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Introducción

El ácido cítrico (ácido orgánico tricarboxilico) es un producto químico utilizado con una
gran demanda en la industria alimentaria, ya que es un conservante y/o antioxidante
que se añade en el envasado de muchos alimentos enlatados, tales como verduras o
frutos. También puede emplearse como saborizante en bebidas (regulador de acidez)
y golosinas. Está presente en la mayoría de las frutas, sobre todo en cítricos como el
limón y la naranja (Bristhar, 2010). El ácido cítrico se obtiene mediante la fermentación
de la caña de azúcar e industrialmente se emplea el microorganismo Aspergillus Niger
en tanques para cultivo sumergido.
La glucosa es la principal fuente de carbono para la obtención del ácido cítrico, este
es un intermediario en el ciclo de Krebs, que en condiciones aeróbicas da como
resultado Acetil - CoA, esta última entra en el ciclo de Krebs para formar el metabolito
de interés (ácido cítrico) (Químicas, 2012).
En cuanto al proceso de obtención del ácido cítrico se deben tomar en cuenta ciertos
factores dentro de la fermentación, tales como: el pH, la temperatura, el grado de
agitación, la aireación, entre otros; ya que si no se controlan las condiciones de
producción se obtiene una disminución en el rendimiento. Una vez terminada la
fermentación, el metabolito de interés debe ser separado del resto de los
componentes del caldo de fermentación y esto se realiza mediante dos filtraciones, la
primera para remover las células muertas de Aspergillus Níger y la segunda para
separar el citrato cálcico del ácido cítrico. Lo que se obtiene es ácido cítrico diluido
con gran cantidad de agua por lo tanto debe purificarse para obtener el producto
sólido, así que se realiza un proceso de evaporación y cristalización, una vez
formados los cristales aún contienen humedad, la cual debe ser retirada mediante
centrifugación y posteriormente secado del producto.

Figura 2: Ejemplos de usos y


Figura 1: Presentación del ácido cítrico a aplicaciones del ácido cítrico.
nivel comercial.
Antecedentes
El ácido cítrico fue aislado por primera vez por Scheels Karls en 1874, en Inglaterra,
quien lo cristalizó a partir del jugo de limón importado de Italia. Los empresarios
italianos tuvieron el monopolio por su producción durante casi 100 años, el cual fue
vendido a un alto costo. Esto llevó numerosos esfuerzos de todo el mundo para
encontrar alternativas para su producción, que incluye técnicas químicas y
microbianas. El proceso industrial se abrió por primera vez por James Currie, en 1917,
quien encontró que Aspergillus Níger tenía la capacidad de producir cantidades
significativas de ácido cítrico en medio a base de azúcar (Li y col. 2012).Además de
los hongos, se sabe que varias levaduras producen ácido cítrico a partir de hidratos
de carbono, especialmente las especies pertenecientes a los géneros Candida,
Hansenula, Pichia, Debaromyces, Torula, Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces,
Yarrowia y Zygosaccharomyce. Sin embargo la utilización de estas levaduras no es
rentable pues en la fermentación se obtienen compuestos no deseables como el ácido
isocítrico, análogo del ácido cítrico. Hoy en día la producción mundial de ácido cítrico
alcanza las 550,000 toneladas por año, y es producido principalmente en Estados
Unidos, la Unión Europea y China; destacando que la producción en su mayoría es
llevada a cabo por fermentación, donde se involucra el uso de dextrosa o melaza de
caña de azúcar como materia prima y Aspergillus niger como organismo de
fermentación.
Para comprender cómo se controla una vía metabólica se debe identificar a la o las
enzimas que catalizan los pasos limitantes de la misma.
El primer sitio de control es la isocitrato deshidrogenasa; la enzima es estimulada
alostéricamente por el ADP, el cual aumenta la afinidad de la enzima por sus
sustratos. La unión de isocitrato, NAD+, Mg2+ y ADP es mutuamente cooperativa. Por
el contrario el ATP resulta inhibidor. Es importante anotar que varias etapas del ciclo
requieren NAD+ o FAD, que sólo son abundantes cuando la carga energética es baja.
El segundo punto de control es la a-cetoglutarato deshidrogenasa. Algunos aspectos
de su control son análogos a los del complejo piruvato deshidrogenasa. La a-
cetoglutarato deshidrogenasa se inhibe mediante el succinil-CoA y el NADH, los
productos de la reacción que cataliza. Además, ésta enzima se inhibe por una carga
energética alta. Por tanto, la velocidad del ciclo se reduce cuando la célula dispone
de un alto nivel de ATP.
La Figura 3 representa lo mencionado anteriormente.

Figura 3 Control del ácido cítrico. Se regula


principalmente por las concentraciones de ATP y
NADH. Las enzimas isocitrato deshidrogenasa y a-
cetoglutarato deshidrogenasa son los puntos claves
de control.

Figura 4: Representación esquemática de las principales reacciones


metabólicas implicadas en la producción de ácido cítrico por A, Níger
(Manzoni, 2006). PFK = fosfofructoquinasa, PC = piruvato carboxilasa,
ACO = aconitasa.

López Ríos et al. evaluaron el suero de leche como sustrato para la producción de
ácido cítrico utilizando Aspergillus niger NRRL 2270. Compararon la hidrólisis ácida y
enzimática de la lactosa con el fin de proporcionar al microorganismo una fuente de
carbono más asimilable.; se determinó la producción de ácido cítrico al agregar
magnesio, carboximetil celulosa (CMC), gelatina y metanol al SE y concluyeron que
Aspergillus niger NRRL 2270 es un buen microorganismo para la producción de ácido
cítrico a partir de suero de leche ya que asimila fácilmente la lactosa sin necesidad de
una hidrólisis previa.
Velásquez, J. A et at. Obtuvieron el ácido cítrico por fermentación con aspergillus Commented [MI1]: Aunque mencionaste a los autores se
debe de citar al final del párrafo la referencia
niger utilizando sustrato de plátano dominico hartón maduro. Y evaluaron la eficiencia Commented [MI2]: Aspergillus

de producción, obtuvieron 13.5 g/L de ácido cítrico, con una concentración de


azucares reductores altos, para alcanzar el mejor rendimiento en la obtención de
ácido.

Justificación del estudio


Son escasos los estudios que se han llevado a cabo a pesar de la importancia
comercial del ácido cítrico. Hasta el momento, las técnicas que se llevan a cabo para
la producción industrial de este compuesto es el método de mutación seguido de una
selección mediante la utilización de la utilización de rayos UV y químicos como
etilenamina.
La ventaja de la propuesta sugerida en el presente documento es la utilización de
técnicas genéticas para intervenir en el metabolismo central de A. niger generando
una optimización en la producción de ácido cítrico, logrando mayores rendimientos y
posibles bajos costos debido a la eliminación de la utilización de químicos que pueden
ser agresivos con la células.
Hipótesis
Se tendrá una mayor producción de ácido cítrico utilizando una cepa con
modificaciones en el metabolismo de Aspergillus niger. Estas modificaciones se
basan en redirigir el flujo metabólico a la sobreproducción de citrato en el ciclo de
Krebs, esto incluye la inactivación de algunas enzimas que intervienen en la
producción de otros compuestos, que no son de interés y que alteran el flujo
metabólico, así como la activación de enzimas la producción de compuestos que
favorecen la ruta a la producción de citrato.
Objetivos
Objetivo General
Realizar una estrategia, mediante técnicas genéticas en el metabolismo central, para
la optimización de una cepa de Aspergillus niger para una mayor producción de ácido
cítrico.

Objetivos Particulares
1. Identificar las enzimas importantes que intervienen en la vía metabólica de
Aspergillus niger para favorecer la producción de ácido cítrico.
2. Conocer y analizar los bioprocesos que se realizan para la obtención del
ácido cítrico.
3. Entender y analizar la vía metabólica de Aspergillus niger y entender la
importancia de cada gen, enzima, y compuesto, que intervienen en la
regulación del metabolismo.

Propuesta de Investigación

Planteamiento del Problema

Actualmente la producción de ácido cítrico es llevada a cabo mediante mutación con


rayos UV seguido de una selección y utilización de químicos, los cuales pueden dañar
de alguna manera la célula y reducir el rendimiento de producción de este compuesto
de importancia comercial.
Ciertos hongos microscópicos son capaces de acumular ácido cítrico, lo que permite
su producción a gran escala. Actualmente casi todo el ácido cítrico industrial se
obtiene del hongo Aspergillus niger, que acumula enormes cantidades del ácido y es
muy fácil de cultivar en grandes fermentadores de acero.
Se desea construir una cepa del hongo Aspergillus Níger capaz de producir una gran
cantidad de ácido cítrico, modificando su ruta metabólica convencional, interviniendo
con modificaciones en las principales enzimas que participan en su vía de
degradación de la glucosa, hasta la interrupción del ciclo de Krebs, con la finalidad de
controlar los flujos de carbono de las vías metabólicas involucradas en la producción
de ácido cítrico.
Una vez obtenida la cepa modificada, se desea llevar la producción a gran escala,
haciendo uso de fermentadores industriales, controlando los parámetros de operación
para llevar a cabo buenos rendimientos de producción, así mismo se busca continuar
con las operaciones unitarias necesarias para la obtención del ácido cítrico con alto
grado de pureza, para ser utilizado en diferentes aplicaciones industriales importantes
ya mencionadas en el presente trabajo.

Organismo Hospedero

El hongo Aspergillus niger produce diversos compuestos de gran interés para las
industrias farmacéutica y de alimentos (enzimas, ácidos orgánicos, etc.), y es el
principal productor de ácido cítrico a nivel industrial por cultivo líquido. Se ha
observado que se obtiene un alto rendimiento de ácido cítrico cuando existe una alta
acumulación de este en el micelio, que puede estar asociada con una alta
concentración de glucosa y de oxígeno disuelto en el medio líquido. Comparados
con las cepas de Penicillium, los Aspergillus producen más ácido por unidad de
tiempo, debido a que presentan baja actividad de las enzimas isocitrato
deshidrogenasa y aconitasa hidratasa, y una alta actividad de citrato sintetasa. Las
anteriores constituyen ventajas importantes si se toma en cuenta que además la
formación de productos laterales no deseados como ácido oxálico, ácido isocítrico y
ácido glucónico puede ser fácilmente suprimida.
Nueva ruta metabólica para la producción de ácido cítrico

1 - Inhibir la enzima DAHP (3-desoxi-D-arabinoheptulosonato 7-fosfato sintasa) que


es la primera enzima en una serie de reacciones metabólicas conocidas como la vía
shikimato, con la finalidad de que el flujo metabólico no se dirija a la biosíntesis de
compuestos aromáticos.

2.- Silenciamiento del gen An02g02920 de codifica para la enzima triosa fosfato
isomerasa (TPI) que cataliza la interconversión entre gliceraldehído-3-fosfato (GADP)
y dihidroxiacetona fosfato (DHAP), reacción que tiene lugar a través de un
intermediario.

3.- Sobreexpresión del gen An0708990 que codifica para la enzima la piruvato
quinasa que cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ADP, produciendo una
molécula de piruvato y otra de adenosín trifosfato (ATP).Con el objetivo de tener
suficiente piruvato para ingresar al ciclo de Krebs y tener suficiente energía en forma
de ATP.

4.-Inactivación de la enzima Acetato Quinasa (cataliza reversiblemente la


fosforilacion del acetato en presencia de un catión divalente y ATP), y Fosfato
Acetiltransferasa (que cataliza la síntesis del acetil fosfato a partir de acetil-CoA y
fosfato inorgánico), con el objetivo de que no se produzca acetato, que es un
compuesto tóxico.

5.- Sobreexpresión del gen An04g02090 que codifica para la enzima piruvato
deshidrogenasa (PDH) es un complejo multi enzimático mitocondrial de muy elevado
peso molecular que cataliza la unión del CoA al piruvato que se descarboxila rindiendo
en el proceso NADH, con el objetivo de tener suficiente Acetil-CoA, para las
posteriores reacciones.

6.-Sobreexpresión de la enzima citrato sintasa: es una enzima del grupo de las Liasas,
que cataliza la condensación del Oxalacetato y la Acetil-CoA, para formar Citrato. Esta
reacción se considera la principal vía de entrada de Carbono al ciclo, pues la Acetil-
CoA se produce en grandes cantidades durante el catabolismo de Glucidos, Lípidos
y Aminoácidos, y su oxidación en el ciclo, produce la mayor parte de la energía
metabólica.

7.- Sobreexpresión del gen An11g00510 que codifica para la enzima ATP citrato
sintasa que cataliza la reacción química:
ADP + fosfato + acetil-CoA + oxalacetato = ATP + citrato + CoA
Sus 3 productos de esta enzima son ATP , citrato y CoA. La razón de la
sobreexpresión es tener suficiente citrato para la producción de ácido cítrico.

8.- Silenciamiento del gen An08g10530 que codifica para la enzima aconitasa que
cataliza la reacción sucesiva del ciclo de Krebs, en donde el ácido cítrico es
transformado en ácido isocítrico, el objetivo del bloqueo de esta enzima es que se
acumule nuestro producto de interés y no continúe el ciclo de Krebs. Una alternativa
propuesta para bloquear esta enzima es agregar EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) que actúa como secuestrante de Fe, que se encuentra en
la enzima aconitasa. Otra alternativa puede ser agregando Cu que se enlaza con la
enzima aconitasa mejor que el Fe, bloqueando de este modo la reacción.

9.- Silenciamiento del gen An15g00070 que codifica para la enzima Malato
deshidrogenasa que cataliza la reacción de oxidación del (S)-malato a oxaloacetato,
para no tener una gran carga metabólica, y todo el flujo metabólico se dirija a la
producción de citrato.
GLUCÓLISIS

Propuesta de activación de expresión y silenciamiento de genes y activación e


inactivación de enzimas, en el metabolismo de Aspergillus niger para la
producción de ácido cítrico.

= Inactivación de la enzima.

=Activación de la enzima.

Figura 5: Glucolisis especifica de Aspergillus niger. Se muestran las modificaciones del ciclo.Recuperada de:
http://www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=ang00010&keyword=
Tabla de los genes, enzimas y reacciones que participan en el ciclo de Krebs
de Aspergillus niger.

= Deleción del gen-inactivación de la enzima.

=Sobreexpresión del gen - Activación de la enzima.


CICLO DE KREBS

Propuesta de activación de expresión y silenciamiento de genes y activación e


inactivación de enzimas, en el metabolismo de Aspergillus niger para la
producción de ácido cítrico.

= Inactivación de la enzima.

=Activación de la enzima.

Figura 6: Ciclo de Krebs especifico de Aspergillus niger. Se muestran las modificaciones del ciclo.
Recuperado de: http://www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=ang00020&keyword=
Tabla de los genes, enzimas y reacciones que participan en el ciclo de Krebs
de Aspergillus niger.

= Deleción del gen-inactivación de la enzima.

=Sobreexpresión del gen - Activación de la enzima.


METODOLOGÍA

Evaluar el efecto de la inserción de genes implicados en la rama reductora del ciclo


de Krebs para la producción de citrato en A. Níger.

La propuesta es: insertar en combinación un conjunto de genes diferentes, de


distintas especies.

S. cerevisiae
 Malato deshidrogenasa (MDH2).
 Fumarato reductasa citosólica soluble (Frds1)
 Fumarasa truncada (Fumis).

R. oryzae
 Fumarasa truncada (FumRs)

Transformación en Aspergillus niger

Una cepa silvestre de Aspergillus Níger será transformada con un plásmido (vector
de sobreexpresión) que contenga los genes Fum1s y FumRs, MDH2 y Fdrs1, además
de un sistema de sobreexpresión mediana por gpdA, pyrG y trpC. Para obtener una
cepa mutante de A Níger capaz de producir citrato en grandes cantidades.

Condiciones del cultivo


Materia prima: jarabe de dextrosa
Es un edulcorante líquido producido por la hidrólisis enzimática del almidón de maíz
para obtener valores mínimos entre 95% y 96% de D-glucosa. Se usan en procesos
de fermentación para la producción de metabolitos ya que sirve como fuente de
nutrientes para facilitar la germinación, crecimiento y reproducción de los
microorganismos productores de determinado metabolito (ácido cítrico). También
ayudan a incrementar la cantidad de azúcares fermentables en la producción de vinos
y en la fabricación de sorbitol por medio de un proceso de hidrogenación. Cuando los
jarabes de dextrosa de alto contenido de D-glucosa, se someten a un proceso de
cristalización, se obtienen dos tipos de dextrosa comercialmente conocidos como:
Dextrosa monohidratada y Dextrosa anhidra.
La dextrosa monohidratada tiene una amplia gama de aplicaciones. Posee una
dulzura refrescante y suave para acentuar el sabor y un alto poder reductor para
ayudar al pardeamiento del producto final. Es 100% fermentable, y proporciona alta
osmolalidad.

Figura 7: Representación del jarabe de dextrosa.

1.-Preparación del sustrato


● Purificación de sustrato: Dilución de la mezcla del jarabe de dextrosa con
agua.
● Filtración: La dilución se pasa a través de un filtro de vacío con el objetivo de
eliminar los sólidos suspendidos y las impurezas que tiene el jarabe de
dextrosa.
● Eliminación de iones del flujo: El líquido de pasa a través de una celda de
intercambio iónico.
● Pasteurización: Elevación de la temperatura aproximadamente 100°C en un
calentador de evaporación instantánea y posteriormente se reduce la
temperatura a 37°C utilizando un enfriador.

2.- Fermentación
La fermentación se llevará a cabo a través del proceso de sumergido .Es el principal
proceso en uso en el que se inocula el medio, seguido de una agitación y aeración
vigorosa controladas en grandes fermentadores. El periodo de fermentación es de 3-
5 días.
● El jarabe de dextrosa pasteurizado, se introduce al fermentador para que se
lleve a cabo el proceso de transformación de sacarosa en ácido cítrico por
medio de Aspergillus Níger.
● Aspergillus Níger se inocula en el fermentador.
● Se ajusta el pH entre 2,8 y 1,5 y se añaden nutrientes como amoniaco NH3 y
sales de fermentación (el amoniaco representa una importante fuente de
nitrógeno, útil para que se lleve a cabo la germinación y crecimiento del hongo.
● El aire estéril se burbujea dentro del fermentador. La temperatura comprendida
es entre 28°C y 33°C.
● La biomasa se conforma por el micelio y el microorganismo muerto y constituye
un subproducto o un efluente del proceso, por esta razón una vez terminada la
fermentación, el flujo es pasado por un filtro rotatorio al vacío para separar el
micelio.

3.- Purificación del ácido cítrico


● Proceso cal-sulfúrico: El ácido cítrico debe ser separado de la biomasa, el
azúcar residual, las proteínas producidas por la fermentación y otras impurezas
solubles, para lograr lo anterior se lleva a cabo el proceso de cal-sulfúrico que
se basa en tratar el producto de la fermentación con cal (Ca(OH)2 cal apagada)
para formar citrato de calcio y así poder separar el ácido cítrico.
● Este citrato de calcio resultante es lavado y el micelio es filtrado.
● Se añade ácido sulfúrico ya que este reacciona con el citrato de calcio y lo hace
precipitar en forma de yeso o sulfato cálcico, permitiendo la liberación del ácido
cítrico presente.
El sulfato de calcio es retirado de la solución por medio de un filtro rotatorio al vacío y
se constituye como un desperdicio o como un subproducto del proceso.

4.- Remoción de impurezas


Por medio de celdas primarias de carbón activado son removidas las impurezas
solubles que producen color a la solución de Ácido Cítrico y en general sustancias
orgánicas contenidas en el licor.
Debido que a lo largo del proceso se añaden sustancias que aumentan la cantidad de
iones contenidos en la solución de ácido cítrico, antes de cristalizarlo se tienen que
retirar los iones Ca++ y SO4-, para estos se usan celdas de resinas de intercambio
iónico. El proceso consiste en una corriente que alimenta los evaporadores de doble
o de triple efecto donde se busca retirar la mayor cantidad de agua para pasar al
cristalizador.

5.- Cristalización
En este proceso se separan los cristales formados del líquido saturado que se
denomina licor madre. Este licor se recircula a la etapa de intercambio iónico (celdas
de carbón) o al tanque de tratamiento por cal. Los cristales de ácido cítrico húmedos
se redisuelven y se recristalizan al vacío. Luego pasan a la centrífuga en donde es
eliminado el licor madre de los cristales formados.

6.- Secado
Se realiza en un equipo de lecho fluidizado, que permite retirar humedad.

Diagrama de flujo del bioproceso para la obtención del ácido cítrico


Uso del programa SuperPro Designer
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