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DILUCIONES Y TECNICAS

1. Técnica de Recuento por Dilución

Mediante el uso de esta técnica de simple ejecución y fácil interpretación, se


pueden evaluar diferentes grupos bacterianos según el medio de cultivo que
contenga el frasco.
Es aplicable para evaluar bacterias heterotróficas, aerobias totales (BAT), bacterias
reductoras de sulfato (BRS), anaerobias heterotróficas totales (BAnT), etc.
Esta técnica está recomendada por el Instituto Americano del Petróleo (API) para
evaluar calidad biológica en aguas de inyección en recuperación secundaria y
también es ampliamente usada en evaluación de problemas microbiológicos en
aguas de refrigeración.
Procedimiento.
La técnica de dilución por extinción consiste en inocular una serie de frascos tipo
antibiótico que contienen 9 ml del medio de cultivo apropiado según el tipo de
bacteria que se quiera evaluar.
Se obtiene 1 ml de la muestra usando una jeringa descartable, estéril, de 1 o 2 ml
de capacidad.
Se inocula el primer frasco, sin retirar la aguja se agita el mismo, se invierte y se
retira 1 ml que se inocula en el 2° frasco.
Con una nueva jeringa, se retira 1 ml del frasco N° 2, previamente agitado, y se
inocula el frasco N° 3 y así sucesivamente, utilizando una nueva jeringa para cada
frasco.
Si no existe información
previa sobre cantidad de bacterias/mL de la muestra suelen sembrarse 6 frascos.
La manifestación de crecimiento bacteriano se observa por la turbidez del medio
de cultivo que se compara por transparencia con un frasco sin inocular en el caso
de bacterias aerobias totales y bacterias anaerobias totales; en el caso de bacterias
reductoras de sulfatos se debe observar un ennegrecimiento del frasco.
Una vez inoculados los frascos y rotulados convenientemente, se incuban durante 7
días (BAT, BAT-RF, MFT) o 14 días (BPA) en estufa de cultivo a ±5ºC respecto de la
temperatura del agua muestreada, efectuando lecturas diarias para observar
aquellos frascos que manifiestan desarrollo positivo. Para el caso de los medios
BRS y BRH, el plazo de lectura es de 28 días máximo, realizando también lecturas
periódicas..
Cálculos de densidad bacteriana.
Se tienen en cuenta los frascos que manifiesten alguna modificación como
consecuencia del crecimiento bacteriano; esta modificación puede ser turbidez,
cambio de color, ennegrecimiento, etc.
Por ejemplo: si se usó el medio BAT-RF y se observa turbidez y/o cambio de color
hasta el frasco N° 4 el resultado sería 1000-10000 bact/mL o exponencialmente
103-104 bact/mL.. Habitualmente se informa 104 bact/mL.

Problemas comunes en la interpretación del crecimiento bacteriano cuando se


utiliza la técnica de dilución por extinción.
Hay una variedad de acontecimientos que interfieren con la interpretación de
resultados obtenidos utilizando las diluciones seriadas. Algunos de los mas
comunes son:
· Todos los frascos muestran crecimiento.
Si esto sucede, no es posible estimar la población, por ejemplo si en una serie de 6
frascos inoculados todos se manifiestan positivos se debe informar:106 bact/mL.
Para el próximo análisis de esa muestra habría que considerar el empleo de 8 o 9
frascos.
· Un frasco no denota crecimiento y el resto sí.
Algunas veces uno de los frascos permanece sin cambios mientras que los
ubicados anterior y posteriormente en la serie inoculada muestran positividad. Es
decir, hay un “salto” en los frascos positivos. Este “salto” debe ser anotado y se
informará la concentración bacteriana correspondiente al frasco de mayor
numeración que resultó positivo. Por ejemplo: El crecimiento positivo se observa en
los frascos 1, 2 y 4 mientras los frascos 3, 5 y 6 permanecen sin modificaciones,
todo después de incubar a la temperatura y tiempo incubado. Hay varias
explicaciones posibles para esto, incluyendo una contaminación accidental del
frasco 4. Por lo tanto, nunca se puede saber que ocurrió realmente y hay que
proceder de la forma más simple ante una situación dudosa.
En el ejemplo anterior, si se confía razonablemente en que los frascos fueron
rotulados apropiadamente con su número de orden, el informe será 104 bact/mL
anotando el frasco que “saltó”.
· Frascos que se manifiestan positivo inmediatamente.
Si el primer frasco con un medio de cultivo para BRS se ennegrece dentro de las 2
horas de haber sido inoculado con 1 mL de agua muestra, este ennegrecimiento no
es producto del crecimiento bacteriano dentro del frasco; el color negro es debido
al SFe proveniente de altos niveles de SH2 en la muestra de agua que reaccionó
con el Fe disuelto en el caldo de cultivo. En estos casos se pueden seguir dos
cursos de acción:

1) Proceder con las diluciones seriadas. Los frascos 2 a 6 permanecerán


generalmente sin cambios y pueden ser usados para detectar el crecimiento
bacteriano incubándolos a temperatura y tiempo adecuado y observando
ennegrecimiento en los mismos transcurrido el tiempo de incubación.

2) Colectar por lo menos 50 mL de agua en un frasco estéril y agregarle una tableta


de Alka-Seltzer que puede despojar la mayoría del SH2 de la muestra. Cuando la
tableta cesa de burbujear, retirar 1 mL de agua con jeringa estéril y llevar a cabo el
procedimiento habitual de las diluciones seriadas.

Siembra masiva

Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este
caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.

2. PRÁCTICA # 5
“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA
Y ESTUDIO DE BACTERIAS”
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos
métodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible
cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo
demicroorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir unamuestra microbiológica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que
en el área de trabajo, existen muchosotros microorganismos; debido a esto,
es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren
ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el
aspecto nutricional, sino también lasc o n d i c i o n e s a m b i e n t a l e s d e s u
hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar
e l p H y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la
temperatura, aireación la luminosidad.La aplicación de estos procedimientos ha
permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así comosu
aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterización, aplicación ycontrol de los mismos. La forma de sembrarlos
y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del
estudio.
OBJETIVOS:
ξ
Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar
contaminaciones.
ξ
Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
ξ
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
ξ
Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos
específicos.
ξ
Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas
de algunas bacterias.
ξ
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de
bacterias.
MARCO TEÓRICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el
desarrollo de éste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio
controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se
denominacultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se
denomina
cultivo puro
o
axénico
, cuandocontiene más de una especie de microorganismos se denomina
cultivo mixto
. Un cultivo tipo contiene una especieconocida de microorganismos y es
conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo
axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
Los cultivos axénicosson muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En
un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.
Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora
de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya
que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio
ye n l o s i n s t r u m e n t o s y r e c i p i e n t e s u s a d o s e n l o s e x p e r i m e n t o s .
E s t o s m i c r o o r g a n i s m o s n o d e s e a d o s o contaminantes

deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. E l
segundo paso paraobtener un cultivo axénico es inocular o introducir,
una sola célula de un microorganismo en un medio sólido oliquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo
microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un
clon
está constituido por una población de células descendientes de unsolo
microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser
visible sobre la superficiede un medio sólido.Un cultivo microbiano que ha estado
creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia
no pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos
básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y
concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de losm i c r o o r g a n i s m o s , l o q u e d e t e r m i n a
que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas
p o r microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiológica a otro recipiente, se debentener una serie de cuidados
que eliminen los riesgos de contaminación. Es tos incluyen el área de
trabajo, ell a v a d o d e l a s m a n o s , l a e s t e r i l i z a c i ó n d e t o d o s l o s
u t e n s i l i o s y m e d i o s d e c u l t i v o a e m p l e a r y r e a l i z a r l a transferencia
del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la
flama del mechero.Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar
la contaminación se le llama técnica aséptica; elseguimiento cuidadoso y detallado
de la misma evita accidentes tales como:
o
La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
o
La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la
contaminación de utensilios,productos y del personal. Este último aspecto
es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patógenos.Con relación a la concentración del inóculo, un
error frecuente del principiante consiste en tomar muestrasgrandes, lo
que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza
de un alfiler contiene variosmillones de microorganismos, es obvio que con
una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa,será más que
suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o boquilla
debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolleo portasa
con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.En
la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asa s de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los
diferentesmedios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por
ejemplo: los medios líquidos se preparan en tu bos omatraces que se
cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser
transferidomediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta
pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo
de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiestaen la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que
presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la
velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo decultivos,
las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo
que permite estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que
presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simplevista.Los medios
semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o
pipeta pasteur; eneste último caso es necesario calentar el medio y cuando se
encuentra en estado líquido y a una temperatura deaproximadamente 42ºC se
agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean
paraestudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación
de microorganismos con diferentesrequerimientos de oxígeno.Los medios sólidos
e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades,
despuésde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La
siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha
suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman
agregadosq u e s e h a c e n v i s i b l e s a s i m p l e v i s t a ; a e s t o s a g r e g a d o s
s e l e s d e n o m i n a n c o l o n i a s , l a s q u e p r e s e n t a n características que
varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.En
cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya
que aún cuando la mayoría de losmicroorganismos crecen mejor en pH
neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH
adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la
obtención del cultivo. Con estemismo propósito durante la incubación se deben
proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El
crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas
que la mayoría de lasveces están relacionadas con la de su hábitat
natural.Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren
temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) yalgunos hasta 80ºC. Para alcanzar y
mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológicao un
baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que
presentan su crecimientoóptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden
incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperaturaambiente.En general
las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a
los rangos de temperaturarequeridas por los microorganismos. La desventaja
que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, loque determina la
deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de
cualquier cultivo
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experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más
de nueve días. Con relación a lasnecesidades gaseosas, no todos los
microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólocrecen
en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen
en ausencia de oxígeno sedenominan anaerobios obligados o estrictos,
un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo
facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que
requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando éste existe en concentraciones
reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo deestos diferentes
grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de
oxígeno paralo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.Las
bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas
en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior
de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en f o r m a
libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como
p a r á s i t o s , c o m e n s a l e s o m u t u a l i s t a s . Fisiológicamente este
grupo presenta características muy variables, hay bacterias
m ó v i l e s e i n m ó v i l e s fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas;
se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura,pH y condiciones
gaseosas.En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios
que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular,
forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas,
movilidad,presencia de inclusiones de reserva y características culturales en
medios líquidos y sólidos en los que presentanpatrones de desarrollo en cuanto a
la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra:El método de siembra por estría en placa
Es el

método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un
asa de siembra se tomauna muestra de la población mixta y a continuación
se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una
placa Petri

(a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se


vanh a c i e n d o e s t r í a s e n z i g z a g c o n e l a s a , c a d a v e z s e v a n
d e p o s i t a n d o e n l a s u p e r f i c i e d e l m e d i o m e n o s microorganismos. A
continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han
realizado las últimasestrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la
superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo esteproceso varias veces se
logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban
en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas
experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias
visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una
sola célula, no podemosasegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan
juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de
que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir
deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la
segunda vez, serán, casi con todaseguridad, cultivos axénicos.
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen
antes
de su siembra en placa. Se siguenestas técnicas cuando la muestra contiene
tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en unasola etapa.
Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser
diluida 10
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veces paraobtener una suspensión con un centenar de células por
mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas

(envarias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en


cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión
bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Seagita
vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea
necesario. A continuación, sepuede proceder de dos maneras diferentes.En el
método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en placa.Algunas colonias quedarán embebidas en el
agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales seextenderán y
serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras
diluidas se siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar,
extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristalestéril. La
suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas
sobre la superficie. En ambastécnicas las placas se incuban hasta la aparición
de las colonias. Como en el método de siembra por estría, noexiste la seguridad
de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por
extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en
placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso.Las dos técnicas
de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un
mayor número decolonias aisladas que el método de siembra por estría, por
tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepaa partir de una mezcla con
varios tipos de microorganismos.Para obtener un cultivo axénico mediante este
método:
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(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener
una muestra con sólo unos pocoscientos de bacterias(b) verter la muestra en
un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa
Petri.( c ) D e s p u é s d e l a i n c u b a c i ó n , s e d e s a r r o l l a n c o l o n i a s e n e l
a g a r ( m á s p e q u e ñ a s ) y e n s u s u p e r f i c i e ( m á s grandes).Método de
aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:(a)
esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero(b)
introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra(c) sembrar
haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y(d)
volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un
segundo grupo de estrías enuna región nueva de la placa. Repetir el proceso una
tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos decélulas se diluyan y se
separen células aisladas.(e) Después de la incubación, se desarrollan
colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el
proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una
segunda placa.
El crecimiento de los cultivos axénicos
Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar
(se le hace crecer de nuevo). Paracultivar microorganismos en el laboratorio,
se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos losnutrientes
necesarios para su crecimiento. Los med ios sólidos se hacen
generalmente, añadiendo agar a loslíquidos.
Tipos de medios de cultivo
El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está
cultivando y el porqué de dichocultivo. Los microorganismos presentan una
enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un mediomínimo
para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un
medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los
medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o
paradistinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se
clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales,
selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y
uso.
Medios definidos
Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química
exacta, porque ha sido preparado apartir de compuestos químicos puros.
Echerichia coli
es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de
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composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente
de carbono orgánica (por ejemplo,glucosa), pero puede obtener el resto de
los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otrosorganismos,
denominados
exigentes
, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria
Leuconostoc citrovorum
es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos
ingredientes. Losmedios definidos se usan generalmente para realizar
estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudosobrepasan sus
ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido
y

las bacteriascrecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los


requerimientos nutricionales de todas las bacterias y,por tanto, no siempre pueden
utilizarse.
Medios complejos

Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo.


Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales
como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Unmedio
líquido complejo se denomina
caldo
. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios
s o n usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más
solubles y, por tanto, más fáciles deutilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial
rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degradahasta
aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina
peptonas
. Entre las peptonascomerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y
la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se ledenomina hidrolizado de
caseína.Los diversos componentes de un medio complejo se venden
como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas
complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de
estos medios esel
caldo nutritivo
, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se
solidifica con agar,se denomina
agar nutritivo.
Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son
fáciles depreparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.
Medios selectivos
Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras
suprime el crecimiento de otros.Los medios selectivos se utilizan para aislar
especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo,se utiliza un
medio selectivo, para aislar
Salmonella typhi,
agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de hecesdonde existen
cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos
porque contienen unproducto químico, como la azida sódíca, el telurito
potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos
microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma
porque contiene sulfadiacinay sulfato de polimixina) se utiliza para identificar
Clostridium botulinum
, agente causal de una grave intoxicacióna l i m e n t a r i a . E l m e d i o S P S
permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras
especies de
Clostridium
. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o
una fuente de carbono pococomún.
Medios diferenciales
Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado
microorganismo. Por ejemplo, paraidentificar
Streptococcus pyogenes,
la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es unagar
que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una
zona transparente debidoa que producen hemólisis (muerte y lisis de los
hematíes).
Escherichia coli
y

las bacterias relacionadas con ellase identifican en medios con un indicador de pH


porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian elcolor del indicador y
por tanto de sus colonias.
Medios selectivos-diferenciales
Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar
MacConkey es un ejemplo de medioselectivo-diferencial,

utilizado para detectar cepas de


Salmonella
y
Shigella,
bacterias entéricas (del intestino) quecausan disenterías. Cualquier muestra de
heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientesa muchas
especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz
grosero que disminuyeel campo de identificación. El cristal violeta y las
sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
positivas
(Salmonella
y
Shigella
son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencialdel medio, en
este caso la lactosa, comienza a ser importante.
Salmonella
y
Shigella
no fermentan la lactosa,pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por
tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas,mientras que las restantes
no lo serán.
Medios de enriquecimiento
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Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de
microorganismo a partir de una poblaciónmixta de gran tamaño. Por ejemplo,
las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo
unamuestra de suelo y cultivando los superv ivientes. Solamente las
endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras
de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio
librede nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el
nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogosmicrobianos usan frecuentemente
medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismoque
degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra
de suelo en un medio en elcual la única fuente de carbono sea dicho compuesto.
El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizadoen biorremediación.
Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio
Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo
necesita para crecer, pero estono es suficiente. En el laboratorio, también es
preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto latemperatura
como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno,
según el caso, seráaportado o eliminado.
Temperatura
Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura
en el cual presenta su crecimientoóptimo. Pero, en general, los
microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura,
sinllegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues,
para favorecer un crecimiento rápido, lasbacterias se suelen cultivar a la
temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su
medionatural.
Escherichia coli
la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se
encuentra en elintestino humano y de otros mamíferos. Este
microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo
humano.Los cultivos se mantienen a temperatura constante en
incubadores

o en
baños de agua
,
ambos controladostermostáticamente. Los incubadores, o estufas, son
cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto decultivos sólidos
como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas
Petri, tubos de ensayo, omatraces. Los medios líquidos, distribuidos en
tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de a g u a
caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos
q u e t i e n e n q u e m a n i p u l a r s e c o n frecuencia, en la misma mesa de trabajo.
pH
El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en
un intervalo de pH relativamenteestrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a
valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo,
los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea el
adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento
microbiano lomodifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan
selectivamente algún componente ácido o básicodel medio; o bien, porque algún
producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los
cambiosde pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En
los medios complejos no suele ser esencial,porque sus materiales
naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces
para valoresneutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se
añaden normalmente como nutrientes (fuente defósforo y calcio); pero si se desea
que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores.
Oxígeno

La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para


el crecimiento bacteriano. Algunosmicroorganismos, a los cuales se
denomina
aerobios estrictos
, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía.
Otros microorganismos, llamados
anaerobios estrictos
, no pueden vivir en presencia deoxígeno, para ellos es un agente
tóxico. Otros tipos de organismos, como los
anaerobios facultativos

o los
anaerobios aerotolerantes,

pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los


anaerobiosf a c u l t a t i v o s u t i l i z a n e l o x í g e n o s i d i s p o n e n d e é l , p e r o
t a m b i é n p u e d e n c r e c e r s i n é l . L o s a n a e r o b i o s aerotolerantes no
utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente . Los
organismos
microaerófilos
requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas
tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto,
dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que
suministrar,restringir o eliminar el oxígeno.Suministrar oxígeno a las bacterias que
lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su
presencia,representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que
crecen en la superficie de las placas de agar,obtiene n suficiente
cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia
es completamente
6
anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil,
porque no existe demasiadooxígeno disuelto en el agua y los microorganismos
aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidoscon más de uno o
dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo
haciendo pasar unacorriente de aire a través del cultivo o agitándolo
vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratoriosd e
microbiología existen agitadores, que son plataformas en las
c u a l e s s e p u e d e n c o l o c a r l o s m a t r a c e s convenientemente sujetos,
para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitac ión de
vaivén, quemezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos
de cientos de litros, como los que se utilizanpara producir antibióticos, es un
desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente
mediantegrandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos
enormes cantidades de aire.L a e x c l u s i ó n d e l o x í g e n o d e l a m b i e n t e d e
los anaerobios también plantea problemas técnicos.
M u c h o s microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo
expuestos al oxígeno, sí el medio contieneu n c o m p u e s t o q u í m i c o q u e
reaccione con el mismo, como el tioglicalato
,
q u e r e a c c i o n a c o n e l o x i g e n o manteniendo la parte inferior del tubo libre de
oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri,si estas se
incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado
totalmente el oxígeno y sehaya reemplazado por un gas inerte como
nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una
eliminaciónq u í m i c a d e l o x i g e n o . P a r a e l l o , s e c o m e r c i a l i z a n
p a q u e t e s c o n u n a s m e z c l a s ( l e r e a c t i v o s q u e p r o d u c e n hidrógeno
cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de
un catalizador; lareacción consume el oxígeno produciendo agua. Un
método muy sencillo para disminuir la concentra ción deoxigeno (y al
mismo tiempo producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos
microorganismos) esencender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo
herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta
técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del
ácido láctico.También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando
el dióxido de carbono les favorece.Los microorganismos anaerobios
estrictos, que mueren incluso con una b reve exposición al aire,
puedencultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren
estos contenedores para añadir medioo tomar muestras, se utiliza una
corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se
requierentécnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de
oxígeno
,
en las cuales se trabaja usando unosguantes conectados a las mismas. Algunos
laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicostrabajan con
máscaras de oxígeno.
Conservación de los cultivos axénicos
Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el
laboratorio para poder trabajar con él ointercambiarlo con otros
científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un
medio fresco,mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro
también puede mantenerse viable durante años sinh a c e r l o c r e c e r
periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el
l a b o r a t o r i o p a r a s u e s t u d i o y c o m o referencia se les denomina
cultivos de colección
.
Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se hanaislado en el
mismo o que han obtenido de las denominadas
colecciones de cultivos tipo,

que son organizacionesque mantienen un número enorme de cultivos microbianos


como un servicio a los microbiólogos. Existen muchastécnicas de mantenimiento
de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación
delagua) o en un almacenamiento a baja temperatura.Los cultivos
generalmente se desecan por
liofilización

(congelación y desecación). El método consiste en losiguiente: el cultivo


líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche
descremada parap r o t e g e r l a s c é l u l a s d u r a n t e e l p r o c e s o . L a m e z c l a
s e c o n g e l a e n h i e l o s e c o y s e e x p o n e a l v a c i ó p a r a s u sublimación
(eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las
células permanecencongeladas. Posteriormente se procede al sellado de los
viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivosliofilizados se almacenan a
temperatura ambiente.Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas,
se mezcla con sustancias protectoras, como la lechedescremada, el glicerol, o el
dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por
debajode los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un
ultracongelador,

capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.


Observación de las bacterias:a) Observación macroscópica:
El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las
coloniasque forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de características que nosayudan a su identificación. A nivel
morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto
delborde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo,
color, etc. Incluso sobre medio líquido lasbacterias producen
modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver
esencialmente con lascaracterísticas de su metabolismo. Así se observa si la
turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen enla zona superficial, si
producen pigmentos, etc.
7
b) Observación microscópica:
Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma
deobservarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su
contraste con respecto al medio. Esto seconsigue mediante su teñido
con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de
contraste,generalmente de fases, en el microscopio.Para observar las bacterias
teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un
frotisa p a r t i r d e m e d i o l í q u i d o o d i s p e r s a n d o e n u n a g o t a d e a g u a
u n a p o r c i ó n d e c é l u l a s c r e c i d a s e n s ó l i d o . Posteriormente se
deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como
control detemperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la
llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.CUADRO
DE CARÁCTERÍSTICAS DE BACTERIAS PATÓGENAS:GÉNERO
YESPECIEM A C R O S C Ó P I C A S M I C
R O S C Ó P I C A S T I N T O R I A
L E S
Micrococcusluteus
A e r o b i o e s t r i c t o , c o a g u l a s a negativa, forma colonias
amarillobrillantes en agar
nutritivoc o c o
s G r a m
+
Escherichia Coli
Móviles, aerobias, anaerobiasfacultativas, mesòfilas, pH
6 - 8 , indol, lactosa y glucosa positivoB a c i l o s , c a p s u l a
o m i c r o c á p s u l a , f l a g e l o s perìtricosGram -
Pseudomonaaeruginosa
M ó v i l e s , c o l o n i a s g r i s c o n b r i l l o metálico, aroma semejante a
uvafermentadaBacilos, un flagelo polar o u n m e c h ó n d e 2 a
3 flagelos, pillisGram -
Staphylococcusaureus
Inmóviles, colonias pequeñas,c i r c u l a r e s , b o r d e
c o n t i n u o , cremosas, anaerobios facultativos,fermentadores de maltosa,
lactosa,g l u c o s a , m a n i t o l , p r o d u c c i ó n d e ácido láctico, catalasaCocos,
racimos o cadenascortas, 0.7 a 1.2 micrasGram +
Streptococcus sp
Inmóviles, colonias elevadas, lisas,c i r c u l a r e s , a e r o b i o y
a n a e r o b i o facultativoC o c o s e n r a c i m o s , capsuladasGram
+
Bacillus anthracis
Móviles o inmóviles,
esporulados,aerobiosb a c i
l o s G r a
m +
Bacillus cereus
A e r o b i o o a n a e r o b i o f a c u l t a t i v o , móvil, hidroliza la lecitina de huevoy no
fermenta el manitolB a c i l o s
e s p o r u l a d o G r a m +
Bacillus subtilis
C a t a l a s a + ,
a e r o b i o B a c i l o s
q u e e s p o r u l a n G r a m
+
Yersinia pestis
i n m ó v i l e s , a e r o b i o s , a n a e r o b i o s facultativos, fermentadores, ureasay
catalasa+, en ocasiones prod gasB a c i l o s c o n
e x t r e m o s redondeados, flagelosp e r ì t r i c o s o
a n f i t r i c o s , p i l l i s , c á p s u l a d e p o c o espesor Gram -
Mycobacteriumleprae
N o s e p u e d e c u l t i v a r i n V i t r o , inmóvilB a c i l o d e l g a d o r e c t o ,
e n empalizada o hacesÁcido alcohol resistenteGram.+
Kleibsella pneumoniae
Inmóviles, aerobios, anaerobios f a c u l t a t i v o s , f e r m e n t a d o r e s
y catalasa+, prod. gasB a c i l o s
c a p s u l a d o s G r a m -
Clostridium tetani
M ó v i l e s , c o l o n i a s b r i l l a n t e s , traslucidas, gris amarillas
b o r d e i r r e g u l a r r i z o i d e , a n a e r o b i o s estrictos, pH 7.2-7.6 T
37ºC, prodgas y olor desagradableBacilos solos en cadena opares, flagelos
perìtricos,p r o d e s p o r a s r e d o n d a s terminalesGram +
Clostridiumbotullinum
Colonias pequeñas, traslucidas,borde filamentoso, centro
o p a c o , b l a n c o g r i s á c e o , a n a e r o b i o s estrictosB a c i l o s
a i s l a d o s e n parejas o cadenas cortas,flagelos perìtricosGram +
Mycobacterium
Forman un pigmento amarillo en bacilo delgado, extremos Acido -alcohol
resistente,
8
tuberculosis
i n c u b a c i ó n ,
a e r o b i o s
e s t r i c t o s r e d o n d e a d o
s G r a m . +
Nocardia
M i c r o a e r o f ì l i c o s , a n a e r o b i o s , fermentadores +Bacilos y
cocobacilos Gram +; débilmenteacido-alcohol resistentes
Salmonella Typhi
Móviles, colonias grandes de 2 a 4 m m r u g o s a s o l i s a s ,
a e r o b i o s , anaerobios facultativos, mesòfilos, fermentadores, prod. H
2
SO
4
Bacilos, flagelos perìtricosno esporuladosGram -
Shigelladysenteriae
I n m ó v i l , c o l o n i a s r e d o n d a s 2 m m , convexas, transparentes,
aerobios,anaerobios facultativos, glucosa +indol+ o -
b a c i l o s G
r a m -
Chlamydiatrachomatis
I n m ó v i l e s ,
f i l t r a b l e s c o c o i d
e s G r a m - ;
t i n c i ó n c o n giemsa,
c a s t a ñ e d a o machiavello
Brucella sp
I n m ó v i l e s , a e r o b i o , c a t a l a s a , oxidasa y ureasa
positivosB a c i l o s c o r t o s ; cocobacilosGram -
Neisseriagonnorrhoeae
I n m ó v i l e s , a e r o b i o s , a n a e r o b i o s facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa
yglucosa positivaC o c o s e n p a r e s , capsulados
d e 0 . 6 a 1micraGram -
Streptococcus pyogenes
Inmóviles, colonias en forma de d i s c o , m u c o s a s , m a t e ,
l i s a s o rugosas con hemólisis alrededor,anaerobios facultativos,
producenácido lácticoC o c o s e n c a d e n a , 0 . 5 a 2mmGram+
Rickettsia pallidum
Inmóviles, intracelulares obligadosBacilos o
cocobacilos,p a r e d f o r m a d a p o r 3 c a p a s a
m a n e r a d e c á p s u l a ,
c u b i e r t a mucilaginosaG r a m - ; t i n c i ó n c o n G i e m s a ,
M a c h i a v e l l o o Jiménez
Vibrio Cholerae
M ó v i l , a e r o b i o , a n a e r o b i o facultativo, sensible a la
a c i d e z , c a t a l a s a , i n d o l , o x i d a s a , r o j o d e metilo, sacarosa y fermentador
+B a c i l o c u r v o , u n f l a g e l o polar Gram -
Corynebacteriumdiphtheriae
A e r o b i o y m i c r o a e r o f ì l i c o , i n m ó v i l e s ,
c a t a l a s a + fermentadores + T 35ºC pH 7.6Bacilo en forma de
bastocon uno de sus extremosmás angosto, a grupaciónen
empalizadas.Gram +; la tinción no esu n i f o r m e d e b i d o a l o s g r á n u l o s
q u e c o n t i e n e en su citoplasma, que setiñen más intensamente
MATERIAL:
P i p e t a p a s t e u r estéril4 t u b o s c o n caldo4 tubos
con medio SIM2 m e c h e r o s A s a y
p o r t a s a E t i q u e t a s o
m a r c a d o r

Cultivos de las siguientes bacterias:
ξ
Escherichia coli
ξ
Bacillus Subtillis
ξ
Staphylococcus Aureus
ξ
StreptococcusFaecallis
ξ
Pseudomona Aureginosa
ξ
StaphylococcusEpidermis
MÉTODOLOGÍA:
o
Limpiar y esterilizar el área de trabajo
o
Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien
marcado.
o
Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.
o
Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.a)
Siembra en medio líquido:
Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de
los microorganismos, desde el tubo
9

que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el
asa en el líquido y agitar paradesprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién
sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperaturaóptima de
crecimiento.b)
Siembra en medio semisólido:
La siembra en este tipo de medio,que contiene una proporción menor de
agar que los medios sólidos yq u e s e e n v a s a e n t u b o s , s e l l e v a a
c a b o c o n u n h i l o d e s i e m b r a esterilizado, con el cual se toma la muestra. El
medio queda inoculadoal introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo,
retirándoloposteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar
Técnicas de estriado:
a)
estriado simple:
estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la
cajade petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero
espera que se enfríe el asa ytoma una colonia de la placa. Regresa la caja
a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a
sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de
laplaca y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy
juntas), oscilando el asade siembra sobre la superficie de una porción
pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
b)
estriado en cuadrantes:
la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que
permiteobtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra,
previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de
microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la
placacon medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no
dañar el medio. Se flamea elasa, se enfría y después de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zonade la placa haciendo nuevas
estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando
elasa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa
a incubar, a la temperaturaadecuada, siempre en posición invertida. Mediante
esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir deuna muestra que contenga un
elevado número de bacterias.
Guía de observación:
o
Observe las características culturales de las colonias formadas para cada
sembrado en los diferentes mediosde cultivo.
o
Describa las observaciones en la tabla correspondiente.
o
De cada microorganismo hacer un frote y teñir mediante la técnica de gram.
o
Observe al microscopio describir las características de las diferentes
bacterias en estudio en la tablacorrespondiente.
o
Compare el desarrollo de las bacterias inoculadas en los diferentes medios para
anaerobios.
o
Con base en los resultados obtenidos, indicar cuál bacteria es aerobia,
anaerobia, anaerobia facultativa omicroaerofílica.
Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
sólido:
10
RESULTADOS:
Tabla de las características de cultivos bacterianos:
CULTURALESBacteria
E.FaecallisStaphylococc us AureusBacillusSubtillisStaphylococcu s
EpidermisE s c h e r i c h i a
c o l i P s e u d o m o n a Aureginosa1) En medio
líquido:Crecimient osuperficial
AnaerobiofacultativoAnaerobiofacultativoa e r
o b i o a n a
e r o b i o -
-
Opacidad
m e d i a n
a n u l a m
e d i a n a
n u l a - -
Sedimento
g r u m o s o c o
m p a c t o C o m
p a c t o v i s c
o s o - -
2) En medio semi-sólidoForma dela línea dela picadura
Papilar m ó
v i l
- - -
P a p i l a r m ó v i l V e l l o s a móvil
3) Colonias en placaMedio
Mc Conkey - S a l
M a n i t o l -
M c
C o n k e y E M B
E M B
Forma
F u s i f o r m e -
f u s i f o r m e -
C i r c u l a r C i r c
u l a r C i r c u l a r

Elevación
P l a n a -
c o n v e x a -
C o n v e x a C o
n v e x a C o n v e
x a
Bordes
Filamentoso- O n d u l a d o -
O n d u l a d o O n d u l a d o
O n d u l a d a
Textura
P l a n a -
M e m b r a n o s o-
M e m b r a n o s omembranosoButirosa
Color
r o s a d o -
m o r a d o -
r o j i z o m o r
a d o M e t a l i
c o
MICROSCÓPICAS
Forma
C o c o s C o c o s
B a c i l o s C o c
o s B a c i l o s b
a c i l o s
Agrupación
C a d e n a s R a c i m o s E n p a r e s
y en
cadenaR a c i m o s C a d e
n a s C a d e n a s
Gram
G r a m
+ G r a m
+ G r a m
+ G r a m
+ G r a m -
G r a m - DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Se realizaron 3 técnicas para sembrado de cultivo: en medio líquido (con


caldo nutritivo), en medio semi-sólido (medio SIM) y en placa (con
estriado simple y en cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para después
dejar incubar las bacterias.

Una vez incubadas las bacterias se observaron sus características


macroscópicas o culturales y suscaracterísticas microscópicas; Los resultados
de estas observaciones realizadas se pueden ver en la tablaa n t e r i o r , e n l a
que se puede observar que cada una de ellas varía de a cuerdo
a s u s c a r a c t e r í s t i c a s específicas de crecimiento en los diferentes
medios.CONCLUSIONES:Por medio de esta práctica se logró utilizar las
técnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logróaprender a
realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de
esta manera observar suscaracterísticas tanto macroscópicas como
microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó
11
que para cada bacteria existen características diferentes que son las
que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera
se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación paraanálisis
posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u
organismo.BIBLIOGRAFÍA:
ξ
Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases etiológicas de
las enfermedades infecciosas.Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-
429
ξ
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS0506.doc
ξ
http://es.wikipedia.org/wiki/
ξ
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf

PRESENTACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:


Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes:
Medios Líquidos o caldos de cultivo
: Son los que una vez preparados se mantienen enestado líquido. Suelen utilizarse para
realizar la suspensión de disolución de la muestra aanalizar con el fin de conseguir la
disolución madre. Pueden presentarse en bolsas de 5litros, en frascos de 250 ml, o
en tubos de un solo uso.
Medios sólidos:
Contiene un agente espesante, por lo general agar a una concentracióndel 1,5 %. El agar
es un derivado de algas. Es sólido a temperaturas inferiores a los 40 o

45ºC.
Medios semisólidos:
T i e n e n u n a c o n s i s t e n c i a i n t e r m e d i a e n t r e l a d e l o s a n t e r i o r e s . Suelen
contener una concentración de agar del 0,7 %.Tal como hemos apuntado, la mayoría
de los medios de cultivo se compran hoy en día y a p r e p a r a d o s . U n o s
llegan para su uso en distintas presentaciones, y
o t r o s deshidratados. La ventaja de los primeros es su comodidad y la desventaja, que su
plazode conservación es corto. Los deshidratados, en cambio, pueden
conservarse bastantemás tiempo, pero hay que prepararlos antes de usarlos.
https://es.scribd.com/doc/29302476/Medios-de-Cultivo

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