CAPÍTULO 65 BIOSÍNTESIS DE ETANOL

Los seres humanos han estado preparando bebidas fermentadas durante más de 5000 años. Los materiales excavados en
las tumbas egipcias que datan del tercer milenio a. C. demuestran las operaciones utilizadas para hacer cerveza y pan
fermentado. La historia de la fermentación, mediante la cual el azúcar se convierte en etanol por acción de la levadura,
también es una historia de la química. La palabra gas fue acuñada por van Helmont en 1610 para describir las burbujas
producidas en la fermentación. Leeuwenhoek observó y describió las células de la levadura con su microscopio recién
inventado en 1680. Joseph Black descubrió en 1754 el dióxido de carbono y demostró que se trataba de una fermentación
de un producto, la quema de carbón y la respiración. Lavoisier en 1789 demostró que el azúcar produce etanol y dióxido
de carbono e hizo mediciones cuantitativas de las cantidades consumidas y producidas.

Una vez que se estableció el concepto de mole, Gay-Lussac en 1815 podría mostrar que 1 mol de glucosa proporciona
exactamente 2 mol de etanol y 2 mol de dióxido de carbono. Pero el proceso de fermentación dejó perplejos a algunos
grandes químicos. El poco conocido Kutzing escribió en 1837, sobre la base de la observación microscópica "Es obvio
que los químicos deben ahora eliminar la levadura del rollo de compuestos químicos, ya que no es un compuesto sino un
cuerpo organizado, un organismo. Por otro lado, había químicos como Berzelius, que creía que la levadura tenía una
acción catalítica; y Liebig, quien presentó una "teoría del movimiento de los elementos dentro de un compuesto que
causaba una perturbación del equilibrio que se comunicaba a los elementos de la sustancia con la que entraba en contacto,
formando así nuevos compuestos".

Quedó para Pasteur para demostrar que la fermentación era una acción fisiológica asociada con los procesos de la vida de
la levadura. A través de su microscopio podía ver las células de levadura que crecían naturalmente en la superficie de las
uvas. Mostró que el jugo de uva cuidadosamente extraído del centro de una uva y expuesto al aire limpio no fermentaría.
En su artículo clásico de 1857, describió la fermentación como la acción de un organismo vivo; pero debido a que la
conversión de glucosa en etanol y dióxido de carbono es una ecuación equilibrada, otros químicos cuestionaron sus
hallazgos. Buscaron la sustancia en la levadura que podría causar la reacción. La búsqueda duró 40 años, finalmente
terminó con un ingenioso experimento de Eduard Buchner. Hizo un extracto de levadura libre de células que aún causaría
la conversión de azúcar en alcohol.

Este extracto libre de células contenía los catalizadores, que ahora llamamos enzimas, que eran necesarios para la
fermentación, un descubrimiento que le valió el premio Nobel de 1907. En 1905 descubrió que el fosfato inorgánico
añadido a las enzimas aumentaba la tasa de fermentación y se consumía a sí mismo. Este resultado lo llevó a aislar
finalmente la fructosa 1,6-difosfato. Claramente, la historia de la bioquímica está íntimamente asociada con el estudio de
la fermentación alcohólica.

Los pueblos antiguos descubrieron muchas de las reacciones esenciales de la fermentación completamente por accidente.
Que las uvas trituradas pronto comenzarían a formar espuma y burbujas y producir una bebida agradable es un
descubrimiento perdido en el tiempo. Pero, ¿qué hay de los que vivían en climas más fríos donde la uva no crecía? ¿Cómo
descubrieron que el almidón del trigo o la cebada podrían convertirse en azúcar por las enzimas de la malta? Cuando el
grano germina, se producen enzimas que convierten el almidón en azúcar. El proceso de malteado consiste en dejar que el
grano comience a germinar y luego calentar y secar los brotes para detener el proceso antes de que las enzimas se agoten.
El color de la malta depende de la temperatura del secado. El más oscuro se usa para stout y porter, el encendedor para
Brown, ambar y pale ale. Debido a un descubrimiento hace algún tiempo de que la bebida resultante no se echó a perder
tan rápidamente si se agregaba el lúpulo, ahora también tenemos cerveza

Existen otras fuentes para las amilasas que catalizan la conversión de almidón en glucosa. Los campesinos peruanos hacen
una bebida llamada "chicha" de trigo masticado, que se seca en pequeños pasteles. Cuando se agregan agua, levadura y
trigo molido, la mezcla resultante se fermenta en una bebida similar a la cerveza. La enzima amilasa salival es el
catalizador para esta conversión de almidón a glucosa.
Los panaderos hacen uso de la fermentación aprovechando el gas liberado para fermentar el pan. En el presente
experimento, la levadura de panadería se usa para convertir sacarosa, azúcar de mesa común, en etanol y dióxido de
carbono con unas 14 enzimas como catalizadores, además de trifosfato de adenosina (ATP), ion fosfato, pirofosfato de
tiamina, ion magnesio y nicotinamida reducida. dinucleótido de adenina (NADH), todos presentes en levadura.

El proceso de fermentación, conocido como el esquema de Emden-Meyerhof-Parnas, implica la hidrólisis de la sacarosa

en glucosa y fructosa, que, como sus fosfatos, se dividen en dos fragmentos de tres carbonos. Estos fragmentos, como sus
fosfatos, finalmente se convierten en ácido pirúvico, que se descarboxila para dar acetaldehído.

El acetaldehído, a su vez, se reduce a etanol en el paso final. Cada paso requiere una enzima específica como catalizador
y, a menudo, iones inorgánicos, como magnesio y, por supuesto, fosfato. Se liberan treinta y una kilocalorías de calor por
mol de glucosa consumida en esta secuencia de reacciones anaeróbicas.

Esta misma secuencia de reacciones, hasta la formación de ácido pirúvico. Ocurre en el cuerpo humano en momentos de
estrés cuando se necesita energía, pero no hay suficiente oxígeno disponible para la oxidación aeróbica normal. El ácido
pirúvico en estas condiciones se convierte en ácido láctico. Es la acumulación de ácido láctico en los músculos que es en
parte responsable de la sensación de fatiga.

El primer paso en la secuencia es la formación de glucosa-6-fosfato (2) a partir de glucosa (1). La reacción requiere
adenosina trifosfato La glucoquinasa se convierte en el difosfato (ADP por catálisis con la enzima que requiere el ion
magnesio para funcionar. Esta conversión es una de las reacciones en las que se libera energía. En el organismo vivo, esta
energía puede ser útil para hacer trabajar en fermentación simplemente crea calor.

En el siguiente paso, la enzima fosfoglucoisomerasa convierte la glucosa-6-fosfato (2) a través del enol del aldehído en
fructosa-6-fosfato (3). La fructosa monofosfato (3) se convierte en el bis-fosfato (4) por la acción del ATP bajo la
influencia de la fosfofructocinasa con la liberación de más energía. Este bis-fosfato (4) se somete a un catalizador de
reacción aldólica inversa por aldolasa para dar fosfato de dihidroxiacetona (5) y fosfato de gliceraldehído (6). Los dos
últimos se interconvierten mediante triosfosfato isomerasa. El grupo aldehído del fosfato de gliceraldehído (6) se oxida
con dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD en presencia de otra enzima a un grupo carboxilo que se fosforila con
fosfato inorgánico. En la siguiente reacción, el ADP se combina con ATP ya que 7 pierde fosfato para dar 8 Una mutasa
convierte el 3-fosfato (8 en el 2-fosfato (9). Una enolasa convierte 9 a 10, y una quinasa convierte 10 en ácido pirúvico
(11). Una descarboxilasa convierte el ácido pirúvico (11) en acetaldehído (12) en el proceso de fermentación. La alcohol
deshidrogenasa de levadura (YAD), una enzima bien estudiada, cataliza la reducción de acetaldehído a etanol. El agente
reductor es nicotinamida adenina dinucleótido reducida, NADH.

Las enzimas son catalizadores notablemente eficientes, pero también son lábiles (sensibles) a factores tales como calor y
frío, cambios en el pH y varios inhibidores específicos. En el primer experimento de este capítulo, tendrá la oportunidad
de observar la biosíntesis del etanol y probar los efectos de diversos agentes en el sistema enzimático.

EN ESTE EXPERIMENTO, una solución acuosa tibia de sacarosa y fosfato de sodio en presencia de levadura se deja
fermentar a etanol y dióxido de carbono. Los catalizadores enzimáticos de la levadura se vuelven inactivos cuando la
concentración de alcohol alcanza 10-12%. La destilación fraccionada de la mezcla de reacción producirá etanol al 95%
puro, un azeótropo de punto de ebullición constante.

A un matraz de 5 ml de fondo redondo y cuello largo, agregue 90 mg de levadura seca y 1,25 ml de agua tibia (hasta 50 °
C). Agite bien la mezcla hasta que tenga una apariencia más o menos homogénea, luego añada 9 mg de hidrogenofosfato
disódico. 1,30 g de sacarosa y 3,75 ml adicionales de agua que deben calentarse a unos 45 ° C. Agitar esta mezcla para
garantizar una mezcla completa, luego colocar el cuello del matraz con un septo conectado a un 8-in. longitud del tubo de
polietileno (Fig. 65.1). Guíe este tubo por debajo de la superficie de aproximadamente 2 ml de una solución acuosa
saturada de hidróxido de calcio (agua de cal) en un tubo de reacción. El tubo en el agua de cal actuará como un sello para
prevenir que el aire y las enzimas no deseadas entren al matraz, pero permitirán que escape el gas. Coloque el conjunto en
un lugar cálido (la temperatura óptima para la reacción es de 35 ° C) durante una semana, en cuyo momento la evolución
del dióxido de carbono habrá cesado, ¿cuál es el precipitado en el agua de cal?

En pequeña escala, será necesario proporcionar calor externo para mantener la fermentación o agrupar varias reacciones
muy juntas en un recipiente aislado. En una escala mayor, dado que la fermentación es una reacción exotérmica, la
reacción produce suficiente calor para mantener la mezcla caliente y promover la biosíntesis del etanol.

Al completar la fermentación, agregue aproximadamente 0,25 g de coadyuvante de filtración de Celite (tierra de

diatomeas, polvo facial) al matraz y agítelo vigorosamente. Celite se agrega para que sea posible filtrar la solución. De lo
contrario, las células de levadura obstruirán el papel de filtro. Filtrar la mezcla en el embudo Hirsch en un matraz de filtro
de 25 ml que se conecta al aspirador de agua a través de una trampa mediante un tubo de vacío (véase la Fig. 3.14).
Debido a que el pequeño matraz de filtro puede volcarse fácilmente, sujételo a un soporte de anillo. Humedezca el papel
de filtro con agua, aplique una succión suave (suministro de agua al aspirador encendido con toda la fuerza, la válvula
para atrapar parcialmente abierta) y vierta lentamente la mezcla de reacción en el filtro. Lave el matraz con un mililitro de
agua y enjuague la torta del filtro con esta agua. El vacío total en esta filtración evaporará algo del etanol deseado

El filtrado, que es una solución diluida de etanol contaminado con algunos trozos de material celular y otros compuestos
orgánicos (ácido acético si no tiene cuidado), se guarda en un recipiente tapado hasta que se destila siguiendo el
procedimiento descrito en el Capítulo 5.

MACROESCALA

Macerar (triturar) media caje de levadura o la mitad de una envoltura de levadura seca en 50 ml de agua en un vaso de
precipitados, agregar 35 g de hidrogenofosfato disódico, y transferir esta suspensión a un matraz de fondo redondo de 500
ml. Agregue una solución de 51.5 g de sacarosa en 150 mL de agua y agite para asegurar una mezcla completa. Coloque
el matraz con un tapón de goma de un orificio que contenga un tubo de vidrio doblado que se sumerge debajo de la
superficie de una solución acuosa saturada de hidróxido de calcio (imewater) en un tubo de 6 pulgadas. tubo de ensayo
(Fig. 65.2). El tubo en agua de cal actuará como un sello para evitar la entrada de aire y enzimas no deseadas al matraz,
pero permitirá que escape el gas. Coloque el conjunto en un lugar cálido en su escritorio (la temperatura óptima para la
reacción es de 35 ° C) durante una semana, en cuyo momento la evolución del dióxido de carbono habrá cesado. ¿Cuál es
el precipitado en el agua de cal?

Después de completar o fermentar, 10 g de coadyuvante de filtración de Celite (diatoma ceous earth, polvo de cara) en el
matraz, agitar vigorosamente y filtrar. Use un embudo Buchner de 5.5 cm colocado en un adaptador de neopreno o
Filtervac sobre un matraz de filtro de 500 ml que está conectado al aspirador de agua a través de una trampa mediante un
tubo de vacío (Fig. 65.3). Debido a que el aparato es muy pesado, sujete el matraz a un soporte de anillo. Humedezca el
papel de filtro con agua, aplique una succión suave (suministro de agua al aspirador encendido con toda la fuerza, pinza
para la ropa en la trampa parcialmente cerrada) y vierta lentamente la mezcla de reacción en el filtro. Lave el matraz con
algunos mililitros de agua de su botella de lavado y enjuague la torta del filtro con esta agua. El coadyuvante de filtración
se utiliza para evitar que los poros del papel de filtro se obstruyan con restos celulares de la levadura.

El filtrado, que es una solución diluida, de trozos de material celular contaminados con etanol y otros compuestos
orgánicos (ácido acético si no tiene cuidado), se guarda en un matraz tapado hasta que se destila siguiendo el
procedimiento descrito en chaper 5

Limpieza Como la sacarosa, la levadura y el etanol son productos naturales, todas las soluciones producidas en este
experimento contienen material biodegradable y se pueden tirar por el desagüe después de la dilución con agua. El agua
de cal se puede eliminar de la misma manera. El coadyuvante de filtración de Celite se puede colocar en el contenedor de
desechos sólidos no peligrosos.

Efecto de varios reactivos y condiciones sobre reacciones enzimáticas.

PROCEDIMIENTO DE MICROESCALA

Prepare una mezcla de fermentación exactamente como se describe en el Experimento 1. Después de aproximadamente 15
minutos, cuando la fermentación debe progresar adecuadamente, divida la mezcla en cinco partes iguales en tubos de
reacción. A un tubo agregue 1,0 ml de agua, al siguiente agregue 1,0 ml de etanol al 95% y al siguiente agregue 1,0 ml de
solución de fluoruro de sodio 0,5 M. Caliente el siguiente tubo durante 5 minutos en un baño de vapor o baño de agua
hirviendo, y enfríe el siguiente tubo durante 5 minutos en hielo. Agregue a cada tubo 2 gotas de aceite mineral. El aceite
flotará en la solución acuosa y evitará la exposición al oxígeno, que es necesario porque la fermentación es un proceso
anaeróbico. Coloque los tubos en un vaso de agua a una temperatura de 30 C durante 15 minutos; luego, conecte uno por
uno mientras está en el vaso de precipitados a una pipeta graduada de 1.0 mL invertida que ha sido taponada en un
extremo como se muestra en la Fig. 65.4 Registre el volumen de gas en la pipeta cada minuto durante 5 minutos o cuente
las burbujas evolucionado por minuto. Trace una gráfica del volumen de gas contra el tiempo para cada una de las cinco
reacciones. ¿Qué conclusiones puedes sacar de los resultados de estas cinco reacciones?

PROCEDIMIENTO DE ESCALA MACROSCÓPICA

Aproximadamente 15 minutos después de mezclar la levadura, la sacarosa y el fosfato, retire 20 ml de la mezcla y coloque
4 ml en cada uno de los cinco tubos de ensayo. A un tubo agregue 1.0 mL de agua, al siguiente agregue 1.0 mL de etanol
al 95%, al siguiente agregue 1.0 mL de fluoruro de sodio 0.5 M. Caliente el siguiente tubo durante 5 minutos en un baño
de vapor y enfríe el siguiente tubo durante 5 minutos en hielo. Agregue 10-15 gotas de aceite mineral encima de la mezcla
de reacción en cada tubo (para excluir el aire, ya que el proceso es anaeróbico). Coloque los tubos en un vaso de agua a
una temperatura de 30 ° C durante 15 minutos, luego tómelos de uno en uno y conéctelos al manómetro como se muestra
en la Fig.65.5

Espere unos 30 segundos para equilibrar la temperatura, luego sujete el tubo de ventilación y lea el manómetro. Registre
la altura del fluido del manómetro en el brazo abierto del tubo en U cada minuto durante 5 minutos o hasta que el líquido
llegue a la parte superior del manómetro. Trace un gráfico de la altura del fluido del manómetro en función del tiempo de
cada una de las cinco reacciones.

Limpieza: combine todas las mezclas de reacción, retire el aceite mineral de la fábrica y colóquelo en el contenedor de
solventes orgánicos. Las soluciones acuosas, después de diluir con aproximadamente 50 volúmenes de agua, se pueden
tirar por el desagüe. Las soluciones que contienen iones fluoruro son altamente tóxicas y no deben colocarse en el sistema
de alcantarillado, sino que deben neutralizarse y tratarse con un exceso de cloruro de calcio para precipitar el fluoruro de
calcio. Este último se separa por filtración y se coloca en el contenedor de desechos sólidos no peligrosos.

PREGUNTAS

1. usando levadura, ¿se puede convertir la glucosa en etanol? ¿Se puede convertir la fructosa en etanol?

2. escriba la ecuación para la formación del precipitado formado en el tubo de ensayo que contiene hidróxido de calcio.

3. en este experimento, ¿se podría producir 90% de etanol agregando más azúcar al matraz de fermentación?