Actualización parcial

770. VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS

La valoración microbiológica de antibióticos se realiza comparando, en idénticas
condiciones de ensayo, la inhibición de la multiplicación de microorganismos sensibles
producida por concentraciones conocidas de una Sustancia de referencia frente a la
inhibición producida por diluciones del antibiótico que se está valorando.
Estos ensayos ponen de manifiesto la verdadera actividad antimicrobiana del producto.
Las Sustancias de referencia empleadas en los ensayos microbiológicos son sustancias
cuya potencia (actividad) ha sido determinada con precisión frente una Sustancia de
referencia, trazable al patrón internacional o a la preparación de referencia internacional
correspondiente.
El ensayo debe ser diseñado de forma tal que permita verificar la validez del modelo
matemático sobre el que se basa la ecuación del cálculo de potencia. Si se escoge un
modelo de líneas paralelas, las dos rectas formadas por logaritmo de dosis y respuestas (o
respuesta transformada) correspondientes a la preparación muestra y a la preparación
de referencia deben ser paralelas.
Asimismo, deben ser lineales en el intervalo de dosis empleado para el cálculo. También
ambas rectas deben tener una regresión significativa. Estas condiciones deben verificarse
mediante pruebas de validez para una determinada probabilidad, generalmente p=0,05.
Para determinar si un antibiótico cumple con los requisitos de potencia especificados en
la monografía correspondiente; debe repetirse la valoración y combinarse los resultados
estadísticamente hasta lograr la precisión requerida. Esta debe ser tal que los límites de
confianza (P=0,95), expresados porcentualmente, se encuentren dentro del intervalo de
potencia especificado en la monografía correspondiente.
Se emplean dos métodos generales: método de difusión en agar o en placa y método
turbidimétrico o en tubo. El primero se basa en la difusión del antibiótico desde un punto
de aplicación, a través de una capa de agar inoculado con el microorganismo de ensayo.
La difusión origina zonas o halos de inhibición del microorganismo, cuyo tamaño
(Diámetro) está en relación con la concentración de antibiótico. El método turbidimétrico
se efectúa en un medio de cultivo líquido inoculado con un microorganismo de ensayo, al
que se le agregan concentraciones crecientes del antibiótico. Luego del período de
incubación se determina la turbidez producida por el desarrollo microbiano, la cual está
en función de la concentración del antibiótico.
Para obtener el intervalo de concentraciones de trabajo, debe realizarse previamente una
curva dosis-respuesta y aplicar los métodos estadísticos apropiados.

Sustancias de referencia y unidades

La potencia de los antibióticos se expresa en Unidades o μg de actividad. En cada caso, la
Unidad o μg de actividad antibiótica se establece y define internacionalmente. [NOTA: no
se debe asumir que la Unidad debe necesariamente corresponder a los μg (peso) del
antibiótico].
DILUYENTES Y MEDIOS: Soluciones reguladoras de fosfato y otras soluciones
Las soluciones reguladoras se deben esterilizar luego de ser preparadas y el pH
recomendado en cada caso corresponde al determinado luego de su esterilización.
Tanto las soluciones, los medios y microorganismos a utilizar según el antibiótico a valorar
se encuentran tabulados específicamente para su utilización.
Preparación del estándar -
Preparar una solución madre del estándar disolviendo una cantidad previamente secada,
si fuera necesario, y exactamente pesada de la Sustancia de referencia correspondiente.
Diluir con el solvente especificado en la Tabla 1 hasta obtener la concentración indicada.
Almacenar la solución en un refrigerador y emplearla dentro del período de uso indicado.
En el día del ensayo preparar, a partir de la solución madre del estándar, tres o más
diluciones en progresión geométrica empleando el diluyente especificado.
Preparación de la muestra -
Se debe asumir una potencia por unidad de peso o volumen de acuerdo con la
información disponible de la preparación muestra. Bajo esta hipótesis se debe preparar
en el día del ensayo una solución madre de la muestra y tres o más diluciones en
progresión geométrica equipotentes con las preparadas de estándar como se especifica
para cada antibiótico. Emplear los mismos diluyentes que se indican para la Sustancia de
referencia.
Preparación del microorganismo de ensayo-
Se recomienda emplear preferentemente cepas de colección, las que se repicarán
periódicamente en medios apropiados para el mantenimiento de los microorganismos.
De ser posible, las cepas deben ser liofilizadas para su mejor conservación.

MÉTODOS GENERALES DE VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA

1-Método de difusión en agar

Procedimiento - De acuerdo con el antibiótico a valorar, fundir una cantidad suficiente de

medio de cultivo estéril según se indica, enfriar a temperatura apropiada (por ej., entre
45 y 50 °C para las formas vegetativas), inocular el medio y agitar por rotación hasta
lograr una suspensión homogénea.
Emplear placas de Petri o bandejas rectangulares de fondo plano y, trabajando sobre una
superficie plana y horizontal, verter en las placas un volumen determinado de medio
inoculado para formar una capa uniforme de 2 a 5 mm de espesor. Alternativamente, el
medio puede estar formado por dos capas, aunque sólo se inocule la superior.
Para algunos microorganismos de ensayo, el procedimiento puede mejorarse si las placas
inoculadas se dejan secar durante 30 minutos antes de ser empleadas o si se refrigeran a
4 °C durante varias horas.
Los reservorios empleados generalmente son cilindros estériles de porcelana, de acero
inoxidable o de cualquier otro material apropiado, discos estériles de papel o pocillos
excavados en el agar.
El volumen que se carga en los reservorios debe ser uniforme y con una tolerancia
máxima de 5 %.
Emplear los solventes y las soluciones reguladoras indicadas en la Tablas para preparar las
soluciones de la Sustancia de referencia y las del antibiótico a ensayar.
Para asegurar la validez de la valoración, emplear por lo menos tres concentraciones
diferentes de la Sustancia de referencia y tres concentraciones del antibiótico a ensayar
que presumiblemente tengan la misma actividad que las soluciones de la Sustancia de
referencia. Se deben emplear series de concentraciones en progresión geométrica para
aplicar el método estadístico.
Distribuir las diluciones en cada placa de Petri o en cada placa rectangular, según un plan
estadísticamente apropiado. En el caso de placas pequeñas que no pueden contener más
de seis diluciones, alternar las diluciones del antibiótico y las diluciones de la Sustancia de
referencia, con el fin de evitar cualquier interacción entre las diluciones de mayor
concentración. Las placas de Petri deben incubarse sin invertirla temperatura indicada ±
0,5 °C durante 18 horas aproximadamente. Es aconsejable un período de predifusión
antes de la incubación, que puede oscilar de 30 minutos a 4 horas, a temperatura
ambiente o próxima a 4°C, según el caso, esto tiene por finalidad reducir los efectos de
desfasaje de tiempo entre la aplicación de las diferentes soluciones sobre las placas y así
mejorar la recta de regresión o bien obtener halos mayores y más nítidos. Empleando un
instrumento de medición apropiado, medir el diámetro de cada halo con una precisión de
hasta la décima de mm. Calcular la actividad empleando métodos estadísticos
apropiados. Emplear el suficiente número de réplicas por concentración de antibiótico en
cada ensayo (no menos de cuatro placas) para asegurar la precisión estadística.

Método turbidimétrico

Procedimiento - Inocular un volumen de medio de cultivo preferentemente conservado a

una temperatura de 2 a 8 °C, con un volumen determinado de suspensión original
estandarizada del microorganismo apropiado y emplearlo inmediatamente.
Para preparar las soluciones de la Sustancia de referencia y las soluciones del antibiótico a
ensayar en concentraciones que se consideren iguales, emplear los solventes y las
soluciones reguladoras indicadas en tablas.
En tubos de ensayo estériles e idénticos, transferir volúmenes iguales de cada solución y
agregar el mismo volumen de medio de cultivo inoculado a cada uno de ellos (como por
ej., 1 ml de solución y 9 ml de medio).
Preparar simultáneamente dos tubos control que contengan cada uno 9 ml de medio de
cultivo inoculado y 1 ml de solvente empleado (sin antibiótico). Agregar inmediatamente
a uno de ellos 0,5 ml de formaldehído diluido. Este tubo será empleado como blanco y
sirve para calibrar el espectrofotómetro. El tubo restante, constituye el testigo de
crecimiento que se emplea para determinar la finalización de la incubación.
Para asegurar la validez de la valoración, emplear por lo menos tres concentraciones
diferentes de la sustancia de referencia y tres concentraciones del antibiótico a ensayar
que presumiblemente tengan la misma actividad que las soluciones de la Sustancia de
referencia. Se deben emplear series de concentraciones en progresión geométrica para
aplicar el método estadístico.
Ubicar todos los tubos, distribuidos al azar, en cuadrado latino o en bloques aleatorios, en
un baño de agua a 37 °C (28 °C para Candicidina). Tomar precauciones para asegurar una
distribución homogénea del calor e idéntico tiempo de incubación, generalmente de 2 a 4
horas.
Luego de la incubación, detener la multiplicación de los microorganismos por adición al
azar de 0,5 ml de formaldehído diluido a cada tubo, excepto a los tubos rotulados como
blanco.
Medir la turbidez del contenido de cada tubo con un espectrofotómetro apropiado, a 530
nm. Calcular la actividad empleando el método estadísticos apropiados.
En cada ensayo, emplear el número de réplicas por concentración de antibiótico (no
menor de 6 tubos) para asegurar la precisión estadística.
[NOTA: el procedimiento para ambos métodos, debe realizarse en condiciones asépticas].
ANALISIS ESTADÍSTICO

Curva Dosis-Respuesta - Para comprobar si cualquier ensayo en particular se está

realizando por el modelo de rectas paralelas, es necesario examinar, previo a la
realización de ensayos de rutina, la relación dosis respuesta del componente activo.
Cuando la diferencia entre la relación del logaritmo de la dosis y la respuesta de la
preparación patrón, se desvía notablemente del efecto teórico, el modelo de rectas
paralelas no es válido para este ensayo en particular. Debe verificarse que en el intervalo
de dosis empleado en los ensayos, la relación entre el logaritmo de dosis y la respuesta;
es representada por una recta de adecuada regresión y linealidad, con una probabilidad
de 0,05.
Diseños de ensayo - La asignación de las unidades experimentales a los diferentes
tratamientos puede realizarse de distintas formas.
Diseño completamente aleatorio - Si la totalidad de las unidades experimentales parece
ser razonablemente homogénea, sin indicación alguna de que la variabilidad de la
respuesta sea distinta dentro de ciertos subgrupos reconocibles la asignación de las
unidades a los diferentes tratamientos debe hacerse aleatoriamente.
Diseño en bloque aleatorio - En este diseño, es posible segregar una fuente identificable
de variación, tal como la variación entre placas de Petri en un ensayo microbiológico por
difusión. El diseño requiere que todos los tratamientos se apliquen el mismo número de
veces en cada bloque (placa de Petri) y es apropiado solamente cuando el bloque es lo
suficientemente grande como para acomodar todos los tratamientos.
Diseño de cuadrado latino - Este diseño es apropiado cuando la respuesta puede verse
afectada por dos fuentes diferentes de variación, cada una de las cuales puede asumir k
niveles o posiciones diferentes. En un ensayo en placa de un antibiótico, los tratamientos
pueden disponerse en una serie de k x k sobre una placa grande, realizándose cada
tratamiento una vez en cada fila y en cada columna.
El diseño es apropiado cuando el número de filas, el número de columnas y el número de
tratamientos son iguales.

Pruebas de validez
El ensayo es estadísticamente válido si el resultado del análisis de la varianza cumple
como mínimo con los siguientes requisitos:
1- Regresión: debe ser significativa para un valor de p ≤ 0,05. El estadístico F calculado
debe ser mayor que el F que figura en la tabla de Fischer, para un valor de α ≤ 0,05 para
los grados de libertad correspondientes al numerador y denominador del estadístico F
calculado.
2- Desvío del paralelismo: debe ser no significativo para un valor de p ≥ 0,05. El
estadístico F calculado debe ser menor que el F que figura en la tabla de Fischer para un
valor de α ≥0,05 para los grados de libertad correspondientes al numerador y
denominador del estadístico F calculado.
3- Desvío de la linealidad: debe ser no significativa para un valor de p ≥ 0,05. EI estadístico
F calculado debe ser menor que el F que figura en la tabla de Fischer para un valor de α ≥
0,05 para los grados de libertad correspondientes al numerador y denominador del
estadístico F calculado.
Sólo una vez que se ha demostrado la validez estadística del ensayo puede calcularse la
potencia de la preparación desconocida y sus intervalos de confianza.
[NOTA: para ambos métodos de valoración, si la potencia calculada es menor de 80 % o
mayor de 125 % que la supuesta para el producto o antibiótico analizado, ajustar las
concentraciones de las soluciones muestra hasta alcanzar igual actividad supuesta que las
soluciones de referencia y repetir la valoración].