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INDICE

MM01 .- PRINCIPIOS GENERALES DE MICROBIOLOGIA COSMETICA.

MM01.1 .- ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CELULA BACTERIANA

MM01.2 .- ESTRUCTURA DE LA CELULA FUNGICA

MM01.3 .- CRECIMIENTO DE BACTERIAS Y HONGOS

MM01.4 PRINCIPALES MICROORGANISMOS CONTAMINANTES

MM02.- NORMAS A SEGUIR Y BIOSEGURIDAD APLICADAS AL


LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA.

MM03 .- EQUIPOS DE LABORATORIO.

MM03.1 .- RELACION DE EQUIPOS CRITICOS.

MM03.2 .- RELACION DE EQUIPOS NO CRITICOS.

MM03.3 .- RELACION DE EQUIPOS RETIRADOS DEL LABORATORIO

MM03.4 .- FUNDAMENTOS Y DESCRIPCIONES DE USO.

MM03.5 .- MANTENIMIENTO, LIMPIEZA Y REGISTROS.

MM04 .- PREPARACION DEL MATERIAL DE TRABAJO.

MM04.1 .- MATERIAL DE VIDRIO.

MM04.2 .- MUESTREADORES.

MM04.3 .- RECOMENDACIONES GENERALES.

MM04.4 .- MEDIOS DE CULTIVO.

MM04.5 .- REACTIVOS.

MM05 .- MUESTREO

MM05.1 .- METODOS DE MUESTREO.

MM05.2 .- CRITERIOS DE MUESTREO

MM05.3.- MUESTREO DE ACUERDO AL TIPO DE PRODUCTO.

MM06 .- ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MMPP, FABRICACIONES Y P.T.

MM06.1.- DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO

MM06.1.1.- PASOS PREVIOS AL ANALISIS MICROBIOLOGICO

MM06.1.2.- MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

MM06.1.3.- MATERIALES Y EQUIPOS

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MM06.1.4.- PROCEDIMIENTO GENERAL PARA REALIZAR EL
UN ANALISIS

MM06.1.5 ANALISIS DE ACUERDO AL TIPO DE PRODUCTO

MM06.1.6 CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS DE LOS


MEDIOS DE CULTIVO

MM06.2 .- INTERPRETACION DE RESULTADOS.

MM06.3 .- EMISION DE RESULTADOS.

MM07. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ENVASES.

MM07.1 .- ENVASES VACIOS DE PRODUCTOS TERMINADOS.

MM07.2.- APLICADORES DE PRODUCTOS COSMÉTICOS (MOTAS,


BROCHAS, PINCELES, APLICADORES CON MOTAS, ESPUMAS)

MM07.3 .- ENVASES PARA BULK Y MATERIA PRIMA.

MM08. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL SISTEMA DE AGUA.

MM08.1 .- TOMA DE MUESTRAS.

MMO8.2 .- PROCEDIMIENTO DE ANALISIS.

MM08.3.- LECTURA, INTERPRETACION Y EMISION DE RESULTADOS.

MM09.- EVALUACION MICROBIOLOGIA DE PLANTA.

MM09.1 .- CONTROL DE AMBIENTES.

MM09.2 .- CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES EN EL


LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

MM09.3 .- MONITOREO DE EQUIPO DE FABRICACION Y ENVASADO.

MM09.4 .- MONITOREO DE SUPERFICIES DE PLANTA.

MM09.5 .- MONITOREO DE PERSONAL.

MM09.6 .- SISTEMA DE MONITOREO DE HIGIENE HY LITE.

MM09.7 .- MONITOREO DE TRAPEADORES

MM10. OTROS ANALISIS MICROBIOLOGICOS

MM10.1 .- TEST DE DESAFIO

MM10.1.1 .- METODO DE REGRESION LINEAL

MM10.1.2 .- METODO DEL VALOR D

MM10.2 .- EVALUACION DE DESINFECTANTES

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MM10.2.1 .- COEFICIENTE DE FENOL

MM10.2.2 .- CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA

MM10.2.3 .- DETERMINACION DEL TIEMPO DE ACCION DE


DESINFECTANTES

MM10.3 .- IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

MM10.4.-PRUEBAS OPCIONALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE


MICROORGANISMOS

MM11. MANEJO DE DESECHOS DE LABORATORIO

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INTRODUCCION

Los Productos Cosméticos están compuestos por una gama de


sustancias que los hacen susceptibles a ser contaminados por microorganismos tales
como bacterias, mohos y levaduras. La contaminación microbiana en estos productos
constituye un peligro potencial por dos razones: La primera porque representa un
riesgo en la salud del usuario y la segunda porque puede ocasionar el deterioro del
producto, se presentan cambios fisicoquímicos en los productos incluso después de
eliminar a los microorganismos. Una alteración del producto podría ocasionar
pérdidas económicas y el desprestigio comercial del fabricante.
El grado de contaminación microbiana en los Productos Cosméticos y
Farmacéuticos de uso externo depende en gran medida de las condiciones bajo las
cuales son elaborados y almacenados, un incremento en el nivel de los
microorganismos puede causar la reducción del poder del preservante o falla del
mismo en el producto final. Los siguientes factores son los más importantes a ser
considerados al respecto:

Los componentes de la fórmula del producto.


Los procedimientos de manufactura empleados en la elaboración del producto.
El efecto de los tipos de envase en los que se mantendrá el producto.
El efecto del sistema de preservantes sobre la estabilidad del producto final.

El objetivo principal del Laboratorio de Microbiología es garantizar que


todos los productos que se expenden sean de buena calidad. Por ello el personal del
laboratorio realiza, además del análisis de Materias primas, bulk y producto terminado,
el monitoreo constante de los equipos que intervienen en la producción, la calidad de
los ambientes y el personal operativo, durante todos los procesos productivos.

En este manual se detallan los procedimientos y técnicas empleadas


por el laboratorio en la toma de muestras, análisis microbiológico, evaluación de los
ambientes, monitoreo microbiológico en planta, etc. Muchas de las técnicas descritas
han sido estandarizadas para que sean aplicables a la realidad de esta empresa.

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MM01.- PRINCIPIOS GENERALES DE MICROBIOLOGIA COSMETICA.

MM01.1.- ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CELULA BACTERIANA

Las bacterias son organismos microscópicos formados por una sola célula,
caracterizados por no presentar un núcleo definido, su tamaño oscila entre 0.75 a 4 µ.
de longitud ( 1 µ equivale a la milésima parte de un milímetro ), Se reproducen
rápidamente por división de cada célula individual en dos células hijas, cada una de
éstas se divide luego para formar dos más. En condiciones ideales de desarrollo
pueden duplicarse cada 20 minutos. Pueden agruparse formando duplas, cadenas o
racimos.

Poseen una pared celular rígida la que les confiere una forma característica.
Químicamente, ésta pared esta compuesta por complejos de azúcares, aminoácidos,
proteínas y lípidos, luego de ésta se encuentra una estructura conocida como la
membrana citoplasmática la que rodea a un fluido viscoso, el citoplasma, dentro del
cual encontramos incluidas a las organelas y al material cromosómico.

La estructura compleja de la pared de las bacterias permite diferenciarlas en dos


grandes grupos según la afinidad tintorial a la coloración Gram (elaborado por Hans
Gram 1884): Las bacterias Gram Positivas y las Gram negativas. Las bacterias gram
negativas presentan una pared celular compleja, formada por lipoproteínas, lipo
polisacáridos entre otros. Al reaccionar con el alcohol las paredes de estas bacterias
se tornan permeables por el alto contenido de grasas. Las bacterias gram positivas por
el contrario no se permeabilizan de la misma manera pues el contenido lipídico de su
pared es menor; esta característica determina su coloración lo que nos permite
diferenciarlas.

MM01.2 ESTRUCTURA DE LA CELULA FUNGICA

Los hongos son organismos que se encuentran normalmente en diferentes hábitats


(suelo, agua, aire o en sustancias orgánicas en descomposición). Agrupan a un
conjunto de organismos muy diferentes unos de otros desde las levaduras, formadas

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por una sola célula hasta los hongos macroscópicos que crecen en los jardines.
Poseen una pared formada por azúcares tales como la celulosa, quitina y otros
materiales complejos que le confieren una estructura rígida. A diferencia de las
bacterias, los hongos poseen un núcleo definido.

MM01.3 CRECIMIENTO DE BACTERIAS Y HONGOS

MM01.3.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES:

Los microorganismos tanto bacterias como hongos pueden crecer en sistemas


nutricionales muy simples. Básicamente los sustratos necesarios para su crecimiento
son : Carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas como la riboflavina y tiamina. Existen
bacterias muy exigentes, que requieren además de otros componentes adicionales.

La mayoría de bacterias requieren de la presencia de oxígeno para su desarrollo,


estas son denominadas bacterias aerobias, otras bacterias crecen en ausencia de
oxígeno y son llamadas anaerobias. Existen bacterias que pueden crecer tanto en
presencia como en ausencia de oxígeno, se les conoce como anaerobias
facultativas.

MM01.3.2 FACTORES AMBIENTALES:

1. TEMPERATURA:
Existe un amplio rango de temperatura para el desarrollo de los microorganismos,
se asume que la temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias es de 35 +
2oC. Los hongos requieren temperaturas entre 20 y 25 oC. A elevadas temperaturas
se produce la muerte de los microorganismos (esterilización), mientras que a bajas
temperaturas sólo se logra mantenerlas en latencia. Las bacterias pueden agruparse,
por su adaptación a la temperatura, como sigue :

Psicrófilas: Son aquellas que crecen a bajas temperaturas, su temperatura óptima está
entre 15 y 20oC, pudiendo desarrollar a 0oC

Mesófilas: Crecen mejor a 25 - 40 oC. No crecen por sobre los 45oC ni por debajo de
los 5 oC.

Termófilas: Pueden crecer a temperaturas por encima de los 55oC algunas crecen
incluso a 80 oC.
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2. pH:
Existe un rango óptimo de pH en el que los microorganismos pueden desarrollar,
este parámetro varía dependiendo del tipo de microorganismo. Para la mayoría de las
bacterias el rango óptimo para su crecimiento es de 7.4 - 7.6. Los hongos desarrollan
en un pH de 5 a 6. Bacterias como el Bacillus ferroxidans tienen un pH óptimo de
desarrollo de 1.2 a 1.6.

3. AGUA:
La presencia de agua es esencial para el desarrollo de hongos y bacterias. En
general, las bacterias necesitan disponer de más agua que las levaduras y los mohos.
El requerimiento de agua del microorganismo puede ser cuantificado la actividad de
agua (aw) que es un factor que mide la disponibilidad del agua en el sistema.

MM01.4 PRINCIPALES MICROORGANISMOS CONTAMINANTES:

El mundo microbiano está ampliamente diversificado. En la industria cosmética los


microorganismos más estudiados son los siguientes:

MM01.4.1 BACTERIAS:

Staphylococcus aureus : Representa a los microorganismos patógenos más comunes


en la piel. Es empleado en la rutina de test de eficacia de antisépticos y
desinfectantes.

Escherichia coli : es representante de un extenso grupo de bacterias entéricas,


constituye un índice de contaminación fecal.

Pseudomonas aeruginosa : Es una bacteria oportunista, afecta principalmente a


personas con
Deficiencias inmunes; ha mostrado resistencia frente a muchos preservantes.

MM01.4.2 LEVADURAS:

Candida albicans : Esta levadura causa afecciones bajo condiciones patogénicas.

MM01.4.3 HONGOS FILAMENTOSOS:

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Se encuentran en el ambiente y son agentes causales del desecho de productos
preservados. Las especies representativas son: Penicillium sp. y Aspergillus sp.

MM02.- NORMAS A SEGUIR Y BIOSEGURIDAD APLICADAS AL LABORATORIO DE


MICROBIOLOGIA

Para garantizar un adecuado trabajo en el laboratorio de Microbiología se deben


seguir las siguientes normas:

PROTECCION PERSONAL
Usar en todo momento bata o uniforme manga larga limpio. El uniforme debe estar
bien cerrado para el trabajo en el laboratorio.
Usar guantes protectores apropiados para todos los procedimientos en los cuales
se encuentren en contacto directo o accidental con las muestras y otros
materiales potencialmente infecciosos. Una vez utilizados, retirar los guantes
de forma aséptica y lavarse las manos. No abandonar el laboratorio o caminar
fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos.
Lavarse las manos después de manipular materiales contaminados (medios de
cultivo con crecimiento positivo), así como antes de abandonar las zonas de
trabajo del laboratorio y antes de realizar los análisis.
Usar gafas de seguridad, al momento de analizar las muestras para evitar posibles
salpicaduras.
Está prohibido el uso de uniforme de trabajo al ingresar, a los baños y área del
comedor.
En las zonas de trabajo está prohibido comer, beber, fumar, o manipular lentes de
contacto.
Está prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas
de trabajo del laboratorio.
El personal que tenga heridas en las manos no debe participar en el trabajo de
análisis por el peligro de contraer y/o contaminar el producto.
Desinfectar la superficie del área de trabajo al iniciar y finalizar cada sesión con
alcohol al 70% o fenol al 5%.
El uso de la campana de flujo laminar o cabina de bioseguridad es obligatorio para
realizar los análisis.
Colocar sobre la mesa sólo aquellos objetos que se van a utilizar en el análisis.
Evitar el contacto de las manos con la nariz o boca mientras se esté analizando; de
igual manera no hablar, comer, beber ni fumar. Usar mascarilla de protección.

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Evitar el constante ingreso de personas al área de análisis para minimizar posibles
contaminaciones. Las personas ajenas al laboratorio no deben de ingresar a
esta área sin previa autorización.
Está estrictamente prohibido pipetear con la boca.
No se colocará ningún material en la boca.
Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al
mínimo la formación de aerosoles y gotas.
Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales
infecciosos se comunicarán al encargado del laboratorio. Se mantendrá un
registro escrito de esos accidentes e incidentes.

ZONAS DE TRABAJO
El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados
con el trabajo.
Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser
descontaminados (autoclavados) antes de eliminarlos o de limpiarlos para
volverlos a utilizar.
Tener cerrada las puertas de cada ambiente de trabajo.
Tener despejadas las zonas de seguridad y áreas de salida del Laboratorio para
prevenir situaciones de riesgo.
Las sustancias inflamables deben permanecer alejadas de fuentes de calor, tales
como mecheros, hornos, entre otros

PRECAUCIONES IMPORTANTES
No saturar con materiales el horno para esterilizado, ya que la ventilación no sería
la adecuada y podría generar accidentes.
Evitar colocar papel junto a las resistencias del horno para esterilizado.
Asegurar bien las llaves del autoclave antes de encenderlo y abrir la tapa una vez
que la presión indique “CERO”.

PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA DE DERRAMES


En caso de que se produzca un derrame de material infeccioso o potencialmente
infeccioso, se aplicará el siguiente procedimiento de limpieza:

- Utilizar guantes y ropa protectora.


- Cubrir el derrame con paños o papel absorbente para contenerlo.
- Verter un desinfectante a base de amonio cuaternario (de acuerdo a lo indicado
en el instructivo de preparación y rotación de desinfectantes) sobre el papel
absorbente y la zona inmediatamente circundante.
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- Aplicar el desinfectante en círculos concéntricos, comenzando por el exterior de
la superficie del derrame y procediendo hacia el centro.
- Después del tiempo necesario (30 minutos), retirar todos los materiales.
- Si hay vidrios rotos u objetos punzantes, juntarlos con un trozo de cartón rígido y
depositarlos en un recipiente a prueba de perforaciones para su eliminación.
- Limpiar la zona afectada por el derrame.
- Colocar el material recolectado en un recipiente para desechos a prueba de
perforaciones.
- Tras una desinfección satisfactoria, informar al personal que labora en el área

MM03.- EQUIPOS DE LABORATORIO

MM03.1 RELACION DE EQUIPOS CRITICOS

1. ESTUFA : INCUBADORA (EST-005)

MARCA : MEMMERT
MODELO : BE600
SERIE : C697.0028
RANGO T°C : 20 - 150 °C +/- 0.1°C
VOLTAJE : 220 v

2. ESTUFA : INCUBADORA (EST-006)

MARCA : MEMMERT
MODELO : B40
SERIE : 791318
RANGO T°C : 30 - 120°C
VOLTAJE : 220 v

3. BALANZA ANALITICA (BAL-006)

MARCA : METTLER TOLEDO AG


MODELO : MS303S/01
SERIE : B022038386
PRECISIÓN DE LECTURA : 0.001G
CAMPO DE PESADA : 0…320G
ZONA DE TARADO : 0…320G
ADAPTADOR AL.ELECTRICA: 220V/240V 50/60 Hz
VOLTAJE : 220 v

4. HY LITE 2 SYSTEM (HYL-001)

MARCA : MERCK S.A


MODELO : HY-LITE 2
SERIE : 12 109 A04
VOLTAJE : 220 v

5. POTENCIOMETRO (POT-009)

MARCA : THERMO ORION 3 STAR

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MODELO : 1112000
SERIE : B25608
VOLTAJE : 220 v
RANGO DE PH : -2.000 a 19.999
RESOLUCIÓN : 0.1/0.01/0.001
PRECISIÓN : +-0.002 und pH

6. ESTUFA : INCUBADORA (EST-007)

MARCA : MEMMERT
MODELO : BE600
SERIE : e603.0070
RANGO T°C : 20 - 150 °C +/- 0.1°C
VOLTAJE : 220 v

7. TERMOHIGROMETRO (H059)

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : 63-1032
SERIE : 07A07
ALC. DE IND. : -50°C A 70°C
RESOLUCIÓN : 0,1°C
ALC. DE IND. : 25%H.R A 95% H.R.
RESOLUCIÓN : 1% H.R.

8. ESTUFA DE ESTERILIZADO (EST-010)

MARCA : MEMMERT
MODELO : UFE 600
SERIE : G606.0077
RANGO T°C : 30 - 300°C
VOLTAJE : 220 v

9. ESTUFA INCUBADORA (EST-011)

MARCA : MEMMERT
MODELO : INE 800
SERIE : E808.0078
RANGO T°C : 30 - 70°C
VOLTAJE : 230 V, 50/60 HZ Trifásica.

10. BAÑO MARIA (BAM02)

MARCA : MEMMERT
MODELO : WNE 29
SERIE : L608.0534
RANGO T°C : 10 - 95°C
VOLTAJE : 230 V (+-10%) 50/60 HZ

11. AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-004)

FABRICANTE : FRAVILL
MODELO : AV-80
SERIE : 95-990528

10
VOLTAJE : 220 v

12. ESTUFA INCUBADORA (EST-012)

MARCA : MEMMERT
MODELO : ICP800
SERIE : K811.0004
RANGO T°C : 0°C - 60°C.
VOLTAJE : 220 v

13. AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-005)

FABRICANTE : FRAVILL
MODELO : AV-80-PE
SERIE : S/N
VOLTAJE : 220 v

14. CABINA DE BIOSEGURIDAD (CBS001)

MARCA : LABCONCO
MODELO : 3450827
SERIE : 110339280B
VOLTAJE : 230V/60 Hz

15. VORTEX (VOR002)

MARCA : CAT
MODELO : VM3
SERIE : 732171
VELOCIDAD : 0-2800 rpm
VOLTAJE : 230 V / 50/60 HZ

16. TERMOHIGROMETRO DIGITAL (TB-03)

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : Cat. N° 63-1032
SERIE : No Indica
ALC. DE IND. : -50°C A 70°C
RESOLUCIÓN : 0,1°C
ALC. DE IND. : 20%H.R A 95% H.R.
RESOLUCIÓN : 1% H.R.

17. TERMOHIGROMETRO DIGITAL (TH009)

MARCA : CONTROL COMPANY


MODELO : 4184
SERIE : 122098672
ALC. DE IND. : -50°C A 70°C
RESOLUCIÓN : 0,1°C
ALC. DE IND. : 20%H.R A 95% H.R.
RESOLUCIÓN : 1% H.R.

18. BALANZA ANALITICA (B022)

MARCA : METTLER TOLEDO AG


MODELO : MS1602S/01
SERIE : B228119196

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PRECISIÓN DE LECTURA : 0.01G
CAMPO DE PESADA : 0...1620 g.
ZONA DE TARADO : 0...1620 g.
ADAPTADOR AL.ELECTRICA: 220V/240V 50/60 Hz
VOLTAJE : 220 v

19. CABINA DE BIOSEGURIDAD (CBS002)

MARCA : LABCONCO
MODELO : 302581110
SERIE : 131184165
VOLTAJE : 230V/60 Hz

20. TERMOHIGROMETRO (TH107)

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : 630069911A12
SERIE : NO INDICA
ALC. DE IND. : -50°C A 70°C
RESOLUCIÓN : 0,1°C
ALC. DE IND. : 25%H.R A 95% H.R.
RESOLUCIÓN : 1% H.R.

MM03.2 RELACION DE EQUIPOS NO CRITICOS

1.- DESTILADOR (DST-02)

MARCA : GF-0025 (GFL)


MODELO : 2008
SERIE : 11092610 I
CAPACIDAD : 8lt/h
ENERGÍA ELÉCTRICA : 220 V / 3 Ph / N / PE / 50-60 Hz
CONEXIÓN ELÉCTRICA : 6Kw

2.- REFRIGERADORA (RSLA-18)

MARCA : TORREY
MODELO : CONSERVADOR VERTICAL R-36
COD. MODELO : R-36
SERIE : NO INDICA
VOLTAJE : 220 v

3.- MICROINCINERADOR (MICR01)

MARCA : NO INDICA
MODELO : NOVA S3022
SERIE : 2682
VOLTAJE : 220 v 60HZ

4.- HORNO MICROONDAS (MICROON01)

MARCA : SAMSUNG
MODELO : MG402MADXBB
SERIE : J6QT7WDF400104T
12
VOLTAJE : 220 v 60HZ

MM03.3 RELACION DE EQUIPOS RETIRADOS DEL LABORATORIO

1.- AUTOCLAVE 25 – X (AUT-001) “Dado de baja 26/05/05”

MARCA : ALL AMERICAN STILIZER


MODELO : 1915X
SERIE : S/N
VOLTAJE : 220 v

2.- POTENCIOMETRO (POT-001) “Dado de baja 10/01/06”

MARCA : ORION
MODELO : 520 A
SERIE
: 072713
VOLTAJE : 220 v

3.- REFRIGERADORA (REF-001) “Pasó al Laboratorio Fisicoquímico de Bulk 08/06”

MARCA : INRESA
MODELO : 409L
SERIE : 521007
VOLTAJE : 220 v

4.- HORNO MICROONDAS (HOR-001) ) “Dado de baja 08/07/06”

MARCA : DAEWOO
SERIE : KOR-161G
VOLTAJE : 220 v

5.- TERMOMETRO DIGITAL (TB-01) “Dado de baja 26/09/07”

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : Cat. N° 63-1024
SERIE : 07A01

6.- TERMOMETRO DIGITAL (E0202) “Dado de baja 11/11/07”

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : No Indica
SERIE : 09A01

7.- HORNO MICROONDAS (HOR-002) “Dado de baja 07/01/08”

MARCA : LG
MODELO : MB-1442DP/DB
SERIE : 703TA2F00485
VOLTAJE : 220 v

8.-MALTHUS SYSTEM V (MAL-001) “Dado de baja 07/01/04”


13
MARCA MODELO SERIE VOLTAJE

INCUBADORA 1 MALTHUS INTRU- F2060 131R0004N0009 220 v


MENTS LTD.

INCUBADORA 2 MALTHUS INTRU- F2060 131R0004N0007 220 v


MENTS LTD.

COOLER MALTHUS INTRU- COOLER 120R0023N001 220 v


MENTS LTD.

PC ACER ACERMATE 220 v


DX4

UPS GAMATRONIC
ELECTRONIC
INDUSTRIES LTD.

9.- ESTUFA DE ESTERILIZADO (EST-003) “Dado de baja 03/08/07”

MARCA : MEMMERT
MODELO : S40
SERIE : 861340
RANGO T°C : 30 - 220°C
VOLTAJE : 220 v

10.- DESTILADOR (DST-001) “Dado de baja 07/10”

MARCA : GFL
MODELO : 2001/4
SERIE : 10753603-F
VOLTAJE : 220 v

11.- BALANZA DE PRECISIÓN (BAL-042) “Dado de baja 07/10”

MARCA : METTLER TOLEDO


MODELO : PB303
SERIE : 1113231446
VOLTAJE : 220 v
CLASE DE EXAC : II
CAPACIDAD MÁX. : 310g
CAPACIDAD MÍN. : 0,02g
DIV. DE ESCALA : 0,001g

12.- POTENCIOMETRO (POT-001) “Dado de baja 08/10”

MARCA : THERMO ORION


MODELO : 520 A
SERIE : 072773
VOLTAJE : 220 v

13.- DESTILADOR (DST-001) dado de baja 08/10

MARCA : GFL
MODELO : 2001/4

14
SERIE : 10753603-F
VOLTAJE : 220 v

14.- AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-003) “Dado de baja 07/11”

MARCA : TECAP
MODELO : SAUT-50
SERIE : 011-2006

15.- AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-002) “Dado de baja 03/12”

MARCA : FANEM
MODELO : 415/2
SERIE : JF9202
VOLTAJE : 220 v

16.- TERMOMETRO DIGITAL (TB-02) “Dado de baja 11/11”

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : Cat. N° 63-1009A
SERIE : No Indica

17.- VORTEX MIXER (VOR-001) “Dado de baja 06/12”

MARCA : BARNSTEAD Y THERMOLYNE CORPORATION


MODELO : MAXI MIX II
SERIE : 871
VOLTAJE : 220 v

18. -BALANZA ANALITICA (B043) “Dado de baja 08/12”

MARCA : METTLER TOLEDO


MODELO : PB1501-S
SERIE : 1119363261
VOLTAJE : 220 v
CLASE DE EXAC : II
CAPACIDAD MÁX. : 1510g
CAPACIDAD MÍN. : 5g
DIV. DE ESCALA : 0,1g

19.-CAMPANA DE FLUJO LAMINAR (CFL-001) ) “Dado de baja 03/13”

MARCA : EACI-ENVIRCO
MODELO : CLASS - 100.803709
SERIE : 85011761
VOLTAJE : 220 v

20.-TERMOHIGROMETRO (H055) “Dado de baja 2014”

MARCA : RADIOSHACK
MODELO : 63-1032
SERIE : 06A07
ALC. DE IND. : -50°C A 70°C
RESOLUCIÓN : 0,1°C
ALC. DE IND. : 25%H.R A 95% H.R.

15
RESOLUCIÓN : 1% H.R.

21.- REFRIGERADORA (REF-002) PASO A OTRO LABORATORIO

MARCA : SAMSUNG
MODELO : MG402MADXBB
SERIE : J6QT7WDF400104T
VOLTAJE : 220 v 60HZ

22.- PLANCHA ELECTRICA (PLE-001) SE UTILIZA SÓLO PARA LA PREPARACIÓN


DE MEDIOS DE CULTIVOS PARA ANÁLISIS FARMACEUTICOS.

MARCA : THERMOLYNE TIPE 2000 HOT PLATE


MODELO : HP - A2240M
SERIE : 247315
VOLTAJE : 240 v

MM03.4 FUNDAMENTO Y DESCRIPCION DE USO

1.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-005)

FUNDAMENTO

Las incubadoras son equipos que se emplean para proveer las condiciones
adecuadas de temperatura, que permite el crecimiento y desarrollo de
microorganismos. En la incubadora se colocan las muestras analizadas, si hubiera
contaminación en alguna muestra, el equipo brinda el calor necesario para que los
microorganismos proliferen rápidamente y puedan ser detectados.

En el laboratorio, las incubadoras operan en un rango de 30 – 35°C (temperatura


ideal para permitir el desarrollo bacteriano).
Esta incubadora se utiliza básicamente en el laboratorio para permitir el desarrollo en
placas petri, las cuales presentarán la muestra analizada en medio de cultivo sólido
(Agar) ó líquido (caldo).

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 voltios, verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Encender el equipo girando el botón interruptor de encendido en la posición I


(servicio permanente). Tras el encendido, se muestra el valor teórico actual de
temperatura durante unos instantes en el display del regulador termostático.

Nota: El modulo de interruptor principal contiene:

-Maneta de conmutación para ajuste de los modos de servicio.


 Interruptor principal en posición 0: Aparato desconectado
 Interruptor principal en posición I: servicio permanente
 Interruptor principal en posición reloj: funcionamiento modo programa

-3 pilotos luminosos para detectar el estado de servicio


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 Power ( color verde) listo para usar
 Alarm ( color rojo) anomalía
 Heat ( color amarillo) calefactor encendido.

-Válvula de regleta para regular la entrada de aire fresco ( la regleta viene graduada
del 0 al 6 en grado ascendente )
 0: trampilla cerrada, apenas existe entrada de aire fresco
 2,3 : posiciones intermedias, ajuste a voluntad del relación de mezcla
 6: entrada máxima de aire fresco

3. Realizar la regulación de la temperatura interna de la incubadora. Para ello, se hace


uso del regulador giratorio, hasta llegar a la temperatura ideal, la cual es luego
verificada en el termómetro del equipo.

Nota : El manejo del regulador se realiza con ayuda de un transmisor rotativa digital
en combinación con la tecla Set.
 Si la tecla set no está accionada, se muestra la temperatura real en el
display del regulador
 El valor teórico indicado solo puede modificarse con el regulador giratorio, si
la tecla Set está presionada (protección contra modificación involuntaria)
 Si el regulador giratorio es desplazado con rapidez, el valor teórico cambia a
grandes pasos, mientras con accionamiento lento cambia paso a paso.
 Todos los valores programados son almacenados después de haber
terminado la programación y se conservan aunque la estufa sea apagada.

4. Ajustar la temperatura deseada, para ello girar el transmisor rotativo con tecla set
accionada origina, el punto decimal del display parpadea.

5. Soltar la tecla set luego de ello se muestra el valor teórico ajustado durante unos 3
segundos aprox., y a continuación es memorizado. El punto decimal del display
parpadea. El punto decimal deja de parpadear y el regulador conmuta a la
indicación del valor real.

6. Proceder a abrir las puertas (externas e internas) y colocar los frascos y/o placas
dentro del equipo, teniendo cuidado de no llenar excesivamente el interior del
incubador.

7. Cerrar las puertas del equipo para mantener la temperatura interior.

8. Se lleva registro de control diario de Temperaturas del equipo para controlar que el
valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos establecidos (registro:
Control de Temperaturas de Estufas). Así como registrar cada vez que se utiliza el
equipo en el registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

NOTA: El fundamento y descripción de uso se aplica también a la Estufa de


Incubación EST-007. Las EST-005 y EST-007 son de la misma marca y modelo.

2.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-006)

FUNDAMENTO

Este equipo funciona bajo el mismo fundamento que anteriormente descrito.


Se utiliza para lograr el crecimiento de microorganismos a partir de muestras
analizadas en caldos (medios de cultivo líquidos), dispuestos en tubos de vidrio,
frascos, matraces, etc.
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DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 voltios, verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Encender el equipo presionando el botón blanco del interruptor principal de


encendido en la posición hacia abajo.

3. Realizar la regulación de la temperatura interna de la incubadora. Para ello, se hace


uso del regulador giratorio, hasta llegar a la temperatura ideal, la cual es luego
verificada en el termómetro del equipo (ubicado en la parte externa).

4. Proceder a abrir las puertas (externas e internas) y colocar los frascos dentro del
equipo, teniendo cuidado de no llenar excesivamente el interior de la incubadora.

Nota: La puerta se abre tirando la manija de metal de la puerta hacia afuera, se


cierra presionando hacia dentro la manija de metal de la puerta

5. Cerrar las puertas del equipo para mantener la temperatura interior.

6. Se lleva registro de control diario de Temperaturas del equipo para controlar que el
valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos establecidos (registro:
Control de Temperaturas de Estufas). Así como registrar cada vez que se utiliza el
equipo en el registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

3.- EQUIPO: BALANZA (BAL-006)

FUNDAMENTO

Se usa para pesar cantidades pequeñas, componentes de medios de cultivo y


reactivos empleados en el análisis microbiológico. La precisión de indicación de este
equipo es de 0.1 mg.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente 220 v.

2. Retirar toda carga del plato de pesada, luego pulse “ON”

Nota:
 Una vez encendida la balanza ésta realiza una prueba de la pantalla (todos
los segmentos de la pantalla se iluminan) y aparece la palabra “BIENVDA”,
la versión del software, carga máxima y resolución de la balanza.
 Es necesario el ajuste de la balanza para ello la balanza está configurada de
fabrica con el ajuste totalmente automático FACT con la pesa interna, cada
vez que se tenga intervalos periódicos durante el servicio de pesaje.
 El ajuste también debe realizarse después de un cambio de ubicación

3. Dejar calentando la balanza durante 30 minutos antes de pesar, para que pueda
adaptarse a las condiciones del entorno.

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4. Verificar que la burbuja de aire se encuentre exactamente en el centro del cristal (La
balanza deberá nivelarse y ajustarse cada vez que se traslade a otra ubicación )

S NO
I
Nota:
La balanza se debe nivelar antes de iniciar la operación.
Regular los dos pies niveladores hasta que la burbuja de aire se detenga en el
centro del cristal,
La balanza cuenta con un nivel de burbuja y dos pies niveladores regulables para
compensar las pequeñas irregularidades de la mesa de pesaje. (la balanza estará
totalmente horizontal cuando la burbuja de aire se halle en el centro del nivel del
cristal).

Regule los dos pies niveladores hasta que la burbuja de aire se detenga
exactamente en el centro del cristal, considerando lo siguiente:

5. Para realizar un pesaje sencillo:


 Pulsar la tecla “ O/T para poner a cero la balanza ( si la balanza no se
encuentra en el modo de pesaje, manteniendo pulsada la tecla hasta
que aparezca la palabra “PESAJE”en la pantalla. Soltar la tecla ya en este
momento la balanza entra en el modo de pesaje y se ajustará a cero.

6. Coloque la muestra en el plato de pesada.

7. Esperar a que desaparezca el detector de inestabilidad “O” que aparece en la


pantalla y se escuche la señal acústica de estabilidad.

Nota: Si trabaja con un contenedor de pesaje, ponga primero la balanza a cero.

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8. Coloque el contenedor vacio en la balanza, el peso se mostrará en la pantalla.

9. Puesta a Cero :
Descargar la balanza, Pulsar la tecla "O/T" para poner la balanza a cero, todos los
valores del peso se calculan con respecto a este punto cero. Ver Anexo 7: Puesta a
Cero la Balanza.
Deducción de la Tara:
Colocar el contenedor vacío en la balanza, el peso es mostrado en la pantalla de la
balanza. Pulsar la tecla "O/T" para deducir la tara de la balanza, en la pantalla,
aparecen “0,00 g” y “Neto.

Nota:

 “Neto” indica que todos los valores de peso mostrados son valores netos.

 Si se trabaja con un contenedor de pesaje, poner primero la balanza a cero.


Si se quita el contenedor de la balanza, se indica el peso de la tara como un
valor negativo. El peso de la tara debe permanecer guardado hasta que se
pulse de nuevo la tecla "O/T" o hasta que se apague la balanza

10. Colocar la muestra cuidadosamente sobre el recipiente o plato de pesada. el


peso de la muestra debe aparecer en la pantalla.

11. Leer el resultado.

12. Retirar la muestra una vez pesada.

13. Apagar la balanza manteniendo pulsada la tecla “OFF” hasta que aparezca
“APAGAR” en la pantalla, suelte la tecla. Después de apagarse, la balanza entra en
modo de reposo, la pantalla muestra la fecha, la hora, la carga máxima y la
resolución. La balanza ya no necesita un tiempo de calentamiento uy está lista para
pesar de inmediato en el caso que se desee pesar nuevamente.

14. Limpiar el platillo.


Es necesario realizar limpieza del plato de pesada, cada vez que se utilice la
balanza. ( se puede utilizar para ello alcohol 70°)
La balanza está configurada de fábrica con el ajuste totalmente automático FACT
(Fully Automatic Calibración Technology, tecnología de calibración totalmente
automática) con la pesa interna. La balanza se ajusta automáticamente: Después
de la fase de calentamiento tras la conexión a la corriente eléctrica. Cuando hay un
cambio de las condiciones del entorno.

Nota: Se debe realizar la verificación de las balanzas 1 vez por semana, ésta se
realiza con pesas patrones calibrados.

15. Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control
de uso de equipos de laboratorio.

PRECAUCIONES PARA EL USO DE BALANZAS

- Las balanzas deben estar ubicadas en lugares exentos de corrientes de aire y en


ambiente seco.
- La mesa o soporte donde se coloque la balanza debe ser estable, de tal manera
que se eviten vibraciones o movimientos.
- Evitar traslados constantes de un área a otra. Cada vez que la balanza cambie de
posición deberá volverse a nivelar.
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- Evitar cambios de temperatura y tránsito excesivo de personas.
- Antes de iniciar la jornada, verificar el nivel de burbuja de aire de la balanza.
- No es necesario desconectar la balanza de la corriente eléctrica, luego de
terminada la jornada de trabajo. Si es importante dejarla correctamente apagada.
- Antes de cada pesada, la balanza debe estar completamente limpia y libre de
cualquier objeto sobre ella.
- Al final de la jornada de trabajo, la balanza debe quedar exenta de cualquier
sustancia o restos del material que se haya pesado.

4.- EQUIPO: BALANZA ANALITICA (B022)

FUNDAMENTO

Se usa para realizar el pesado de muestras para el análisis microbiológico de


MMPP, fabricaciones y productos terminados cosméticos. La precisión de indicación
de este equipo es de 0.01 g.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente 220 v.

2. Retirar toda carga del plato de pesada, luego pulse “ON”

Nota:
 Una vez encendida la balanza ésta realiza una prueba de la pantalla (todos
los segmentos de la pantalla se iluminan) y aparece la palabra “BIENVDA”,
la versión del software, carga máxima y resolución de la balanza.
 Es necesario el ajuste de la balanza para ello la balanza está configurada de
fabrica con el ajuste totalmente automático FACT con la pesa interna, cada
vez que se tenga intervalos periódicos durante el servicio de pesaje.
 El ajuste también debe realizarse después de un cambio de ubicación

3. Dejar calentando la balanza durante 60 minutos antes de pesar, para que pueda
adaptarse a las condiciones del entorno.

4. Verificar que la burbuja de aire se encuentre exactamente en el centro del cristal (La
balanza deberá nivelarse y ajustarse cada vez que se traslade a otra ubicación )

S NO
I
Nota:
La balanza se debe nivelar antes de iniciar la operación.
Regular los dos pies niveladores hasta que la burbuja de aire se detenga en el
centro del cristal,
La balanza cuenta con un nivel de burbuja y dos pies niveladores regulables para
compensar las pequeñas irregularidades de la mesa de pesaje. (la balanza estará
totalmente horizontal cuando la burbuja de aire se halle en el centro del nivel del
cristal).

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Regule los dos pies niveladores hasta que la burbuja de aire se detenga
exactamente en el centro del cristal, considerando lo siguiente:

5. Para realizar un pesaje sencillo:


 Pulsar la tecla “ O/T para poner a cero la balanza ( si la balanza no se
encuentra en el modo de pesaje, manteniendo pulsada la tecla hasta
que aparezca la palabra “PESAJE” en la pantalla. Soltar la tecla ya en este
momento la balanza entra en el modo de pesaje y se ajustará a cero.

6. Coloque la muestra en el plato de pesada.

7. Esperar a que desaparezca el detector de inestabilidad “O” que aparece en la


pantalla y se escuche la señal acústica de estabilidad.

Nota: Si trabaja con un contenedor de pesaje, ponga primero la balanza a cero.

8. Coloque el contenedor vacio en la balanza, el peso se mostrará en la pantalla.

9. Puesta a Cero :
Descargar la balanza, Pulsar la tecla "O/T" para poner la balanza a cero, todos los
valores del peso se calculan con respecto a este punto cero. Ver Anexo 7: Puesta a
Cero la Balanza.
Deducción de la Tara:
Colocar el contenedor vacío en la balanza, el peso es mostrado en la pantalla de la
balanza. Pulsar la tecla "O/T" para deducir la tara de la balanza, en la pantalla,
aparecen “0,00 g” y “Neto.

Nota:

 “Neto” indica que todos los valores de peso mostrados son valores netos.

 Si se trabaja con un contenedor de pesaje, poner primero la balanza a cero.


Si se quita el contenedor de la balanza, se indica el peso de la tara como un
valor negativo. El peso de la tara debe permanecer guardado hasta que se
pulse de nuevo la tecla "O/T" o hasta que se apague la balanza

10. Colocar la muestra cuidadosamente sobre el recipiente o plato de pesada. el


peso de la muestra debe aparecer en la pantalla.

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11. Leer el resultado.

12. Retirar la muestra una vez pesada.

13. Apagar la balanza manteniendo pulsada la tecla “OFF” hasta que aparezca
“APAGAR” en la pantalla, suelte la tecla. Después de apagarse, la balanza entra en
modo de reposo, la pantalla muestra la fecha, la hora, la carga máxima y la
resolución. La balanza ya no necesita un tiempo de calentamiento uy está lista para
pesar de inmediato en el caso que se desee pesar nuevamente.

14. Limpiar el platillo.


Es necesario realizar limpieza del plato de pesada, cada vez que se utilice la
balanza. ( se puede utilizar para ello alcohol 70°)
La balanza está configurada de fábrica con el ajuste totalmente automático FACT
(Fully Automatic Calibración Technology, tecnología de calibración totalmente
automática) con la pesa interna. La balanza se ajusta automáticamente: Después
de la fase de calentamiento tras la conexión a la corriente eléctrica. Cuando hay un
cambio de las condiciones del entorno.
Nota: Se debe realizar la verificación de las balanzas 1 vez por semana, ésta se
realiza con pesas patrones calibrados.

15. Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control
de uso de equipos de laboratorio.

PRECAUCIONES PARA EL USO DE BALANZAS

- Las balanzas deben estar ubicadas en lugares exentos de corrientes de aire y en


ambiente seco.
- La mesa o soporte donde se coloque la balanza debe ser estable, de tal manera
que se eviten vibraciones o movimientos.
- Evitar traslados constantes de un área a otra. Cada vez que la balanza cambie de
posición deberá volverse a nivelar.
- Evitar cambios de temperatura y tránsito excesivo de personas.
- Antes de iniciar la jornada, verificar el nivel de burbuja de aire de la balanza.
- No es necesario desconectar la balanza de la corriente eléctrica, luego de
terminada la jornada de trabajo. Si es importante dejarla correctamente apagada.
- Antes de cada pesada, la balanza debe estar completamente limpia y libre de
cualquier objeto sobre ella.
- Al final de la jornada de trabajo, la balanza debe quedar exenta de cualquier
sustancia o restos del material que se haya pesado.

5.- EQUIPO: AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-005)

FUNDAMENTO

Es un equipo diseñado para la destrucción de microorganismos mediante calor


húmedo. Tiene un efecto mayor y más rápido sobre las bacterias, por lo que el agua es
un buen conductor y el calor penetra mejor y se distribuye más uniformemente. El
calor húmedo se puede aplicar en forma de agua caliente o como vapor de agua.
Destruye los organismos por coagulación y desnaturalización de las estructuras
proteicas y enzimáticas. Desarrolla condiciones de temperatura y presión elevadas, las
cuales permiten que se produzca la esterilización efectiva de los materiales
introducidos.

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En el laboratorio de microbiología, se emplea básicamente para la esterilización de
material contaminado.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.
2. Verter agua destilada o desionizada al interior del autoclave, hasta el nivel de la
parrilla situada en el fondo del equipo (de 7 -8 litros de agua).

Nota:
El ciclo de trabajo del equipo no debe empezar si no cuenta con el nivel de agua
requerido (agua destilada o desionizada) es decir al nivel de la parrilla situada en el
fondo.
3. Introducir el material a esterilizar en las canastillas (canastilla con soporte a
manera de cuñas en la base va cerca a la resistencia y la canastilla sin soporte va
en la parte superior), luego éstas canastillas colocar dentro del equipo, ubicándolas
en ese orden; luego colocar la tapa tipo platillo.

4. Cerrar y ajustar la tapa en forma de cruz (+) a fin de que el ajuste sea parejo.
Asegurar bien la tapa antes de iniciar el proceso de esterilizado.

5. Encender el equipo con el switch (botón de encendido) a posición "sin timer" (sin
reloj) para iniciar el proceso de autoclavado. El panel del lado derecho muestra en
la parte superior la temperatura al interior de la cámara y en la parte inferior
mostrará la temperatura programada.

6. Dejar abierta la llave o válvula de purga roja mientras dure el proceso de


calentamiento, para permitir el escape del aire contenido dentro del autoclave.

7. Observar que el termómetro indique una temperatura de 100°C y comience a salir


vapor de la llave o válvula de purga roja dejar transcurrir éste proceso por 5 - 7
minutos, cerrar la llave o válvula de purga para que la temperatura alcance 121°C
y el manómetro alcance 15 psi.

Nota:

 No intentar abrir la tapa durante el proceso de esterilizado, puede sufrir


quemaduras.

 Nunca abrir la válvula de descarga o drenaje del tanque durante el proceso


de esterilización, porque el vapor presurizado y el agua caliente sale a una
presión de 15 psi.

8. Observar que la temperatura haya llegado a 121°C y 15 psi y conmutar el switch a


posición "con timer" (con reloj), el cual está programado al tiempo de esterilización
del laboratorio 20 minutos.
-Para realizar cambios de temperatura ver Figura A: Modo de operación de
temperatura.
-Para realizar cambios de tiempo en el reloj ver Figura B: Modo de Operación de
Tiempo.

Figura A: Modo de operación de temperatura

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Figura B: Modo de Operación de Tiempo

9. Transcurrido el tiempo programado el equipo se apaga automáticamente.

10. Colocar el swich en posición "OFF".

11. Eliminar el vapor una vez concluido el proceso de esterilización,


abrir gradualmente la válvula de manija roja, luego abrir la tapa del autoclave
cuando el manómetro nos indique 0 libras de presión y observemos que ya no sale
vapor por la válvula de purga.

Nota :

 Después del proceso de esterilización no dejar la puerta del autoclave


cerrada de un día para otro se malograría la empaquetadura.

 Para un nuevo proceso de esterilización agregar nuevamente agua al


autoclave al nivel de la parrilla y seguir con los pasos anteriormente
descritos

12. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de
equipos de laboratorio.

6.- EQUIPO: HY-LITE SISTEM (HYL-001)


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FUNDAMENTO

El Sistema de Control de Higiene Hy Lite es un desarrollo innovador en el campo de


la microbiología; el cual permite determinar el grado de limpieza general que presenta
la superficie analizada, detectando para ello los niveles de ATP presentes.

El ATP (Adenosina Trifosfato) es una molécula de intercambio energético propia de


las formas vivientes. Se encuentra presente en todas las materias animales y
vegetales (es decir: Materia orgánica) y ligada a la actividad de bacterias, hongos y
otros microorganismos. Por lo tanto, la medición de los niveles de ATP permite realizar
un buen control de higiene, ya que mide la contaminación tanto microbiana como no
microbiana, procedente de restos de materia orgánica.

El sistema Hy Lite aprovecha la misma reacción química que en la naturaleza


permite a la luciérnaga emitir luminiscencia, utilizando para ello el Reactivo luciferina /
luciferasa, como se expresa a continuación:

Reactivo luciferina / luciferasa + ATP = emisión de luz.

La intensidad de luz que se libera durante el proceso es medida en el monitor de


Hy-Lite (luminómetro) y es visualizada en la pantalla digital, expresándose en unidades
relativas de luz (RLU). Mediante la medición precisa de luz liberada, el sistema Hy-
Lite permite la determinación del nivel de ATP presente en la muestra, en pocos
segundos.

De esta forma, el sistema de Control de Higiene Hy-Lite proporciona una señal casi
instantánea, que permite reaccionar a tiempo y evitar una posible contaminación.

Partes del Sistema de Monitoreo de Higiene Hy Lite

Cada sistema Hy-Lite se suministra completo dentro de un maletín portátil. Sus


principales componentes son descritos a continuación:

A. TUBOS DE ENJUAGUE Dispositivos pequeños que contienen solución de


enjuague, destinada a lisar las partículas recogidas en el
muestreo y liberar el ATP presente en ellas.

B. HISOPOS O TORUNDAS Destinados para el muestreo de superficies. Se


recomienda realizar la toma de muestra en 10 cm2 de
superficie.

C. DISPOSITIVOS DE Constituyen la parte central del proceso analítico,


REACCION contiene el reactivo luminiscente para llevar a
cabo la reacción. El dispositivo de reacción
presenta una varilla de muestreo que extrae
el ATP de un volumen definido de muestra (Contenido
en la solución de enjuague luego de procesar la muestra). El
ATP es sometido luego a la reacción, cuya lectura
se expresa en el monitor.

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D. MONITOR O Equipo destinado a la medición de luz liberada
durante el
Proceso.
LUMINOMETRO Es un instrumento ligero y portátil, que puede utilizarse en
el Laboratorio y en el mismo lugar de toma de la
muestra.

DescripciOn de uso

El equipo Hy Lite se utiliza para el monitoreo de superficies (equipos y personal) que


se encuentren listos para iniciar los procesos de envasado ó fabricación. En esta
sección se explicará la forma de procesamiento de las muestras a analizar.

1. Coger hisopos estériles para el muestreo de cada superficie. Si la superficie a


analizar está seca, introducir el hisopo en la solución de enjuague para
humedecerlo.

2. Pasar el hisopo por la superficie de ensayo (preferentemente en 10 cm2).

3. Introducir luego el hisopo en los tubos de enjuague respectivos, dejando enjuagar


aproximadamente 10 segundos. Sacar el hisopo fuera del tubo y desecharlo.

4. Luego, introducir la varilla de muestreo verticalmente en la solución de enjuague,


tocando el fondo del tubo. Sacar la varilla del tubo de enjuague después de 1
segundo aproximadamente.

5. Introducir a presión la varilla, con la muestra, en el tubo que contiene los reactivos.

6. Agitar 10 veces como mínimo la varilla de muestreo para mezclar bien la muestra
y los reactivos.

7. Colocar luego el dispositivo de reacción en la cámara de medición del monitor.

8. Esperar aproximadamente 10 segundos mientras el monitor lee la muestra.

9. Leer el resultado expresado en RLU y anotarlo en las hojas correspondientes.


Anotar también las características de la superficie analizada: Fecha, producto a
elaborar, etc.

7.- EQUIPO: POTENCIOMETRO (POT-009)

FUNDAMENTO

En el laboratorio de Microbiología se utiliza para la determinación del pH de los


medios de cultivo. Cada medio tiene un rango de pH al cual debe prepararse. Los
rangos están indicados en las instrucciones del fabricante y son transcritos al formato
de preparación de cada medio de cultivo.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Presionar la tecla de encendido del equipo , con la línea de alimentación en


el medidor de mesa . Cuando el medidor de mesa funciona con la línea de
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alimentación la pantalla permanece activada hasta que se desactive presionando la

tecla de encendido/apagado .

Descripción General del Teclado de sobremesa del equipo Potenciómetro POT009.

3. Realizar la calibración de pH:


Seleccionar la calibración adecuada teniendo en cuenta lo siguiente:

 En el modo de medición:

Presionar la tecla Selección en línea , hasta que la flecha en la izquierda


de la pantalla apunte hacia el modo de medición que se va a calibrar: pH, ORP,
ISE • Conductivity (conductividad) • DO (OD)

 Nota: Verificar que el orificio del llenado del electrodo se encuentre descubierto
antes de llevar a cabo la medición.

4. Presionar la flecha de desplazamiento hacia arriba / hasta que se ilumine


el icono correspondiente al modo de medición que desea calibrar.

5. En el modo setup, seleccionar el juego de buffer para realizar la calibración.

Nota:
 Para calibrar el equipo se deben usar los buffer pH 4.01 y pH 7.00, los cuales
deben cambiar por lo menos cada 15 días. La calibración se debe realizar a
temperatura ambiente.

6. Presionar la flecha de desplazamiento hacia arriba para empezar la


calibración seleccionada.

7. Enjuagar el electrodo con agua desionizada secar sin frotar con un paño sin
hilachas y la sonda ATC y colocar dentro del buffer seleccionado.

8. Espere a que el icono pH deje de destellar.

a. Reconocimiento de Auto Buffer : cuando el icono pH deje de destellar, el


medidor mostrara el valor de pH con corrección de temperatura para el buffer.

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b. Calibración manual: cuando el icono pH deje de destellar, el medidor mostrara
el valor del buffer que ha leído el electrodo de pH. Utilice y / para cambiar el
valor de pH al valor de pH con temperatura corregida para el buffer.

9. Verficar que se muestre el valor del buffer correcto en la pantalla del medidor,

presione la tecla "Calibrate" (calibrar) para proceder al siguiente punto de


calibración y repita los pasos del 6 al 7, o presione la tecla " measure , save /print"

(medir, guardar, imprimir) para guardar la calibración. Registrar en el formato


el valor obtenido y el corregido.

Tener en cuenta que:

 La pendiente real de electrodo, debe encontrarse entre 92 – 102 %.

 El valor en mV del buffer pH 7, debe oscilar entre -30 mV a + 30 mV.

 El valor en mV del buffer pH 4, el valor del mV debe oscilar entre +150 mV a


+210 mV.

 Calcular la diferencia absoluta en mV entre los dos buffers, la diferencia en mV


debe ser entre 160 y 180 mV.

 Registrar los datos en el formato correspondiente y verificar que los valores


obtenidos se encuentren dentro de los rangos establecidos por el fabricante.
En este momento, el equipo se encontrará listo para medir el pH de cualquier
muestra.

10. Las calibraciones deben realizarse diariamente y llevar un Registro de las


verificaciones.

11. Antes de que el medidor vuelva al modo de medición se mostrara la pendiente.


aparece en el campo inferior mientras que la pendiente real del electrodo, en forma
de porcentaje, se muestra en el campo principal.

12. En este momento, el equipo está listo para medir el pH de cualquier muestra

13. Realizar la medición de pH:


Enjuagar el electrodo con agua desionizada y secar sin frotar con un paño sin
hilachas.

14. Colocar el electrodo en la muestra. (Cada vez que se cambie de muestra para
medir el pH, se debe enjuagar el electrodo con agua destilada y secarlo
cuidadosamente con papel higiénico o paño hilachas.)

a. Si el instrumento se encuentra en el modo de medición continuo, empezara a


medir de inmediato.
b. Si el instrumento se encuentra en el modo AUTO-READ™, presione la tecla

"measure" para comenzar la medición.


c. Si el instrumento se encuentra en el modo de medición por intervalo de tiempo,
el equipo empezara a medir con la frecuencia que se haya especificado en la
configuración.

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15. Retirar el electrodo de la muestra, enjuagar con agua desionizada agitar o secar
sin frotar; si se cuenta con más muestras para medición colocar la siguiente
muestra y repita la actividad anterior.

16. Enjuagar el electrodo con agua desionizada y secar sin frotar.


Nota: Es recomendable dejar el electrodo en solución storage cuando no se use
por un período largo.

17. Apagar el equipo, manteniendo presionado la tecla de encendico/apagado


durante 3 segundos.

18. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de
equipos de laboratorio.

8. EQUIPO: TERMOMETRO DIGITAL (TB-03)

FUNDAMENTO

Este equipo está diseñado para medir la temperatura interna de algún equipo o
ambiente y poder realizar la lectura sin necesidad de ingresar al área ya que permite
tener la pantalla de lectura por fuera del equipo o ambiente.

También realiza la medición de temperatura externa.

DESCRIPCION DE USO

1. El equipo requiere de 1 pila alcalina AA para el funcionamiento.

2. Elegir el lugar donde se colocará el termómetro, de tal forma que permita la fácil
ubicación del sensor externo (al extremo del cordón) dentro del equipo o ambiente
donde se requiere medir la temperatura.

3. El termómetro tiene un botón en la parte frontal, que permite el cambio para la


lectura de la temperatura externa o interna.

4. Para cambiar la lectura de °C a °F presionar el botón °C/°F que se encuentra en la


parte posterior del termómetro.

9. EQUIPO: TERMOHIGROMETRO (TH107)

FUNDAMENTO

Este equipo está diseñado para medir la temperatura interna y la humedad relativa de
algún equipo o ambiente y poder realizar la lectura sin necesidad de ingresar al área
ya que permite tener la pantalla de lectura por fuera del equipo o ambiente.

También realiza la medición de temperatura externa.

DESCRIPCION DE USO

5. El equipo requiere de 1 pila alcalina AAA para el funcionamiento.

6. Elegir el lugar donde se colocará el termo higrómetro, de tal forma que permita la
fácil ubicación del sensor externo (al extremo del cordón) dentro del equipo o
ambiente donde se requiere medir la temperatura.

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7. Para cambiar la lectura de °C a °F presionar el botón °C/°F que se encuentra en la
parte posterior del termo higrómetro.

10. EQUIPO: TERMOHIGROMETRO (H059)

FUNDAMENTO

Este equipo está diseñado para medir la temperatura interna y la humedad relativa de
algún equipo o ambiente y poder realizar la lectura sin necesidad de ingresar al área
ya que permite tener la pantalla de lectura por fuera del equipo o ambiente.

También realiza la medición de temperatura externa.

DESCRIPCION DE USO

8. El equipo requiere de 1 pila alcalina AAA para el funcionamiento.

9. Elegir el lugar donde se colocará el termo higrómetro, de tal forma que permita la
fácil ubicación del sensor externo (al extremo del cordón) dentro del equipo o
ambiente donde se requiere medir la temperatura.

10. Para cambiar la lectura de °C a °F presionar el botón °C/°F que se encuentra


en la parte posterior del termo higrómetro.

11.- EQUIPO: DESTILADOR (DST-02)

FUNDAMENTO

La destilación es un proceso por el cual se separan uno ó varios componentes de


una mezcla líquida. En nuestro caso, el agua potable (agua de la distribución pública)
es sometida a calentamiento en el interior del equipo y el vapor resultante se somete a
la acción de un refrigerante que produce su condensación, recogiendo luego el agua
destilada. Se entiende pues que durante la destilación se separa los iones y sólidos
disueltos, obteniéndose el agua libre de estos componentes.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.
2. Subir la llave de electricidad ON.

3. Encender el equipo pulsando la tecla negra hacia arriba ON.

4. Abrir la llave alimentadora de agua (hasta la cuarta parte para permitir que el agua
corriente ingrese al destilador, a través de la manguera correspondiente).
El Líquido condensado es almacenado en uno de los compartimento del equipo.

Nota: Verificar que la presión de suministro de agua sea la adecuada de 3 a 7 bar.

5. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de equipos
de laboratorio.

12.- EQUIPO: VORTEX MIXER (VOR-002)

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FUNDAMENTO

Es un equipo diseñado para realizar la mezcla u homogenización de una solución


.Este aparato es capaz de crear un remolino al interior de la solución, produciendo la
homogenización precisa de la misma. Utiliza un potente motor que permite el
movimiento oscilatorio de las plataformas de mezcla (donde se colocan los tubos de
vidrio).

En el laboratorio, se utiliza básicamente para la homogenización de muestras en


tubos con caldo nutritivo (tubos de vidrio con tapa), obteniéndose diluciones
adecuadas para realizar análisis microbiológico.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 v , verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.
2. Encender el interruptor principal "ON" y la unidad está configurada "lista para usar".

Nota:

 Cuando el botón se encuentra en el centro (o) el equipo se encuentra


apagado OFF.

 Cuando el botón se encuentra arriba en posición ( - ) significa operación


continua es decir que el equipo se mantiene agitando.

 Cuando el botón se encuentra abajo en posición ( = ) significa que al


presionar el tubo de ensayo se iniciará la función agitadora.

3. Mover el botón de control del lado derecho (flecha amarilla) en sentido horario
para regular la velocidad del equipo (para mayor o menor oscilación) de acuerdo a
lo que se requiera.
Nota: El equipo tiene una velocidad ajustable de 0- 2800 rpm operación continua.

4. Colocar el tubo de ensayo con la solución o muestra, de forma vertical con una
ligera presión en la taza receptora, sólo se necesita una ligera presión para iniciar el
movimiento giratorio, se debe aasegurar que la tapa del tubo se encuentre bien
cerrada, para evitar derrames o contaminaciones.

Nota:

 Si la presión es muy alta, el motor debe ser empujado contra un dispositivo


de seguridad y en consecuencia la velocidad se reduce.

 El equipo tiene una frecuencia de agitación continua, operación de


respuesta continua.

 Se debe asegurar que no haya derrames durante la agitación.

 Se debe utilizar lentes de seguridad.

5. Someter la muestra a la homogenización 10-20 segundos.

6. Detener el proceso de homogenizado y retirar el tubo.


Esta operación se puede realizar tantas veces como muestras por homogenizar se
tengan.

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7. Colocar el botón de control de velocidad en el mínimo y el interruptor principal en el
centro (o) "OFF" , al terminar el trabajo de agitación.

8. Desconectar el equipo y mantenerlo en un lugar apropiado.

9. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de equipos
de laboratorio.

13.- EQUIPO: REFRIGERADORA (RSLA-18)

FUNDAMENTO

Muchos reactivos y medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiología


requieren mantenerse a bajas temperaturas. La refrigeradora mantiene estos
productos a la temperatura necesaria para su conservación.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 v.

2. Colocar el material a refrigerar en el interior del equipo.

3. Mantener el equipo encendido permanentemente

4. .
Registrar el control diario de Temperaturas, en el registro "Control de temperaturas
de refrigeradora".
Nota : Para ello se debe tener en cuenta lo siguiente: Realizar la lectura teniendo
en cuenta que la temperatura en el interior del equipo se encuentre estabilizada, es
decir que la puerta de la refrigeradora no haya sido abierta hasta entonces y anotar
en el registro el valor de la temperatura leída.

14.- EQUIPO: ESTUFA DE ESTERILIZADO (EST-010)

FUNDAMENTO

La estufa de esterilizado es un equipo utilizado con el fin de eliminar


microorganismos por medio de calor seco. Opera a elevadas temperaturas
asegurando una eficaz esterilización de los materiales introducidos.

Se usa principalmente para esterilizar materiales resistentes al calor (material de


vidrio, cucharas, hisopos, entre otros).

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el


voltaje coincida con la fuente de alimentación.

2. Proceder a abrir las puertas y colocar el material a esterilizar en el interior del


horno.

3. Cerrar las puertas del equipo.

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4. Encender el equipo apretando el mando giratorio pulsador. (Nota: El equipo
está apagado cuando el mando giratorio pulsador esta encastrado dentro del
panel y así protegido contra daños.

5. Ajustar el modo de servicio nominal ( I ) manteniendo presionada la tecla “set”


durante 3 segundos, el servicio actual parpadea, seleccionar el modo de
servicio ( I ) mediante el mando giratorio pulsador y la tecla “set” presionada.
Tras soltar la tecla “set”, el regulador se encuentra en el modo de servicio ( I ).

6. Realizar el ajuste de la temperatura interna de la estufa. Para ello, mantener


presionada la tecla “set” se hace girar el “mando giratorio pulsador”, hasta
llegar a la temperatura nominal deseada. Después de soltar la tecla “set”, el
equipo sigue indicando durante un momento, la temperatura nominal de forma
parpadeante. Después se indica la temperatura real actual y el regulador
empieza a regular la temperatura nominal deseada, La cual se observa en la
pantalla del equipo. La función “calentamiento” se indica por medio del símbolo
correspondiente de color naranja.

7. Realizar el ajuste del cambio de aire moviendo la regleta de aire para abrir o
cerrar la trampilla, ajustándose de esta manera la cantidad de aire que entra o
sale.

8. Realizar el ajuste de las revoluciones de la turbina de aire, para ello girar el


mando giratorio pulsador hacia la derecha hasta que parpadee el símbolo de la
turbina, con la tecla “set” apretada seleccionar el 50% (5 rayas) mediante el
mando giratorio pulsador.

9. Realizar el ajuste de la temperatura de vigilancia. Para ello girar el mando


giratorio pulsador hacia la derecha hasta que parpadee la indicación de la
temperatura de vigilancia. Mantener presionada la tecla “set” y ajustar la
temperatura de vigilancia. El rango de ajuste es hasta 10°C por encima de la
temperatura máxima.

10. Proceder a esterilizar el material

11. Una vez transcurrido el tiempo de esterilización, esperar que la temperatura del
horno baje.

12. Abrir las puertas del horno y retirar el material.

Nota: Al esterilizar deberá cerrarse la trampilla del aire después del secado de
material húmedo.

13. Se lleva registro de control diario de Temperaturas del equipo para controlar
que el valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos establecidos
(registro: Control de Temperaturas de Estufas). Así como registrar cada vez
que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

15.- EQUIPO: BAÑO MARIA (BAM-02)

FUNDAMENTO

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Este equipo es empleado básicamente para licuar los medios de cultivo así como
también para mantenerlos una vez licuados, en estado líquido para ser utilizados en el
análisis microbiológico.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el


voltaje coincida con la fuente de alimentación.

2. Encender el equipo apretando el mando giratorio pulsador.

3. Realizar la selección de parámetros del baño maría. Para ello, Girar el mando
giratorio/pulsador, los otros parámetros oscurecen. El parámetro seleccionado
parpadea con luz clara de manera que ahora puede ajustarse, con la tecla set
apretada (protección contra modificación involuntaria), por medio del mando
giratorio/pulsador.

4. Proceder a soltar la tecla set, ya en este momento el valor seleccionado está


fijado.

5. Colocar dentro del baño María los matraces y/o frascos conteniendo los medios
de cultivo, Una vez alcanzada la temperatura de operación deseada.

Nota: Para licuar los medios se regula a 95°C y para mantener los medios de
cultivos ya licuados se regula a 45°C.
6. Luego de concluido el análisis, se procede a apagar el equipo.

7. El equipo está apagado cuando el mando giratorio pulsador está encastrado


dentro del panel y así protegido contra daños.

Nota:
 Girando el mando giratorio/pulsador se pueden seleccionar los siguientes
parámetros en el orden correlativo mostrado y modificado de acuerdo a lo
indicado líneas arriba: Consigna de temperatura. Retardo a la conexión
(delay) Tiempo de retención de la temperatura teórica (hold) Tiempo de
retención dependiente del valor teórico (SP) Suspensión de temperatura

 Girando el mando giratorio/pulsador se pueden seleccionar los siguientes


parámetros en el orden correlativo mostrado y modificado de acuerdo a lo
indicado líneas arriba:

a. Consigna de temperatura.
a. Retardo a la conexión (delay)
b. Tiempo de retención de la temperatura teórica (hold)
c. Tiempo de retención dependiente del valor teórico (SP)
d. Suspensión de temperatura.

8. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de


equipos de laboratorio.

16. EQUIPO: AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-004)

FUNDAMENTO

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Es un equipo diseñado para la destrucción de microorganismos mediante calor
húmedo. Tiene un efecto mayor y más rápido sobre las bacterias, por lo que el agua es
un buen conductor y el calor penetra mejor y se distribuye más uniformemente. El
calor húmedo se puede aplicar en forma de agua caliente o como vapor de agua.
Destruye los organismos por coagulación y desnaturalización de las estructuras
proteicas y enzimáticas. Desarrolla condiciones de temperatura y presión elevadas, las
cuales permiten que se produzca la esterilización efectiva de los materiales
introducidos.

En el laboratorio de microbiología, se emplea básicamente para la esterilización de


medios de cultivo, reactivos, etc.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Verter agua destilada o desionizada al interior de la cámara, hasta un nivel


ligeramente superior a la parrilla base ubicada en el fondo del equipo 7- 8 litros de
agua.(El ciclo de trabajo del equipo no debe empezar si no cuenta con el nivel de
agua requerido (agua destilada o desionizada) es decir al nivel de la parrilla situada
en el fondo.

3. Introducir el material a esterilizar en las canastillas (canastilla sin orificio en la base


va cerca a la resistencia y la canastilla con orificio va en la parte superior), luego
éstas canastillas colocar dentro del equipo, ubicar uniformemente; luego colocar la
tapa tipo platillo , proceder a cerrar la tapa del equipo.

4. Cerrar y ajustar la tapa en forma de cruz (+) a fin de que el ajuste sea parejo.
Asegurar bien la tapa antes de iniciar el proceso de esterilizado.

Nota: Asegurar bien la tapa antes de iniciar el proceso, la llave de purga debe estar
abierta.

5. Encender el equipo con el interruptor del centro para iniciar el autoclavado.


El panel del lado derecho mostrará en la parte superior la temperatura al interior de
la cámara y en la parte inferior mostrará la temperatura programada.

6. Observar que el termómetro indique una temperatura de 100°C y comience a salir


vapor de la llave o válvula de purga roja dejar transcurrir éste proceso por 5 - 7
minutos, cerrar la llave de purga para que la temperatura alcance a la temperatura
deseada (121°C) ó (115°C) y el manómetro alcance 15 psi.

Nota:

 Para Productos cosméticos no utilizamos temperatura de 115°C.

 No intentar abrir la tapa durante el proceso de esterilizado, puede sufrir


quemaduras.

 Nunca abrir la válvula de descarga o drenaje del tanque durante el proceso


de esterilización, porque el vapor presurizado y el agua caliente sale a una
presión de 15 psi.

7. Observar cuando la temperatura deseada el timer empezará a contar a partir del


tiempo programado, transcurrido ese tiempo el equipo comenzará a enfriar..
-Para realizar cambios de temperatura ver Figura A: Modo de operación de
36
temperatura.
-Para realizar cambios de tiempo en el reloj ver Figura B: Modo de Operación de
Tiempo.

Figura A: Modo de operación de temperatura

Figura B: Modo de Operación de Tiempo

8. Colocar el switch en posición “off” y abrir con mucho cuidado la llave de purga para
quitar la presión. Cuando el manómetro ha llegado a cero y se observe que ya no
sale vapor de la llave de purga, procedemos a esperar que enfríe el autoclave y
luego podemos abrir.
Nota :

 Después del proceso de esterilización no dejar la puerta del autoclave


cerrada de un día para otro se malograría la empaquetadura.

 Para un nuevo proceso de esterilización agregar nuevamente agua al


autoclave al nivel de la parrilla y seguir con los pasos anteriormente
descritos

9. Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de equipos
de laboratorio.

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PRECAUCIONES PARA EL USO DEL EQUIPO

- No intentar abrir la tapa durante el proceso de esterilizado, puede sufrir


quemaduras.
- Nunca abrir la válvula de descarga o drenaje del tanque durante el proceso de
esterilización, porque el vapor presurizado y el agua caliente saldrán a una presión
de 15 psi.

17.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-011)

FUNDAMENTO

Las incubadoras son equipos que se emplean para proveer las condiciones
adecuadas de temperatura, que permite el crecimiento y desarrollo de
microorganismos. En la incubadora se colocan las muestras analizadas, si hubiera
contaminación en alguna muestra, el equipo brinda el calor necesario para que los
microorganismos proliferen rápidamente y puedan ser detectados.

En el laboratorio, las incubadoras operan en un rango de 30 – 35°C (temperatura


ideal para permitir el desarrollo bacteriano).
Esta incubadora se utiliza básicamente en el laboratorio para permitir el desarrollo en
placas petri, las cuales presentarán la muestra analizada en medio de cultivo sólido
(Agar) ó líquido (caldo).

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Encender el equipo apretando el mando giratorio pulsador. (Nota: El equipo está


apagado cuando el mando giratorio pulsador esta encastrado dentro del panel y
así protegido contra daños)
3. Ajustar el modo de servicio nominal ( I ) manteniendo presionada la tecla “set”
durante 3 segundos, el servicio actual parpadea, seleccionar el modo de servicio ( I
) mediante el mando giratorio pulsador y la tecla “set” presionada. Tras soltar la
tecla “set”, el regulador se encuentra en el modo de servicio ( I ).

4. Realizar la regulación de la temperatura interna de la incubadora. Para ello,


mantener presionada la tecla “set” se hace girar el “mando giratorio pulsador”,
hasta llegar a la temperatura nominal deseada. Después de soltar la tecla “set”, el
equipo sigue indicando durante un momento, la temperatura nominal de forma
parpadeante. Después se indica la temperatura real actual y el regulador empieza
a regular la temperatura nominal deseada, La cual se observa en la pantalla del
equipo. La función “calentamiento” se indica por medio del símbolo
correspondiente de color naranja.

5. Realizar el ajuste de la temperatura de vigilancia. Para ello girar el mando giratorio


pulsador hacia la derecha hasta que parpadee la indicación de la temperatura de
vigilancia. Mantener presionada la tecla “set” y ajustar la temperatura de vigilancia.
El rango de ajuste es hasta 10°C por encima de la temperatura máxima.

6. Proceder a abrir las puertas (externas e internas) y colocar las placas petri dentro
del equipo. Las placas deben colocarse invertidas, teniendo cuidado de no llenar
excesivamente el interior de la incubadora.
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7. Cerrar las puertas del equipo para mantener la temperatura interior.

8. Se lleva registro de control diario de Temperaturas del equipo para controlar que el
valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos establecidos (registro:
Control de Temperaturas de Estufas). Así como registrar cada vez que se utiliza el
equipo en el registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

18.- EQUIPO : HORNO MICROONDAS (MICROON01)

FUNDAMENTO

Se utiliza para la homogenización del tween con lecitina en el análisis


microbiológico.

DESCRIPCION DE USO
1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el
voltaje coincida con la fuente de alimentación.
Nota 1: Esta actividad se realiza en base al procedimiento "Uso de equipos del
Laboratorio de Microbiología".
Nota 2: Una vez conectado, la pantalla del horno mostrará "88:88" cambia
automáticamente a "12:00" después de 10 segundos.
2. Abrir la puerta del horno para introducir los matraces y/o frascos conteniendo el
tween con lecitina.

Nota 3: Se debe asegurar que el anillo guía rodante se encuentre en el centro


del horno.
Nota 4: El plato de vidrio debe estar sobre el anillo de manera que las tres
lengüetas en el centro del plato encajen con seguridad dentro con las
lengüetas en el piso del horno.

3. Colocar sobre el plato de vidrio los matraces y/o frascos conteniendo el tween
con lecitina.

4. Cerrar la puerta. Asegurarse que se cierre firmemente.

5. Programar el tiempo en el panel de controles, luego presionar el botón "Inicio".


Nota 5: Utilizar para la homogenización minuto a minuto, controlando que no se
rebalse, utilizar para ello los guantes protectores de calor.
Nota 6: El botón "Pausa/Cancelar", nos permite borrar las instrucciones que se
ha ingresado, también permite ordenar una pausa durante el ciclo de
calentamiento del horno.
Nota 7: Presionar una vez el botón "Pausa/Cancelar" para que el horno haga
una pausa durante el calentamiento. Para continuar presionar el botón "Inicio".
Nota 8: Para detener el calentamiento, borrar las instrucciones y regresar a la
pantalla del horno a la hora del día, presionar dos veces el botón
"Pausa/Cancelar".
Nota 9: Para corregir un error que se acaba de ingresar, presionar una vez el
botón "Pausa/Cancelar", después reingrese las instrucciones.
Nota 10: El botón "+30 Seg", permite ahorrar tiempo y configurar rápidamente y
comenzar el calentamiento sin la necesidad de oprimir el botón "Inicio"

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6. Agitar el frasco con cuidado y con ayuda de una bagueta, utilizando para ello
los guantes protectores de calor.
Nota 11: Esta actividad se debe realizar con cuidado ya que están calientes.

7. Retirar el frasco, cuidadosamente haciendo uso de los guantes protectores de


calor, cerrar la puerta del horno.

19.- EQUIPO: MICROINCINERADOR (MICR01)

FUNDAMENTO

Se utiliza para la esterilización de asas de inoculación previa a realizar la siembra


por superficies en los agares plaqueados, tubos de cultivo o laminillas portaobjetos.

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 v.

2. Colocar el interruptor de la palanca en posición "ON" para activar el equipo.


Tener en cuenta que el interruptor debe iluminarse con luz roja..
Nota 1: No tocar ninguna de las piezas de la defensa del calefactor o de las
tapas de extremo cuando el microincinerador esté en posición "ON"
(encendido) o durante 1 hora después de apagarlo.

3. Esterilizar las asas de siembra insertando cuidadosamente el asa o la aguja


como mínimo a mitad de camino en el elemento esterilizante, para evitar el
efecto de producir un aerosol con los contaminantes residuales.
Nota 2: La aguja o el asa se esterilizan en 5 a 7 segundos. No es necesario
calentar la aguja o asa al rojo vivo.
Nota 3: Cuando no se usan las asas se pueden colocar en los orificios de
almacenamiento ubicados en las patas de la unidad base. Ver anexo 3:
Descripción de partes del equipo.
Nota 4: Se puede usar el soporte para asas sin embargo cuando las utilice
evitar dejar las asas y/o las agujas dentro del elemento calefactor durante
periodos prolongados. Puede recalentarse el apoyo de asa puede causar
riesgo potencial a la seguridad.
4. Ajustar de ser necesario el ángulo del cabezal del quemador para adecuarlo al
estilo de trabajo de cada usuario.
Nota 5: Dejar enfriar el quemador durante 1 hora antes de ajustarlo.

5. Girar la palanca de ajuste de inclinación del quemador en sentido anti horario


aprox. ½ vuelta a la posición deseada. Para trabar el cabezal del quemador
girar la palanca de ajuste de inclinación del mismo en sentido horario hasta que
el cabezal quede firmemente sujeto. (no apriete excesivamente la palanca de
ajuste del quemador).

Nota 6: Se debe tener precauciones ya que el micro incinerador puede


alcanzar temperaturas extremas de 350 grados F (177°C) . No usar materiales
inflamables con la unidad cuando éste está funcionando. Solo se puede usar
agujas y asas reutilizables con mangos aislados. No insertar agujas o asas de
plásticos descartables.

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Para esterilizar las asas de siembra:

41
20.- EQUIPO: CABINA DE BIOSEGURIDAD (CBS001)

FUNDAMENTO

La atmósfera del ambiente de análisis es muy importante, ya que los medios de


cultivo son muy susceptibles de contaminarse.

La cabina de bioseguridad es un equipo cuya función es brindar un ambiente


aséptico, exenta de partículas físicas y microorganismos, permitiendo que el análisis
sea seguro y sin riesgo de contaminación.

Posee 2 filtro HEPA el cual tiene un 99.9 % de eficiencia de retención sobre


partículas de 0.3 um.

DESCRIPCION DE USO

Las descripciones de uso están detalladas en el instructivo “uso correcto de cabina de


bioseguridad CBS001” cargado en el YDM.

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21.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-012)

FUNDAMENTO

Las incubadoras son equipos que se emplean para proveer las condiciones
adecuadas de temperatura, que permite el crecimiento y desarrollo de
microorganismos. En la incubadora se colocan las muestras analizadas, si hubiera
contaminación en alguna muestra, el equipo brinda el calor necesario para que los
microorganismos proliferen rápidamente y puedan ser detectados.

En el laboratorio, las incubadoras operan en un rango de 20 – 25°C (temperatura ideal


para mohos y levaduras).
Esta incubadora se utiliza básicamente en el laboratorio para permitir el desarrollo en
placas petri, las cuales presentarán la muestra analizada en medio de cultivo sólido
(Agar) ó líquido (caldo).

DESCRIPCION DE USO

1. Conectar el equipo a corriente de 220 Voltios, Verificar previamente que el voltaje


coincida con la fuente de alimentación.

2. Encender el equipo apretando el mando giratorio pulsador. (Nota: El equipo está


apagado cuando el mando giratorio pulsador esta encastrado dentro del panel y
así protegido contra daños).

3. Ajustar el modo de servicio nominal ( I ) manteniendo presionada la tecla “set”


durante 3 segundos, el servicio actual parpadea, seleccionar el modo de servicio ( I
) mediante el mando giratorio pulsador y la tecla “set” presionada. Tras soltar la
tecla “set”, el regulador se encuentra en el modo de servicio ( I ).

Nota: Tras seleccionar un modo de servicio, se indican en el display todos los


ajustes importantes del regulador al mismo tiempo. Girando el mando
giratorio/pulsador, puede seleccionarse un parámetro (punto de menú) , los otros
parámetros oscurecen. El parámetro seleccionado parpadea con luz clara de
manera que ahora puede ajustarse, con la tecla "Set" apretada, por medio del
mando giratorio y pulsador. Después de soltar la tecla "Set" el valor seleccionado
está fijado.
Tras 30 segundos sin accionar ni el mando giratorio/pulsador ni la tecla "Set", el
regulador regresa automáticamente al menú principal.

4. Realizar la regulación de la temperatura interna de la incubadora. Para ello,


mantener presionada la tecla “set” se hace girar el “mando giratorio pulsador”,
hasta llegar a la temperatura nominal deseada. Después de soltar la tecla “set”, el
equipo sigue indicando durante un momento, la temperatura nominal de forma
parpadeante. Después se indica la temperatura real actual y el regulador empieza
a regular la temperatura nominal deseada, La cual se observa en la pantalla del
equipo. La función “calentamiento” se indica por medio del símbolo
correspondiente de color naranja.

5. Realizar el ajuste de la temperatura de vigilancia. Para ello girar el mando giratorio


pulsador hacia la derecha hasta que parpadee la indicación de la temperatura de
vigilancia. Mantener presionada la tecla “set” y ajustar la temperatura de vigilancia.
El rango de ajuste es hasta 10°C por encima de la temperatura máxima.
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6. Proceder a abrir las puertas (externas e internas) y colocar las placas petri dentro
del equipo. Las placas deben colocarse invertidas, teniendo cuidado de no llenar
excesivamente el interior de la incubadora.

7. Cerrar las puertas del equipo para mantener la temperatura interior.

8. Se lleva registro de control diario de Temperaturas del equipo para controlar que el
valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos establecidos (registro:
Control de Temperaturas de Estufas). Así como registrar cada vez que se utiliza el
equipo en el registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

22.- EQUIPO: CABINA DE BIOSEGURIDAD (CBS002)

FUNDAMENTO

La atmósfera del ambiente de análisis es muy importante, ya que los medios de


cultivo son muy susceptibles de contaminarse.

La cabina de bioseguridad es un equipo cuya función es brindar un ambiente


aséptico, exenta de partículas físicas y microorganismos, permitiendo que el análisis
sea seguro y sin riesgo de contaminación.

Posee 2 filtro HEPA el cual tiene un 99.9 % de eficiencia de retención sobre


partículas de 0.3 um.

DESCRIPCION DE USO

Las descripciones de uso están detalladas en el instructivo “uso correcto de cabina de


bioseguridad CBS002” cargado en el YDM.

MM03.5 MANTENIMIENTO, LIMPIEZA Y REGISTROS

1.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-005)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Se debe efectuar el mantenimiento preventivo y calibración del equipo según


cronograma.

- La limpieza periódica del recinto interior, que se limpia fácilmente, evita la


formación de restos que en efecto continuo puedan mermar tanto la
funcionabilidad de la incubadora como su aspecto.

- La estufa puede limpiarse con productos de limpieza para acero inoxidable, de uso
comercial. Hay que cuidar de no introducir objetos que puedan oxidarse dentro de
la cámara de trabajo. Los sedimentos de óxido provocan la infección de la cámara
de trabajo de acero inoxidable o bien de la carcasa.

- Si a causa de los ensuciamientos, se producen puntos de óxido en la superficie de


la cámara de trabajo , estos deben ser limpiados y pulidos de inmediato.

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- La limpieza se realiza semanalmente, utilizando alcohol 70%, (Registro: Limpieza
de Equipos).

- Es recomendable lubricar las piezas móviles de las puertas (bisagras y cierre) 1


vez al año, con una grasa fina de silicona. No se puede prescindir de un buen
cierre de puerta en las estufas térmicas.

- En las estufas de esta marca el cierre estanco de la puerta queda garantizado de


forma optima por una junta de lado estufa y otra junta de lado puerta.

- Para garantizar una circulación de aire óptima la chapa de corredera (bandejas) de


modo que entre la puerta, chapa de corredera y pared posterior de la cámara
interior queden unos espacios intermedios de aire aprox.

- Verificar constantemente que la incubadora esté trabajando a la temperatura


deseada (30-35°C). Si la temperatura varía, los resultados obtenidos no serán
confiables, ya que los microorganismos no podrían desarrollar por estar a
temperatura baja, morirían por exceso de calor o simplemente se pueden inhibir
por los cambios de temperatura.

- El equipo presenta un indicador digital de temperatura que permite visualizar la


lectura de la temperatura interna.

- Se debe llevar un registro de verificación diaria de la temperatura del equipo para


controlar que el valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos
establecidos (registro: Control de Temperaturas de Estufas). Adicionalmente, con
otro termómetro calibrado, realizar controles mensuales de la temperatura de la
estufa para garantizar que el termómetro del equipo está funcionando
correctamente y por tanto dando lecturas correctas.

- Registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro: Control de uso de


equipos de laboratorio.

NOTA
El mantenimiento y limpieza se aplica también a la Estufa de Incubación EST-007 ya
que las Estufas de Incubación EST-005 y EST-007 son de la misma marca y modelo.

2.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-006)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

Según los mismos procedimientos que en el caso de la incubadora anterior.

3.- EQUIPO: BALANZA ANÁLITICA (BAL006)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Se debe efectuar el mantenimiento preventivo del equipo así como la calibración


según cronograma.

- Es importante evitar al momento de pesar: Fluctuaciones excesivas de


temperatura, corrientes de aire, vibraciones ya que pueden originar errores en las
lecturas de los resultados.

- Desconectar de la fuente de alimentación antes de realizar la limpieza del equipo.

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- Limpiar el plato de pesaje, el elemento de la corta -aires , la placa inferior y la corta
aires; La balanza está fabricada con materiales resistente de alta calidad, por ello
se puede limpiar con un paño húmedo o con productos de limpieza corriente.

- Para limpiar a fondo el corta –aires, retirar el plato de pesada, el elemento de la


corta aires y el soporte para la cazoleta, retire la placa inferior. Desbloquear la
corta -aires , levantarla y retirarla de la balanza, colocar sobre una superficie
limpia, y proceder con la limpieza.

- Volver a instalar el corta-aires, asegurarse de colocarla en posición correcta.

- Asegurar de que ningún liquido entre en contacto con la balanza ni el adaptador de


CA

- No utilizar bajo ningún concepto productos de limpieza que contengan disolventes


o ingredientes abrasivos, ya que podrían borrar el panel de mandos.( para la
limpieza del cristal de la corta - aires se puede utilizar alcohol Isopropilico ).

- Es necesario realizar limpieza del plato de pesada, cada vez que se utilice la
balanza. ( se puede utilizar para ello alcohol 70°)

- La balanza está configurada de fábrica con el ajuste totalmente automático FACT


(Fully Automatic Calibración Technology, tecnología de calibración totalmente
automática) con la pesa interna. La balanza se ajusta automáticamente: Después
de la fase de calentamiento tras la conexión a la corriente eléctrica. Cuando hay un
cambio de las condiciones del entorno.

- Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de


Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro:
Control de uso de equipos de laboratorio.

Descripción General Balanza BAL006: Plataforma S.

46
4.- EQUIPO: BALANZA ANALITICA (B022)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Se debe efectuar el mantenimiento preventivo del equipo así como la calibración


según cronograma.

- Es importante evitar al momento de pesar: Fluctuaciones excesivas de


temperatura, corrientes de aire, vibraciones ya que pueden originar errores en las
lecturas de los resultados.

- Desconectar de la fuente de alimentación antes de realizar la limpieza del equipo.

- Limpiar el plato de pesaje, la balanza está fabricada con materiales resistente de


alta calidad, por ello se puede limpiar con un paño húmedo o con productos de
limpieza corriente.

- Asegurar de que ningún liquido entre en contacto con la balanza ni el adaptador de


CA
- No utilizar bajo ningún concepto productos de limpieza que contengan disolventes
o ingredientes abrasivos, ya que podrían borrar el panel de mandos.

- Es necesario realizar limpieza del plato de pesada, cada vez que se utilice la
balanza. ( se puede utilizar para ello alcohol 70°)

- La balanza está configurada de fábrica con el ajuste totalmente automático FACT


(Fully Automatic Calibración Technology, tecnología de calibración totalmente
automática) con la pesa interna. La balanza se ajusta automáticamente: Después

47
de la fase de calentamiento tras la conexión a la corriente eléctrica. Cuando hay un
cambio de las condiciones del entorno.

- Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de


Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro:
Control de uso de equipos de laboratorio.

Descripción General Balanza B022 : Plataforma S.

5.- EQUIPO: AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-005)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Este equipo requiere de mantenimiento preventivo (incluida la limpieza del tanque)


al menos una vez al año y calibración según cronograma.

- Las autoclaves necesitan el cambio continuo del agua destilada o desionizada con
la que operan, cuya frecuencia debe ser semanal o cada vez que se observa
enturbiamiento o suciedad del agua.
- Para realizar la limpieza del equipo es necesario que éste se encuentre apagado y
desconectado.
- Además, es necesario realizar la limpieza del equipo utilizando para ello una
esponja suave y pulidor, no usar sustancias química en ninguna parte del
autoclave.
Lavar las paredes internas y la canastilla, enjuagando luego con agua corriente y
finalmente con agua destilada
- Los autoclaves necesitan el cambio continuo del agua destilada o desionizada con
la que operan, cuya frecuencia debe ser semanal o cada vez que se observa
enturbiamiento o suciedad del agua.
- Se debe llevar un registro de limpieza semanal del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro:
Control de uso de equipos de laboratorio.
- Se realiza una verificación del proceso de esterilización utilizando bioindicadores
con frecuencia semanal o cada vez que se crea necesario. se registra los datos en
el registro: Verificación de esterilización de Autoclave.

48
VERIFICACIÓN DEL PROCESO DE ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO
(AUTOCLAVADO) a 121°C.

PRINCIPIO:

El indicador biológico EZTEST Steam contiene esporas bacterianas inoculadas sobre


un soporte, empacadas en un pequeño tubo termoplástico de cultivo. Dentro del tubo
termoplástico hay una ampolla de vidrio sellada conteniendo el medio de cultivo
especialmente diseñado: Soybean Casein Digest con un indicador de color, el cual
cambia a amarillo en presencia de crecimiento del microorganismo.

- Para realizar el control de la esterilización (es decir, que se garantice la destrucción


total de microorganismos), utilizamos un indicador biológico para calor húmedo EZ
TEST Steam, cuya frecuencia se realiza semanalmente o cada vez que se crea
necesario ( se registra los datos en el registro: Verificación de esterilización de
Autoclave).
-

- Cada unidad de indicador biológico EZTEST Steam consta de un vial termoplástico


que sirve como tubo de cultivo y contiene lo siguiente:

 Esporas bacteriana de Geobacillus stearothermophilus (Bacillus


stearothermophilus) ATCC 7953, inoculadas en un soporte.
 Una ampolla de vidrio con medio de cultivo estéril especialmente
diseñado de Soybean Casein Digest, conteniendo un indicador de pH
(púrpura de bromocresol).
 Un indicador químico en la etiqueta de cada unidad, el cual cambia de
color de azul a negro cuando ha habido exposición al vapor,
distinguiendo las ampollas de bioindicador expuestas a proceso de las
no expuestas. Nota: El cambio de color no indica esterilización
aceptable.
 Un pequeño dispositivo para romper la ampolla que contiene el medio
de cultivo y liberarlo para proporcionarle al microorganismo condiciones
adecuadas de crecimiento. Las esporas sólo se destruyen totalmente
luego de someterse a presión de vapor alta (15 lb.) y temperatura de
121 °C por 15 min. En el caso de temperatura baja o tiempo de
esterilización más corto, las esporas pueden sobrevivir.

- El indicador se colocan en la autoclave dentro del material a esterilizar. ( los


indicadores biológicos se colocan 1 por canastilla, en el centro)

- Luego de someter al indicador biológico EZTEST Steam al proceso de esterilizado,


este debe ser incubado a una temperatura de 55-60°C por un tiempo de 24 horas.
Es aconsejable realizar lecturas rutinarias cada 12 horas.

- Como control positivo debe incubarse otro indicador no esterilizado.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

- La aparición de un color amarillo luego de la incubación de los indicadores


biológicos sometidos a esterilización, indican desarrollo del microorganismo en
consecuencia esterilización inaceptable.

- Ningún cambio de color indica que las esporas fueron eliminadas en el proceso de
esterilización en consecuencia esterilización aceptable.

49
- Los resultados obtenidos son registrados en el registro: Verificación de
esterilización de Autoclave.

Nota:

- Almacenar los indicadores a temperatura ambiente, en ambiente controlado


- Para el descarte de los indicadores biológicos EZTEST Steam, deben someterse a
incineración o autoclavado a 121°C por no menos de 30 minutos.
- Se puede utilizar también el indicador Biológico sterikon.
- Los dispositivos Sterikon son bioindicadores dispuestos en ampollas que
presentan en su interior esporas de las bacterias Bacillus stearothermophilus como
organismos de prueba. Las esporas sólo se destruyen totalmente luego de
someterse a presión de vapor alta (15 lb.) y temperatura de 121 °C por 15 min. En
el caso de temperatura baja o tiempo de esterilización más corto, las esporas
pueden sobrevivir.
- Las ampollas se colocan en la autoclave junto con el material a esterilizar. Luego
de la esterilización, las ampollas de Sterikon se colocan en la incubadora a 60° + 2
°C por 48 horas.
- Como control debe incubarse otra ampolla no esterilizada.
- En el caso de esterilización suficiente de las esporas de Bacillus
stearothermophilus quedan destruidas. El color del contenido de las ampollas
permanece violeta rojizo y transparente.
- En caso de esterilización insuficiente sobrevivien las esporas de Bacillus
stearothermophilus. El contenido de las ampollas muestra generalmente ya dentro
de las 24 horas de incubación un viraje de color hacia amarillo por formación de
ácido como consecuencia de la fermentación del azúcar así como turbidez debida
al crecimiento microbiano.
- Los resultados obtenidos son registrados en el registro: Verificación de
esterilización de Autoclave.

6.- EQUIPO: HY-LITE SISTEM (HYL-001)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- El equipo requiere de mantenimiento preventivo y calibración según cronograma.

Limpieza del monitor:

- La superficie externa del monitor debe limpiarse con un paño húmedo y luego
secarse.
- La cámara de medición debe también limpiarse periódicamente de la siguiente
manera:

 Desconectar el monitor de la fuente externa de corriente.

 Limpiar cuidadosamente la superficie interior de plástico de la cámara de


medición con un hisopo limpio, ligeramente humedecido con agua. Repetir
el procedimiento usando un hisopo seco, para eliminar la humedad al
interior de la cámara.

Es recomendable limpiar rutinariamente el monitor cada día de uso del equipo.

Recargamiento de Baterías:

50
- El monitor funciona con baterías recargables de Níquel - Cadmio. Con las baterías
totalmente cargadas, el monitor es capaz de realizar como mínimo 800
operaciones secuenciales.
- Cuando las baterías requieren recargarse, aparecerá en el visor una señal de
aviso. Cuando esto sucede, recargar las baterías lo antes posible de la siguiente
manera:

 Conectar al monitor el adaptador para conexión a corriente de 240 v. éste a


su vez se conecta a la corriente externa, teniendo cuidado de que el monitor
se encuentre desconectado.

 Comprobar que el indicador rojo LED del cargador esté iluminado, lo cual
garantiza que el monitor está recibiendo carga.

 El monitor debe estar conectado al cargador como mínimo 8 horas. La carga


completa de las baterías Níquel - Cadmio requiere 18 horas de carga.

7.- EQUIPO: POTENCIOMETRO (POT-009)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- El equipo requiere de mantenimiento preventivo y calibración según cronograma


- La limpieza externa de las superficies puede efectuarse con esponja o paño suave,
teniendo cuidado de no mojar el interior del equipo, ésta limpieza se realiza
semanalmente
- Realizar la verificación diaria del potenciometro, con los buffers que se registra en
el registro de " Verificación de Potenciómetro".
- Realizar la limpieza del electrodo esta se realiza con agua destilada por enjuagues
sucesivos procurar no frotar el electrodo sólo absorber el líquido, esta limpieza se
realiza diaria y/o cada vez que se realiza una medición.
- Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro:
Control de uso de equipos de laboratorio.

8. EQUIPO: TERMOHIGROMETRO (TH107)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA:

Este equipo requiere de calibración según cronograma.

9. EQUIPO: TERMOMETRO DIGITAL (TB-03)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA:

Este equipo requiere de calibración según cronograma.

10. EQUIPO: TERMOHIGROMETRO (H059)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA
e
Este equipo requiere de calibración según cronograma.

11. EQUIPO: TERMOHIGROMETRO (TH009)

51
MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA:

Este equipo requiere de calibración según cronograma.

12.- EQUIPO: AUTOCLAVE VERTICAL (AUT-004)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA:

- Este equipo requiere de mantenimiento preventivo (incluida la limpieza del tanque)


al menos una vez al año y calibración según cronograma.

- Las autoclaves necesitan el cambio continuo del agua destilada o desionizada con
la que operan, cuya frecuencia debe ser semanal o cada vez que se observa
enturbiamiento o suciedad del agua.

- Para realizar la limpieza del equipo es necesario que éste se encuentre apagado y
desconectado.

- Además, es necesario realizar la limpieza del aparato, utilizando para ello una
esponja suave y pulidor. Deben lavarse las paredes internas y la canastilla,
enjuagando luego con agua corriente y finalmente con agua destilada.

- Para realizar la limpieza del equipo es necesario que éste se encuentre apagado y
desconectado.

- Se debe llevar un registro de limpieza semanal del equipo, (Registro: Limpieza de


Equipos).

VERIFICACIÓN DEL PROCESO DE ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO


(AUTOCLAVADO)
- Idem a lo detallado para el AUT-005.

13.- EQUIPO: DESTILADOR (DST-02)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA:

- Se recomienda realizar un mantenimiento preventivo de acuerdo a lo indicado por


el fabricante en el certificado, para evitar la acumulación de sólidos que puedan
dañar el equipo y disminuir su funcionabilidad.
- En el se debe contemplar la realizar la limpieza del recinto interno removiendo el
sarro acumulado en el interior del destilador, utilizando para ello solución de ácido
acético al 15 %. Esta solución se somete a calentamiento dentro del equipo,
observándose el arrastre del sarro adherido al interior.
- Al finalizar esta operación, retirar el exceso de ácido haciendo circular abundante
agua.
- El mantenimiento preventivo se realiza de acuerdo al cronograma.

14.- EQUIPO: VORTEX MIXER (VOR-002)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

52
- El aparato requiere mantenimiento preventivo mínimo una vez al año. El
mantenimiento preventivo del equipo según cronograma
- La parte superior de la carcasa es en su mayoría resistente al ácido y fácil de
limpiar con agua tibia y detergente. No utilizar malla metálica o esponjas similares
para limpiar el equipo.
- La taza receptora se puede limpiar con alcohol de 70°.
- Se debe llevar un registro de limpieza diaria del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos). Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el registro:
Control de uso de equipos de laboratorio.

15.- EQUIPO: REFRIGERADORA (RSLA-18)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Este equipo requiere de mantenimiento preventivo según cronograma


- El equipo debe ser limpiado (interna y externamente) periódicamente con
productos de limpieza adecuados evitando así la acumulación de restos y su
deterioro.
- Es importante verificar el buen funcionamiento del termostato así como también
que el cierre de la puerta del refrigerador garantice la hermeticidad del equipo ya
que de no ser así podría descongelarse y malograr los productos refrigerados.

16.- EQUIPO: ESTUFA DE ESTERILIZADO (EST-010)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Este equipo requiere de mantenimiento preventivo y calibración según


cronograma.

- La limpieza periódica de la cámara interior evita la formación de restos que en


efecto continuo pueden mermar tanto el aspecto de la cámara interior inoxidable
como su funcionalidad. Esta limpieza se realiza una vez por semana.

- Se debe llevar un registro de limpieza semanal del equipo , (formato : Registro de


Limpieza de Equipos. Así como registrar cada vez que se utiliza el equipo en el
registro: Control de uso de equipos de laboratorio.

- Las superficies metálicas de la estufa pueden limpiarse con productos de limpieza


de acero inoxidable corrientes en el comercio.

- Se debe cuidar de no introducir objetos oxidados o que puedan oxidarse en


contacto con la cámara interior o la carcasa de acero inoxidable. los sedimentos de
oxido provocan la infección del acero inoxidable. Si a causa de los ensuciamientos,
se producen puntos de oxido en la superficie de la cámara de trabajo, estos deben
ser limpiados y pulidos de inmediato.

- El panel de mando, los módulos de servicio así como otras partes del plástico del
horno no deben limpiarse con productos de limpieza que contengan disolventes o
arena para fregar.

- Es recomendable lubricar las piezas móviles de las puertas (bisagras y cierre) 1


vez por año ( en servicio permanente de 4 veces por año) con grasa fina de
silicona y comprobar si las bisagras están bien fijadas con tornillos.

- No se puede prescindir de un buen cierre de la puerta de las estufas.

53
- Se realiza una verificación del proceso de esterilización utilizando bioindicadores
con frecuencia semanal o cada vez que se crea necesario. se registra los datos en
el registro: Verificación de esterilización de Estufa ( calor seco).

VERIFICACIÓN DEL PROCESO DE ESTERILIZACION POR CALOR SECO A ALTAS


TEMPERATURAS

La verificación del proceso de esterilización por calor seco (estufa de esterilizado) se


realiza utilizando indicadores biológicos en este caso se utilizan indicador biológico
DRIAMP Culturing Set with Releasat Medium.

El indicador biológico DRIAMP Culturing Set with Releasat Medium contiene una
ampolla con esporas en soporte de sílica y un tubo con medio de cultivo Modified
Soybean Casein Digest Broth con un indicador de color, el cual cambia a amarillo en
presencia de crecimiento del microorganismo.

- La frecuencia se realiza semanalmente o cada vez que se crea necesario.

- Cada unidad de indicador biológico DRIAMP Culturing Set with Releasat Medium
contiene lo siguiente:

 Una ampolla con esporas bacteriana de Bacillus atrophaeus ATCC


9372 en soporte de sílica..
 Un tubo con medio de cultivo estéril especialmente diseñado de cultivo
Modified Soybean Casein Digest Broth, conteniendo un indicador de pH
(Rojo de fenol).

- La ampolla se coloca dentro de la estufa, dentro del material a esterilizar. ( los


indicadores biológicos se colocan 1 en la parte superior , una en la parte inferior de
la estufa)

- Luego de someter la ampolla al proceso de esterilizado, está en condiciones de


esterilidad debe ser trasvasada al tubo conteniendo el medio de cultivo, para ser
incubado a una temperatura de 36-38°C por un tiempo de 72 horas.

- Como control positivo debe incubarse otro medio conteniendo una ampolla sin
haber sido esterilizada.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

- El viraje de color del medio a amarillo luego de la incubación, indican desarrollo del
microorganismo en consecuencia esterilización fallida.

- La permanencia del color del medio de cultivo rojo – anaranjado, indica no


crecimiento en consecuencia esterilización adecuada.

- Los resultados obtenidos son registrados en el Registro : Verificación de


esterilización de Estufa ( calor seco)

Nota:

- Almacenar los indicadores a temperatura ambiente, en ambiente controlado

- Para el descarte de los indicadores biológicos DRIAMP Culturing Set with Releasat
Medium, deben someterse a incineración o autoclavado a 121°C por no menos de
30 minutos.
54
17.- EQUIPO: BAÑO MARIA (BM-02)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Este equipo requiere de mantenimiento preventivo y calibración según


cronograma.
- Para realizar la limpieza del equipo es necesario que éste se encuentre apagado y
desconectado
- No debe usarse cualquier otro líquido que no sea agua destilada.
- La limpieza del recinto de atemperar, se limpia fácilmente para evitar la formación
de restos que en efecto continuo pueden mermar tanto la funcionalidad del
recipiente para baños de agua como su aspecto.
- La cubeta ya la caja pueden limpiarse con productos de limpieza y descalcificación
para acero inoxidable comerciales.
- Se debe realizar la limpieza con esponja suave, agua y/o detergente líquido.
Deben lavarse las paredes internas del recinto, enjuagando luego con agua
corriente y finalmente con agua destilada.
- Se debe llevar un registro de limpieza semanal del equipo, (Registro: Limpieza de
Equipos).

Nota:
 Se ha de prestar atención de que no entren en contacto objetos oxidados con
la cubeta de acero inoxidable o con la carcasa de acero inoxidable. Los
sedimentos de óxido provocan contaminación.
 Si a causa de los ensuciamientos, se producen puntos de óxido en la
superficie, estos deben ser limpiados y pulidos de inmediato.
 En los aparatos con tapa tejadillo, es recomendable de lubricar de vez en
cuando el vástago de la bisagra (en caso de uso intensivo).

18.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-011)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Se debe efectuar el mantenimiento preventivo del equipo según cronograma y


calibración según cronograma.
- Verificar constantemente que la incubadora esté trabajando a la temperatura
deseada (30-35°C). Si la temperatura varía, los resultados obtenidos no serán
confiables, ya que los microorganismos no podrían desarrollar por estar a
temperatura baja, morirían por exceso de calor o simplemente se pueden inhibir
por los cambios de temperatura.

- El equipo presenta un indicador digital de temperatura que permite visualizar la


lectura de la temperatura interna.

- Se debe llevar un registro de verificación diaria de la temperatura del equipo para


controlar que el valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos
establecidos (formato: Registro de Temperaturas de Estufas).

- La limpieza periódica de la cámara interior evita la formación de restos que en


efecto continuo pueden mermar tanto el aspecto de la cámara interior inoxidable
como su funcionalidad. Esta limpieza se realiza una vez por semana.

- Se debe llevar un registro de limpieza semanal, utilizando alcohol 70%. (formato :


Registro de Limpieza de Equipos)

55
- Las superficies metálicas de la estufa pueden limpiarse con productos de limpieza
de acero inoxidable corrientes en el comercio.

- Se debe cuidar de no introducir objetos oxidados o que puedan oxidarse en


contacto con la cámara interior o la carcasa de acero inoxidable. los sedimentos de
oxido provocan la infección del acero inoxidable. Si a causa de los ensuciamientos,
se producen puntos de oxido en la superficie de la cámara de trabajo, estos deben
ser limpiados y pulidos de inmediato.

- El panel de mando, los módulos de servicio así como otras partes del plástico del
horno no deben limpiarse con productos de limpieza que contengan disolventes o
arena para fregar.

- Es recomendable lubricar las piezas móviles de las puertas (bisagras y cierre) 1


vez por año ( en servicio permanente de 4 veces por año) con grasa fina de
silicona y comprobar si las bisagras están bien fijadas con tornillos.

- No se puede prescindir de un buen cierre de la puerta de las estufas.

19.- EQUIPO: HORNO MICROONDAS (MICROON01)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Mantener limpio el interior del horno. las partículas y los líquidos


derramados pueden pegarse a las paredes del horno, causando que el
horno pierda eficiencia.

- Limpiar inmediatamente los derrames. Usar para ello un trapo húmedo y un


jabón suave. No utilizar detergentes agresivos o abrasivos.
Retirar el palto de vidrio cuando limpie el horno o plato. Para evitar que el
plato se rompa, manejarlo con cuidado y no la coloque en agua
inmediatamente después de haberla usado. Lavar cuidadosamente el plato
con agua tibia y jabonosa.

- Se puede limpiar la superficie externa del horno con jabón y un trapo


húmedo. Secar usando un trapo seco. Para prevenir daños a las partes
operativas del horno, no permitir que el agua resbale dentro de las
aberturas.
Se puede lavar la ventana del horno usando jabón muy suave y agua,
Asegurar de usar u trapo suave para evitar rayarla.
Nota 1: Antes de limpiar se debe desenchufar el equipo del tomacorriente
de pared.
Nota 2: No poner en funcionamiento el equipo con las manos húmedas.
Nota 3: No utilizar benceno ni alcohol para limpiar el equipo

- No se debe introducir otro tipo de producto al interior del horno (alimentos,


productos químicos, materiales metálicos, medios de cultivo, etc.).

20.- EQUIPO: MICROINCINERADOR (MICR01)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- No se debe sumergir nunca en agua ni en ningún otro compuesto limpiador.

56
- Inspeccionar periódicamente el tubo para detectar posibles signos de que sea
necesario reemplazar el elemento.
- Verificar si hay indicaciones de acumulación de residuos o pequeñas fisuras que
pueden reducir la eficiencia del elemento.
- Cuando se enciende la unidad las fisuras aparecerán como líneas amarillo –
anaranjadas brillantes en el tubo.
- Antes de realizar cualquier limpieza o mantenimiento el equipo debe estar apagado
y que se haya enfriado como mínimo durante 1 hora.
- Para limpiarlo use sólo un paño húmedo en el esterilizador y evite introducir
fluidos en la unidad.
- Se puede usar un detergente suave. Humedezca ligeramente el paño de limpieza y
páselo por la unidad, asegurándose de eliminar todo el exceso de líquido.

21.- EQUIPO: ESTUFA INCUBADORA (EST-012)

MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA

- Se debe efectuar el mantenimiento preventivo del equipo según cronograma y


calibración según cronograma.
- Verificar constantemente que la incubadora esté trabajando a la temperatura
deseada (20-25°C). Si la temperatura varía, los resultados obtenidos no serán
confiables, ya que los mohos y las levaduras no podrían desarrollar por estar a
temperatura baja, morirían por exceso de calor o simplemente se pueden inhibir
por los cambios de temperatura.

- El equipo presenta un indicador digital de temperatura que permite visualizar la


lectura de la temperatura interna.

- Se debe llevar un registro de verificación diaria de la temperatura del equipo para


controlar que el valor de la temperatura se mantenga dentro de los rangos
establecidos (formato: Registro de Temperaturas de Estufas).

- La limpieza periódica de la cámara interior evita la formación de restos que en


efecto continuo pueden mermar tanto el aspecto de la cámara interior inoxidable
como su funcionalidad. Esta limpieza se realiza una vez por semana.

- Se debe llevar un registro de limpieza semanal, utilizando alcohol 70%. (Registro:


Limpieza de Equipos)

- Las superficies metálicas de la estufa pueden limpiarse con productos de limpieza


de acero inoxidable corrientes en el comercio.

- Se debe cuidar de no introducir objetos oxidados o que puedan oxidarse en


contacto con la cámara interior o la carcasa de acero inoxidable. los sedimentos de
oxido provocan la infección del acero inoxidable. Si a causa de los ensuciamientos,
se producen puntos de oxido en la superficie de la cámara de trabajo, estos deben
ser limpiados y pulidos de inmediato.

- El panel de mando, los módulos de servicio así como otras partes del plástico del
horno no deben limpiarse con productos de limpieza que contengan disolventes o
arena para fregar.

- Es recomendable lubricar las piezas móviles de las puertas (bisagras y cierre) 1


vez por año ( en servicio permanente de 4 veces por año) con grasa fina de
silicona y comprobar si las bisagras están bien fijadas con tornillos.

57
- No se puede prescindir de un buen cierre de la puerta de las estufas. Un buen
cierre de puertas en las incubadoras es esencial, el cierre estanco de la puerta
queda garantizado de forma óptima por una junta de lado incubadora y otra junta
de lado puerta.

MM04.- PREPARACION DE MATERIAL DE TRABAJO

MM04.1 CONCEPTOS

ESTERILIZACION.- Es la técnica basada en métodos físicos, mediante el cual se


destruye toda forma de vida. Para tal fin se utiliza el Autoclave o el Horno de
Esterilizado. Siempre que se controle adecuadamente los parámetros (temperatura,
tiempo de acción y presión) el proceso será garantizado.

ESTERILIZACION POR MEDIO DEL CALOR.- El efecto destructivo del calor sobre las
bacterias está en íntima relación con el grado de humedad del ambiente, por lo que
hay que distinguir entre acción del calor húmedo y la del calor seco.

ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO (AUTOCLAVE).- Tiene un mayor efecto en


menor tiempo sobre las bacterias, porque el agua es un buen conductor, con lo que el
calor penetra mejor y se distribuye más uniformemente.

ESTERILIZACION POR CALOR SECO.- Tiene un menor efecto sobre los


microorganismos por lo que se necesita aplicar durante mayor tiempo que el húmedo.

MM04.2 RECOMENDACIONES GENERALES

1. Todo material esterilizado debe llevar su respectiva etiqueta o sello según


corresponda, indicando la fecha de preparación fecha de caducidad (una
semana) y las iniciales del personal del Laboratorio que preparó el material.

2. Los materiales estériles deben guardarse en lugares secos y limpios, para


evitar que puedan contaminarse. Se debe llevar un registro de limpieza
semanal de los cajones y muebles donde se guarda el material (Registro:
Limpieza de Equipos).

3. Al esterilizar los hisopos no se deben colocar cerca a las paredes del horno,
porque al estar hechos de madera y envueltos en papel prenderían
rápidamente pudiendo provocar un incendio.

4. Cuando concluye la esterilización en el horno, es necesario apagarlo y dejar


unos minutos que baje la temperatura del mismo con el objetivo que los
materiales de vidrio no se rompan por el cambio brusco de temperatura.

MM04.3 MATERIAL DE VIDRIO Y PLASTICO

Los materiales de vidrio empleados en el análisis microbiológico son:

1. Placas Petri

2. Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml

3. Baguetas

4. Frascos de boca ancha.

58
5. Frascos graduados con tapa.

6. Tubos de prueba con tapa

7. Balones de 125 ml y 1 litro

8. Embudos

9. Erlenmeyer de 500 ml y 1 litro.

10. Probeta de 50 ml y 1 litro.

11. Micropipetas de 0,5 – 5,0 mL.

Los materiales de plástico empleados en el análisis microbiológico son:

11. Probetas de 100, 250 y 500 ml

12. Beakers graduados de 250 y 500 ml

13. placas petri descartables , pipetas descartables.

1.- PLACAS PETRI

Son empleadas para realizar el cultivo de muestras y efectuar la Numeración de


microorganismos Aerobios Mesófilos Viable (NMAMV), Numeración de mohos y
levaduras (NMyL), aislamiento primario, determinación de patógenos, entre otros.

LIMPIEZA

1. Despintar las rotulaciones, hechas con el plumón indeleble sobre la superficie, con
un algodón empapado en alcohol 96° ó acetona.

2. Si las placas contienen material contaminado, esterilizarlas en autoclave a 121ºC


por 30 minutos antes de continuar, de no ser así seguir con el procedimiento
directamente.

3. Retirar el agar con ayuda de una espátula. Colocarlo sobre una bolsa de plástico y
desechar.

4. Lavar tapa y base con abundante agua, detergente y refregar con esponja.

5. Enjuagar con agua destilada.

6. Escurrir y dejar secar sobre una gasa limpia.

ESTERILIZACIÓN

Una vez secas:

7. Juntar las tapas con sus correspondientes bases, evitando que queden demasiado
ajustadas o sueltas.

59
8. Colocar las placas invertidas dentro de estuches metálicos o envueltos en papel
Kraft.

10. Colocar el sello, en el caso de placas envueltas en papel Kraft o etiqueta en caso
de placas dentro de estuches metálicos, indicando la fecha de esterilización y fecha
de vencimiento, con validez de una semana.

11. Esterilizar en el horno a 175ºC +-5°C durante 2 horas, para el caso de material en
estuches metálicos esterilizar en el horno a 200ºC durante 2 horas y 30 minutos.

2.- PIPETAS GRADUADAS

Son empleadas en el cálculo de volúmenes durante el análisis microbiológico, en el


muestreo y para medir reactivos y componente de los medios a preparar, etc.

LIMPIEZA

1. Retirar los tapones de algodón con ayuda de un alambre pequeño.

2. Lavar con detergente por dentro y fuera de la pipeta con ayuda de una escobilla
hasta que quede limpia.

3. Si se observan restos en las paredes de la pipeta, dejarla reposando en solución


sulfocrómica.

4. Lavar con abundante agua, detergente y enjuagar con agua destilada.

5. Dejar escurrir verticalmente en un depósito amplio y dejar secar sobre una gasa
limpia.

ESTERILIZACIÓN

6. Tapar con algodón el extremo oral de la pipeta con ayuda de un alambre pequeño,
quemar por llama el extremo una o dos veces con el fin de eliminar el exceso de
algodón. (Pipetas de 2, 5 y 10ml)

7. Las pipetas de 2 y 5 ml se colocan con la punta sobre la base en estuches metálicos


apropiados (la base de estos estuches debe tener algodón forrado con gasa), las
pipetas de 10 ml se envuelven en papel Kraft.

7. Colocar etiqueta cuando se coloquen las pipetas en estuches metálicos indicando la


fecha de esterilización y fecha de vencimiento, con validez de una semana.

8. Esterilizar en el horno a 175ºC +-5°C durante 2 horas las que se envuelven en


papel Kraft. , para el caso de material en estuches metálicos esterilizar en el horno
a 200ºC durante 2 horas y 30 minutos.

3.- BAGUETAS

Son empleadas durante el análisis básicamente para homogenizar muestras de


difícil disolución tales como: Sombras, compactos, cremas grasas, máscaras, entre
otras.

60
LIMPIEZA

1. Lavar con abundante agua y detergente con ayuda de una esponja, enjuagar con
agua destilada.

2. Dejar secar sobre una gasa limpia.

ESTERILIZACIÓN

3. Envolver las baguetas con papel Kraft y sujetarlas en grupos con pabilo.

4. Esterilizar en el horno a 175ºC +-5°C durante 2 horas.

4.- FRASCOS DE BOCA ANCHA

Los frascos son utilizados en el muestreo de bulk y materia prima, además se


emplean durante el análisis para pesar, homogenizar y disolver muestras. Tienen una
capacidad aproximada de 200 ml.

LIMPIEZA

1. En caso de contener material contaminado, proceder a la esterilización en


autoclave a 121°C por 30 minutos.

2. Descartar el contenido y proceder con el lavado.

3. Si contiene muestras no contaminadas retirarlas con ayuda de una espátula.

4. Lavar los frascos con abundante agua y detergente, refregando con escobilla.

5. Enjuagar con agua destilada.

6. Colocar invertidos los frascos sobre una gasa limpia para que sequen.

ESTERILIZACION

7. Envolver la boca de los frascos con papel kraft o papel reciclado.

8. Sujetar el papel a los bordes del frasco con pabilo.

9. Colocar el sello indicando la fecha de esterilización y fecha de vencimiento con


validez de una semana.

10. Esterilizar en el horno a 175ºC +-5°C durante 2 horas.

5.- FRASCOS GRADUADOS CON TAPA

Los frascos son empleados básicamente en la preparación de medios de cultivo


(agares y caldos) y ocasionalmente empleados también en la preparación de reactivos
(por ejemplo: Cristal violeta, T.T.C, etc.)

LIMPIEZA

61
FRASCOS

1. Despintar las rotulaciones, hechas con el plumón indeleble sobre la superficie, con
un algodón empapado en alcohol, acetona.

2. Si los frascos contienen material contaminado, proceder a la esterilización en el


autoclave a 121°C durante 30 minutos.

3. Lavar con detergente y agua corriente empleando una escobilla.

4. Cuando sea necesario, sacar el anillo de la boca del frasco para permitir una
buena limpieza.

5. Enjuagar con agua destilada.

6. Dejar secar sobre una gasa limpia. Guardar.

7. Antes de ser utilizados, estos materiales deben enjuagarse con agua destilada.

8. Si son empleados en la preparación de medios de cultivo, los frascos no requieren


esterilización previa.

TAPAS

9. Eliminar el rótulo del medio utilizado. De ser necesario utilizar acetona.

1. Lavar con detergente y agua corriente empleando una escobilla.

2. Enjuagar con agua destilada.

6.- TUBOS DE PRUEBA

En los tubos de prueba se depositan principalmente caldos de cultivo que se utilizan


en el análisis de superficies (equipos y personal), para realizar diluciones, preparar
ceparios, etc.

LIMPIEZA

1. Despintar las rotulaciones, hechas con el plumón indeleble sobre la superficie, con
un algodón empapado en alcohol, acetona.

2. Si los tubos contienen material contaminado, proceder a la esterilización en el


autoclave a 121°C durante 30 minutos.

3. Lavar escrupulosamente con agua corriente, detergente empleando una escobilla.

4. Enjuagar con agua destilada.

5. Colocar los tubos limpios invertidos en una gradilla, dejar secar.

ESTERILIZACIÓN

6. La esterilización previa no es necesaria si van a emplearse para depositar caldos de


cultivo.

62
7. En algunos casos se requiere su esterilización previa (para depositar material
estéril, muestras, etc.)
8. Los tubos tapa rosca se colocan agrupados en recipientes (latas vacías, etc.) y
envueltos con papel, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
9. A los tubos sin tapa se les coloca tapones de algodón en la boca, se agrupan,
envuelven con papel Kraft y sujetan con pabilo, esterilizar en autoclave a 121 °C
por 15 minutos.

7.- EMBUDOS

Los embudos se emplean en el laboratorio con el fin de facilitar la incorporación de


sustancias a otros recipientes.

LIMPIEZA

1. Refregar usando una esponja con agua y detergente

2. Enjuagar con agua destilada.

3. Dejar secar y guardar.

8.- PROBETAS

Las probetas son empleadas en el Laboratorio en el cálculo de volúmenes para la


preparación de medios de cultivo, soluciones, reactivos, etc.

LIMPIEZA

1. Lavar con agua corriente y detergente, emplear para ello una escobilla.

2. Enjuagar con agua destilada.

3. Dejar secar y guardar.

ESTERILIZACION

Por lo general no se requiere esterilizar este material antes de su uso.

MM04.2 MUESTREADORES

Son utensilios empleados en el muestreo de bulks: (Cremas, Maquillajes, Talcos),


materia prima, personal, superficies, etc. Los más usados en este laboratorio son:

CUCHARAS

PIPETAS

HISOPOS

CUCHARONES

1.- CUCHARAS, CUCHARONES

63
Se emplean en el muestreo de bulk y materia prima.

LIMPIEZA

1. Lavar con agua corriente y detergente, con ayuda de una esponja.

2. Enjuagar con agua destilada.

3. Dejar secar sobre una gasa limpia.

ESTERILIZACIÓN:

Una vez secas, se procede a envolver con papel kraft.


Se esterilizan en el horno a 180°C durante 1 hora 30 minutos.

2.- PIPETAS

Son muestreadores alternativos, se utilizan en el muestreo de sustancias o


preparados líquidos cuando resulta difícil realizar este procedimiento con cucharas.
Los procedimientos de limpieza y esterilización fueron descritos anteriormente. Se
emplean las pipetas esterilizadas con papel Kraft.

3.- HISOPOS

Son empleados en la toma de muestras de superficie de equipos, personal,


envases, etc. Los hisopos son descartables, por ello no se detalla procedimiento de
limpieza.

ESTERILIZACION

Envolver cada hisopo con papel kraft y agrupar en paquetes de 15 unidades


aproximadamente.
Calentar el horno hasta 180°C y colocar los paquetes.
Esterilizar por 1 hora 30 minutos y retirar inmediatamente.

MM04.3 RECOMENDACIONES GENERALES

1. Los materiales estériles deben guardarse en lugares secos y limpios, para


evitar que puedan contaminarse.

1. Al esterilizar los hisopos no se deben colocar cerca de las paredes del horno,
porque al estar hechos de madera y envueltos en papel prenderían
rápidamente pudiendo provocar un incendio.

2. Cuando concluye la esterilización en el horno, es necesario apagarlo y dejar


unos minutos que baje la temperatura del mismo con el objetivo que los
materiales de vidrio no se rompan por el brusco cambio de temperatura.

3. El material a esterilizar como las placas en papel, frascos boca ancha con
papel, latas metálicas se colocará en la parte superior de la tapa cinta la cual
es un indicador químico que se tornará de color negro luego del proceso se
esterilización. ( la cinta indicador químico sin esterilizar es de color verde)

MM04.4 MEDIOS DE CULTIVO

64
MM04.4.1 PRINCIPIO

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes que favorecen el


crecimiento de los microorganismos. Contienen además sustancias inhibidoras e
indicadores que permiten la identificación y aislamiento de grupos determinados.

Un medio de cultivo adecuado es aquel que contenga los elementos nutricios


esenciales en concentraciones adecuadas, la cantidad necesaria de sustrato y el
adecuado volumen de agua , se encuentre exento de sustancias inhibidoras del
organismo que se va a cultivar, tenga la consistencia deseada, la reacción (pH)
conveniente para el metabolismo del cultivo y ser estéril.

Los medios de cultivo empleados en el Laboratorio son deshidratados requieren en


algunos casos de la adición de otras sustancias complementarias.

Seguidamente se describen detalles de la composición, preparación, utilización y


fundamentos de los medios de cultivo empleados con más frecuencia en este
laboratorio, previo a ello los cuidados que hay que tener al respecto.

MM04.4.2 RECOMENDACIONES GENERALES

1. Verificar que los matraces (u otros recipientes destinados a la preparación)


hayan sido limpiados escrupulosamente para evitar que queden residuos de
otras sustancias.

2. Verificar que los medios de cultivo, aditivos y reactivos antes de preparar se


encuentren vigentes, caso contrario comunicar al Jefe del área y descartarlos.

3. Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia recién destilada


o recién desmineralizada lo más cercana posible al pH neutro (pH 7).

4. La medida de pH (y la corrección si fuese necesario) de los medios de cultivo


preparados se realiza (medios sólidos o agares y medios líquidos) a
temperatura ambiente antes de ser esterilizados en la autoclave y pasan por
una verificación de pH post autoclavados..

5. Todo Medio de Cultivo preparado debe tener la etiqueta de identificación


indicada en el Procedimiento Control de Calidad en Medios de cultivo.

6. La corrección de los valores de pH se logra por adición de solución 1N ó 0.1N


de NaOH ó HCl respectivamente.

7. Antes de colocar los medios de cultivo para licuar dentro del baño de agua, se
debe desenroscar ligeramente la tapa, así como también cuando se coloquen
medios de cultivo dentro del autoclave para su respectiva esterilización.

8. Todo medio de cultivo es sensible al calor por este motivo no debe calentarse
más de lo estrictamente necesario pues se corre el riesgo de alterar los
componentes del medio. (degradación de azúcares, proteínas, colorantes,
sustancias inhibidoras, etc.)

9. Cerrar bien los frascos de los medios deshidratados antes de guardar, pues se
hidratan con facilidad. Se debe llevar un registro de limpieza semanal de los
cajones y muebles donde se almacenan los medios de cultivos (Registro:
Limpieza de Equipos).

65
10. Cada vez que se apertura un frasco de medio de cultivo deshidratado se
deberá colocar la fecha de apertura (F.A) en la parte lateral del frasco de
manera visible.

11. Manipular con cuidado, los matraces y/o frascos con medios recién
esterilizados pues se encuentran muy calientes.

12. Los frascos (que no son pirex) con medios recién esterilizados no pueden ser
colocados en agua fría pues podrían rajarse.

13. Todo medio de cultivo preparado se colocará en la parte superior de la tapa


cinta la cual es un indicador químico que se tornará con líneas negras luego del
proceso se esterilización. (la cinta indicador químico indicador sin esterilizar
tiene las líneas de color blanco).

14. Todo medio de cultivo y/o reactivo debe llegar al laboratorio con su respectivo
certificado de análisis, el cual es almacenado en el laboratorio en un archivo de
palanca indicando “Certificado de análisis” según sea el año.

15. Las Cepas ATCC también deben llegar al laboratorio con certificado de análisis
y éstos son almacenados en un file manila indicando “certificado de análisis
cepas ATCC”.

MM04.4.3 MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN EL LABORATORIO DE


MICROBIOLOGIA

Medios de Cultivo Base (Universales)

1. Agar Tripticasa soya con Lecitina y Tween 80 (TSA)

2. Caldo Tripticasa soya con 2% de polisorbato 80 (CTSPL)

3. Agar plate count (PC)

4. Caldo Peptona de caseína – Lecitina – Polisorbato 20 base (diluyente) (CPLT)

5. Caldo Tripticasa soya(TSB)

6. Agar Neutralizante (AN)

7. Caldo LPT (LPT)

Medios de Cultivo para el Crecimiento de Hongos.

8. Agar Sabouraud glucosado (SAB)

9. Agar Papa dextrosa (APD)

Medio Selectivos y Diferenciales para el crecimiento de BacteriaS PatOgenas.

10. Agar Mc Conkey (MCK)

66
11. Agar Eosin Methylene Blue (EMB)

12. Agar Cetrimide (CTM)

13. Agar Manitol Salado (MS)

14. Caldo Sabouraud dextrosa (CAL-SAB)

15. Caldo Mc conkey (Cal-MCK)

16. Caldo Rappaport-vassiliadis

17. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Medios Empleados en el analisis de agua

18. Caldo P-A ( Caldo Presencia –Ausencia) a triple concentración (3X)

19. Agar plate count (PC)

MICROORGANISMOS MEDIOS DE UTILIZACION


CULTIVO

Bacterias en general Caldo Tripticasa Numeración de


Soya microorganismos aerobios
Agar Tripticasa Soya mesófilos viables
Agar Plate Count
Caldo Peptona de
Caseína Lecitina
Polisorbato 20
Caldo Tripticasa
Soya con
Polisorbato 80
Agar Neutralizante
(*)
Caldo LPT(*)

(*) Estos medios son


utilizados
únicamente para el
cliente Belcorp
según lo solicite.

Staphylococcus aureus Agar Manitol Salado Aislamiento selectivo

Pseudomona aeruginosa Agar Cetrimide Aislamiento selectivo

Coliformes, Coliformes fecales y Agar Mc Conkey Aislamiento selectivo


Totales Agar EMB

Escherichia coli Agar EMB Aislamiento selectivo


67
Agar Mc Conkey
Caldo Mc conkey

Mohos y Levaduras Agar Sabourand Aislamiento


Glucosado 4% Numeración de Mohos

Candida albicans Caldo Sabouraud Aislamiento selectivo


dextrosa
Agar Sabouraud
Glucosado 4%

Salmonella spp. Caldo Rappaport- Aislamiento selectivo


vassiliadis
Agar XLD

* Subrayado: Medios Usado Actualmente

1.- AGAR TRIPTICASA SOYA CON LECITINA Y TWEEN 8O AL 0.5% (TSA)

Es un medio de cultivo universal, exento de sustancias inhibidoras y rico en


nutrientes. Permite el crecimiento de una amplia gamma de microorganismos, incluso
de los exigentes, es usado principalmente en recuento de gérmenes en placa y es
empleado también como base de medios especiales de cultivo como por ejemplo el
agar sangre entre otros.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de caseína 15,0 g


2. Peptona de harina de soya 5,0 g
3. Cloruro de sodio 5,0 g
4. Agar Agar 15,0 g
5. Aditivos Tween 80 5,0 g
6. Aditivos Lecitina 0,7 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Pesar 0,7g de lecitina diluida en un beaker de 500 ml.

2. Pesar 5,0g de Tween 80 en el mismo beaker.

3. Agitar con una bagueta hasta homogenizar.

4. Agregar aproximadamente 100 ml de agua destilada y calentar hasta disolver.

5. Trasvasar al beaker de 1 litro y completar con agua destilada hasta 1 L. Seguir


agitando hasta homogenizar la mezcla.

68
6. Una vez que la mezcla (Tween + Lecitina) se haya atemperado añadir 300 ml a
cada frasco (medir en probeta) y homogenizar.

7. Pesar el medio deshidratado proporcionalmente al contenido de cada frasco (12g


de medio deshidratado para 300 ml) para 1 litro suspender 40g del medio
deshidratado.

8. Medir el pH y ajustar a 7,3 +/- 0,2.

9. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

10. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

11. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs).

2.- CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)

Es un caldo altamente nutritivo que permite el crecimiento de la mayoría de


microorganismos aerobios y anaerobios (incluso organismos exigentes). Se emplea en
el análisis para realizar diluciones y también para el aislamiento de microorganismos
patógenos. Depositado en tubos es utilizado también en el muestreo de superficies y
personal.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de caseína 17,0 g


2. Peptona de Harina de Soya 3,0 g
3. D (+) - glucosa 2,5 g
4. Cloruro Sodio 5,0 g
5. Hidrógeno Fosfato de potásico 2,5 g

PREPARACION: ( de 1 litro de medio de Cultivo)

1. Disolver 30gr del medio de cultivo deshidratado en un litro de agua destilada


contenida en un matraz.

1. Homogenizar.

2. Medir el pH y ajustar a pH : 7,3 + 0,2

3. Para el análisis de muestras: servir en frascos 90 ml de caldo en frascos de tapa


rosca de 250ml de capacidad, colocar las tapas roscas sin ajustar al tope.

4. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

5. Para la preparación de diluciones: servir en tubos tapa rosca 9 ml de caldo, colocar


un grupo de tubos en un recipiente, envolver con papel sujetando con pabilo,
Colocar etiqueta de identificación sobre en el recipiente que contiene los tubos.

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs)

3.- CALDO PEPTONA DE CASEÍNA-LECITINA-POLISORBATO 20 BASE

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Es un caldo que actúa como diluyente para el análisis microbiológico. Es altamente
nutritivo y contiene además sustancias inhibitorias para los preservantes contenidos en
los productos analizados.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de caseína –Lecitina 25,0 g


1. Tween 20 40,0 ml
2. Agua desionizada 960 ml

PREPARACION : ( de 1 litro de medio de Cultivo)

1. Disolver 25,0g del medio de cultivo deshidratado en 960 mililitros de agua destilada
contenida en un matraz.

2. Calentarlo en un baño de agua a una temperatura de 48° a 50° durante aprox. 30


minutos para lograr la disolución.

3. Agregar 40 mL de polisorbato 20 (Tween 20).

4. Agitar hasta mezclar completamente.

5. Medir el pH y ajustar a pH: 7,1 + 0,2.

6. Dispensar en frascos de 250 ml y 500ml, colocar las tapas roscas sin ajustar al
tope.

7. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

8. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs)

4.- AGAR PLATE COUNT

El agar plate count es un medio de cultivo base, usado para estimar el número de
microorganismos aerobios. En el Laboratorio de microbiología es utilizado para el
análisis de muestras de agua y para determinar el Recuento de bacterias en la
evaluación microbiana de ambientes y otros.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de caseína 5,0 g


2. Extracto de Levadura 2,5 g
3. D (+) Glucosa 1,0 g
4. Agar Agar 15,0 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de Cultivo)

2. Disolver 23,5g del medio de cultivo deshidratado en un litro de agua destilada


contenida en un matraz.

3. Homogenizar

70
4. Calcular el pH y ajustar a 7,0 + 0,2

5. Dispensar en frascos de 500 ml y colocar las tapas roscas sin ajustar al tope.

6. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

7. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs)

8. Para la evaluación microbiana de ambientes: dejar enfriar y atemperarlos a (45°C +


1°C) y verter en placas petri estériles. Dejar solidificar, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV) .

9. Para el análisis de muestras de agua se describe en MM08.2.

5.- AGAR SABORAUD GLUCOSADO 4% (SAB)

El agar sabourand glucosado es un medio sólido usado para el aislamiento, y


determinación del número de hongos (mohos y levaduras). La acidez de este medio de
cultivo inhibe a la flora bacteriana acompañante.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona 10,0 g
2. D(+) Glucosa 40,0 g
3. Agar Agar 15,0 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 65 gramos en un litro de agua destilada en un matraz. Homogenizar.

2. Ajustar el pH a 5,6 + 0,2

3. Dispensar en frascos de 300 ml y de 500 ml , colocar las tapas roscas sin ajustar
al tope.

4. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

5. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs)

6. Para la evaluación microbiana de ambientes y aislamiento de Candida albicans:


dejar enfriar atemperarlos a (45°C + 1°C) y verter en placas petri estériles. Dejar
solidificar, rotular las placas con el nombre del medio de cultivo y colocar la fecha
de vencimiento (FV).

7. Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

6.- AGAR MAC CONKEY

Es un agar selectivo para el aislamiento y conteo de bacterias coliformes, fecales y


totales, Salmonellas y Shiguellas.

FORMA DE ACTUACION

71
Las sales biliares y el cristal violeta contenidos en el medio inhiben
considerablemente a la flora gram positiva y algunos gram negativos existentes. La
lactosa es el único carbohidrato y el rojo neutro es el indicador de pH (incoloro en
neutralidad y rojo en acidez a pH menor de 6.8) para comprobar la degradación de
dicho azúcar.

E. coli es una bacteria fuertemente degradadora de la lactosa, forma colonias rojas


rodeadas por un halo de precipitación del mismo color. Los géneros lactosa negativos
como Salmonella y Shiguella forman colonias incoloras o transparentes.

COMPOSICIÓN (g / LITRO)

1. Peptona de caseína 17,0 g


2. Peptona de carne 3,0 g
3. Cloruro Sódico 5,0 g
4. Lactosa 10,0 g
5. Mezcla de sales biliares 1,5 g
6. Rojo neutro 0,03 g
7. Violeta Cristal 0,001 g
8. Agar Agar 13,5 g

PREPARACIÓN: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver en un frasco conteniendo 1 litro de agua destilada, 50g del medio


deshidratado. Homogenizar.

2. Ajustar el pH a 7,1 + 0,2

3. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

4. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

5. Esterilizar por 15 minutos en autoclave (121°C y 15 lbs)

6. Dejar enfriar atemperarlos a (45°C + 1°C)

7. Verter en placas petri estériles (aprox. 12 - 15 ml)

8. Dejar solidificar a la temperatura del medio ambiente, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV) .

9. Los medios de cultivo preparados son claros y de color rojo parduzco.

7.- AGAR EOSIN METHYLENE BLUE EMB (Eosina Azul de Metileno)

Este medio de cultivo se emplea para el aislamiento de enterobacteriaceas y


diferenciación de Escherichia coli y Enterobacter.

FORMA DE ACTUACION

Los colorantes contenidos en su fórmula inhiben a muchos gérmenes gram positivos


y a los gram negativos exigentes. Estos colorantes se combinan para formar un

72
precipitado verde metálico cuando el pH del medio se torna ácido por degradación de
los azúcares.

Las colonias de E. coli aparecen de un color verde negruzco con brillo metálico,
Enterobacter, produce colonias púrpuras.

COMPOSICIÓN (g / LITRO)

1. Peptona 10,0 g
2. Lactosa 10,0 g
3. Hidrógeno fosfato dipotásico 2,0 g
4. Eosina amarillenta 0,4 g
5. Azul de metileno 0,065 g
6. Agar Agar 15,0 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 37,4g del medio de cultivo deshidratado en un litro de agua destilada


contenido en un frasco.

2. Ajustar el pH a 7,1 + 0,2

3. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

4. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

5. Esterilizar en autoclave por 15 minutos (121°C y 15 lbs)

6. Dejar enfriar atemperarlos a (45°C + 1°C)

7. Verter en placas petri estériles (12 - 15 ml aprox.).

8. Dejar solidificar a la temperatura del medio ambiente, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV) .

9. Las placas con medio de cultivo son claras y de color rojo parduzco.

8. AGAR CETRIMIDE

Es un medio empleado para el aislamiento y diferenciación de Pseudomona


aeruginosa a partir de diversos materiales.

FORMA DE ACTUACION

El Cetrimide (Cetiltrimetilamonio bromuro) sirve para inhibir notablemente a la flora


acompañante, Pseudomona aeruginosa crece evidenciando la producción de un
pigmento verde azulado (piocianina) y es fluorescente a la luz UV.

Para la identificación definitiva se requiere de otras investigaciones.

COMPOSICIÓN (g / LITRO)

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1. Peptona de gelatina 20,0 g
2. Cloruro de magnesio 1,4 g
3. Sulfato potásico 10,0 g
4. Cetrimide 0,3 g
5. Agar Agar 13,6 g
6. Aditivo : Glicerina 10,0 ml

PREPARACIÓN

1. Disolver 45,3 g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua destilada en un


matraz. Homogenizar.

2. Añadir 10 ml de glicerina. Homogenizar.

3. Calcular el pH 7,2 + 0,2

4. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

5. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

6. Esterilizar en autoclave x 15 minutos (121°C y 15 lbs)

7. Dejar enfriar y atemperarlos a (45°C + 1°C)

8. Verter en placas.

9. Dejar solidificar a la temperatura del medio ambiente, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV) .

10. Las placas con medios de cultivo son turbias y ligeramente amarillo.

9. AGAR MANITOL SALADO

Es un medio de cultivo empleado para el aislamiento y diferenciación de


estafilococos.

FORMA DE ACTUACION

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los


estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las
colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos
coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de


carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente
selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el
indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el
manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de
pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el
manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan
como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

74
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas,
rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.

COMPOSICIÓN (g / LITRO)

1. Digerido pancreático de caseína 5,0 g


2. Digerido péptido de tejido animal 5,0 g
3. Extracto de carne 1,0 g
4. D-Manitol 10,0 g
5. Cloruro de Sodio 75,0 g
6. Agar Agar 15,0 g
7. Rojo de Fenol 0,025 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 111 g del medio de cultivo deshidratado en un litro de agua destilada


contenido en un frasco.

2. Homogenizar con una bagueta.

3. Ajustar el pH a 7,4 + 0,2

4. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

5. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos (121°C y 15 lbs)

7. Dejar enfriar y atemperarlos a (45°C + 1°C)

8. Verter en placas petri estériles (12 - 15 ml aprox.).

9. Dejar solidificar a la temperatura del medio ambiente, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV) .

10. Las placas con medio de cultivo son claras y de color rojo naranja.

10. CALDO PRESENCIA -AUSENCIA.

Medio de cultivo utilizado en forma cualitativa para determinar la presencia o ausencia


de bacterias coliformes y Pseudomonas en aguas.

FORMA DE ACTUACION

En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la triptosa


constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y aminoácidos necesarios para el
desarrollo bacteriano. La lactosa es la fuente de carbono (es el hidrato de carbono
fermentable). El fosfato dipotásico y monopotásico constituyen el sistema buffer. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El lauril sulfato de sodio es el agente
selectivo que inhibe la flora acompañante, y el púrpura de bromocresol es el indicador
de pH, que le da al medio un color púrpura y vira al amarillo en medio ácido, cuando
fermenta la lactosa.

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COMPOSICIÓN: (g / LITRO)

1. Peptona de carne 3,0 g


2. Peptona 5,0 g
3. Lactosa 7,46 g
4. digerido pancreático de caseína 5,90 g
5. hidrogenofosfato di potásico 1,35 g
6. Dihidrogenofosfato potásico 1,35 g
7. Cloruro de sodio 2,46 g
8. Lauril sulfato de sodio 0,05 g
9. Purpura de bromocresol 0,0085 g
10. Peptona de proteosa N° 3 3,93 g

PREPARACIÓN:

1. Para preparar una solución a triple concentración, disolver 91,5 gr del medio
deshidratado en 1 litro de agua destilada.

2. Medir el pH y ajustar a pH: 6,8 + 0,2

3. Servir 50 ml de caldo en frascos de tapa rosca de 250ml de capacidad.

4. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

5. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs).

7. El medio preparado es de color púrpura.

11. CALDO TRIPTICASA SOYA CON 2% DE POLISORBATO 80 (CTSPL)

Es un caldo que actúa como diluyente para el análisis microbiológico. Es altamente


nutritivo y contiene además sustancias inhibitorias para los preservantes contenidos en
los productos analizados. Se emplea en el análisis para realizar diluciones y también
para el aislamiento de microorganismos patógenos. Depositado en tubos es utilizado
también en el muestreo de superficies y personal.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de caseína 17,0 g


2. Peptona de Harina de Soya 3,0 g
3. D (+) - glucosa 2,5 g
4. Cloruro Sodio 5,0 g
5. Hidrógeno Fosfato de potásico 2,5 g
6. Tween 80 20,0 g
7. Agua desionizada 980 ml

PREPARACION: ( de 1 litro de medio de Cultivo)

1. Pesar 20g de tween 80 en un matraz de 250 ó 300ml.

2. Agregar aproximadamente 100 ml de agua destilada y calentar hasta disolver.

76
3. En otro recipiente disolver 30 g de caldo tripticasa soya con el resto del agua (880
ml).

4. Mezclar las dos soluciones y agitar hasta mezclar completamente.

5. Medir el pH y ajustar a pH: 7,3 + 0,2

6. Dispensar en frascos de 500 ml y colocar las tapas roscas sin ajustar al tope.

7. Para el análisis de muestras: servir en frascos 90 ml y 80 ml de caldo en frascos


de tapa rosca de 250ml de capacidad, colocar las tapas roscas sin ajustar al tope.

8. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

9. Para la preparación de diluciones: servir en tubos tapa rosca 9 ml de caldo, colocar


un grupo de tubos en un recipiente, envolver con papel sujetando con pabilo,
Colocar etiqueta de identificación sobre en el recipiente que contiene los tubos

7. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C y 15 lbs)

12.- CALDO SABOURAUD DEXTROSA (CAL-SAB)

El caldo sabourand dextrosa es usado para el aislamiento y cultivo de hongos y


levaduras.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de carne 5,0 g


2. Peptona de caseína 5,0 g
3. D (+) - glucosa 20,0 g

PREPARACION: ( de 1 litro de medio de Cultivo)

1. Disolver 30gr del medio de cultivo deshidratado en un litro de agua destilada


contenida en un matraz.

2. Homogenizar.

3. Medir el pH y ajustar a pH : 5,6 + 0,2

4. Servir en frascos 90 ml en frascos de tapa rosca de 250ml de capacidad, colocar


las tapas roscas sin ajustar al tope.

5. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C y 15 lbs)

13.- CALDO MAC CONKEY (CAL-MCK)

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento presuntivo de E.coli.

FORMA DE ACTUACION

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Este caldo contiene lactosa la cual cuando se degrada forma ácido y gas, la
producción de gas se puede observar en los tubos durham y la producción de acido se
detecta por el indicador de purpura de bromocresol el cual se torna a amarillo.

La bilis de buey promueve el crecimiento de varias especies de bacterias intestinales e


inhibe el crecimiento de microorganismos que no habitan en el intestino.

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Peptona de gelatina 20,0 g


2. Lactosa 10,0 g
3. Bilis de buey desecada 5,0 g
4. Púrpura bromocresol 0,01 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 35g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua destilada


contenida en un matraz.

2. Medir el pH y ajustar a 7,3 +/- 0,2.

3. Servir 100 ml de caldo en frascos de tapa rosca de 250ml de capacidad.

4. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

5. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs).

7. El medio preparado es de color púrpura.

8. Una vez atemperado el medio este debe almacenarse entre 2-8 ° C.

14.- AGAR NEUTRALIZANTE (AN)

Es un medios que se utiliza para cultivar una amplia gama de microorganismos,


actuando en la neutralización de desinfectantes y antimicrobianos los cuales poseen
propiedades bacteriostáticas inherentes es usado principalmente en recuento de
gérmenes en placa.

FORMA DE ACTUACION

La peptona de caseína proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos


esenciales para el crecimiento. El extracto de levadura es una fuente de vitaminas, en
particular del grupo B. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable proporciona
carbono y energía. Cinco neutralizadores inactivan una serie de productos químicos
desinfectantes y antisépticos. Bisulfito de sodio neutraliza los aldehídos, el tioglicolato
de sodio neutraliza mercuriales, tiosulfato de sodio neutraliza el yodo y el cloro, la
lecitina neutraliza los compuestos cuaternarios de amonio, el polisorbato 80 es una
agente tensoactivo no iónico, neutraliza los compuestos fenólicos sustituidos. El
purpura de bromocresol se utiliza como indicador de la dextrosa, los organismos que
fermentan la dextrosa harán volver el medio de color purpura a amarillo.

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COMPOSICION (g / LITRO)

1. Digerido pancreático de caseína 5,0 g


2. Extracto de levadura 2,5 g
3. Dextrosa 10,0 g
4. Tioglicolato Sódico 1,0 g
5. Tiosulfato Sódico 6,0 g
6. Bisulfito sódico 2,5 g
7. Polisorbato 80 5,0 g
8. Lecitina 7,0 g
9. Agar Agar 15,0 g
10. Púrpura bromocresol 0,02 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 54g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua destilada


contenida en un matraz.

2. Mezclar bien calentando agitando frecuentemente y hierva durante un periodo


de 1 minuto para disolver completamente el polvo.

3. Medir el pH y ajustar a 7,6 +/- 0,2.

4. Dispensar 300 ml a cada frasco (medir en probeta) y homogenizar.

5. Pesar el medio deshidratado proporcionalmente al contenido de cada frasco


(16,2g de medio deshidratado para 300 ml) para 1 litro suspender 54g del
medio deshidratado.

6. Colocar las tapas sin ajustar al tope.

7. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

8. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs).

9. Una vez atemperado el medio este debe almacenarse entre 2-8 ° C.

10. El medio preparado es de color violeta.

15.- CALDO LPT (CAL-LPT)

El caldo LPT es utilizado como diluyente para la homogenización de las muestras


en el análisis de los productos cosméticos.

FORMA DE ACTUACION

La triptona proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales


para el crecimiento. El cloruro de sodio suministra electrolitos esenciales para el
transporte y el equilibrio osmótico. Los fosfatos de potasio actúan como un sistema
tampón, la lecitina y el tween neutralizan los compuestos de amonio cuaternario e
inhiben la acción de los conservantes.
COMPOSICION (g / LITRO)

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1. Fosfato disódico 9,0 g
2. Fosfato monopotásico 1,5 g
3. Cloruro de Sodio 8,5 g
4. L-Histidina 1,0 g
5. Tiosulfato de sodio 5,0 g
6. Triptona 1,0 g
7. Lecitina 3,0 g
8. Aditivos Tween 80 30ml

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 29g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua destilada


contenida en un matraz.

2. Mezclar bien y añadir 30 mL de Tween 80.

3. Disolver calentando agitando frecuentemente hasta disolución completa dejar


hervir durante un minuto.

4. Medir el pH y ajustar a 7,0 +/- 0,2.

5. Para el análisis de muestras: servir según sea el caso en frascos 90 ml , 80 ml


, 40ml , 45ml de caldo en frascos de tapa rosca de 250ml de capacidad,
colocar las tapas roscas sin ajustar al tope.

6. Para la preparación de diluciones: servir en tubos tapa rosca 9 ml de caldo,


colocar un grupo de tubos en un recipiente, envolver con papel sujetando con
pabilo, Colocar etiqueta de identificación sobre en el recipiente que contiene los
tubos

7. Colocar las etiquetas de identificación sobre las tapas.

8. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a ( 121°C. y 15 lbs).

Nota: La vigencia de los medios de cultivo preparados es de 2 semanas


guardados a una temperatura de 2° -8°C; y/o de 1 semana guardados a
temperatura ambiente.

16.- CALDO RAPPAPORT – VASSILIADIS PARA ENRIQUECIMIENTO DE


SALMONELLA (CAL-RAP-VAS)

Es un medio selectivo para Salmonella.

FORMA DE ACTUACION

Las concentraciones de malaquita verde y cloruro de magnesio en el medio de cultivo


presente son menores que los del caldo de enriquecimiento de Salmonella según
Rappaport, con el fin de mejorar el crecimiento de Salmonella.
La peptona de harina de soja y la reducción del pH a 5,2 aumenta la selectividad.

COMPOSICION (g / LITRO)

80
5. Peptona de harina de soja 4,5 g
6. Cloruro de magnesio hexahidrato 29,0 g
7. Cloruro de sodio 8,0 g
8. Fósfato dibásico de Potasio 0,4 g
9. Fósfato monobásico de Potasio 0,6 g
10. Verde de malaquita 0,036 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Disolver 42.5g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua destilada.

2. Calentar suavemente.

3. Medir el pH y ajustar a 5,2 +/- 0,2.

4. Dispensar en tubos de ensayo 10mL.

5. Colocar un grupo de tubos en un recipiente, envolver con papel sujetando con


pabilo, Colocar etiqueta de identificación sobre en el recipiente que contiene los
tubos

6. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a (115°C. y 15 lbs).

7. El medio preparado es de color azul oscuro.

8. Una vez atemperado el medio este debe almacenarse entre 2-8 ° C.

17.- AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación de patógenos entéricos,


especialmente las especies de Shigella.

FORMA DE ACTUACION

La xilosa se incorpora en el medio, ya que es fermentado por prácticamente todos los


microorganismos entéricos a excepción de la Shigella , esta propiedad permite la
diferenciación de las especies de Shigella . La lisina se incluye para que el grupo de
Salmonellas deban diferenciarse de los no patógenos.
Sin lisina, las Salmonellas rápidamente fermentarían la xilosa y se volverían
indistinguibles de las especies no patógenas.
Después que salmonela agota el suministro de xilosa, la lisina es atacada a través de
la enzima descarboxilasa de lisina, con la reversión a un pH alcalino, que imita la
reacción Shigella.
Para evitar reversión similar de coliformes lisina - positivo , lactosa y sacarosa
(Sacarosa ) se añaden para producir ácido en exceso. Degradación
de xilosa , lactosa y sacarosa genera productos ácidos , los cuales
en la presencia del indicador de pH rojo fenol , causa un cambio de color en el medio
de rojo a amarillo .

COMPOSICION (g / LITRO)

1. Xilosa 3,5 g
2. L-Lisina 5,0 g

81
3. Lactosa 7,5 g
4. Sacarosa 7,5 g
5. Desoxicolato sódico 2,5 g
6. Tiosulfato sódico 6,8 g
7. Cloruro sódico 5,0 g
8. Citrato férrico de amonio 0,8 g
9. Extracto de levadura 3,0 g
10. Rojo de fenol 0,08 g
11. Agar 13,5 g

PREPARACION: (de 1 litro de medio de cultivo)

1. Suspenda 55g del medio de cultivo deshidratado en 1 litro de agua purificada.

2. Mezclar bien.

3. Calentar con Agitación sólo hasta que el medio hierva. No sobrecaliente. NO


ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.

4. Medir el pH y ajustar a 7,4 +/- 0,2.

5. Enfriar a 45-50 ° C en un baño de agua. El sobrecalentamiento provoca la


precipitación.

6. Verter en placas petri estériles (15 - 20 ml aprox.).

7. Dejar solidificar a la temperatura del medio ambiente, rotular las placas con el
nombre del medio de cultivo y colocar la fecha de vencimiento (FV).

8. Las placas con medio preparado son claros y rojos.

9. Una vez atemperado el medio este debe almacenarse entre 2-8 ° C.

Nota: Este agar es preparado al momento de ser utilizado.

MM04.5 REACTIVOS

MM04.5.1 RECOMENDACIONES GENERALES

1. Verificar que los matraces (u otros recipientes destinados a la preparación) hayan


sido limpiados escrupulosamente para evitar que queden residuos de otras
sustancias.

2. Verificar que los reactivos a preparar se encuentren vigentes, caso contrario


comunicar al Jefe del área y descartarlos.

3. Para la preparación de reactivos utilizar agua limpia recién destilada o recién


desmineralizada lo más cercana posible al pH neutro (pH 7).

4. Todo Reactivo preparado debe tener la etiqueta de identificación indicada en el


Instructivo para la preparación de Reactivos.

82
5. Las soluciones de NaOH ó HCl son solicitadas al laboratorio de Materias Primas.

6. Todo reactivo preparado (excepto NaOH , HCl y Fenol) debe ser almacenado a
temperaturas entre 2-8°C.

REACTIVOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Bacto TTC solución 0.4 % (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride)

CRISTAL VIOLETA 0.01 % ( C2 H30 ClN 3 Violeta de Metilo 10 B )

SOLUCION DE FENOL 5 %

SOLUCION SALINA 0.85 %

TIOSULFATO DE SODIO 3 % (Na2S2O3)

BATERIA GRAM (LUGOL, CRISTAL VIOLETA, SAFRANINA Y SOLUCIÓN


DECOLORANTE)

1.- Bacto TTC solución 0.4 % (2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride )

Este reactivo es empleado en el laboratorio para realizar la Numeración total de


microorganismos aerobios, permite el reconocimiento de las colonias bacterianas.

FORMA DE ACCION

Es un indicador de reducción. Al reducirse se forma el trifenil formazán que presenta


una coloración roja. Los sistemas reductores presentes en las bacterias realizan esta
reacción, de tal manera resulta fácil reconocer las colonias, que se observan como
puntos rojos en el medio de cultivo en placa.

PREPARACIÓN

1. Colocar en un matraz 100 ml. de agua destilada, taponar y envolver el pico del
matraz con papel sujetando con pabilo.

2. Esterilizar en autoclave por 15 minutos (121 o C , 15 lbs)

3. En un frasco estéril, pesar (en la cabina de bioseguridad o cerca al mechero) 0,4


gramos del reactivo TTC. Emplear con este fin la balanza de precisión.

4. Adicionar en esterilidad 100 ml de agua destilada estéril. Homogenizar, agitando el


frasco.

5. Utilizar frascos color ámbar y/o cubrir el frasco con papel aluminio para proteger de
la luz.

6. Este reactivo debe ser guardado en un frasco de vidrio, a baja temperatura (2-8
°C).

83
7. Para cada 100 ml. de Agar Tripticasa Soya añadir 1 ml. de la solución preparada de
TTC.

2.- CRISTAL VIOLETA ( C2 H30 ClN 3 Violeta de Metilo 10 B ) 0.01 %

Este reactivo soluble en agua se emplea en microscopía (coloración gram).

FORMA DE ACCIÓN

Las bacterias gram positivas, por su naturaleza, son más susceptibles a ser
inhibidas por este colorante que las gram negativas, de esta manera se puede aislar
algunas bacterias gram negativas a partir de diferentes materiales.

PREPARACIÓN

1. Colocar en un matraz 100 ml. de agua destilada; taponar y envolver el pico del
matraz con papel sujetando con pabilo

2. Esterilizar en autoclave por 15 minutos (121 o C , 15 lbs)

3. Pesar en esterilidad 0,01 gramos del reactivo cristal violeta.

4. Adicionar 100 ml. de agua destilada estéril. Homogenizar agitando el frasco.

3.- SOLUCION DE FENOL 5 %

Este reactivo soluble en agua es usado en la desinfección de soluciones


contaminadas. También en la limpieza de superficies antes y después de realizado los
análisis.

FORMA DE ACCIÓN

Este desinfectante de amplio espectro actúa inhibiendo bacterias tanto gram


positivas como gram negativas.

PREPARACIÓN

1. Colocar en un matraz 95 ml. de agua destilada.

2. Pesar 5 gr de Fenol y agregar al matraz.

3. Homogenizar bien la solución.

4.- SOLUCION SALINA 0.85 %

Este diluyente es usado en el análisis de muestras que requieren ser diluidas para
la numeración de microorganismos.

FORMA DE ACCIÓN

84
Este es un medio tamponado que permite las bacterias viables por un tiempo.

PREPARACIÓN

1. Colocar en un matraz 100 ml.

2. Pesar 0,85 gr de NaCl y agregar al matraz.

3. Se mide el pH, este debe estar entre 6,8 – 7,2

4. Repartir en tubos con tapa en cantidades de 9 ml.

5. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min y 15 lbs .

5.- TIOSULFATO DE SODIO 3 % (Na2S2O3)

Este diluyente es usado en el análisis de muestras de agua que contienen cloro


residual u otros halógenos.

FORMA DE ACTUACIÓN

Este es un buen agente declorinador que neutraliza cualquier halógeno residual y


evita la continuación de la acción bactericida durante el transporte de la muestra.

PREPARACIÓN

1. Colocar en un matraz 100 ml, taponar y envolver el pico del matraz con papel
sujetando con pabilo.

2. Esterilizar en autoclave por 15 minutos (121 ° C y 15 lbs)

3. En un frasco estéril, pesar (en la cabina de bioseguridad o cerca al mechero) 3


gramos del reactivo Tiosulfato de sodio. Emplear con este fin la balanza de
precisión.

4. Adicionar en esterilidad 100 ml de agua destilada estéril. Homogenizar, agitando el


frasco.

5. Utilizar frascos color ámbar y/o cubrir el frasco con papel aluminio para proteger de
la luz.

6. Para cada 100 ml de muestra de agua potable 0.1 ml. de la solución preparada.

7. Este reactivo debe ser guardado en un frasco de vidrio, a baja temperatura (2-8
°C).

MM05.- MUESTREO

En una colección grande de datos es a menudo imposible o poco práctico


observarlos en su totalidad. En lugar de examinar el grupo entero llamado población o
universo se examina una pequeña parte del grupo llamada muestra.
85
En una empresa de productos cosméticos y farmacéuticos de uso externo,
físicamente la inspección de la calidad de todos los productos y/o materias primas
resulta tediosa y costosa. Resulta más factible realizar un muestreo con tablas
estadísticas, con ellas podemos determinar el número de muestras (tamaño de la
muestra) para cada población.

En este capítulo se detallan los procedimientos empleados en el muestreo de


diferentes materiales, los criterios considerados y las normas a seguir al respecto.

MM05.1 METODOS DE MUESTREO

1.- MUESTREO AL AZAR

Es el proceso mediante el cual se extrae una muestra cualquiera de una población,


esta muestra debe ser representativa, es decir debe tener las características generales
de la población. De esta manera se pueden deducir importantes conclusiones a partir
del análisis de la misma. En este caso podemos hacer uso de las tablas estadísticas o
como lo establezca el cliente.

Por ejemplo:
Para evaluar la calidad microbiológica de un lote de shampoo para bebes
almacenado que contiene 10,000 unidades de productos terminados, se hace uso de
la tabla estadística y se muestrean y analizan 125 unidades, los resultados obtenidos
del análisis se extrapolan a todo el lote.

2.- MUESTREO PUNTUAL O INDIVIDUAL

Aquí se realiza la toma de muestra de cada unidad involucrada y cada muestra es


juzgada como aprobada o rechazada.

Por ejemplo:
Para realizar la evaluación de un bulk de cremas, se tomará una muestra de cada
recipiente que contenga el producto. Los resultados obtenidos son independientes
para cada uno de los recipientes.

MM05.2 CRITERIOS DE MUESTREO

1.- EL PERSONAL

Debe ser designada en el laboratorio una persona responsable de la organización


de la toma de muestras y que será a su vez quien garantice la comunicación efectiva
con las demás áreas involucradas en esta operación.

El personal autorizado a intervenir en el muestreo es el Inspector de Control de


Calidad del laboratorio de microbiología y el personal del área que colabora con el
muestreo, ambas personas deben usar guantes y mascarilla durante el muestreo. Las
personas con lesiones abiertas no deben participar en esta operación.

2.- EL AMBIENTE

86
Una de las funciones del personal responsable del muestreo, es evaluar las
condiciones sanitarias en las que se encuentra el área donde son almacenados los
materiales a analizar.

Puede optarse por realizar el muestreo de los materiales cuando se crea pertinente
siguiendo el criterio del inspector aún cuando no esté considerado en la rutina de
muestreo, cuando el Inspector de Control de Calidad considere que pueden existir
riesgos de contaminación. Por ejemplo: olores extraños, tanques de bulk o recipientes
mal tapados, almacenes en desorden o sucios, presencia evidente o indicios de la
presencia de insectos, roedores etc.

3.- LOS RIESGOS

Lo más importante a ser considerado en este caso es el riesgo de contaminación


accidental durante el muestreo. El personal responsable debe minimizar los riesgos
verificando la limpieza de los utensilios, del personal que interviene en la operación y
del ambiente. Es importante también exponer los muestreadores estériles lo menos
posible al ambiente durante el muestreo.

4.- VIGENCIA DE RESULTADOS

Los resultados del análisis microbiológico de bulk cremas tienen un mes de tiempo
de vigencia (ver MM06). Transcurrido este tiempo, se deberán muestrear y analizar
nuevamente. Los bulk de compactos tienen un tiempo de vigencia dependiendo cada
especificación de producto, Se informará a las áreas correspondientes los
resultados.
Los saldos de bulk producto del envasado pierden su condición de APROBADO ya
que el manipuleo y almacenamiento prolongado del material incrementa el riesgo de
contaminación, por esta razón para certificar su calidad deben ser muestreados e
ingresar nuevamente a análisis.
Los productos terminados susceptibles a la contaminación microbiana deben
ingresar también nuevamente a análisis cuando su tiempo de vida se haya vencido.
La naturaleza de las materias primas determina su susceptibilidad a la
contaminación microbiana son las más susceptibles aquellas de origen natural. Por
norma cada seis meses se deben muestrear y analizar las materias primas en stock
para verificar que se encuentren aptas.

5.- TABLAS DE MUESTREO ESTADISTICO

Las tablas de muestreo se emplean con el fin de extraer un determinado número de


muestras de la población que sea representativa del total. Dependiendo de la
susceptibilidad de los productos muestreados se establecen tipos de muestreo:

TABLA DE MUESTREO MIL-STD-105D

TAMAÑO DE LOTE REDUCIDO NORMAL RIGUROSA


2-8 2 2 3
9-15 2 3 5
16-25 2 5 8

87
26-50 2 8 13
51-90 2 13 20

91-150 3 20 32
151-280 5 32 50
281-500 8 50 80
501-1200 13 80 125
1201-3200 20 125 200
3210-10000 32 200 315
10001-35000 50 315 500
35001-150000 80 500 800
150001-500000 130 800 1250
500001A MÁS 200 1250 2000

MM05.3 MUESTREO DE ACUERDO AL TIPO DE PRODUCTO

MM05.3.1 MATERIALES:

1. MUESTREADORES

 PIPETAS ESTÉRILES: Son usados para el muestreo de bulk o materias primas


líquidas o que se encuentran depositados en recipientes con abertura angosta.

 CUCHARAS ESTÉRILES: Son usadas para muestrear polvos, sustancias


viscosas y líquidos contenidos en recipientes de abertura amplia.

 CUCHARONES ESTÉRILES: Empleados para líquidos o polvos. Por su


tamaño son generalmente difíciles de esterilizar por lo tanto poco usados.

2. OTROS MATERIALES:

Bolsas de plástico, frascos de vidrio de boca ancha, piceta con alcohol,


mascarilla, guantes, plumón indeleble, algodón, Bombilla, macro pipette controller.

MM05.3.2 PROCEDIMIENTOS GENERALES

1.- REGISTRO DE DATOS

 DE BULK CREMAS: El Inspector de Control de Calidad del laboratorio


fisicoquímico anota en el Registro Análisis de bulk : el código de bulk, nombre
del producto, N° de orden de fábrica, N° de picking, peso, fecha de muestreo y
nombre de los Inspectores responsables para su completa identificación. El
Inspector de Control de Calidad del Laboratorio de microbiología debe
transcribir esta información en el formato: Análisis microbiológico de Bulk y en
el frasco o bolsa de muestreo estéril destinado al muestreo del bulk.
88
 BULK COMPACTOS Y MAQUILLAJES: El Inspector de Control de Calidad del
laboratorio fisicoquímico de esta área anota: nombre del producto, N° de orden
de fábrica, peso y fecha en el formato: Registro de análisis de bulk. El Inspector
de Control de Calidad del laboratorio de microbiología debe transcribir esta
información en el formato: Análisis Microbiológico de bulk respectivo.

 SALDOS, TARJETAS VENCIDAS DE BULK: El Inspector de Control de Calidad


del laboratorio fisicoquímico es responsable de hacer llegar al laboratorio de
microbiología el Registro de Muestreo de saldos de bulk emitida por el área de
almacén. En esta hoja deben figurar los siguientes datos: código de bulk,
nombre del producto, N° de orden de fábrica, peso, fecha de fabricación,
nombre del fabricante, resultado del análisis fisicoquímico y firma de
aprobación del Inspector de Control de Calidad fisicoquímico.

 MATERIA PRIMA: El Inspector de Control de Calidad del laboratorio de


Materias primas es el responsable de llenar el formato: Ingresos de materias
primas al laboratorio de microbiología con los siguientes datos: código,
aspecto, estado de la MMPP (ingreso/stock), lote, peso y número de bultos y
fecha de ingreso. Entrega el formato al Inspector de Control de Calidad del
laboratorio de microbiología. El stock de materia prima debe reingresar a
análisis microbiológico con el fin de certificar su calidad en este aspecto.

2.- COORDINACION DE MUESTREO

 BULK: Se debe coordinar con el personal de las áreas de almacén


correspondientes la hora de muestreo. El personal de estas áreas deberá
verificar la limpieza de las mismas antes del muestreo.

 SALDOS, TARJETAS VENCIDAS: La coordinación en este caso se realiza


también con el personal de los almacenes de bulk correspondientes. El
muestreo se realiza el mismo día que llega el Registro de muestreo de saldos
de bulk al laboratorio de microbiología.

 MATERIA PRIMA (MMPP): El muestreo de ingresos de MMPP es coordinado


con el personal del área de recepción. Si se va a muestrear stock de MMPP se
debe coordinar con el personal responsable del almacén de productos
delicados (productos con análisis microbiológico). Esta área tiene las
condiciones ambientales adecuadas para realizar el muestreo. El muestreo se
realiza el mismo día que llega el formato de Ingresos de materias primas al
laboratorio de microbiología.

3.- IDENTIFICACION Y PREPARACION DEL TANQUE U OTRO RECIPIENTE

1. El personal que intervenga en la operación de muestreo debe sanitizar la superficie


de sus guantes con alcohol al 70% antes y durante la operación. El Inspector de
Control de Calidad debe llevar los recipientes debidamente rotulados al área de
muestreo.

2. El personal responsable de cada proceso (almacenes) es el encargado de ubicar


el bulk o MMPP a muestrear.

3. Cada recipiente lleva adherida una tarjeta de identificación en la que se especifican


:

89
 BULK : código del producto, N° de orden de fábrica, picking, peso, nombre del
fabricante y fecha de fabricación

 MMPP: código del productos, lote, peso, cantidad de bultos.

4. El Inspector de Control de Calidad del laboratorio de microbiología debe verificar


que coincidan los datos del recipiente y del registro proporcionados por el
Inspector de Control de Calidad del laboratorio fisicoquímico o de MMPP según
corresponda. De no ser así se informa a los mismos para obtener el dato correcto.

5. Verificar la limpieza de los bordes y cubiertas del tanque. El personal del almacén
deberá limpiar estas zonas con gasa empapada con alcohol al 70% porque las
partículas de polvo en la superficie podrían contaminar “accidentalmente” las
muestras durante esta operación.

4.- RECOLECCION DE LAS MUESTRAS

 MUESTREO DE SUSTANCIAS VISCOSAS Y POLVOS

1. Mover la capa superficial con ayuda de la cuchara estéril a los costados.

Para el caso de sustancias viscosas utilizar frascos o bolsas estériles y para


productos en polvo bolsas de primer uso. Las muestras son asépticamente
tomados de cada recipiente (teniendo en cuenta las tablas de muestreo) con
la ayuda de cucharas, de esta manera se garantiza la representatividad de
esta muestra con respecto al total.

2. Identificar el tanque de bulk o MMPP del que ha sido tomada la muestra.

3. Para el caso de MMPP que llegan en sacos (como es el caso de talcos), el


personal del proceso realiza un corte en forma de “V” de aprox. 5 cm de
cada lado de la “V”, suficiente para que ingrese la cuchara de muestreo,
utilizando un cutter o cuchilla sanitizada con alcohol 70°. Luego que el
Inspector de Control de Calidad toma la muestra, el personal del proceso
sella la abertura con 1 etiqueta blanca de 10 x 15 cm y asegura con cinta de
embalaje para que quede seguro. Se toma una muestra por pallet.

 MUESTREO DE LÍQUIDOS

1. Agitar el recipiente cuidadosamente antes de realizar la toma de la muestra.

2. En caso que el recipiente sea demasiado grande, agitar el contenido con


ayuda del muestreador a emplear antes de tomar la muestra (si el
recipiente tiene abertura amplia utilizar cuchara y si es de abertura angosta,
pipeta)

3. Transferir la muestra a los frascos de vidrio de boca ancha o bolsas


estériles previamente rotulados.

4. Una vez concluida esta operación; transportar las muestras inmediatamente


al laboratorio para el análisis.

 MUESTREO DE PRODUCTOS TERMINADOS RECIEN ENVASADOS

90
Aún cuando los productos tengan resultado aprobatorio en el análisis de bulk
deben ingresar a análisis como producto terminado para descartar
contaminaciones durante el manipuleo del envasado.

El número de muestras necesarias para análisis microbiológico están indicadas


en el procedimiento: “Evaluación del Producto durante el envasado y como
Producto Terminado”. Estas muestras son tomadas por el Encargado de línea
correspondiente quien es responsable de llevarlas al centro de acopio para ser
trasladada al Laboratorio de Microbiología. Para determinar el número de
muestras se considera además del número total de productos envasados, la
susceptibilidad del producto, la historia del producto (si el producto es nuevo o
de línea), etc.

 MUESTREO DE PRODUCTOS TERMINADOS: ALMACENADOS

El número de muestras de un lote de productos terminados (P.T.) es determinado


por las tablas de muestreo estadístico.

Para garantizar que sea representativa, la muestra debe ser tomada de


diversos puntos. Por ejemplo si deben tomarse 40 muestras de un lote de
shampoo que está almacenado en 20 cajas se toman las muestras del mayor
número de cajas posible, es decir se toman por ejemplo 2 muestras por caja.

Las cajas de donde han sido tomadas las muestras, deben ser numeradas y
deben quedar rotuladas con el número de muestra extraída.

Nota: Colocar etiqueta verde de muestreado a los bulk o bultos que han pasado
por muestreo microbiológico.

MM06.- ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MMPP, FABRICACIONES Y


PRODUCTOS TERMINADOS

OBJETIVO

Evaluar la calidad microbiológica de los productos cosméticos y farmacéuticos de


uso externo; para ello se determina el límite microbiano, es decir, el número de
microorganismos viables (hongos y bacterias) por unidad de peso o volumen, así
como la presencia o ausencia de microorganismos patógenos.

PRINCIPIO

En la determinación del límite microbiano, se toman en cuenta tres tipos principales


de evaluaciones:

 NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS aerobiOs mesofilOs viables

 NUMERACION DE MOHOS Y LEVADURAS

 DETERMINACION DE MICROORGANISMOS PATOGENOS –


INVESTIGACION DE Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa, Coliformes fecales y totales.

Nota:

91
La selección de identificación de microorganismos patógenos como Candida
albicans , Salmonella Coliformes fecales y tolales, etc , dependerá de cada solicitud
del cliente o especificación del producto.

Los dos primeros constituyen una estimación indirecta de la eficacia de los


preservantes usados, las Buenas Prácticas de Manufactura y otros, los cuales en
conjunto deben asegurar que el producto sea de buena calidad microbiológica y, por lo
tanto, inocuo para la salud. Tanto la numeración total de bacterias como la de hongos
se realizan por el método de Recuento en Placa.

La determinación de microorganismos patógenos en productos cosméticos y


farmacéuticos de uso externo, sirve como indicador de contaminación (humana o
ambiental) durante los procesos de producción. En el Laboratorio se determina la
presencia de las siguientes bacterias de interés:

Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y
Pseudomonas sp.

Coliformes Totales y fecales

Candida albicans

Salmonella spp

Nota: La investigación de patógenos debe realizarse de acuerdo con las


especificaciones de cada producto.

La presencia de cualquiera de ellas basta para rechazar cualquier producto, no sólo


porque causan el deterioro del producto sino porque se pone en riesgo la salud del
cliente.

MM06.1 DETERMINACION DEL CONTENIDO MICROBIANO

MM06.1.1 PASOS PREVIOS AL ANALISIS MICROBIOLOGICO

1. REGISTRO E IDENTIFICACION DE MUESTRAS

Cada muestra o producto llegado al Laboratorio se identificará con un N° de


análisis correlativo y será registrado en el correlativo de análisis. En adelante,
las muestras sólo serán identificadas por este número.

Las muestras vienen acompañadas con un formato respectivo en el que se


registran todos los datos necesarios para su identificación. Es necesario anotar
en el correlativo de análisis: la fecha de análisis, procedencia o condición de la
muestra (materia prima ingreso o stock, fabricación, saldo, producto terminado,
envase, etc.), identificación (lote o No. de orden de fabricación), cantidad (peso
o N° de unidades) y otras observaciones pertinentes.

Para el caso de los productos terminados, las muestras de un mismo lote


ingresan con un mismo número de análisis, a excepción de los productos
nuevos o delicados que llevan 3 análisis (inicio, intermedio y final). Las
fabricaciones, saldos, materias primas, envases ingresarán con un número
diferente cada una.
92
Los productos nuevos y muestras ingresan a análisis con dilución hasta la
menos 3.

2. LIMPIEZA Y DESINFECCION DE LA ZONA DE ANALISIS

Para el análisis microbiológico de todas las muestras se utiliza la cabina de


bioseguridad biológica, que proporciona un ambiente estéril y adecuado para el
procesamiento de las muestras.

Antes de iniciar el análisis, encender la cabina, limpiar utilizando algodón


empapado con alcohol al 70%, desinfectando las paredes internas y externas,
así como la mesa sobre la cual se trabaja.

Es necesario desinfectar también la balanza de precisión que se utiliza para


pesar las muestras, utilizando algodón y alcohol al 70%.

También para la limpieza se puede usar solución de fenol para ello mezclar en
un recipiente limpio agua destilada (aproximadamente 300 ml) y 15 ml. de fenol
al 5%. Este recipiente debe estar en el interior de la cabina y sirve para colocar
las pipetas usadas.

3. FUSION DE MEDIOS SÓLIDOS PARA ANALISIS

Para la fusión de medios sólidos para análisis, se debe tener en cuenta las
siguientes consideraciones.

- La fusión deberá realizarse una sola vez para evitar que la calidad de
los medios de cultivo se deteriore por sobrecalentamiento o
contaminación.
- Siempre para esta actividad utilizar lentes de protección y guantes
protectores de calor.

FUSION EN BAÑO DE AGUA

- Sólo se puede fundir 1 vez.


- Aflojar la tapa del frasco girando la tapa ¼ del diámetro total.
- Colocar los frascos dentro del baño de agua.
- Realizar la fusión de los medios que sean necesarios revisando entre
uno y otro la fusión del medio y el ajuste de tapas.

MANEJO DE MEDIOS FUNDIDOS

- El medio de agar líquido debería colocarse en un baño de agua


controlado a una T° entre 45 °C – 50°C durante no más de 8 horas. ( la
temperatura puede variar según la técnica a usar)
- Se debe tener cuidado al verter los medios contenidos en un envase
sumergido en un baño de agua para evitar que el agua del baño se
mezcle con los medios estériles. Se recomienda que antes de verter los
medios se seque el exterior del envase con gasa.

MM06.1.2.- MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Caldo Peptona de Caseína – Lecitina de Soja – Polisorbato 20 (CPLT) (Diluyente)


93
Caldo Tripticasa soya (TSB).

TSA: Agar Soya Tripticase con 0.5% de Polisorbato 80 y lecitina de soya al 0.07%.

SAB: Sabouraud Dextrosa Agar

CAL-SAB: Caldo Sabouraud dextrosa

TTC: Trifenil, Tetrazolio cloruro, solución al 0.4%.

Caldo Tripticasa Soya con 2% Polisorbato 80 (CTSPL) (Diluyente)

AN: Agar Neutralizante

Cal-LPT: Caldo LPT

MM06.1.3 MATERIALES Y EQUIPOS

1. Placas Petri estériles.

2. Pipetas graduadas de 2ml, 5ml y 10ml. Estériles.

3. Baguetas de vidrio de 15 x 150mm estériles.

4. Frascos de vidrio de 200ml y/o bolsas de polietileno Estériles.

5. Solución de alcohol al 70%.

6. Algodón hidrófilo.

7. Tijeras.

8. Bombillas y/o macro pipette.

9. Papel Kraft.

10. Recipiente plástico con agua fenolada.

11. Polisorbato (TWEEN 8O), estéril.

12. Cabina de bioseguridad biológica.

13. Balanza de precisión.

14. Estufa incubadora a 30-35°C.

15. Estufa incubadora a 20-25°C

16. Horno Microondas y/o Plancha de Calentamiento.

17. Baño María 45-50°C

MM06.1.4 PROCEDIMIENTO GENERAL PARA REALIZAR UN ANÁLISIS

94
 NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS aerobiOs mesofilOs viables Y
NUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

El análisis de los productos de CETCO, se realiza de acuerdo a lo indicado en


el Método Microbiológico de E.T.I. MIC-001 (M0208182). Para el caso de
productos de Manufacturing se tiene el Método Microbiológico DQYSM 005.
Cabe resaltar que deben realizarse pruebas de esterilidad y los controles
positivos y negativos de los medios de cultivo.
Todo análisis microbiológico se realiza dentro de la cabina bioseguridad.

 DETERMINACION DE MICROORGANISMOS PATOGENOS –


INVESTIGACION DE Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans, Coliformes fecales y totales, Salmonella spp. La
investigación de patógenos debe realizarse de acuerdo con las
especificaciones de cada producto.

El análisis de los productos de CETCO, se realiza de acuerdo a lo indicado en


el Método Microbiológico del cliente.
Para el caso de productos de Manufacturing se tiene el Método Microbiológico
DQYSCM.036.

MM06.1.5 ANALISIS DE ACUERDO AL TIPO DE PRODUCTO

 ANALISIS DE MATERIA PRIMA

1. Se analiza si la especificación lo indica para cada nuevo ingreso de materia


prima y cuando la tarjeta de Aprobado del stock cumple la fecha de
vigencia. El personal del laboratorio de Materia prima comunica cuales de
éstas deben ingresar a análisis.

2. Para el análisis microbiológico se aplica el procedimiento general antes


descrito o de acuerdo a lo indique el cliente.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE BULK CREMAS, LIQUIDOS Y POLVOS

1. Todos los productos indicados en la Relación de Productos con control


microbiológico son analizados de acuerdo al procedimiento general antes
descrito.

2. Los productos que son inmiscibles en agua son analizados con el diluyente
indicado más Tween 80 estéril.

 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTO TERMINADO

1. Antes de realizar el pesado, debe limpiarse la boca del envase con algodón
empapado en alcohol al 70%. Luego, descartar la parte superficial del
producto.

2. Para el análisis microbiológico se aplica el procedimiento general antes


descrito.

MM06.1.6 CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

95
El desempeño de los medios preparados en un laboratorio o por un fabricante
depende, en gran medida, de cómo fueron preparados.
La referencian para las pruebas de controles de los medios de cultivo son las
siguientes:

 USP vigente <61> Examen microbiológico de productos no estériles: Prueba de


Recuento Microbiano – Promoción de Crecimiento de los Medios.

 USP vigente <62> Examen microbiológico de productos no estériles: Prueba de


microorganismos específicos. Propiedades de promoción de crecimiento e
inhibitorias de los medios.

 “Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and


production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance
testing of culture media (ISO/TS 11133-2:2003)”

La preparación del inoculo de la cepa se adjunta en la parte final del manual.

 CONTROL POSITIVO - PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO

1. El control positivo se realiza para cada lote de medio de cultivo TSA, PC,
SAB preparado en el laboratorio.

2. La promoción de crecimiento y propiedades inhibitorias se realizan a los


medios selectivos y aplica para cada lote de medio preparado en el
laboratorio de los agares selectivos MCK, MS, CTM, EMB.

3. Los agares para ser utilizados en los ensayos microbiológicos deben


contar con resultados conformes de promoción de crecimiento previo a su
uso.

4. Los Microorganismos viables empleados para la inoculación deben


corresponder a no más de 5 repiques desde el lote de siembra maestro
original.

5. Verificar que las cepas ATCC antes de iniciar las pruebas se encuentren
vigentes, caso contrario comunicar al Jefe del área y descartarlos.

6. Las cepas a utilizar son las siguientes:

Para TSA:
- Candida albicans ATCC 10231
- Aspergillus brasilensis ATCC 16404
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Bacillus subtilis ATCC 6633

Para PC:
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Eschericchia coli ATCC 8739

Para SAB:
- Candida albicans ATCC 10231
96
- Aspergillus brasilensis ATCC 16404

Para MCK:
- Staphylococcus aureus ATCC 6538 ( Propiedades Inhibitorias)
- Eschericchia coli ATCC 8739 ( Promoción de crecimiento)

Para CTM:
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ( Promoción de crecimiento)
- Eschericchia coli ATCC 8739 ( Propiedades Inhibitorias)

Para Manito Salado:


- Staphylococcus aureus ATCC 6538 ( Promoción de crecimiento)
- Eschericchia coli ATCC 8739 ( Propiedades Inhibitorias)

Para Caldo SAB:


- Candida albicans ATCC 10231 ( Promoción de crecimiento)

Para caldo MCK:


- Eschericchia coli ATCC 8739 ( Promoción de crecimiento)
- Staphylococcus aureus ATCC 6538 ( Propiedades Inhibitorias)

Para Agar XLD:


- Salmonella entérica subesp. Entérica serovar Typhimurium ATCC
14028( Promoción de crecimiento)

Para Caldo Rappaport – vasiliadis para enriquecimiento de Salmonella:


- Salmonella entérica subesp. Entérica serovar Typhimurium ATCC
14028( Promoción de crecimiento)
- Staphylococcus aureus ATCC 6538 ( Propiedades Inhibitorias)

OBS: La concentración de las cepas ATCC debe ser no más de 100 UFC.

A.- Control Positivo para Medios Universales: (Cuantitativo)

1. Se prepara el inoculo, de acuerdo a lo indicado en el folleto adjunto en


la parte final del manual.
2. Colocar 0.1ml de inoculo conteniendo la cepa y depositarlo en 4 placas
petri estériles.
3. Agregar por incorporación y duplicado 15-20ml del agar licuado
atemperado a 44°- 46°C a 2 placas se agrega el medio de cultivo en
uso y a las otras 2 el medio de cultivo muevo.
4. Mezclar el inoculo con el agar mediante movimientos de vaivén y
rotación de las placas petri sobre una superficie plana.
5. Se incuba las placas con TSA de 30-35°C, PC a 30°C por 3 días y las
placas de SAB de 20-25°C por 5 días.
6. Se realiza la lectura de las placas, se determina el promedio por cada
dilución y el Ratio de Productividad aplicando la siguiente fórmula:
NS
PR = -----------
NO
PR = Ratio de Productividad
NS = ufc/ml del medio de cultivo nuevo
NO = ufc/ml del medio de cultivo en uso o referencia (patrón)

7. El PR en estos medios (No Selectivos), debe estar entre 0,7 – 2,0.

97
Nota: Para realizar la prueba de promoción de crecimiento del PC se
utiliza como medio de referencia (patrón) el agar TSA.
Aplicando la formula anterior el Ratio de Productividad PR para el agar
PC debe ser ≥ 0,7.

B.- Promoción de crecimiento y Propiedades inhibitorias de medios de cultivo


selectivos: (Cualitativo)

1. Se prepara el inoculo, de acuerdo a lo indicado en el folleto adjunto en


la parte final del manual.
2. Sembrar en el agar selectivo previamente solidificado, por siembra en
superficie por el método de estrías.
3. Se incuba las placas de MCK, EMB, MS, CTM o EMB a 30-35°C por 2
días.
4. Se realiza la lectura de las placas.
5. La Promoción de crecimiento se mide por el desarrollo característico del
microorganismo en el medio de cultivo.
6. La Prueba de propiedades inhibitorias se mide por la ausencia de
crecimiento del microorganismo en el medio de cultivo.

 CONTROL NEGATIVO

1. El control negativo se realiza cada vez que se utiliza los medios TSA, PC,
SAB ó CPLT o CTSBT en los análisis microbiológicos.
2. En el caso del TSA, PC ó SAB, se realiza el control negativo por cada
grupo de muestras analizadas (24 muestras).
3. Al inicio de cada grupo de análisis, se dispensa en una placa estéril, 15-
20ml del medio licuado atemperado a 45° +-1°C
4. Se incuba las placas con TSA ó PC de 30-35°C por 3 días y las placas de
SAB de 20-25°C por 5 días.
5. Ausencia de crecimiento indica que los medios han sido bien esterilizados.
6. En el caso del CPLT o CTSBT, se realizan 2 controles por cada grupo de
muestras analizadas.
7. Al inicio de cada grupo de análisis, se dispensa 1 ml del CPLT o CTSBT
en una placa estéril.
8. A la mitad del grupo de muestras analizadas (12 de 24) se cambia la pipeta
que se está usando en la dispensación del CPLT o CTSPL.
9. Al final del grupo de muestras analizadas, se dispensa 1 ml del CPLT o
CTSPL en una segunda placa estéril.
10. Se adiciona medio TSA y se homogeniza como si se tratara de una
muestra.
11. Se incuba las placas de de 30-35°C por 3 días.
12. Ausencia de crecimiento indica que el medio ha sido bien esterilizado y no
se ha contaminado durante el análisis.

Nota: Sólo en el caso de existir algún impedimento para la realización de la


promoción de crecimiento y/o propiedades inhibitorias (no llegada de cepas
ATCC) se puede tercerizar el servicio.

MM06.2 INTERPRETACION DE RESULTADOS

 NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS aerobiOs mesofilOs viables Y


NUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

98
- Expresar el resultado como unidades formadoras de colonias (ufc) por
gramo o mililitro.
- Cuando no hay desarrollo de colonias en las placas expresar el resultado
como < 10 ufc/g o ml.
- Si hay desarrollo de colonias en las placas, elegir para el recuento de
bacterias las placas de acuerdo al método.
- El número de colonias contadas, deberá multiplicarse por el factor de
dilución para expresar el resultado final.
- Se considera APROBADO si el número de ufc presentes en la muestra,
resultado del análisis, está por debajo de los límites microbianos
establecidos y RECHAZADO si sobrepasa estos límites. ( los límites
microbiológicos se encuentran establecidos en la especificación del
producto)

Ver límites microbiológicos en las especificaciones cargadas en el sistema de


acuerdo a cada cliente.

 DETERMINACION DE MICROORGANISMOS PATOGENOS –


INVESTIGACION DE Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans, Coliformes fecales y totales. La investigación de
patógenos debe realizarse de acuerdo con las especificaciones de cada
producto.

- CRECIMIENTO EN Agar EMB:


E coli aparece de un color verde negruzco con brillo metálico.

Klebsiella, Enterobacter, Serratia forman colonias púrpuras en 24 - 48


horas.
Las dos primeras forman colonias mucoides.
Proteus, Salmonella y Shiguella presentan colonias transparentes.

- CRECIMIENTO En agar Mac Conkey:


E coli forma colonias rojas rodeadas por un halo de precipitación del
mismo color.
Klebsiella y Enterobacter forman colonias rojas.
Citrobacter, Providencia y Serratia forman colonias incoloras
Proteus, Salmonella y Shiguella producen colonias incoloras o
transparentes.

- CRECIMIENTO En Agar Cetrimide:


` Pseudomonas aeruginosa produce un pigmento hidrosoluble
denominado piocianina que se difunde en el medio. Las colonias son
verdes fosforescentes.

- CRECIMIENTO EN AGAR MANITOL SALADO:


Staphylococcus aureus Forma colonias amarillas rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los Staphylococcus coagulasa negativos,
presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.

- CRECIMIENTO EN AGAR SABORAUD:


Candida albicans Forma colonias blancas y realizar microscopia.

-CRECIMIENTO EN AGAR XLD:


Salmonella Las colonias típicas de la Salmonella son de color rojo con
el centro negro debido a la producción de H2S. Mientras que las de E.
coli son grandes, amarillas con o sin precipitado de bilis.

99
La presencia de cualquiera de estas bacterias en el material analizado significa
el RECHAZO del mismo.

MM06.3 EMISION DE RESULTADOS

 Los resultados se registran en el correlativo de análisis así como en los


formatos respectivos de las muestras analizadas.
 Los formatos de análisis microbiológicos productos Terminados deben llevar,
además de la firma del Inspector de Control de Calidad (Laboratorio de
Microbiología), las firmas del Inspector de Control de Calidad (Laboratorio de
fisicoquímico).
 El original de los formatos con los resultados se entregan al Inspector de
Control de Calidad (Laboratorio de Fisicoquímico) o Inspector de Control de
Calidad (Laboratorio de MMPP) o Inspector de Control de Calidad de P.T.
según corresponda y las copias son archivadas en el Laboratorio de
Microbiología. Los Inspectores se encargarán de la emisión de las tarjetas de
Aprobado o Rechazado según sea el caso.
 En el caso de saldos de bulk o bulks con tarjeta vencida, la emisión de las
tarjetas es responsabilidad del Inspector de Control de Calidad (Laboratorio de
Microbiología.)

Nota: En el caso que se detecte resultados fuera de especificación de debe


realizar lo siguiente:
a) Si se trata de una Materia Prima al momento de ingresar a Planta, proceder de
acuerdo al procedimiento "Evaluación de Materias Primas al momento de la
recepción".
b) Si se trata de una Materia Prima en Stock, tomar una nueva muestra de
envases manipulados y sellados si es que hay y efectuar el reanálisis de ambas.
c) Si el producto todavía se encuentra como bulk, tomar una nueva muestra,
ubicar la muestra de retención del bulk ( del laboratorio de microbiología) y
efectuar el reanálisis de ambas .
d) Si el producto está como PT, ubicar las muestras y contramuestras extraídas
de la Línea, solicitar muestras al almacén de acuerdo a la Tabla MIL-STD-105D
(mitad de la muestra reducida) en función a las unidades producidas y efectuar
el reanálisis.
e) Si se trata de PT de Proveedor, ubicar las muestras, solicitar muestras
adicionales al almacén (mismo número de muestras iniciales) y efectuar el
análisis.

Todas las muestras son analizadas por duplicado.

MM07.- ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ENVASES

MM07.1.- ENVASES VACIOS DE PRODUCTOS TERMINADOS

TOMA DE MUESTRAS DE ENVASES

 El análisis microbiológico de envases se realiza según lo indique la


especificación.
100
 El análisis microbiológico de envases se realiza cada vez que lo solicita el
proceso, cuando se trata de envases almacenados por mucho tiempo, cuando
los envases han sido sanitizados o cuando el Inspector de Control de Calidad
de Envases crea conveniente.
 El número de muestras a analizar será de acuerdo a la tabla de muestreo o
según lo que indique el cliente.
 El personal encargado de tomar las muestras (Inspector de Control de Calidad
de microbiología) deberá estar correctamente uniformado, con mascarilla y
guantes.
 Las muestras extraídas son colocadas en una bolsa de primer uso y llevadas al
laboratorio de microbiología para el análisis, e identificar las cajas de las cuales
se ha tomado la muestra colocando stiker verde de muestreado con sus
iniciales y fecha.
Solicitar a los inspectores de Control de Calidad de Envases rótulos de
muestras de Control de Calidad (etiquetas blancas) en donde se colocará la
cantidad de unidades retiradas y pegarlas en las cajas de donde retiraron las
muestras.
 La muestra es registrada e identificada con el N° de análisis correspondiente.

METODO DE ENJUAGUE

- El análisis se realiza añadiendo una cantidad determinada de diluyente (agua


peptonada o TSB) al interior del envase. La cantidad de diluyente depende de la
capacidad del envase. En general se utilizan los siguientes criterios:

Capacidad del envase (ml) Cantidad de diluyente a añadir (ml)

< 100 5
De 100 a 200 10
De 201 a 500 20
De 500 a 1000 30

- Hacer fluir el caldo por todas las paredes del envase.

- Transferir el líquido de enjuague al frasco que lo contenía inicialmente,


para proceder con el análisis microbiológico.

- Extraer 2 ml del caldo y colocar 1 ml en 2 placas petri para la


numeración de microorganismos aerobios mesófilos viables y
Numeración de mohos y levaduras.

- Agregar 15-20 ml del agar respectivo atemperado a 45° +-1°C (TSA ó


PC, SAB) según sea el caso, antes de agregar el TSA ó PC añadirle por
cada 100ml, 1ml de la solución TTC al 0.4%. ( para facilitar la lectura de
las colonias)

- Homogenizar la muestra mediante movimientos de vaivén y rotación de


las placas sobre una superficie plana y dejar solidificar.

- Incubar las placas de TSA ó PC en forma invertida a 30-35°C por 72


horas y las placas de SAB previamente envueltas en papel de 20-25°C
por 5 días.

- Incubar los caldos de cultivo a 30-35°C durante 48 horas, para la


determinación de patógenos.

101
MM07.2.- APLICADORES DE PRODUCTOS COSMÉTICOS (MOTAS, BROCHAS,
PINCELES, APLICADORES, APLICADORES CON MOTAS, ESPUMAS)

TOMA DE MUESTRAS DEL APLICADOR

 El análisis microbiológico de envases se realiza según especificación.


 El análisis microbiológico del aplicador se realiza cada vez que lo solicita el
proceso, cuando se trata de aplicadores almacenados por mucho tiempo,
cuando éstos han sido sanitizados o cuando el Inspector de Control de Calidad
de Envases crea conveniente.
 El número de muestras a analizar será de acuerdo a la tabla de muestreo o
según lo que indique el cliente.
 El personal encargado de tomar las muestras (Inspector de Control de Calidad
de Laboratorio de Microbiología) deberá estar correctamente uniformado, con
mascarilla y guantes.
 Las muestras extraídas son colocadas en una bolsa de primer uso y llevadas al
laboratorio de microbiología para el análisis, e identificar las cajas de las cuales
se ha tomado la muestra colocando sticker verde de muestreado con sus
iniciales y fecha.
Solicitar a los inspectores de Control de Calidad de Envases rótulos de
muestras de Control de Calidad (etiquetas blancas) en donde se colocará la
cantidad de unidades retiradas y pegarlas en las cajas de donde retiraron las
muestras.
 La muestra es registrada e identificada con el N° de análisis.

PROCEDIMIENTO:

- Con ayuda de una pinza estéril colocar la muestra (un aplicador) y colocarlo
dentro de un tubo o frasco que contiene 10 ml del medio CTSPL. El medio debe
cubrir de preferencia la zona del aplicador que estará en contacto con el producto.
La cantidad de diluyente depende de la muestra a analizar. En general se utilizan
los siguientes criterios:

Muestra Cantidad de diluyente a añadir (ml)

Motas de 2 mm 10
Brochas rubor rosadas 20
Motas Queso 20
Motas rubor lujo 20
Motas de 16 mm 30
Brochas rubor negra 30

- Dejar al aplicador en contacto con el medio durante 20 minutos.

- Al cabo de este tiempo, extraer 2 ml del caldo y colocar 1 ml en 2


placas petri para la numeración de microorganismos aerobios mesófilos
viables y Numeración de mohos y levaduras.

- Agregar 15-20 ml del agar respectivo atemperado a 45° +-1°C (TSA ó


PC, SAB) según sea el caso, antes de agregar el TSA ó PC añadirle por

102
cada 100ml, 1ml de la solución TTC al 0.4%. ( para facilitar la lectura de
las colonias),

- Homogenizar la muestra mediante movimientos de vaivén y rotación de


las placas sobre una superficie plana y dejar solidificar.

- Incubar las placas de TSA ó PC en forma invertida a 30-35°C por 72


horas y las placas de SAB de 20-25°C por 5 días. Las placas para
hongos se incuban previamente envueltas en papel.

- Incubar los caldos de cultivo a 30-35°C durante 24 horas, para la


determinación de patógenos.

MM07.3.- ENVASES PARA BULK Y MATERIA PRIMA

Se realiza el Monitoreo de los envases que van a ser utilizados en el


fraccionamiento de un bulk o MMPP, o en el caso del procesamiento de una
MMPP.

Los tanques a evaluar deben ser previamente sanitizados por el personal del
proceso.

METODO DE HISOPADO EN SUPERFICIE

Preparar el material para el muestreo (tubos c/diluyente, hisopos estériles, alcohol


70% y algodón).

Destapar el tubo de prueba con diluyente e introducir el hisopo en el interior del


tubo con diluyente.

Pasar el hisopo humedecido por una superficie aproximada de 10 cm2 del tacho a
evaluar.

Introducir nuevamente el hisopo al tubo con el caldo, quebrando antes la parte


superior del mismo (la parte que se coge para tomar la muestra) y tapar el tubo
de ensayo.

Limpiar con un pedazo de algodón empapado en alcohol 70% la superficie


muestreada.

Registrar los datos del tacho evaluado en el tubo de ensayo y transportar las
muestras al laboratorio.

Registrar los datos de las muestras en el correlativo de análisis indicando en el


tubo el número de análisis correspondiente.

Agitar en el vortex y realizar la siembra por incorporación. Agregar el agar


correspondiente, incubar las placas de TSA a 30-35°C por 48 horas y las de
SAB a 20-25°C por 5 días previamente envueltas en papel..

Incubar el tubo con el caldo de cultivo a 30-35 °C durante 48 horas para la


determinación de patógenos.

103
Realizar la siembra mediante el método de estriado sobre placas con agar EMB,
Centrimide, MCK, o Manitol Salado para el aislamiento de bacterias patógenas.

Incubar las placas a 30-35°C por 24 hr y realizar la lectura de acuerdo a lo indicado


en el punto MM06.2.

MONITOREO CON EL EQUIPO HY LITE

Se realiza de acuerdo a lo indicado en el punto MM10.4 del Manual.

MM07.4.- LIMITES ESTABLECIDOS

Método Utilizado NMAMV NMyL Patógenos URL


(ufc) (ufc)
Convencional < 100 < 10 Ausencia de patógenos
No Aplica
Hy-Lite No Aplica No Aplica No Aplica Máx.
40

Los resultados están expresados por envase.

MM08.- ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL SISTEMA DE AGUA

El agua es la principal materia prima en la elaboración de productos cosméticos y


farmacéuticos de uso externo. Controlar su calidad es imprescindible pues puede ser
la principal vía de contaminación en el proceso de manufactura y puede contener
microorganismos que causan enfermedades en el hombre o el deterioro del producto.
Además, un alto contenido microbiano introducido por medio del agua, puede
reducir la actividad del preservante o causar debilitamiento o fallo del preservante en el
producto final.

MM08.1.- TOMA DE MUESTRAS

Se ha considerado como un punto a parte pues el procedimiento difiere


completamente de los antes descritos. A continuación se detalla los pasos a seguir.

1. MATERIALES Y REACTIVOS
- Frascos de vidrio con tapa estériles
- Mascarilla, guantes y algodón
- Alcohol 70%.
- Tiosulfato de sodio 3 %

2. PUNTOS DE MUESTREO SIGLAS

PUNTOS DE USO DE AGUA POTABLE (TODAS CLORADAS)

1. Pozo de Agua # 3 – Sedapal (CLORADA) PZ3

SISTEMA DE TRATAMIENTO DE AGUA N° 1

104
2. Salida del Filtro de Carbón -1 SFC-1
3. Salida del Equipo UV-1 SUV-1

SISTEMA DE TRATAMIENTO DE AGUA N° 2

4. Salida del Filtro de Carbón -2 SFC-2


5. Salida del Equipo UV-2 SUV-2
6. Salida del equipo desionizador SED

SALIDAS DE AGUA DESIONIZADA EN PUNTOS DE USO

7. Salida del tanque de Almacenamiento para puntos de uso STQ


8. Salida del grifo de máquina Groen 2 SG2
9. Salida del Reactor de 2 TN -1
SR2TN-1
10. Salida del Reactor de 4 TN-1 SR4TN-
1
11. Salida del Reactor de 4 TN-2 SR4TN-
2
12. Salida del Reactor de 4 TN-3 SR4TN-
3
13. Salida del Reactor de 2 TN -2 SR2TN-
2
14. Salida del Reactor de 1TN SR1TN
15. Salida del grifo de máquina Unimix 1 SUN1
16. Salida del grifo de máquina Unimix 2 SUN2
17. Salida del grifo de máquina Unimix 320
SUN320
18. Salida del grifo de máquina Turugrau
STURUG
19. Salida del grifo Fab de colonias 1 SFCOL-
1
20. Salida del grifo de Groen FSH 6 Fab de Maquillaje SMAQ
21. Salida del Grifo de Fab. Productos de Higiene Doméstica
SGPHIGDOM
22. Salida del grifo Fab de colonias 2 SFCOL-2

PUNTOS DE USO DE AGUA POTABLE (TODAS CLORADAS) LAVADO DE EQUIPOS

23. Pozo de agua # 1 ó 2 PZ1 ó PZ2


24. Salida de Agua potable Fab. De Shampoo SAP-
FSH
25. Salida de Agua potable Fab. De Cremas SAP-
FCR
26. Lavadero de Máquinas LAVMAQ
27. Salida de Agua Potable Fab. Maquillajes SAP-
FMAQ
28. Lavadero de Máquinas – área de envasado de Sachet LAVMAQ-
ENVSACH

105
3. PROCEDIMIENTO

- Tanto el personal del laboratorio, como el del área de proceso deben usar
mascarilla y guantes durante la etapa de muestreo. Los últimos deben ser
sanitizados con alcohol al 70% cada vez que se tome una muestra.

- Coordinar el muestreo con la cadena responsable (cremas).

- Rotular los frascos con las siglas de los puntos a muestrear.

- Adicionar a los frascos que se empleen para muestrear el agua potable 0,1 ml
de tiosulfato de sodio 3% por cada 100 ml de agua muestreada. Esta sustancia
inhibe la acción del cloro, lo que permite conocer las condiciones
microbiológicas reales del agua.

- Transportar al área de muestreo los materiales.

- El personal del área retira la bolsa o parafilm del punto de muestreo (Sala de
Tratamiento de Agua)

- El personal del área debe sanitizar las salidas de agua con alcohol 70% y gasa
nueva. Al igual que en el caso anterior, el personal del laboratorio de
microbiología debe verificar que el proceso se realice correctamente.

- Abrir la llave completamente y dejar correr el agua por 2 a 3 minutos, reducir el


flujo para permitir el llenado del recipiente sin salpicaduras y tomar la muestra
tapar o cerrar inmediatamente, dejando en el frasco un espacio (aprox. 2.5 cm)
que permita homogenizar la muestra antes del análisis.

- El volumen de la muestras debe ser suficiente para llevar a cabo todas las
pruebas requeridas (150-200mL)

- Las muestras de agua de los pozos son tomadas por el personal responsable
del área empleando para ello un cucharón previamente sanitizado con alcohol
70%. El personal del laboratorio de microbiología debe verificar que este
proceso se realice correctamente.

- La muestra se extrae a 20-30 cm por debajo de la superficie.

- Una vez tomada la muestra colocar nuevamente la bolsa o parafilm del punto
de muestreo.

- El personal del laboratorio de microbiología debe verificar que esta actividad se


realice correctamente.

- En el caso del muestreo de agua para fabricación de productos Sedal, se debe


constatar que la concentración de cloro sea 2ppm. Anotar este dato
proporcionado por el fabricante.

- Transportar las muestras al laboratorio de Microbiología para su posterior


análisis. Si las muestras no son analizadas inmediatamente, mantenerlas de 2-
8°C por un máximo de 12 horas.

- En el laboratorio: Registrar en el correlativo de análisis todos los datos


concernientes a este muestreo.

106
MM08.2.- PROCEDIMIENTO DE ANALISIS

1. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

Frascos (vol.250 mL ) conteniendo 50 ml de Caldo P-A ( Caldo Presencia –


Ausencia) a triple concentración (3X)

Agar Plate count

Agar Mac Conkey

Agar Centrimide

Agar EMB

2. NUMERACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES:

A continuación se detallan los pasos a seguir:

 Verificar que el área de análisis esté en perfecto estado de orden y


sanitización.

 Colocar las placas petri estériles a emplear en el interior de la cabina y


rotularlas con el N° de análisis correspondiente a cada muestra.

 Agitar la muestra de agua.

 Adicionar 1ml de cada muestra en las placas petri empleando pipetas estériles.
Emplear una pipeta diferente por cada muestra.

 Añadir 1 ml de TTC por cada 100 ml de medio y homogenizar.

 Añadir de 15 – 20 ml de agar atemperado a 45°C +-1°C en esterilidad sobre las


placas con muestra. Previamente atemperado en el baño de agua a 45 °C. +-
1°C.

 Verter de 15-20 ml de agar PC sobre una placa sin muestra. CONTROL


NEGATIVO.

 Homogenizar y dejar solidificar.

 Incubar durante 48 -72 horas las placas invertidas a 34 °C. +-1°C.

3. DETERMINACION DE BACTERIAS PATOGENAS EN AGUA

Este ensayo sirve para determinar la presencia de microorganismos patógenos y/o


indicadores de contaminación.

Los dos grupos bacterianos de interés son:

Pseudomonas sp: Se emplea para su detección caldo P-A a triple concentración.

107
Bact. Coliformes, E.coli : Son indicadores de contaminación fecal. Se emplea para
su detección caldo P-A a triple concentración y agares selectivos.

 Sacar de la refrigeradora el caldo P-A (Caldo Presencia - Ausencia) 30 minutos


antes de iniciar el análisis con el fin que se atemperen.

 Verificar que el área de análisis esté en perfecto estado de orden y


sanitización.

 Rotular cada frasco de medio de cultivo con el número y la fecha de análisis


correspondiente.

 Ordenar los frascos en el interior de la cabina. Retirar las tapas de cada uno.

 Homogenizar la muestra de agua agitando el frasco. Añadir 100ml de la


muestra de agua en cada frasco (vol. 250mL) que contiene 50ml de Caldo P-A
(3x) .Homogenizar.

 Incubar los frascos conteniendo los caldos de cultivo a 30-35 °C +- 2.5°C


durante 48 +- 4 horas.

MM08.3.- LECTURA, INTERPRETACION Y EMISION DE RESULTADOS

NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES

 Expresar el resultado como unidades formadoras de colonias (ufc) por


mililitro.
 Cuando no hay desarrollo de colonias expresar el resultado como < 1
ufc/ml.
 Si hay desarrollo de colonias en las placas, elegir para el recuento
placas que presenten de 30 a 300 colonias.
 El número de colonias contadas, será el valor del resultado final.
 Se considera APROBADO si el número de ufc presentes en la muestra,
resultado del análisis, está por debajo de los límites microbianos
establecidos y RECHAZADO si sobrepasa estos límites.

LIMITES ESTABLECIDOS
Para los puntos de muestreo que comprende las Salidas de Agua Purificada
(Salida del equipo Desionizador) y las Salidas de Agua Desionizada en los
Puntos de Uso (Salida del tanque de almacenamiento para punto de uso,
Salida del grifo de Máquina Groen 2, Salida del reactor de 2 TN-1, Salida del
reactor de 4 TN-1, Salida del reactor de 4 TN-2, Salida del reactor de 4 TN-3,
Salida del reactor de 2 TN-2, Salida del reactor de 1 TN, Salida del grifo de
Máquina Unimix 1, Salida del grifo de Máquina Unimix 2, Salida del grifo de
Máquina Unimix 320, Salida del grifo de Máquina Turugrau, Salida del Grifo en
Fab. De colonias 1, Salida de grifo de Groen FSH # 6 Fab. De Maquillajes,
Salida del Grifo de fab productos de higiene doméstica y Salida del grifo Fab
de colonias 2 )
El límite máximo está basado en la USP vigente. Water for
pharmaceutical purposes.

PUNTO DE MUESTREO NMAMV PATOGENOS


(ufc/ml) 100 ml
Límite máximo 100 Ausencia (Pseudomonas sp. E.
coli Y Coliformes.)
108
Límite de Alerta 50 Ausencia Pseudomonas sp. E.
coli Y Coliformes.)

LIMITES ESTABLECIDOS
Para los puntos de muestreo que comprenden los puntos de uso de
Agua Potable (Pozo de agua # 3 Sedapal) y Agua para el Lavado de
Equipos (Pozo de agua # 1 ó 2, Salida de agua potable Fab. de
Shampoo, Salida de agua potable Fab. de Cremas, Lavadero de
máquinas, Salida de agua potable Fab. De maquillaje y Lavadero de
máquinas área de envasado de sachet)

PUNTO DE MUESTREO NMAMV PATOGENOS


(ufc/ml) 100 ml
Límite máximo 500 Ausencia (Pseudomonas sp. E.
coli Y Coliformes.)
Límite de Alerta 300 Ausencia (Pseudomonas sp. E.
coli Y Coliformes.)

LIMITES ESTABLECIDOS
Para los puntos de muestreo que comprenden el Sistema de Tratamiento
de Agua.

PUNTO DE MUESTREO Límite de Alerta Límite


Máximo
NMAMV (ufc/ml)
NMAMV (ufc/ml)
Agua de Lámpara UV 1 ó 2 300 500
Agua de Filtro de Carbón 1 ó 2 300
500

- Los resultados son registrados en el formato: Análisis Microbiológico del


Agua el cual es adjuntado al informe que se envía vía E-mail.

 DETERMINACION DE BACTERIAS PATOGENAS EN AGUA

- Cumplido el tiempo de incubación, observar la turbidez y el color del


caldo; se separan los frascos que presenten enturbiamiento y/o cambio
de color para la investigación de patógenos.

- Si se observa turbidez y cambio de color a amarillo tomar una asada y


sembrar en superficie en agar MCK y/o EMB y agar Centrimide en
placa.

- Si la muestras presenta enturbiamiento sin cambio de color usando el


asa de siembra se procede a sembrar por estriado sólo en placas
conteniendo Agar Cetrimide.

- Incubar las pacas a 30-35 °C +- 2.5°C durante 24 – 48 horas.

- Si no se detecta presencia de patógenos, se expresa como Ausencia de


patógenos / 100 ml.

MM09.- EVALUACION MICROBIOLOGICA DE PLANTA

109
MM09.1.- CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES

1.- PRINCIPIO

La elevada carga de microorganismos tales como hongos y bacterias en el


ambiente en el que se almacenan y manufacturan los productos cosméticos y
farmacéuticos de uso externo y sus materias primas, puede ocasionar la
contaminación de los mismos; por ello es imprescindible establecer un adecuado
régimen de control de la calidad microbiológica de estas áreas. Una adecuada política
de limpieza y sanitización suele asegurar la buena calidad microbiológica de los
ambientes.

La función del personal del laboratorio de microbiología es evaluar la calidad


microbiológica de los ambientes e informar a los jefes responsables de área sobre el
resultado de dicha evaluación.

A continuación se describen los pasos a seguir.

2.- METODO DE SEDIMENTACION EN PLACA

 MATERIALES

- Placas petri conteniendo agar TSA


- Placas petri conteniendo agar Sabourad.
(un juego por cada punto a muestrear)
- Alcohol 70%, algodón, mascarilla, guantes.

 PUNTOS DE MUESTREO

Los puntos descritos a continuación, han sido seleccionados dentro de las áreas
de muestreo.

AREA: ENVASADO DE TALCOS


- Sobre las líneas de envasado al azar ( U ó V)

AREA: FRACCIONAMIENTO DE MP COMPACTO PUNTOS DE USO


- Sobre los racks

AREA: FABRICA DE COMPACTOS


- Sobre la mesa de trabajo/ Sobre máquina mezcladora FMQ 03 o Sobre
microondas.

AREA: DE COMPACTADO
- Sobre la máquina de compactado o Sobre la máquina de compactado
Vetraco

AREA: ENVASADO DE COMPACTOS


- Sobre la línea de envasado X

AREA: ENVASADO DE COLONIAS


- Envasado de colonias sobre las líneas de envasado al azar ( T, S ó R)

AREA: ENVASADO DE CREMAS Y SHAMPOO

110
- Sobre las líneas de envasado al azar ( B, D) o Sobre las líneas de
envasado al azar ( C,F)
- Sobre las líneas de envasado J, M1 o Sobre las líneas de envasado K ,
L1
- Sobre las líneas Máquinas sacheteadoras M2 y M5

AREA: ENVASADO DE CREMAS Y SHAMPOO – LAVADERO DE MAQUINAS


- Zona de equipos limpios - Sobre Equipos limpios
- Zona de lavado- Sobre lavadero

AREA: ENVASADO DE MAQUILLAJE (2do piso) (1 punto por día de muestreo)


- Sobre la línea de envasado L o Sobre la línea de envasado M

AREA: ALMACEN DE CREMAS Y SHAMPOO


- Sobre los tachos de bulk (Toma 1)
-
AREA: ALMACEN AREA DE ENVASADO DE SACHET
- Sobre los totem de bulk (Toma 1)

AREA: FABRICA DE SHAMPOO (2 puntos por día de muestreo)


- Sobre Motor del reactor de 4 TN # 3 o mesa de trabajo o Sobre el
tanque de agua
- Sobre tacho ( de bulk o MP) frente a reloj o Sobre escalera hacia
tanque de agua

AREA: FABRICA DE CREMAS (2 puntos por día de muestreo)


- Sobre la mesa de máquina Unimix 1 o Sobre la mesa de trabajo
costado de patrones.
- Sobre la mesa de la máquina Turugrau o Frente al tablero de controles
de la maquina Unimix

AREA: FABRICA DE PRODUCTOS DE HIGIENE DOMESTICA (1 punto por día


de muestreo)

- Sobre Tanque de fabricación o Sobre línea de envasado

AREA: FABRICA DE MAQUILLAJE (2 puntos por día de muestreo)


- Sobre mesa de patrones o Detrás de las máquinas Groen
- Sobre Molino o sobre máquina unimaq

AREA: FRACCIONAMIENTO DE MP LABIALES PUNTO DE USO


- Sobre los racks

AREA: CABINA DE FRACCIONAMIENTO PUNTO DE USO LABIALES


- Sobre la mesa de trabajo.

AREA: MOLDEO DE LABIALES


- Sobre la mesas de trabajo.

AREA: ENVASADO DE MAQUILLAJE-LABIALES (1 punto por día de


muestreo)
- Sobre la línea de envasado Z o Sobre Balanza

AREA: FABRICA DE TALCOS (1 punto por día de muestreo)


- Sobre las mezcladoras 1 ó 2 cerca de los extractores o Sobre
parihuelas

111
AREA: MICRONIZADO DE TALCOS
- Sobre máquina micronizadota FTA07

AREA: FRACCIONAMIENTO DE MATERIAS PRIMAS PUNTO DE USO DE


TALCOS
- Sobre mesa de trabajo

AREA: ALMACEN DE TALCOS


- Sobre las parihuelas

ALMACEN DE BULK Y CONCENTRADOS COMPACTOS


- Sobre mesa central.

AREA: FRACCIONAMIENTO Y ALMACENES DE MATERIA PRIMA


- Cabinas de fraccionamiento sobre las mesas de trabajo al azar ( 1,2 ó
3)
- Cabinas de fraccionamiento sobre las mesas de trabajo al azar ( 4 ó 5)
- Almacén de Materias Primas con temperatura controlada (sobre rack).
- Almacén de MMPP sobre los racks ( rack 48 y rack 54) 2do nivel

AREA: RECEPCION DE MATERIA PRIMA


- Cabina de muestreo de Materias Primas

 MUESTREO

El personal del laboratorio de microbiología encargado de llevar a cabo esta


operación debe usar mascarilla y guantes, los guantes deben sanitizarse con
alcohol cada vez que se muestree un punto.

1. Preparar el material de muestreo

2. Inspeccionar el área a muestrear.

3. Ubicar los puntos a evaluar. Deben ser superficies planas,

4. Colocar entreabiertas sobre un papel una placa petri con agar TSA y otra
con agar Sabouraud. Repetir esta operación en cada punto de muestreo.

5. Dejar las placas expuestas al medio ambiente durante 1 hora en las áreas
de Productos Cosméticos, higiene doméstica .

6. Cerrar, recoger las placas y transportarlas al laboratorio inmediatamente.

7. En el laboratorio, registrar en el correlativo de análisis los nombres de los


puntos muestreados, las observaciones realizadas y asignar un número
de análisis a cada juego de placas con agar. Anotar el lote de medio
utilizado para la evaluación.

8. Incubar a 30-35°C las placas con agar TSA en forma invertida por 72
horas y las placas con agar Sabouraud a temperatura (20-25°C)
previamente envueltas en papel por 5 dias días.

 INTERPRETACION DE RESULTADOS

112
- Una vez concluido el tiempo de incubación de las placas se realiza el
recuento de colonias que desarrolla en cada una y se registra los
resultados en el correlativo de análisis.

- Existen Límites de Alerta que nos permiten tomar acciones correctivas


antes de que los recuentos excedan los Límites máximos.

- Un punto de muestreo se considera “RECHAZADO” cuando el número


de colonias que desarrolla excede los límites establecidos para dicha
área y “APTO” cuando sucede lo contrario.

Los límites establecidos para los ambientes han sido estandarizados por el
laboratorio de Microbiología de esta Empresa, y se encuentran detallados en el
registro “Evaluación de ambientes”.

MM09.2.- CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES EN EL LABORATORIO DE


MICROBIOLOGÍA

1.- PRINCIPIO

La elevada carga de microorganismos tales como hongos y bacterias en el


ambiente en el que se realizan los análisis microbiológicos, puede ocasionar la
contaminación de los mismos; por ello es imprescindible establecer un adecuado
régimen de control de la calidad microbiológica de estas áreas. Una adecuada política
de limpieza y sanitización suele asegurar la buena calidad microbiológica de los
ambientes.

La función del personal del laboratorio de microbiología es evaluar la calidad


microbiológica de los ambientes del laboratorio de microbiología e informar a los jefes
responsables de área sobre el resultado de dicha evaluación.

A continuación se describen los pasos a seguir.

2.- METODO DE SEDIMENTACION EN PLACA

 MATERIALES

- Placas petri conteniendo agar TSA


- Placas petri conteniendo agar Sabourad.
(un juego por cada punto a muestrear)
- Alcohol 70%, algodón, mascarilla, guantes.

 PUNTOS DE MUESTREO

AREA ANÁLISIS

- Cabina de bioseguridad 1 – sobre mesa dentro de la cabina.


- Área de análisis – sobre mesa

 MUESTREO

113
El personal del laboratorio de microbiología encargado de llevar a cabo esta
operación debe usar mascarilla y guantes, los guantes deben sanitizarse con
alcohol cada vez que se muestree un punto.

1. Preparar el material de muestreo

2. Inspeccionar el área a muestrear.

3. Ubicar los puntos a evaluar. Deben ser superficies planas,

4. Colocar entreabiertas sobre un papel una placa petri con agar TSA y otra con
agar Sabouraud. Repetir esta operación en cada punto de muestreo.

5. Dejar las placas expuestas al medio ambiente durante 4 horas.

6. Cerrar, recoger las placas.

7. Registrar en el correlativo de análisis de productos Farmacéuticos de uso


externo, los nombres de los puntos muestreados, las observaciones
realizadas y asignar un número de análisis a cada juego de placas con agar.

8. Incubar a 30-35°C las placas con TSA en forma invertida por 48 horas y las
placas con agar Sabouraud a temperatura 20-25°C previamente envueltas en
papel por tres días.

 INTERPRETACION DE RESULTADOS

- Una vez concluido el tiempo de incubación de las placas se realiza el


recuento de colonias que desarrolla en cada una y se registra los
resultados en el correlativo de análisis respectivo.

- Existen Límites de Alerta que nos permiten tomar acciones correctivas


antes de que los recuentos excedan los Límites máximos.

- Un punto de muestreo se considera “RECHAZADO” cuando el número


de colonias que desarrolla excede los límites máximos establecidos
para dicha área y “APTO” cuando sucede lo contrario.

Los límites de ambientes farmacéuticos para el método de Sedimentación en placa


se encuentran detallados en el registro “control microbiológico de ambientes en el
laboratorio de microbiología”.

 EMISION DE RESULTADOS

- El responsable del laboratorio debe ser informado sobre el resultado de


dicha evaluación.

MM09.3.- MONITOREO DE UTENSILIOS Y EQUIPOS DE FABRICACION Y


ENVASADO

114
1.- PRINCIPIO

Para garantizar que los productos no se contaminen durante los procesos de


manufactura, es necesario entre otras cosas, realizar una adecuada limpieza y
sanitización de los equipos de fabricación y envasado siguiendo las normas
establecidas. Un equipo que no ha sido limpiado adecuadamente puede contener
restos de los productos anteriormente elaborados los que a su vez favorecerían el
crecimiento de los microorganismos.

Una de las funciones del laboratorio de Microbiología es evaluar la calidad


microbiológica de los equipos de planta, empleando los métodos que detallamos a
continuación. Estos equipos también pueden evaluarse empleando el HY LITE como
se describe en el punto MM10.4.

2.- MATERIALES

- Hisopos estériles.
- Tubos de ensayo conteniendo 10 ml de TSB con Tween 80.
- Algodón, alcohol 70%, mascarilla, guantes.

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

 MUESTREO

- Preparar el material para el muestreo.


- Seleccionar el punto o los equipos a evaluar.
- Rotular los tubos con el nombre del equipo a evaluar.
- Destapar el tubo de prueba con caldo TSB.
- Introducir el hisopo en el interior del tubo con caldo TSB.
- Pasar el hisopo humedecido por una superficie aproximada de 10 cm2.
- Introducir nuevamente el hisopo al tubo con el caldo, quebrando antes la parte
superior del mismo (la parte que se coge para tomar la muestra).
- Tapar el tubo de ensayo.
- Limpiar con un pedazo de algodón empapado en alcohol 70% la superficie
muestreada.
- Registrar los datos (nombre y N° de orden) del producto que será manipulado.
- Transportar las muestras al laboratorio.

 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

 LÍMITE MICROBIANO:

Los materiales y reactivos empleados ya han sido descritos en el capítulo


MM06.1

1. En este tipo de análisis, si las muestras no van a ser procesadas dentro de


los 30 minutos luego del muestreo, éstas deben ser mantenidas en
refrigeración, ya que de sobrepasarse este tiempo el número de
microorganismos se incrementaría dando un resultado de numeración
superior al que le corresponde.

2. Limpiar y sanitizar la superficie de la mesa en la que se realizará el análisis.

3. Rotular las placas petri con el número de análisis correspondiente.

115
4. Agitar cada tubo en el vortex y con la ayuda de una pipeta extraer 1 ml del
caldo TSB con Tween 80 conteniendo la muestra y depositar en el interior
de 2 placas petri estériles.

5. Atemperar los Agares TSA y Sabouraud aproximadamente hasta 45°C +-


1°C.

6. Agregar 1 ml de TTC por cada 100 ml de medio TSA y agitar para


homogenizar.

7. Añadir aproximadamente 15 – 20 ml del medio de cultivo correspondiente a


la placa que contiene la muestra y agitar suavemente hasta mezclar la
muestra con el medio de cultivo.

8. Dejar solidificar los agares de las placas.

9. Incubar las placas con TSA invertidas, en la incubadora a una temperatura


de 30-35°C por 48 – 72 horas y las placas de Sabouraud sin invertir por 5
días. Las placas para hongos se incuban previamente envueltas en papel.

10. Incubar el tubo con el caldo de cultivo a 30-35 °C durante 48 horas para la
determinación de patógenos.

 DETERMINACION DE PATOGENOS

- Separar los tubos con crecimiento microbiano, es decir presencia de


turbidez.
- Realizar la siembra mediante el método de estriado sobre placas con
agar EMB, Cetrimide, MCK, y/o Manitol Salado para el aislamiento de
bacterias patógenas.
- Incubar las placas invertidas a 30-35°C por 48 horas y realizar la lectura
de acuerdo a lo indicado en el punto MM06.2.

4.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. Transcurrido el tiempo de incubación, realizar el conteo de colonias de


microorganismos que crecen en la placa. El número de colonias resultante
representa un estimado de la cantidad de microorganismos, hongos o
bacterias que crecen en 10 cm. de la superficie evaluada.
2. Se considera aprobado cuando el número de ufc encontrados está por
debajo de los límites establecidos y rechazados si sobrepasa estos límites.
3. La interpretación del crecimiento de microorganismos en medios selectivos
se realiza siguiendo las pautas señaladas en el capítulo MM06.5
(interpretación de resultados)

LÍMITES MAXIMOS ESTABLECIDOS:


NMAMV NMyL PATOGENOS
ufc/10cm2 ufc/10cm2

Equipos < 100 < 10 Ausente

5.- EMISIÓN DE RESULTADOS:

116
Se informa sobre los resultados de las evaluaciones a los jefes responsables de
cada proceso.

MM09.4.- MONITOREO DE SUPERFICIES DE PLANTA

1.- PRINCIPIO

Para garantizar que los productos no se contaminen durante los procesos de


manufactura, es imprescindible establecer un adecuado régimen de control de la
calidad microbiológica de estas áreas. Una adecuada política de limpieza y
sanitización suele asegurar la buena calidad microbiológica de las superficies.

2.- MATERIALES

- Hisopos estériles.
- Tubos de ensayo conteniendo 10 ml de TSB con Tween 80.
- Algodón, alcohol 70%, mascarilla, guantes.

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

 MUESTREO

- Preparar el material para el muestreo.


- Seleccionar el punto de muestreo a evaluar. Para el caso del monitoreo
quincenal de superficie será de acuerdo al cronograma de muestreo detallado
en el procedimiento respectivo.
- Rotular los tubos con el nombre del punto de muestreo a evaluar.
- Destapar el tubo de prueba con caldo TSB.
- Introducir el hisopo en el interior del tubo con caldo TSB.
- Pasar el hisopo humedecido por una superficie aproximada de 10 cm2.
- Introducir nuevamente el hisopo al tubo con el caldo, quebrando antes la parte
superior del mismo (la parte que se coge para tomar la muestra).
- Tapar el tubo de ensayo.
- Limpiar con un pedazo de algodón empapado en alcohol 70% la superficie
muestreada.
- Registrar los datos en el correlativo de análisis.
- Transportar las muestras al laboratorio.

 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

 LÍMITE MICROBIANO:

Los materiales y reactivos empleados ya han sido descritos en el capítulo


MM06.1

11. En este tipo de análisis, si las muestras no van a ser procesadas dentro de
los 30 minutos luego del muestreo, éstas deben ser mantenidas en
refrigeración, ya que de sobrepasarse este tiempo el número de
microorganismos se incrementaría dando un resultado de numeración
superior al que le corresponde.

12. Limpiar y sanitizar la superficie de la mesa en la que se realizará el análisis.

117
13. Rotular las placas petri con el número de análisis correspondiente.

14. Agitar cada tubo en el vortex y con la ayuda de una pipeta extraer 1 ml del
caldo TSB con Tween 80 conteniendo la muestra y depositar en el interior
de 2 placas petri estériles.

15. Atemperar los Agares TSA aproximadamente hasta 45°C +- 1°C.

16. Agregar 1 ml de TTC por cada 100 ml de medio TSA y agitar para
homogenizar.

17. Añadir aproximadamente 15 – 20 ml del medio de cultivo correspondiente a


la placa que contiene la muestra y agitar suavemente hasta mezclar la
muestra con el medio de cultivo.

18. Dejar solidificar los agares de las placas.

19. Incubar las placas con TSA invertidas, en la incubadora a una temperatura
de 30-35°C por 48 – 72 horas.

20. Incubar el tubo con el caldo de cultivo a 30-35 °C durante 48 horas para la
determinación de patógenos.

 DETERMINACION DE PATOGENOS

- Separar los tubos con crecimiento microbiano, es decir presencia de


turbidez.
- Realizar la siembra mediante el método de estriado sobre placas con
agar EMB, Cetrimide, MCK, y/o Manitol Salado para el aislamiento de
bacterias patógenas.
- Incubar las placas invertidas a 30-35°C por 48 horas y realizar la lectura
de acuerdo a lo indicado en el punto MM06.2.

4.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

4. Transcurrido el tiempo de incubación, realizar el conteo de colonias de


microorganismos que crecen en la placa. El número de colonias resultante
representa un estimado de la cantidad de microorganismos, bacterias que
crecen en 10 cm. de la superficie evaluada.
5. Se considera aprobado cuando el número de ufc encontrados está por
debajo de los límites establecidos y rechazados si sobrepasa estos límites.
6. La interpretación del crecimiento de microorganismos en medios selectivos
se realiza siguiendo las pautas señaladas en el capítulo MM06.5
(interpretación de resultados)

LÍMITES MAXIMOS ESTABLECIDOS:


NMAMV PATOGENOS (Escherichia
coli y
Pseudomonas aeruginosa,
ufc/10cm2

Superficies inertes <500 Ausente

5.- EMISIÓN DE RESULTADOS:

118
Se informa sobre los resultados de las evaluaciones a los jefes responsables de
cada proceso.

MM09.5.- MONITOREO DE PERSONAL

1.- PRINCIPIO

El personal constituye una de las principales fuentes de contaminación durante la


manufactura, ya que transporta consigo microorganismos tales como bacterias y
hongos que pueden dañar la calidad microbiológica de los productos.

Para conservar limpia y libre de contaminación un área de trabajo, el personal debe


cumplir las Buenas Prácticas de Manufactura. El uso de la mascarilla es indispensable
por parte del personal ya que evita la generación de “gotitas de saliva” que se expelen
al hablar. El uso de guantes es también imprescindible para evitar la contaminación
por manipulación.

MICROORGANISMOS EN LAS PERSONAS

SUPERFICIE CORPORAL

- Piel, cabellos, uñas, ropa.

FLORA DE LA PIEL

- Incluye microorganismos saprófitos y algunos patógenos. Los primeros pasan


fácilmente de la piel al ambiente y viceversa directamente a través de la ropa
siendo fáciles de eliminar con agua y jabón. Los segundos son eliminados con
mayor dificultad son diseminadores abundantes. La flora está constituida por:
Difteroides, Staphylococcus, Sarcina, Enterobacteriacea, Criptococcus,
Candida albicans.

FLORA DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS Y DIGESTIVAS:

- Hábitat de numerosos microorganismos que corresponden a flora normal y


transitoria.

2.- MATERIALES

- Hisopos estériles.
- Tubos de ensayo conteniendo 10 ml. de TSB con Tween 80.
- Tubos de ensayo conteniendo 10 ml de solución salina 0.85%.
- Algodón, alcohol 70%, mascarilla, guantes.

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

 MUESTREO

- Preparar el material para el muestreo.

- Dirigirse a la zona de muestreo.

- Rotular los tubos con el nombre del personal a evaluar.

119
- Para el caso del monitoreo semanal del personal será de acuerdo al
cronograma de muestreo semanal, detallado en el procedimiento
respectivo.

 MUESTREO DE GUANTES/ MANOS

- Destapar un tubo de prueba con caldo TSB.

- Introducir un hisopo estéril, humedecerlo con caldo.

- Pasar el hisopo humedecido por una superficie aproximada de 10 cm2 de


ambos guantes o manos según sea el caso.

- Introducir nuevamente el hisopo al tubo con el caldo quebrando antes, la


parte superior del mismo (la parte que se coge para tomar la muestra).

- Tapar el tubo de ensayo.

- Limpiar con un pedazo de algodón empapado en alcohol 70% o incorporar


alcohol 70% sobre los guantes o manos muestreados.

- Anotar el producto manipulado por el personal evaluado y las


características de su función.

Nota: La evaluación de manos se realiza en las esclusas antes de ingresar


a las áreas productivas.

- Transportar las muestras al laboratorio.

- Registrar en el correlativo de análisis los datos del muestreo y asignar un


número de análisis.

MUESTREO DE MANDILES, MAMELUCOS, POLOS O CAMISACOS:

- Pasar el hisopo estéril humedecido en solución salina por una superficie


aproximada de 10 cm2 de la zona frontal del mandil, mameluco o camisaco.

- Introducir nuevamente el hisopo al tubo solución salina quebrando la parte


superior del mismo (la parte que se coge para tomar la muestra).

- Tapar el tubo de ensayo.

- Anotar el producto manipulado por el personal evaluado y las


características de su función.

- Transportar las muestras al laboratorio.

- Registrar en el correlativo de análisis los datos del muestreo y asignar un


número de análisis.

 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

120
Se realiza dos tipos de análisis: Límite microbiano y determinación de
patógenos

 LÍMITE MICROBIANO:

Los materiales y reactivos empleados ya han sido descritos en el capítulo


MM06.1

21. En este tipo de análisis, si las muestras no van a ser procesadas dentro de
los 30 minutos luego del muestreo, éstas deben ser mantenidas en
refrigeración, ya que de sobrepasarse este tiempo el número de
microorganismos se incrementaría dando un resultado de numeración
superior al que le corresponde.

22. Limpiar y sanitizar la superficie de la mesa en la que se realizará el análisis.

23. Rotular las placas petri con el número de análisis correspondiente.

24. Agitar cada tubo en el vortex y con la ayuda de una pipeta extraer 1 ml del
caldo TSB con Tween 80 conteniendo la muestra de guantes o extraer 1ml
de la solución salina al 0.85% conteniendo la muestra de mandiles,
mamelucos, o camisacos y depositar en el interior de la placa estéril.

25. Atemperar el Agar aproximadamente hasta 45°C. +-1°C

26. Añadir aproximadamente 15 – 20 ml del medio de cultivo TSA a la placa


que contiene la muestra y agitar suavemente hasta mezclar la muestra con
el medio de cultivo.

27. Dejar solidificar el agar de la placa.

28. Incubar las placas con TSA invertidas, en la incubadora a una temperatura
de 30-35°C por 48 – 72 horas.

DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS

Se procede siguiendo el procedimiento detallado en el capítulo MM06.1.4.

4.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

7. Transcurrido el tiempo de incubación, realizar el conteo de colonias de


microorganismos que crecen en la placa. El número de colonias resultante
representa un estimado de la cantidad de microorganismos o bacterias que
crecen en 10 cm2. de la superficie evaluada.
8. Se considera aprobado cuando el número de ufc encontrada está por
debajo del límite establecido y rechazado si sobrepasa este límite.
9. La interpretación del crecimiento de microorganismos en medios selectivos
se realiza siguiendo las pautas señaladas en el capítulo MM06.2
(interpretación de resultados).

LÍMITES MAXIMOS ESTABLECIDOS:

 Productos Cosméticos e Higiene Doméstica

121
NMAMV PATOGENOS
ufc/10cm2

Guantes y/o manos del personal 150 Ausente


Mandiles y/o Camisacos del personal 300 Ausente

5.- EMISIÓN DE RESULTADOS:

Se informa sobre los resultados de las evaluaciones a los jefes responsables de


cada proceso. Además los resultados son publicados para que sean vistos por todo el
personal de planta.

MM09.6.- SISTEMA DE MONITOREO DE HIGIENE HY-LITE

1.- PRINCIPIO:

El sistema de control de higiene HY LITE permite evaluar de manera indirecta la


limpieza general de la superficie evaluada la que puede ser un equipo, personal, etc
se basa en la medición de los niveles de ATP (tri fosfato de adenosina) que es una
molécula de intercambio energético propia de las células vivas, la que también puede
encontrarse en restos de materia orgánica, alimentos y está ligada a la actividad de
bacterias, hongos y otros microorganismos

El sistema de control de higiene HY LITE contiene todo lo necesario para extraer y


medir los niveles de ATP y se basa en la siguiente reacción química:

Reactivo luminiscente + ATP = LUZ

La intensidad de la luz emitida es expresada en unidades relativas de luz (RLU).


Este valor está directamente relacionado con la cantidad de ATP de la superficie
analizada, siendo por ello un indicador de la cantidad de restos de materia orgánica
existentes en la misma.

El sistema de HY LITE proporciona una señal de aviso casi instantáneo que


permite reaccionar a tiempo ante una posible contaminación.

2.- PARTES DEL SISTEMA:

El sistema consta de un maletín portátil en el que podemos encontrar los siguientes


componentes:

Monitor
Hisopos libres de ATP
Tubos con solución de enjuague
Caja para residuos
Cargador de bacterias
Estación de trabajo

Además muestra las instrucciones graficadas paso a paso para llevar a cabo el
análisis
Los dispositivos de reacción deben permanecer almacenados entre 0 y +6 °C
122
La descripción de los principales componentes está en el capítulo MM03.2.12

EL MONITOR: Es un instrumento ligero en el que se realiza la lectura de la cantidad


de
ATP de una muestra y lo convierte en RLU unidades relativas de luz.

BOTONES DEL MONITOR:

Desconecta el instrumento

Conecta el instrumento e ilumina el visor

Pulsa, abre o cierra el obturador

Sirve para conectar o desconectar el compensador de temperatura

SÍMBOLOS DE LA PANTALLA:

Los siguientes símbolos pueden observarse durante el uso

wait aparece cuando el monitor es tá en funcionamiento

load significa que el monitor está listo para introducir la


siguiente muestra
unload indica que ya se realizó la medición, debiendo extraerse
el dispositivo de reacción

temperature muestra que el compensador de temperatura está


conectado
compensator

3.- PROCEDIMIENTO:

- Pasar el hisopo por la superficie a evaluar. si la superficie está seca humedecer


previamente el hisopo con la solución de enjuague. Si la superficie está
húmeda se toma la muestra directamente.
- Introducir los hisopos en los tubos de enjuague respectivos y hacerlos girar por
los bordes durante 10 segundos
- Volver a colocar los hisopos en sus tubos protectores y rotularlos con el
nombre de la superficie evaluada.
- Sacar el dispositivo de reacción de su envase e introducir por espacio de un
segundo la varilla de muestreo verticalmente en la solución de enjuague de
modo que toque el fondo del tubo.
- Presionar fuertemente la varilla de muestreo contra la parte superior de la tapa
del tubo con la solución de enjuague hasta que se introduzca del todo.
- Presionar fuertemente haciéndolo girar al mismo tiempo hasta unir ambos
extremos del dispositivo.
- Agitar diez veces como mínimo vigorosamente para mezclar bien la muestra
con los reactivos.
- Presionar el botón de encendido del monitor HY LITE.
- Colocar el dispositivo de reacción en la cámara de medición del monitor y
cerrar la tapa.

123
- Esperar a que la máquina termine la operación de análisis.
- Leer el resultado expresado en RLU y registrar el resultado.

Si aparece en el visor la indicación ---------- ello indica que la señal de luz


procedente de la muestra es demasiado alta para ser medida por el monitor. El
resultado debe anotarse como “Desbordamiento.”

- Retirar el dispositivo del monitor y presionar el botón de apagado del monitor


HY LITE.

4.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Para poder RECHAZAR O APROBAR una muestra, en el laboratorio de Microbiología


se ha estandarizado el equipo y establecido límites de tolerancia en función a la
realidad de esta empresa. Estos límites son:

Límite máximo permitido es: 40 RLU.

5.- RECOMENDACIONES:

- Evitar el contacto de los reactivos del HY LITE con los ojos o la piel. en
caso de contacto lavar inmediatamente con abundante agua.

- Evitar sumergir la varilla de muestreo en el tubo de enjuague más de


algunos segundos.

- No tocar los anillos de la varilla muestradora (ver esquema) contra el


borde del tubo de enjuague.

- No agitar la solución de enjuague con la varilla de muestreo.

- No mover o agitar bruscamente la varilla de muestreo después de haber


tomado la muestra.

- No forzar nunca el dispositivo de reacción dentro de la cámara de


lectura ya que ello ocasionara daño a los componentes internos.

- No forzar manualmente para extraer un dispositivo de reacción


atascado.

MM09.7.- MONITOREO DE TRAPEADORES

1.- PRINCIPIO:

Cada uno de los aspectos de la fabricación de productos cosméticos y


farmacéuticos debe ir acompañado de un elevado nivel de saneamiento e higiene, el
cual abarca los utensilios de limpieza que se utilizan en el saneamiento de las
instalaciones.
Las instalaciones deben ser mantenidas de tal forma que sean apropiadas para las
operaciones que se realizarán en ellas, por tanto es importante realizar el saneamiento
adecuado a fin de evitar la contaminación cruzada, el polvo y la suciedad y en general
toda condición que pueda influir negativamente en la calidad de los productos.
Como parte importante del saneamiento de Planta, está el monitoreo microbiológico
de los trapeadores de planta que nos permitirá comprobar que el saneamiento de
Planta se está desarrollando en forma adecuada.

124
2.- MATERIALES:

- Tijera de acero.
- Bolsas de primer uso.
- Algodón, alcohol 70%, mascarilla, guantes.
- Caldo TSB con Tween 80. (CTSPL)

3.- PROCEDIMIENTO:

RELACION DE TRAPEADORES

Cadena de
Números Producción Ubicación Cantidad frecuencia
1 Talcos Fábrica de Talcos 1 SEMANAL
2 Talcos Envasado de Talcos zona blanca 1 SEMANAL
3 Talcos Almacén punto de uso talcos 1 MENSUAL
4 Cremas y Shampoo Fábrica de Cremas 1 SEMANAL
5 Cremas y Shampoo Fábrica de Shampoo 1 SEMANAL
6 Cremas y Shampoo Lavadero de Tachos de MP 1 MENSUAL
Cabina de Fraccionamiento de
7 Cremas y Shampoo MP 1 SEMANAL
8 Cremas y Shampoo Envasado de cremas y Shampoo 1 SEMANAL
9 Cremas y Shampoo Almacén de Cremas y Shampo 1 MENSUAL
10 Cremas y Shampoo Lavadero de Máquinas 1 SEMANAL
Envasado de cremas y Shampoo
11 Cremas y Shampoo - sachet´s 1 SEMANAL
Fábrica de Líquidos
12 Cremas y Shampoo Farmacéuticos 1 SEMANAL
Envasado de Líquidos
13 Cremas y Shampoo Farmacéuticos 1 SEMANAL
14 Laboratorio Laboratorio 1 MENSUAL
15 Maquillaje Fábrica de Maquillaje 1 SEMANAL
16 Maquillaje Envasado de Maquillaje 1 SEMANAL
17 Maquillaje Fábrica de Compactos 1 SEMANAL
Envasado de Compactos -
18 Maquillaje compactado 1 SEMANAL
19 Planta General Vestidores de Damas 1 MENSUAL
20 Planta General Vestidores de Caballeros 1 MENSUAL

 MUESTREO

- Coordinar con el personal de limpieza la toma de muestras.


- Preparar el material para el muestreo.
- Dirigirse a las áreas donde se encuentran los trapeadores.
- Rotular la bolsa indicando el área al que pertenece el trapeador.
- Limpiar la tijera con alcohol 70% y algodón.
- Coger pequeñas tiras del trapeador con la bolsa y proceder a
cortar.
- Cerrar la bolsa.
- Transportar las muestras al laboratorio.

 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

125
- Registrar los datos de las muestras en el correlativo de análisis.
- Rotular cada muestra con el número de análisis correspondiente.
- En un frasco estéril, pesar 2 g del trapeador a analizar.
- Adicionar 18 ml de caldo TSB con Tween 80.
- Agitar la muestra y dejar incubar a 30-35°C durante 24 horas.

 DETERMINACION DE PATOGENOS

- Elegir los frascos que presenten turbidez.


- Realizar la siembra mediante el método de estriado sobre placas con agar
EMB y Cetrimide.
- Incubar las placas invertidas a 30-35°C por 48 horas y realizar la lectura de
acuerdo a lo indicado en el punto MM06.2.

4.- INTERPRETACION DE RESULTADOS

- Se considera que un trapeador es Apto para el saneamiento de planta cuando no


presenta crecimiento de patógenos y Rechazado cuando presenta crecimiento de
patógenos (E.coli y/o Pseudomonas).

MM10.- OTROS ANALISIS MICROBIOLOGICOS

MM10.1 TEST DE DESAFÍO

PRINCIPIO

Un preservante, es una sustancia que se añade a un producto para protegerlo


de la contaminación por microorganismos. También puede emplearse en situaciones
en las que se requiera minimizar la proliferación de microorganismos, es decir, tiene
efecto antimicrobiano.

Un agente antimicrobiano es bueno si la concentración a la que es efectivo es


menor que la concentración que resulta tóxica para los seres humanos.

Este ensayo permite evaluar la eficacia de los preservantes presentes en el


producto evaluado.

CEPAS DE TRABAJO

MICROORGANISMOS TESTIGO:

Se emplean los siguientes microorganismos:

- Candida albicans ATCC 10231


- Aspergillus niger ATCC 16404
- Eschericchia coli ATCC 8739
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Staphylococcus aureus ATCC 6538

Se pueden emplear también otros microorganismos (cepas nativas), especialmente


aquellos que sean los causantes de contaminación.

126
 MATERIALES

- Cultivo de 18 – 24 horas de la cepa a evaluar


- Tubos con 9 ml. de caldo peptonado al 1%
- Tubos con 4 ml de Solución salina 0.85%
- Tubos con 9 ml de solución salina 0.85%
- Tubos con 4 ml de Solución salina 0.85%, con Tween 80 al 0.05%
- Agar TSA con Lecitina y Tween 80 .
- Agar Sabouraud glucosado 4%
- Frascos con 90 ml aprox. de Caldo peptona 1%
- Pipetas, baguetas, placas petri y frascos estériles
- Agitador Vortex
- Incubadora de 30-35 °C

Cajones para incubación a T° 20-25°C

 PREPARACION DE INOCULOS DE CEPAS PARA TEST DE DESAFIO:

1. Transferir una asada de un cultivo bacteriano reciente, a un tubo con agar


sólido en plano inclinado por estriado.

2. Para bacterias usar agar TSA e incubar por 18 - 24 horas a 30-35 °C.

3. Proceder de la misma manera para Candida albicans usando Agar Sabouraud,


pero incubar el subcultivo por 48 horas a 20 - 25 °C

4. Para el cultivo de Aspergillus niger también se procede de la misma manera,


pero la transferencia se realiza empleando el método de siembra en puntura
sobre agar Sabouraud en plano inclinado. Se incuba por una semana a 20 -25
°C.

5. Para preparar suspensiones de Candida albicans y de bacterias para el


ensayo, adicionar solución salina 0.85% estéril sobre la superficie del agar.

6. Agitar en el vortex y transferir 1 ml de la suspensión a otro tubo con solución


salina estéril.

7. Hacer las diluciones necesarias en solución salina hasta ajustar la


concentración de microorganismos a 108 ufc/ml. Comparar con la escala Mc
Farland 0.5 para bacterias y 1.0 para hongos. Esta viene a ser el Inóculo de
trabajo.

8. Para preparar suspensiones de Aspergillus niger proceder de la mima manera,


pero usando solución salina estéril conteniendo polisorbato 80.

9. Realizar el recuento en placa del inóculo para calcular la concentración


empleada.

10. Refrigerar las suspensiones en el caso de no ser usadas dentro de las 2 horas.

11. Las suspensiones de bacterias y hongos deben ser usadas dentro de las 24
horas de colecta, pero las suspensiones de hongos pueden ser almacenadas
en refrigeración hasta por 7 días.

MM10.1.1 METODO DE REGRESION LINEAL

127
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Coloque 50 gr. del producto a evaluar en un frasco estéril.

Anadir 0,10 ml del inóculo de trabajo previamente preparada por cada 10 gr. de
producto.

Homogenizar con una bagueta estéril.

La concentración del inóculo que es adicionado el producto, debe ser tal que la
preparación final en el producto contaminado esté entre 1x105 y 1x106 ufc/ml.

La concentración inicial es estimada de acuerdo al recuento previo en placa del


inóculo.

Incubar los frascos inoculados a una T° entre 20-25°C.

Determinar el número de ufc/ml a los 14 y 28 días de la siguiente manera (USP 28,


Microbiological Test, [51] Antimicrobial Effectiveness Testing, page 2242):

Pesar en un frasco estéril, 10 g del producto contaminado y adicionar 90 ml de caldo


Caseína (10-1). Realizar diluciones en tubos con caldo caseína hasta 10-5.

De cada dilución, tomar 1 ml y sembrar en placas por incorporación y por duplicado.

Para bacterias se utiliza el medio TSA y para hongos y Levaduras se utiliza el medio
SAB.

Mezclar bien la muestra con el agar por movimientos rotativos o laterales y dejar
solidificar a T° ambiente.

Incubar las placas para bacterias de 30-35°C por 48 horas y las placas para hongos de
20-25°C durante 5 días. Las placas de levaduras se incuban también de 20-
25°C, pero durante 72 horas.

Al cumplirse los tiempos de incubación, efectuar la lectura de resultados. Para


bacterias y levaduras, escoger las placas que tengan desarrollo entre 30 a 300
colonias. Par el caso de hongos, escoger placas con desarrollo entre 20 – 100
colonias.

Usando las concentraciones calculadas de ufc/ml presentes al inicio de la prueba,


calcular el cambio en valores de log10 para cada microorganismo en los
intervalos de tiempo trabajados y expresar los cambios en términos de
reducción logarítmica.

En este método, se afirma que el sistema preservante es efectivo cuando:

- Bacterias : A los 14 días, reducción no menor a 2 logaritmos del


recuento inicial y sin incremento del recuento de los 14 a
los 28 días.

- Hongos y levaduras : Sin incremento del recuento inicial a los 14 y 28 días.

MM10.1.2 METODO DEL VALOR D

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
128
Se siguen los mismos pasos que para el Método de Regresión Lineal, con algunos
cambios.

En el punto 7, los intervalos de trabajo son 4 y 24 horas para bacterias patógenas y 4,


24 y 72 horas para levaduras, hongos y bacterias no patógenas.

En el punto 15, el Valor D (tiempo de demora la población microbiana en descender un


logaritmo)es el siguiente:

Para bacterias patógenas : el valor D debe ser menor o igual a 4


horas.
Para bacterias no patógenas, hongos y levaduras : el valor D debe ser menor o igual a
28 horas.

MM10.2 EVALUACIÓN DE DESINFECTANTES

PRINCIPIO

La limpieza y sanitización son dos de los más importantes procedimientos en la


manufactura de productos cosméticos y farmacéuticos de uso externo. El agente
químico que se emplea para la sanitización debe caracterizarse entre otras cosas por
poseer un amplio espectro de acción frente a microorganismos y actuar efectivamente
en un corto tiempo de exposición.

La evaluación de la actividad de los agentes químicos antimicrobianos en el


laboratorio, tanto desinfectante como antiséptico, permite determinar que agente es
más adecuado para ser empleado en nuestra Planta.

MM10.2.1 COEFICIENTE DE FENOL


La determinación de la actividad desinfectante de un determinado agente es necesaria
para conocer su posible eficacia. El método primario que se viene empleando desde
hace muchos años es comparar la potencia del compuesto a ensayar con la de un
desinfectante-tipo o estándar, que por motivos históricos es el fenol.

MATERIALES

Caldo peptonado 0.1 %


Agua destilada
Agar TSA
Agar SAB
Fenol
Tubos de ensayo
Pipetas graduadas,
Desinfectante en evaluación,
Cultivos puros de 24 horas en caldo.
Solución salina
Escala 0.5 Mc Farland

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Sembrar la cepa a ensayar por puntura en un tubo con Agar TSA (para
bacterias) o Agar SAB (para hongos). Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego,
realizar un enjuague con solución salina, ajustar a escala 0.5 Mc Farland.
Efectuar los recuentos necesarios para determinar el tamaño del inóculo.

129
2. Preparar diluciones del desinfectante a evaluar: 1/10 y 1/100. Colocar además
en un tubo 5 ml. del antiséptico sin diluir.
3. Colocar 5 ml. de cada dilución de desinfectante en tubos de ensayo estériles,

4. Añadir 0,5 ml de cultivo del microorganismo testigo.

5. Simultáneamente, se incluyeron tubos conteniendo 5 ml. de agua (como control


de crecimiento) y tubos conteniendo 5% de fenol a diluciones 1/90 y 1/100
(para calcular el coeficiente de fenol).
6. A intervalos de tiempo de 5, 10, 15 minutos, transferir con ayuda de un asa de
siembra a tubos con medio esterilizado (caldo peptonado). A la vez, sembrar en
placas petri con los agares respectivos. Incubar las placas a las temperaturas y
tiempo apropiados.

7. Incubar los tubos de subcultivo a 35 °C.

8. Observar la aparición del crecimiento en los tubos.

9. Luego de cumplirse el tiempo de incubación de las placas, proceder a efectuar


los recuentos respectivos.

RESULTADOS E INTERPRETACION

La máxima dilución del desinfectante que mata el organismo testigo en 10


minutos pero no en 5 minutos se divide entre la máxima dilución de fenol que da el
mismo resultado. El resultado de esta división es el coeficiente de fenol. Los valores
resultantes son comparados con las especificaciones del desinfectante,
proporcionadas por el proveedor. Un elevado coeficiente de fenol indica que el
desinfectante es efectivo.

Ejemplo:
5 min. 10 min. 15 min.

Desinfectante "x" 1/150 + 0 0


Desinfectante "x" 1/175 + + 0
Fenol 1/90 + 0 0
Fenol 1/100 + + 0
Coeficiente de fenol de "x": 150/90 = 1.6

Por otra parte, se deben analizar los resultados de los recuentos en placa en las
distintas diluciones y a los distintos tiempos de exposición. Escoger los valores de
inhibición de crecimiento a la menor dilución del desinfectante y el menor tiempo de
exposición.

MM10.2.2 CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI)

PRINCIPIO
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se define como la mínima
concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un
microorganismo después de 24 horas de incubación a 37°C.
La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros métodos que
evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias inusuales,
da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es
indeterminado.

MATERIALES

130
Conservador o inhibidor a evaluar
Cepa a enfrentar
Tubos de ensayo estériles
Asa de siembra en aro
Agua destilada estéril
Placas petri estériles
Medio de cultivo adecuado a las cepas a utilizar

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. A partir de conservador o inhibidor problema prepara 2 diluciones de


concentración: 10g/L y 1g/L conteniendo 10 000ppm y 1 000ppm de inhibidor.

2. En tubos de ensayos estériles colocar de cada una de las diluciones del


conservador: 1mL, 0.75mL, 0.5mL, 0.25mL y 0.05mL.

3. Con el medio de cultivo adecuado, a las cepas a utilizar, completar los tubos a
volumen de 10mL.

4. Verter el medio de cultivo paso anterior, en placas petri estériles obteniéndose


placas con conservador en concentraciones de 1000, 750, 500, 250, 100, 50,
25, 10 y 5ppm respectivamente.

5. Dejar enfriar y solidificar el agar, luego secar las placas en la estufa.

6. Inocular mediante estrías los microorganismos de ensayos.

7. Incubar las placas estriadas con la cepa a evalúa 35 – 37°C durante 48 horas.

8. Observar si hay o no crecimiento y anotar los resultados.

9. Paralelamente prepara 2 placas control; una de ellas sin conservador (control


negativo) y la otra con 1 ml de conservador y 9mL del medio de cultivo (control
positivo).

LECTURA:

La menor concentración en la que se observa falta de crecimiento de


microorganismos es la concentración mínima inhibitoria.

MM10.2.3 DETERMINACION DEL TIEMPO DE ACCION DE DESINFECTANTES

PRINCIPIO
Los desinfectantes ejercen su acción sobre alguna estructura o algún
mecanismo vital de los microorganismos. La eficacia de un producto desinfectante
depende de la naturaleza del microorganismo, del número de células iniciales, de la
concentración y tiempo de contacto del sanitizante. La concentración requerida para la
efectividad del desinfectante depende de su estructura química, pH, temperatura y
presencia de materia orgánica.
Esta técnica nos permite determinar el tiempo de acción que necesita el
desinfectante en prueba para eliminar los microorganismos evaluados.

MATERIALES

131
Alfileres de acero inoxidable (6)
Cultivo de microorganismo a evaluar
Pinzas estériles
Papel de filtro estéril
Tubos de ensayo
Caldo nutritivo
Agua destilada estéril
Placas petri

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

10. Preparar el cultivo de microorganismo a evaluar en caldo nutritivo, incubar a 35


– 37°C por 24 horas y añadirlo al tubo que contienen los alfileres, por 15
minutos de contactos.

11. Eliminar el caldo de cultivo y depositar los alfileres sobre el papel de filtro
colocado dentro de un placa petri.

12. Secar los alfileres por 30 minutos a temperatura ambiente.

13. Tomar cada uno de los alfileres, con una pinza estéril y depositarlos
independientemente en tubos, los cuales contienen 7 ml de desinfectante.

14. Dejar en contacto los alfileres con el desinfectante por 1,5,10,30 y 60 minutos
(el primer alfiler por 1 minuto, el segundo alfiler por 5 minutos y así
sucesivamente).

15. Al cumplirse el tiempo de contacto eliminar cuidadosamente el desinfectante y


transferir cada alfiler a un tubo con 7ml de agua destilada estéril, dejar en
contacto por 1 minuto.

16. Eliminar el agua y trasvasar los alfileres a tubos con 7ml de caldo nutritivo.

17. Tomar un alfiler de la placa petri y depositar en un tubo con caldo nutritivo,
marcar como control.

18. Incubar los caldos nutritivos que contienen los alfileres a 35 – 37°C durante 48
horas.

19. Observar el crecimiento microbiano y registrar los resultados.

MM10.3 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

PRINCIPIO

La principal flora microbiana de planta está constituida por bacterias Gram


negativas, por lo cual la identificación de microorganismos está principalmente dirigida
a este grupo.

Las identificaciones se realizan mediante el método de API 20E (bioMérieux)


constituido por:
Tiras API 20E conteniendo 20 pruebas separadas en 7 grupos
Cámaras de incubación
Hojas de resultados
Reactivos para algunas pruebas específicas.

132
PRECAUCIONES

- No pipetear las muestras ni los reactivos con la boca.


- Evitar el contacto de los reactivos con la piel, los ojos y la ropa.
- No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad.
- Después de sacarlos de la nevera, esperar que los reactivos alcancen una
temperatura de 20-30°C. Antes de utilizarlos.
- Abrir las ampollas de Reactivos con cuidado. Antes de invertir la ampolla debe
presionarse el tapón para evitar que se derrame el líquido por el exterior.
- Todos los productos inoculados, muestras y cultivos bacterianos deben ser
considerados potencialmente infecciosos y deben por lo tanto ser manipulados
de manera apropiada.
- Todos los productos inoculados, muestras y cultivos bacterianos deben ser
manipulados de manera apropiada por personal calificado.
- Al terminar el test, después de la lectura e interpretación, todas las muestras,
objetos contaminados y productos inoculados deben ser sometidos a autoclave
o sumergidos en fenol al 5% antes de eliminarlos.

CONSERVACIÓN DE LAS GALERIAS

- Las galerías se encuentran en una bolsa de aluminio con bolsitas


deshidratantes.
- Para la apertura de las galerías, cortar justo en la zona de la soldadura,
manteniendo el sobre derecho, para evitar el deterioro de las bolsas de
deshidratante.
- Guardar las galerías restantes y las bolsitas deshidratantes utilizando el
sistema de cierre de la bolsa apretando suavemente y a fondo a lo largo de
toda la apertura.
- Las galerías pueden conservarse así 10 meses después de la apertura del
sobre a 2-8°C o hasta la fecha de caducidad indicada en el envase, si ésta es
anterior.

CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS

- Los Reactivos deben conservarse en la oscuridad a 2-8°C (salvo TDA, VP1 y


NIT1 que se conservan de 2-30°C y Zn que se conserva a 8-30°C) hasta la
fecha de caducidad del envase.
- Después de la apertura (y la transferencia de los Reactivos a los frascos
cuentagotas), los reactivos pueden conservarse 1 mes ó hasta la fecha de
caducidad si ésta es anterior.
- El Reactivo JAMES es muy sensible a la luz: conservar el frasco envuelto en
papel aluminio. Sacar el Reactivo de la nevera solamente para su utilización y
guardar inmediatamente.

PROCEDIMIENTO

- El microorganismo a identificar debe ser primero aislado en medio TSA ó PC.


- Coger el fondo y la tapa de la cámara de incubación y repartir aprox 5 ml de
agua destilada o desionizada para crear una atmósfera húmeda.
- Rotular la cámara con la referencia de la cepa a identificar.
- Sacar la galería de su envase y colocar en la cámara de incubación.
- Con la ayuda de un asa de siembra colocar una colonia bien aislada en un tubo
con 5 ml de solución salina 0.85%.

133
- Homogenizar utilizando el vortex.
- Llenar, con la suspensión bacteriana, los tubos y cúpulas de las pruebas
indicadas dentro de una U, al resto de pruebas llenar sólo los tubos.
- Crear anaerobiosis a los test subrayados, llenando la cúpula con aceite de
parafina estéril.
- Cerrar la cámara de incubación.
- Incubar a 35-37°C durante 18-24 horas.
- Realizar la Lectura de acuerdo a lo indicado en el Manual del API 20 E (Axeno
físicamente a este Manual).
- La Identificación se obtiene a partir del perfil numérico de acuerdo al Manual
del API 20E (Ubicado Físicamente en el laboratorio de Microbiología o al API
WEB stand alone).

MM10.4 PRUEBAS OPCIONALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE


MICROORGANISMOS

COLORACIÓN GRAM

El Objetivo de la ésta prueba es buscar la identificación morfolofica de los


microorganismos, mediante la tinción.

FUNDAMENTO

La coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la


visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y
bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
gram positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl
(Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa
con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya


que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram
positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras
que las gram positivas permanecen violetas.

134
Al término del protocolo, las gram positivas se verán azul-violáceas y las gram
negativas, se verán rojas.

Fundamentos de diferenciación de gram positivo y gram negativo

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes


celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas

La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa
de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el
peptidoglicano (también conocido como mureína).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las gram negativas es delgada, y se


encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición
distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana
exterior está hecha de proteína,fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas


direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo
poseen en mucha mayor proporción que las gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la


membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea. Pero por el contrario, las gram positivas, al poseer una pared celular
más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros,
cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul-violeta.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Colocar sobre una lamina portaobjeto el material a examinar, haciendo uso de un asa
de siembra estéril.
Luego mezclar con 1 ó 2 gotas de Solución fisiológica de cloruro de sodio y se
extiende.
135
Una vez secada al aire se procede a la fijación por calor. Por lo que se pasa 3 veces
lentamente el lado inferior del portaobjeto (la parte de la extensión queda arriba) por la
parte superior de la llama del mechero bunsen. Luego se deja enfriar y se tiñe.

PROCEDIMIENTO

1. Agregar al portaobjeto con la muestra el cristal violeta, cubrir


completamente el portaobjeto, y teñir por 1 minuto, verter el líquido
sobrante.

2. Cubrir completamente el portaobjeto con Lugol y dejar actuar durante 1


minuto.

3. Se decolora con una mezcla de alcohol y acetona (los gram negativos


se decoloran). Realizar enjuagues durante 10-15 segundos hasta que
no se desprendan nubosidades de color y la extensión aparezca azul
gris.

4. Cubrir completamente el portaobjeto con Safranina (colorante de


contraste, que tiñe a los gram negativos), durante 1 minuto.

5. Enjuagar cuidadosamente con agua destilada durante 5 segundos.

6. Secar, observar al microscopio.

PRUEBA DE LA OXIDASA

El Objetivo de la ésta prueba es buscar la presencia de la enzima Citocromo C


Oxidasa

FUNDAMENTO

136
La enzima Citocromo C Oxidasa, se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la
cadena transportadora de e- (electrones). Este se detecta utilizando el tetra para
fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado
por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira
a púrpura.

PROCEDIMIENTO

Para la determinación de citocromo oxidasa en los microorganismos utilizamos tiras de


reacción Bactident - oxidasa (Merck), a partir de una placa con la bacteria problema
tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en las tiras. Tras unos 30
segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio
oxidativo.

Se considera positiva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.

CONSERVACIÓN DE LAS TIRAS Bactident - oxidasa (Merk)

- Las tiras son almacenadas en lugar fresco y seco a 2-8°C.

PRECAUCIONES

- No se debe tocar la zona de reacción y sacar solamente las tiras a usar.


- Utilizar las tiras dentro de la fecha de vencimiento.
- Tomar con un asa de siembra estéril una colonia bien aislada de TSA ó PC y
colocarlo sobre la zona de reacción de la tira.
- Esperar de 20-60 segundos y comparar con la escala de colores.
- Determinar si se trata de una colonia oxidasa positiva (cambio de color a lila o
púrpura) u oxidasa negativa (sin cambio de color).
- Las Instrucciones de uso de las tiras de reacción están anexadas físicamente a
este Manual.

PRUEBA DE LA CATALASA

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

FUNDAMENTO

137
El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa.
Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la
producción de la enzima catalasa

H2O2 -> H2O + ½ O2

PROCEDIMIENTO

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de


ensayo previamente esterilizado a continuación tomamos una muestra de la cepa del
microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra
solamente debe acercarse a la muestra de la solución líquida de peróxido de
hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

PRUEBA DE LA COAGULASA

FUANDAMENTO

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. El objetivo


es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan
con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero
Staphylococcus.

PROCEDIMIENTO

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazón) y 0,3 ml. de
plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya
contiene cepas de St. aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo
llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15
minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no organizados

2: pequeños coágulos organizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.


138
Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

MM11.- MANEJO DE DESECHOS DE LABORATORIO

Una vez que la muestra es analizada, se procede al descarte del mismo.

Materias Primas y fabricaciones

Las muestras son recogidas en bolsas, correctamente selladas y eliminadas en el


contenedor de basura para Residuos industriales.

Producto Terminado

En el caso de producto terminado, primero se realiza el vaciado de los productos


en una bolsa, se sella y descarta en el contenedor de basura para residuos
industriales. Seguidamente se procede a la rotura de frascos, se colocan en otra
bolsa, se sella y se descarta en el contenedor de basura para plásticos.

Material Biológico Contaminado

En el caso de tener muestras, productos terminados o medios de cultivo


contaminados, se procede a la esterilización en autoclave (121°C durante 30
minutos). Luego se procede a la eliminación en bolsas selladas y eliminarlas en el
contenedor de basura para residuos industriales.

Envases
139
Todo envase de plástico o vidrio debe ser roto antes de proceder a la eliminación
en el contenedor de basura para plástico o para vidrio respectivamente

Nota:

1. Para el caso de Placas Petri (plástico) descartables se retirar el agar


con ayuda de una espátula, éste es colocado dentro de una bolsa de
plástico y desechar en el contenedor de basura para residuos
industriales. Seguidamente se procede a la rotura de las placas, se
colocan en otra bolsa, se sella y se descarta en el contenedor de basura
para plásticos.

2. En el caso de tener Placas Petri (plástico) descartables con muestras


contaminadas, se procede a la esterilización en autoclave (121°C
durante 30 minutos). Luego se procede a la eliminación del agar en
bolsas selladas y desechar en el contenedor de basura para residuos
industriales. Seguidamente se procede a la rotura de las placas, se
colocan en otra bolsa, se sella y se descarta en el contenedor de basura
para plásticos.

3. Para el descarte de los indicadores biológicos, se someten a


esterilización en autoclave a 121°C por 30 minutos.

4. Para el caso de pipetas (plástico) descartables una vez culminado el


análisis se procede a descartar en el contenedor de basura para
plásticos.

5. En el caso de tener pipetas (plástico) descartables con muestras


contaminadas, se procede a la esterilización en autoclave (121°C
durante 30 minutos). Luego se procede a descartar en el contenedor de
basura para plásticos.

140