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Downstream Processing

Biotecnología Plan 2008


Estrategias de Recuperación y
Purificación de Proteínas
Recombinantes

2016

Dr. Federico J. Wolman fwolman@ffyb.uba.ar


Lic. Agustín Navarro del Cañizo anavarro@ffyb.uba.ar
1
Ingeniería Genética

Producción en
biorreactor

Recuperación y Purificación

2
Dra. Silvia Andrea Camperi
Filtración
Ultrafiltración Técnicas
cromatográficas
Centrifugación
Precipitación

Producción en Recuperación
Purificación
biorreactor (aislamiento, enriquecimiento)

No hay que purificar más de lo


necesario

3
La selección de un método separativo depende de:

Localización del producto


Propiedades del producto
Caracterización del medio de cultivo, microorganismos y contaminantes
Concentración del material de partida
Escala de trabajo
Estabilidad del producto
Costos
Uso del producto

4
Planear una estrategia
¿Qué conozco de la proteína?

Estabilidad (Temperatura, pH)


pI
Peso molecular
Metaloproteína/cofactores/sustratos
Intracelular
Extracelular
Inhibidores
Grupos SH

5
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido

No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular

Homogenato

Separación Sólido-Líquido

Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
6
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido
Centrifugación y filtración

No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular

Homogenato

Separación Sólido-Líquido
Centrifugación y filtración

Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
7
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido

No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular

Homogenato

Separación Sólido-Líquido

Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
8
Ruptura celular

Métodos químicos

Métodos biológicos

Métodos mecánicos

9
Ruptura celular
• Métodos Químicos
• Ácidos
• Base
• Solventes
• Detergentes
• Métodos Biológicos
• Lisis Enzimática
• Auto lisis
• Tratamientos Físicos
• Congelamiento-descongelamiento
• Shock Osmótico
• Calentamiento y secado
• Métodos mecánicos
• Homogenización a alta presión
• Molino húmedo
• Sonicación
• Extrusión por presión
• Prensa Francesa
Ruptura celular
Homogeneizador de alta presión

Contra
presión Anillo de
válvula impacto

Desechos
celulares

Presión del producto


Muestra (células enteras)

Velocidad de liberación de proteínas en homogeneizador

ln (Rm/Rm-R) = k . N . Pa
2000 atm

11
Homogeneizador de alta presión
Válvulas de ruptura
Cuchillas

ln (Proteína Liberada )

Planos

Las válvulas en forma de Cuchillas provocan mayor


turbulencia, lo que implica mayor Rompimiento
Ruptura celular
Molino de bolillas (Bead Mill)

Velocidad de liberación de proteínas en molino de bolillas


ln (Rm/Rm-R) = k . t 13
Molino de bolillas (Bead Mill)
Tamaños relativos
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido

No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular

Homogenato

Separación Sólido-Líquido

Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
15
Dra. Silvia Andrea Camperi
Precipitación
Negativa
– Precipitan los contaminantes
– La proteína de interés queda en solución

Positiva
– Precipita la proteína de interés (se concentra)
– Los contaminantes quedan en solución

Precipitación por salting out

Agua en estado ordenado Aumenta la entropía

Alta fuerza iónica

Baja fuerza iónica Interacción


proteína-proteína

16
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido

No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular

Homogenato

Separación Sólido-Líquido

Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
17
Purificación
Cromatografía de exclusión molecular (SEC) Método no adsortivo
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Métodos adsortivos
Cromatografía de afinidad (AC)

SEC HIC IEC AC


18
Cromatografía de exclusión molecular (SEC)
Mal llamada filtración en geles

Método de fraccionamiento de
proteínas basado en el tamaño
molecular de las mismas

Método no adsortivo
Diluye la muestra
Volumen de siembra < volumen de la columna (10-30%)
Elución no modificable por la composición del buffer

19
Mecanismo

Kd: fracción de la fase estacionaria a la que puede


acceder por difusión una determina sustancia.

20
Cromatografía Dra. Silvia A.
Camperi

Partículas esféricas de
matriz de exclusión
molecular se empacan
dentro de columnas
Mecanismo

Kd: fracción de la fase estacionaria a la que puede


acceder por difusión una determina sustancia.

22
Ferritina
Aldolasa
Catalasa
Ovalbumina
Anhidrasa carbónica
Ribonucleasa A
Aprotinina

¿Cuál de las proteínas


tiene mayor tamaño
molecular?

mL
Columna SuperdexTM 200 10/300.
*

> grado de entrecruzamiento< diámetro de poro< absorción de


agua>Resistencia mecánca

*G/10 =los ml de agua que absorbe 1 g de Sephadex. 24


Aplicaciones

Separación de grupos
Desalificación
Cambio de buffer
Matrices con alto grado de entrecruzamiento

Fraccionamiento
Matrices poco entrecruzadas e

Kd: fracción de la fase estacionaria a la que puede 25


acceder por difusión una determina sustancia.
Cromatografía de exclusión molecular (SEC)

Método no adsortivo
Diluye la muestra
Volumen de siembra < volumen de la columna (10-30%)
Elución no modificable por la composición del buffer

26
Cromatografía de exclusión molecular (SEC) Método no adsortivo
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Métodos adsortivos
Cromatografía de afinidad (AC)

Método adsortivo
Concentra la muestra
Volumen de siembra puede ser > volumen de la columna
Elución modificable por la composición del buffer

Tabla 1 27
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)

Método de
fraccionamiento de
proteínas basado en las
cargas superficiales de
las mismas

28
Carga positiva
Lisina pK = 8,5-9
Arginina pK = 9,5-10
Histidina pK = 6,5

Carga negativa
Ácido aspártico pK = 4
Ácido glutámico pK = 4

29
Curva de titulación y punto isoeléctrico de una proteína

Carga neta

Punto
isoeléctrico pI
Intercambiadores de aniones
(tienen carga positiva)

Intercambiadores de cationes
(tienen carga negativa)
Condiciones para la adsorción
pH tal que la proteína tenga carga neta contraria al intercambiador
Baja fuerza iónica

Condiciones para la elución

pH tal que la proteína tenga carga neta igual al intercambiador


Alta fuerza iónica

Tabla 1 3
2
Gel de isoelectroenfoque: para determinar pI
Se crea un gradiente de Cada proteína migrará
pH mediante anfolitos hasta alcanzar su pI

PH=9
- PH=9

PH=3 PH=3

Cátodo -

+
Ánodo
Curva de titulación y punto isoeléctrico de una proteína

Carga neta Proteína con pI=8


Dos cargas positivas a pH=6
1 carga negativa a pH=9

Punto
isoeléctrico pI
Curva de titulación electroforética
PH=9
90º PH=3 PH=9

PH=3

Problema 2
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5

C
A B

36
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)

pH muy ácido
(Ej pH=4)
ABC +

Catión C
Carga neta

A B
Anión

37
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)

Catión C
Carga neta

A B
Anión

pH moderadamente ácido
(Ej pH=6,5)
A- BC +

38
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)

Catión C
Carga neta

A B
Anión

pH moderadamente básico
(Ej pH=7,5)
AB - C+

39
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador catiónico (SP-CM) (-)

pH muy básico
(Ej pH=9,5)
ABC -

Catión C
Carga neta

A B
Anión

40
Intercambiador aniónico (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador catiónico (SP-CM) (-)

pH muy ácido pH muy básico


(Ej pH=4) (Ej pH=9,5)
ABC + ABC -

Catión C
A
Carga neta

B
Anión

pH moderadamente
pH moderadamente
básico
ácido
(Ej pH=7,5)
(Ej pH=6,5)
AB - C+
A- BC +

Problema 3
41
Intercambiador aniónico (Q-DEAE) (+)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

Método de
fraccionamiento de
proteínas basado en la
hidrofobicidad de las
mismas

42
Grupos R alifáticos no polares
Grupos R aromáticos

43
Mecanismo
Precipitación por salting out

Agua en estado ordenado Aumenta la entropía

Alta fuerza iónica

Baja fuerza iónica Interacción


proteína-proteína

Adsorción: interacción hidrofóbica


Agua en estado ordenado Aumenta la entropía

Interacción
Alta fuerza iónica proteína-ligando

Matriz Baja fuerza iónica Matriz

Capa de hidratación en los parches hidrofóbicos previene interacciones hidrofóbicas.


41
¿Cuál proteínas es
más hidrofóbica?
¿Cuál de las proteínas
precipita con menor
porcentaje de sulfato
de amonio?

• % de (NH ) SO a la que precipita la proteína Hidrofobicidad superficial


• Solubilidad en agua
4 2 4
Matriz cromatográfica

Sal

46
Condiciones para la adsorción
Alta fuerza iónica de sal anticaotrópica

Condiciones para la elución


Baja fuerza iónica
Solventes orgánios, polioles, detergéntes no iónicos, iones caotrópicos

Tabla 1 Problema 4 4
7
Cromatografía de afinidad (AC)
Técnica cromatográfica con mayor selectividad
Problema 5

Método de fraccionamiento de proteínas basado en el


reconocimiento molecular entre la proteína a purificar y un
ligando inmovilizado en un soporte.
El producto de interés puede estar en bajas concentraciones y en
presencia de productos similares contaminantes.
48
Parámetros de evaluación de un proceso
RENDIMIENTO

Porcentaje (%)= Cantidad de producto luego de la purificación x 100


Cantidad de producto en el material de partida
PUREZA
Actividad específica (AE)= Cantidad de proteína de interés
Cantidad total de proteínas

PERFORMANCE
Factor de purificación (FP)= AE luego de la purificación
AE antes de la purificación

49
Problema 7

50
Traer resueltos Problema 5-6

Día 2

28/10/2016 51
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas

 Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia

52
Rendimiento total vs número de etapas del proceso

53
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
 Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
 A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC

54
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
 Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
 A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
 Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas

55
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
 Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
 A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
 Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas
 Elegir métodos y condiciones que exploten las mayores
diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y las impurezas

56
57
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
 Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
 A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
 Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas
 Elegir métodos y condiciones que exploten las mayores
diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y las impurezas
 Usar con criterio la capacidad adsortiva de las columnas
matrices cromatográficas
 Eliminar primero los contaminantes que están en mayor
proporción
58
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional

 En una secuencia integrada y lógica, las etapas


cromatográficas deben sucederse de manera que la
muestra pueda pasar de una etapa a la siguiente sin
etapas intermedias de acondicionamiento tales como:
concentración, desalificación, cambio de buffer.

59
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional

 En una secuencia integrada y lógica, las etapas


cromatográficas deben sucederse de manera que la
muestra pueda pasar de una etapa a la siguiente sin
etapas intermedias de acondicionamiento tales como:
concentración, desalificación, cambio de buffer.
 Utilizar al principio técnicas adsortivas

60
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional

 En una secuencia integrada y lógica, las etapas


cromatográficas deben sucederse de manera que la
muestra pueda pasar de una etapa a la siguiente sin
etapas intermedias de acondicionamiento tales como:
concentración, desalificación, cambio de buffer.
 Utilizar al principio técnicas adsortivas
 Las etapas que usan matrices cromatográficas más
costosas o lábiles se usan al final

61
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional

 En una secuencia integrada y lógica, las etapas


cromatográficas deben sucederse de manera que la
muestra pueda pasar de una etapa a la siguiente sin
etapas intermedias de acondicionamiento tales como:
concentración, desalificación, cambio de buffer.
 Utilizar al principio técnicas adsortivas
 Las etapas que usan matrices cromatográficas más
costosas o lábiles se usan al final
 La cromatografía de exclusión molecular en el modo
fraccionamiento siempre al final

62
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional

 En una secuencia integrada y lógica, las etapas


cromatográficas deben sucederse de manera que la
muestra pueda pasar de una etapa a la siguiente sin
etapas intermedias de acondicionamiento tales como:
concentración, desalificación, cambio de buffer.
 Utilizar al principio técnicas adsortivas
 Las etapas que usan matrices cromatográficas más
costosas o lábiles se usan al final
 La cromatografía de exclusión molecular en el modo
fraccionamiento siempre al final
 La cromatografía de interacción hidrofóbica antes o
después del intercambio iónico
63
Axioma de la Biotecnología

NO HAY QUE
PURIFICAR MÁS DE
LO NECESARIO

64
Proteína Peso Hidrofobicidad pI Concentración
molecular
[(NH4)2SO4] de elución (mg/ml)
(kDa)

A 90 1,5 5 0,9
B 100 2,0 6 2,3
C 45 1,5 7 5,1
D 25 0,5 5 0,1
X 95 1,5 5 0,2

Problema 8
Adición de salesHICSEC
SECIEC Calcula AE final en cada proceso
IECSEC ¿Cuál esquema considera más conveniente? 65
Problema 9

Proteína Peso Hidrofobicidad pI Concentración


molecular [(NH4)2SO4] de elución (mg/ml)
(kDa)
A 90 0,5 5 1
B 90 1,0 6 10
C 45 1,5 7 15
D 20 1,5 6 5
E 90 1,5 6 3
X 45 1,5 6 1

66