LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS BIOMOLEKULAR

ACARA II
ISOLASI DNA

Disusun oleh:

Nama : Wahyuni Wulansari

NIM : 1611201004
Kelompok :3
Hari/Tanggal :
Fakultas : Sains dan Teknologi
Program Studi : Bioteknologi

PROGRAM STUDI S1-BIOTEKNOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ‘AISYIYAH
YOGYAKARTA
2017
 ACARA II
TEHNIK ISOLASI DNA
I. TUJUAN

1. Mengetahui Tehnik Isolasi DNA dari jaringan hewan dan tumbuhan

II. DASAR TEORI

Gen disusun oleh suatu substansi yang disebut dengan deoxyribonucleic acid atau
disingkat DNA. DNA merupakan material genetik yang diturunkan dari generasi ke generasi
berikutnya.Setiap penelitian manipulasi gen memerlukan sumber asam nukleat, dalam bentuk
DNA atau RNA. Pengisolasian komponen tersebut dari sel penting dilakukan dengan
menggunakan metode yang tersedia. Ekstraksi DNA merupakan suatu langkah awal
pengisolasian molekul DNA. Molekul DNA ini harus diekstraksi dari tempat asalnya. Pada
seluruh jaringan dan cairan tubuh terdapat DNA. Oleh karena itu, DNA genom dapat diisolasi
dari semua bahan biologis yang mengandungsel berinti, seperti darah, semen, akar, rambut,
tulang dan lain-lain.
o Edy Siswanto,* Tiara Berlian,** Evira Putricahya,*** Lidya V. Panggalo,*** Luluk
Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal
Yuniani2016.
pada Bayi Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi
dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri, Vol. 18, No. 4
Isolasi DNA genom merupakan langkah awal dan sangat menentukan dalam studi
genetika dan molekuler suatu spesies. Proses tersebut membutuhkan preparasi sampel untuk
mendapatkan DNA dengan kualitas yang baik karena akan digunakan untuk berbagai analisis
molekuler maupun manipulasi genetik. Analisis genom dilakukan untuk berbagai sampel dan
untuk tiap sampel dibutuhkan optimasi agar diperoleh DNA yang baik dalam jumlah besar.
Isolasi atau pengambilan DNA dari makhluk hidup terbagi atas beberapa tahapan yaitu
penghancuran sel, penghilangan RNA dan protein serta pemurnian dan pengendapan DNA
(Sambrook et al, 1989 cit Ferniah,2013).
Rejeki Siti Ferniah dan Sri Pujiyanto.2013. Optimasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum annuum
L.) Berdasar Perbedaan Kualitas dan Kuantitas Daun serta Teknik Penggerusan. BIOMA.Vol.156, No. 1,

DNA dapat diisolasi baik dari sel tanaman,hewan,manusia,maupun bakteri

(Faatih,2009 cit Hapsari,2015). Salah satu rangkaian tehnik rekayasa genetik adalah isolasi
DNA,yang melibatkan suatu proses memindahkan DNA dari suatu organisme ke organisme
lain dengan tujuan tertentu. Melalui isolasi DNA kita dapat memperoleh DNA murni,yaitu
tanpa protein mupun RNA dari suatu sel dalam jaringan. DNA murni yang sudah diperoleh
dapat digunakan sebagai bahan pengayaan pokok bahasan sel yaitu DNA berada di sel
tumbuhan maupun hewan,sebagai kajian genetika bahwa gen merupakan bagian dari DNA
(terdapat sebagai lokus-lokus) yang berfungsi untuk mengontrol perkembangan fisik maupun
perilaku dari setiap mahluk hidup.
Hapsari A.I. 2015. Isolasi DNA Tanaman Bayam (Amaranthus sp.) Dan Iken Lele (Clarias
sp) Sebagai Kajian Dalam Biologi Molekular. Jurnal Didaktika Vol 13 No 2
Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit.
Ekstraksi DNA secara konvensional bisa dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl (Mulyani et al.,
2011). metode SDS (Sambrook et al., 1982), dan metode fenol kloroform (Tenriulo et al., 2001).

Keefektifan Metode Isolasi DNA Kit dan CTAB/NaCl

Fitriya R. T ., Ibrahim .M, Lisdiana .L.2015.
yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan Shigella dysentriae. LenteraBio Vol. 4 No. 1
Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Melalui proses tersebut DNA dipisahkan dari
komponen seluler lain seperti protein, RNA (Riboksi nukleat acid), dan lemak. Banyak metode yang digunakan
untuk mengisolasi DNA, tergantung specimen yang akan dideteksi. Metode tersebut pada dasarnya memiliki
prinsip yang sama, namun ada beberapa hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat
menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber spesimen. DNA yang kurang murni dan
pengenceran yang kurang tepat akan menyebabkan tidak menempelnya primer pada DNA target. Hal ini
ditegaskan oleh Young, dkk (2000) dimana pananda genetik (RAPD) sangat sensitive pada kondisi reaksi serta
kualitas DNA templat. Oleh karena itu diperlukan konsentrasi dan kemurnian DNA primer serta prosedur
penyiapan DNA genom konsisten. Tiga konsep dasar yang harus dilakukan adalah pembukaan sel pada sampel
untuk mengeluarkan asam nukleatnya, memisahkan asam nukleatnya dari komponen sel yang lain, dan
pemurnian asam nukleat (Yusdiana, 2008 cit Langga,2012).

Penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dalam proses isolasi DNA dapat mencegah proses
oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol
terhadap asam nukleat (Wilkins & Smart 1996 cit Restu,2012).

Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi

Restu M., Mukrimin, Gusmiaty. 2012.

DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis

Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia Vol 14 No 2.
III. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam praktikum tehnik isolasi DNA adalah

mortar,pestle,tube 1,5 ml/2 ml,inkubator,sentrifus,dan mikropipet. Bahan yang digunakan
dalam praktikum isolasi DNA yaitu buffer ekstraksi (50mM Tris-HCL ph 8,100 mM
NaCL,1% SDS),Proteinase K,Kloroform,Isopropanol,ddH20 dan Buffer TE.

IV. CARA KERJA

Jaringan dipotong dan dimasukkan kedalam mortar

Sample digerus menggunakan pastle dan ditambahkan 700µl buffer ekstraksi

Setelah digerus sample dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml/ 2 ml

Sample Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55°C,dilakukan inversi setiap 15
menit

Sample di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm

500 µl Kloroform ditambahkan pada sample,kemudian sample dikocok

Sample di sentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm

Ambil fas air (Aquoeous Phase) dan dipindahkan ke tube baru,sample

ditambahkan 500 µl isopropanol diinversikan hingga benang DNA terlihat.

Sample di sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm

Supernatan dibuang perlahan tanpa menyentuh pelet,dikeringkan kemudian sample

ditambah 100 µl Buffer TE lalu disimpan pada suhu -20°C.
 Isolasi DNA Tumbuhan

Jaringan tumbuhan dipotong dan ditimbang kurang lebih 100 mg,kemudian

dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml. Ditambahkan buffer ekstraksi sebanyak 500 µL

Sample dihomogenisasi dan digerus dengan menggunakan pestle plastik,kemudian

ditambahkan 66 µL 10% SDS lalu disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan
13.000

Supernatan diambil sebanyak 500 µL dan dipindahkan ke tube baru lalu setelah itu
isopropanol sebanyak 500 µL ke dalam tube kemudian dilakukan sentrifugasi
kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama.

Supernatan dibuang dengan hati-hati tanpa menyentuh pelet,ditambahkan 500 µL

alkohol 70% kemudian disentrifugasi kembali dengan waktu dan kecepatan yang
sama.

Supernatan dibuang dengan hati-hati tanpa menyentuh pelet,dikering anginkan dan

ditambahkan 50 µL ddH2O.
 V. HASIL PENGAMATAN

VI. PEMBAHASAN

Isolasi DNA merupakan proses pengambilan DNA tanpa adanya kontaminasi

RNA,protein maupun komponen lain selain DNA,DNA dapat diambil dari tumbuhan maupun
hewan. Tujuan dilakukannya suatu isolasi DNA ini yaitu untuk mendeteksi suatu
penyakit,kelainan genetik,untuk pengobatan dan mengetahui suatu proses metabolisme dari
suatu mahluk hidup. Isolasi DNA dapat digunakan untuk mendeteksi penyakit dan kelainan
genetik karena di dalam DNA terdapat banyak sekuen sekuen yang mengkode suatu asam
amino,karena beberapa penyakit tertentu dan beberapa penyakit keturunan timbul akibat
terjadinya suatu kesalahan dalam mengkode basa nitrogen pada asam amino yang ada di
dalam DNA. Selain mendeteksi penyakit secara molekuler melalui isolasi DNA kita bisa
mengetahui proses metabolisme dari suatu mahkluk hidup. Ekstraksi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara
konvensional bisa dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl (Mulyani et al., 2011),
metode SDS (Sambrook et al., 1982), dan metode fenol kloroform (Tenriulo et al., 2001).
Seiring perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, ektraksi DNA dapat dilakukan
menggunakan kit dari berbagai merk. Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA
tanaman. Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA
(Ribeiro et al. 2007). Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada
tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. Protokol Doyle & Doyle
(1999) sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman (Ribeiro et al. 2007). Selain itu,
terdapat protokol lain dalam ekstraksi DNA, yaitu Dellaporta et al. (1983), Jobes et al.
(1995), Zheng et al. (1995) serta masih banyak metode lainnya. Namun, tidak semua
protokol-protokol tersebut cocok untuk semua jenis tanaman.

Perbedaan isolasi DNA jaringan hewan dan tumbuhan adalah pada proses
pengekstrasian DNA. Tumbuhan memiliki dinding sel yang tebal sehingga proses
pengesktrasian DNA di dalam jaringan lebih sulit daripada ekstraksi DNA pada jaringan
hewan. Maka dari itu pemberian konsentrasi larutan SDS lebih banyak diberikan pada saat
proses pengesktrasian DNA pada jaringan tumbuhan,SDS berfungsi untuk menghancurkan
jaringan maupun dinding sel tumbuhan yang tebal. Bahan-Bahan yang digunakan untuk
mengisolasi DNA yaitu buffer ekstraksi yang terdiri dari Tris-HCL,NaCl dan SDS,Proteinase
K,Kloroform,Isopropanol,ddH20 dan Buffer TE. Komponen tersebut merupakan komponen
penting yang diperlukan dalam isolasi DNA,karena jika salah satu atau beberapa bahan
terebut tidak dimasukkan ke dalam tube berisi sample maka isolasi DNA hasilnya tidak akan
maksimal bisa saja DNA tersebut hanya sedikit atau bahkan tidak bisa dikeluarkan dari
dinding sel apabila DNA tersebut berada di dalam dinding sel yang sangat tebal. Bahan
pertama yang sangat penting adalah buffer lysis atau buffer ekstraksi buffer ini mengandung
tiga bahan macam zat yaitu Tris-HCL,NaCL dan SDS. SDS merupakan suatu detergen yang
berfungsi menghancurkan dinding atau membran sel dari suatu sample yang akan diisolasi
DNA nya. Pada proses isolasi DNA penghilangan protein dilakukan sebanyak dua kali bahan
yang digunakan untuk menghilangkan protein pada DNA yaitu Proteinase K dan kloroform
karena Proteinase K merupakan enzim yang dapat mendegradasi protein sedangkan
kloroform merupakan suatu zat pelarut organik yang dapat melarutkan suatu protein. Setelah
penghilangan protein DNA diendapkan atau dipresipitasi dengan menggunakan Isopropanol
dan kemudian untuk DNA hewan jika ingin disimpan dalam jangka waktu tertentu dapat
menggunakan buffer TE sebagai penstabil DNA apabila disimpan sewaktu-waktu. Sedangkan
jika yang disimpan adalah DNA tumbuhan maka DNA tersebut akan diletakan pada ddH20.
Karena fungsi buffer adalah menyeimbangkan dan menstabilkan larutan agar kondisi larutan
tidak berubah ubah.

Isolasi DNA hewan pada praktikum kali ini didapatkan dari satu sample yaitu dari
jaringan daging kambing. Sedangkan sample DNA tumbuhan didapatkan dari tanaman
tembakau tipe liar(WT) dan tanaman tembakau mutan (AL). Proses Isolasi DNA hewan
membutuhkan waktu yang lebih lama dikarenakan bahan yang digunakan adalah daging
kambing,proses pengekstrasian DNA lebih lama karena harus dihaluskan dan dilunakkan
terlebih dahulu,hal ini dilakukan agar DNA terektraksi lebih banyak karena jika jaringan
daging tidak tergerus dengan baik maka DNA tidak akan keluar dari jaringan tersbut. Proses
inkubasi juga dilakukan dengan menggunakan waterbath sehingga dengan proses tersebut
setelah penambahan proteinase K diharapkan daging dapat melunak sehingga cairan dari
dalam jaingan akan keluar dan mudah untuk di sentrifugasi. Hasil yang didapatkan berupa
hasil pelet atau benang-benang putih hasil presipitasi isopropanol yang berada pada dasar
tube. Sentrifugasi yang dilakuka berkali kali dilkakuan untuk mendapatkan hasil yang
maksimal pada sample sehingga didapatkan hasil DNA yang murni. Kesulitan yang dialami
saat proses pengisolasian DNA adalah pada proses pemberian bahan-bahan yang digunakan
pada saat pengekstraksian DNA,pada saat pengambilan bahan menggunakan pipet karena
praktikan tidak terbiasa menggunakan mikropipet volume yang diambil tidak sesuai dengan
prosedur yang ada,sehingga volume bahan yang digunakan dapat mempengaruhi kualitas
DNA tersebut. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. Kualitas DNA
dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada
sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. DNA dinyatakan murni jika memiliki
nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8–2,0 (Muladno, 2002). Menurut
Devereux dan Wilkinson (2004) rasio OD260/OD280 < 1,8 menunjukkan adanya
kontaminasi fenol atau protein pada hasil ekstraksi. Khosravinia et al., (2007) juga
menjelaskan bahwa DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280
> 2,0.
Keberhasilan suatu isolasi DNA ditentukan dari jumlah DNA yang didapatkan
untuk mendapatkan suatu hasil isolasi DNA yang cukup maka kita harus memperhatikan
proses