190

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
“CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DEL GEN DE K-CASEÍNA EN

RAZAS DE GANADO BOVINO”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
PRESENTA
I.B.Q. VÍCTOR INOCENCIO PACHECO CONTRERAS
REYNOSA, TAMPS. NOVIEMBRE, 2010

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
“CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DEL GEN DE K-CASEÍNA EN

RAZAS DE GANADO BOVINO”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
PRESENTA
I.B.Q. VÍCTOR INOCENCIO PACHECO CONTRERAS
REYNOSA, TAMPS. NOVIEMBRE, 2010

“Caracterización de las variantes del gen de K-caseína en razas de ganado bovino”
AGRADECIMIENTOS
Le doy gracias a Dios por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo.
A la Dra. Ana María Sifuentes Rincón por su apoyo constante e incondicional, por su
paciencia en su asesoría y la confianza que depositó en mí para desarrollar este trabajo.
A la comisión revisora de tesis, Dra. Ana María Sifuentes Rincón, Dr. Gaspar Manuel
Parra Bracamonte, Dr. Javier Rosales Alday, M.C. Cristian Lizarazo Ortega y al Dr.
Víctor Ricardo Moreno Medina por su disponibilidad y sus observaciones acertadas que
hicieron mejorar este trabajo.
A mis compañeros de generación, Lupita, Samanta, Perla, Eliseo, Dr. Cerezo, Luis,
Paco, Salvador, Alfonso, Camilo, por sus experiencias, conocimientos y amistad dentro
y fuera del salón de clases, les deseo un rotundo éxito en todo lo que emprendan.
A mis compañeros de laboratorio de Biotecnología Animal Dra. Ana, Dr. Manuel, M.C.
Xochitl, M.C. Williams, Brenda, Carmen, Perla, Diana, Sojan, Denisse, Gisela, Luis,
Rey David, Breidy, por su apoyo y asesoría incondicional en cuestiones prácticas y
teóricas que favorecieron a mejorar mi formación profesional y por todos aquellos
momentos de convivencia y alegría.
Al Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, por abrirme

sus puertas y poder ampliar mi conocimiento en el campo de la ciencia mediante todos
los medios necesarios otorgados para lograrlo.
Al Dr. Juan Carlos Martínez González y al Dr. Gaspar Manuel Parra Bracamonte, por su
asesoría en el análisis de los datos.
Agradezco a CONACYT, Becas PIFI, GRUPO FINANCIERO SANTANDER,

FORDECYT, ICEST, quienes en su momento me brindaron el apoyo para hacer mi
Maestría.
A cada uno de los académicos, quienes con paciencia supieron compartir sus
experiencias y conocimientos que encaminaron a mejorar nuestra formación profesional.
“Muchas gracias”
V
DEDICATORIAS
Dedico este trabajo a mis padres

Eliseo Pacheco Cruz y María Natividad Contreras Osorio, quienes supieron comprender
mi deseo de continuar estudiando y por la fortaleza que me brindaron en cada momento
de la maestría.
A mi hermano Rolando y a la memoria de mi hermano Roberto,

para mis hermanas, Sinfo, Águeda, Yola, Paula, Cata, Vicky y Mary quienes nunca
dejaron de motivarme para alcanzar esta meta más de mi vida y a cada uno de mis
sobrinos.
A Cliz, Mary, Eliseo, Belinda, Josafath, Thamar, Matías, Gris, Chuy,

Rigo, Esther, Elvia, Ginette, Cheli, Llallita, Yuri, Rosita, Elim, Melina, Iran David, por
la amistad especial que me han dado y el cariño que les tengo.
A cada uno de mis amigos de San Peter, Puebla, Toño, Leo,

Javier, Luis, Peluchin, Etó, Erick, Manolo, Pavel, Tury, Hugo, Omar, Mariony, Monss,
gracias por su amistad y todos aquellos momentos de convivencia.
Y muy especialmente dedico este trabajo a una mujer tan especial en mi vida,
Gaby; gracias por brindarme tu apoyo, tu tiempo, por escucharme y comprenderme,
agradezco a Dios por darme la oportunidad de conocerte.
VI
ÍNDICE
Sección Página
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ V
DEDICATORIAS ....................................................................................................... VI
LISTA DE CUADROS ................................................................................................. X
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI
LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA ................................................. XIII
RESUMEN................................................................................................................XVI
ABSTRACT ............................................................................................................ XVII
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES ..................................................................................................... 3
2.1. La ganadería bovina ............................................................................................ 3

2.2. Ganado bovino con orientación a producción de carne ...................................... 3
2.3. Ganado bovino con orientación a producción de leche ...................................... 5
2.4. Ganado bovino en sistemas de producción de doble propósito .......................... 6
2.5. Mejoramiento genético........................................................................................ 7
2.6. Mejoramiento genético en ganado bovino .......................................................... 8
2.6.1. Estrategias para la selección artificial en ganado bovino............................. 8
2.6.1.1. Selección tradicional ............................................................................. 8
2.6.1.2. Selección por pedigrí............................................................................. 9
2.6.1.3. Selección por prueba de progenie ......................................................... 9
2.6.1.4. Evaluaciones génicas ............................................................................ 9
2.7. Selección asistida por marcadores genéticos .................................................... 10
2.8. La leche como alimento y materia prima .......................................................... 12
2.9. Composición de la leche ................................................................................... 12
2.10. Marcadores asociados a la calidad de la leche ................................................ 14
2.11. Gen K-caseína (CSN3).................................................................................... 18
3. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 23
VII
4. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 24
4.1. Objetivos específicos ........................................................................................ 24
5. HIPÓTESIS .............................................................................................................. 24
6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 25
6.1. Origen del material biológico ........................................................................... 25

6.2. Genotipificación de las nueve variantes del gen K-caseína .............................. 27
6.2.1. Extracción del ADN ................................................................................... 27
6.2.2. Cuantificación del ADN genómico ............................................................ 28
6.2.3. Diseño de la estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína
.............................................................................................................................. 28
6.3. Análisis estadístico ............................................................................................ 32
6.3.1. Cálculo de frecuencias ............................................................................... 32
6.3.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg................................................................... 32
6.3.3. Análisis de asociación ................................................................................ 33
7. RESULTADOS ........................................................................................................ 34
7.1 Diseño de estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína ........ 34
7.2 Genotipificación de las poblaciones de estudio ................................................. 34
7.2.1 Formación de los cluster A y B ................................................................... 34
7.2.2 Diferenciación de las variantes del cluster A .............................................. 37
7.2.3 Diferenciación de las variantes del cluster B .............................................. 40
7.3. Frecuencias genotípicas y alélicas .................................................................... 42
7.3.1. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Carora ................... 42
7.3.2. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Gyrholando ........... 42
7.3.3. Frecuencias genotipos y alélicas en la población Charolais ...................... 43
7.4. Análisis de asociación del genotipo sobre PD205 ............................................ 44
8. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 45
8.1. Tipificación de las variantes del gen CSN3 ...................................................... 45

8.2. Análisis de frecuencias ...................................................................................... 46
8.2.1. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población de Carora
.............................................................................................................................. 46
VIII
8.2.2. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población

Gyrholando ........................................................................................................... 47
8.2.3. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Charolais
.............................................................................................................................. 49
8.3. Análisis de asociación de las variantes del gen CSN3 ...................................... 50
9. CONCLUSIONES ................................................................................................... 52
10. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 53
11. REFERENCIAS ..................................................................................................... 54
12. GLOSARIO ........................................................................................................... 68
APÉNDICES ................................................................................................................ 71
IX
LISTA DE CUADROS
Cuadro Página
1 Principales variantes de los genes de caseína asociados a rasgos de

productividad…………..…………………………………………………..... 17
2 Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las variantes del gen CSN3…... 19
3 Iniciadores y tipos de ensayos para la detección de nueve variantes del

gen CSN3……………………………………………………………………. 30
4 Muestras de tres poblaciones bovinas agrupadas en el cluster A y B………. 34
5 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Carora………………….. 42
6 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Gyrholando……………. 43
7 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Charolais……………….. 43
8 Medios de cuadrados mínimos para el efecto del genotipo sobre características

de crecimiento.……………………..…………………………………………. 44
X
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Principales estados productores de ganado bovino de carne en

México………………………………………………………………………. 4
2 Principales países productores de leche bovina en 2006……………………. 5
3 Composición de la leche en ganado bovino………………………………… 13
4 Estructura del locus de genes que codifican a las proteínas de caseína……... 15
5 Organización estructural de unidad transcripcional de CSN3………………. 18
6 Diseño de iniciadores para detección de SNP………………………………. 29
7 Estrategia basada en PCR-RFLP, para la determinación simultanea de nueve

variantes del gen K-caseína…………………………………………………. 35
8 Resultado de la amplificación por PCR de la población Charolais…………. 36
9 Patrones de la digestión con Hind III y Taq I……………………………….. 36
10 Análisis de la variante E…………………………………………………….. 37
11 Confirmación de la variante E por secuenciación………………………….... 38
XI
12 Análisis de un heterocigoto para la variante H determinado por

secuenciación………………………………………………………………… 38
13 Patrón de digestión con Alu I para determinar la variante I………………..... 39
14 Patrón de digestión con Hae III para determinar la variante J………………. 40
15 Patrón de digestión con Fok I para determinar la variante C………………... 41
16 Análisis por secuenciación para determinar la variante C…………………... 41
XII
LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA
˃ Mayor que
˂ Menor que
% Porciento
± Más o menos
°C Grados centígrados
µl Microlitro
µM Micromolar
A Adenina
AI Inseminación artificial
BLUP Best linear unbiased prediction
C Citosina
Da Dalton
DEP Diferencia esperada en la progenie
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTPs Desoxirribonucleotidos trifosfatados
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
G Guanina
GLM General Lineal Models (Modelos lineales generales)
HW Equilíbrio de Hardy-Weinberg
IFE Isoelectroenfoque
XIII
Kb Kilobase
Kg Kilogramo
MALDI-MS Espectrofotometría de masa-Desorcion/ionización mediante

laser asistida por matriz
SAM Selección asistida por marcadores
MgCl2 Cloruro de magnesio
min Minuto
ml Mililitro
mM Milimolar
NOM Norma oficial mexicana
OMTE Ovulación múltiple y transferencia de embriones
p/v Peso/volumen
pb Pares de bases
PCR-ACRS Creación de sitios de restricción artificial basada en la reacción

en cadena de la polimerasa
PCR-RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción basada en la

reacción en cadena de la polimerasa
PCR-SSCP Polimorfismos de conformación de cadena simple basada en la

reacción en cadena de la polimerasa
PD205 Peso ajustado a los 205 días
pH -log [H+]
QTLs Loci de rasgos cuantitativos
QTNs Nucleótidos de rasgos cuantitativos
RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiencia en fase reversa
rpm Revoluciones por minuto
s Segundo
XIV
SGE Electroforesis en gel de almidón
SNPs Polimorfismo en un solo nucleótido
S-S Enlace disulfuro
SSA Secretaría de salud y asistencia
T Timina
Taq ADN polimerasa Thermus aquaticus
U Unidad
UV Ultravioleta
X Por
χ2 Chi cuadrada
XV
RESUMEN
La ganadería bovina es una de las actividades productivas más desarrolladas y

practicadas en México, generando dos productos básicos para la dieta del hombre: carne
y leche. Actualmente, los mercados de estos productos exigen criterios de calidad
nutricional y sanitaria, entre otros. El contenido proteico en la leche ha sido considerado
como buen indicador para incidir en su calidad, y en ganado de carne; la producción de
leche es uno de los principales factores involucrados en la habilidad materna que afecta
la eficiencia productiva de las crías. De las proteínas de la leche, la K-caseína es muy
importante ya que tiene variantes que se han asociados a producción y contenido
proteico, dos de las características deseables en la industria láctea. El objetivo del
presente trabajo fue caracterizar las variantes alélicas del gen K-caseína y determinar su
efecto sobre rasgos productivos en poblaciones de la raza Carora, Gyrholando y
Charolais, para lo cual se diseñó una estrategia basada en PCR-RFLP y en algunos casos
PCR-ACRS para caracterizar las nueve variantes de K-caseína. La estrategia se optimizó
y aplicó para tipificar tres poblaciones de ganado bovino con diferente fin productivo.
En Carora las frecuencias alélicas fueron de 0.41 y 0.59 para los alelos A y B
respectivamente, en Gyrholando fueron 0.83, 0.13, 0.02 y 0.01 para los alelos A, B, E y
H respectivamente, y en Charolais fueron 0.40 y 0.60 para las variantes A y B,
respectivamente. Se realizó un análisis de asociación entre las variantes encontradas en
la raza Charolais y el peso al destete ajustado a 205 días, encontrando que el genotipo
favorable BB ejerce un efecto significativo para peso al destete ajustado. En la población
Carora y Gyrholando no se realizó este análisis por falta de datos productivos. La
aplicación de la estrategia de detección para las nueve variantes del gen de K-caseína
permitirá evaluarlas y definir su efecto sobre la calidad de la leche en ganado bovino.
XVI
ABSTRACT
The cattle producction system, is one of the activities most deloveped and
extended througrout México, providing two basic products for the human diet: meat and
milk. Upto date, the markets for these products require have nutritonal quality and health
criteria, among others. High protein content in milk has been considered as a good
indicator of quality and in beef cattle, the milk production is one of the main factors
involved in maternal ability that affects offspring productive efficiency. Among the milk
proteins, the K-casein is very important because it has variants that have been associated
to production and protein content, two of the desirable characteristics in the dairy
industry. The aim of this study was characterize the allelic variants of K-casein gene and
determine its effect on productive traits in populations of Carora, Gyrholando and
Charolais cattle, for which was designed a strategy based on PCR-RFLP and PCR-
ACRS in some cases, to characterize the nine variants of K-casein. The strategy was
optimized and applied to genotyping three populations of cattle with different productive
purposes. In Carora breed, the allelics frequencies were of 0.41 y 0.59 for A and B
alleles, respectively; in Gyrholando breed were 0.83, 0.13, 0.02 and 0.01 for A, B, E and
H alleles, respectively; and in Charolais breed, were 0.40 and 0.60 for A and B alleles,
respectively. Asociation analysis was performed between the variants of K-casein found
in Charolais breed and adjusted weaning weight to 205 days, finding that the BB
favorable genotype had significant effect on ajusted weaning weight. In Carora and
Gyrholando populations were not performed the asociation analysis due to lack of
productive data. The implementation of the strategy for detection of nine variants of K-
casein gene will allow evaluate and define its effect on milk quality in cattle.
XVII
1. INTRODUCCIÓN
El cambio de vida que experimentó el hombre con el paso de la vida nómada al

sedentarismo, hace aproximadamente 10,000 años; le permitió desarrollar actividades
que llevaron a la domesticación de especies vegetales y animales, dando lugar a la
agricultura y la ganadería, respectivamente (Jann et al., 2004; Hocquette y Gigli, 2005).
En la actualidad, la ganadería en México, es una de las actividades más

desarrolladas y practicadas, ocupa más del 50% de la superficie nacional, para la cría de
bovinos en sistema extensivo, donde 32 millones de cabezas de ganado bovino
aproximadamente, son explotados en este sistema. La ganadería es fuente principal de
alimento, empleo, vestido y entretenimiento. En México la ganadería contribuye con el
18% y 33% de leche y carne respectivamente de la producción total dentro del sector
agropecuario y es considerada como una de las principales actividades productivas en la
población rural (Magaña et al., 2006).
El poco desarrollo de la ganadería en México, se ha asociado a diversos factores

como el financiamiento, infraestructura, la escasa aplicación tecnológica dentro de los
sistemas de selección y mejoramiento genético de hatos para una mayor producción,
limitándose al empleo de estrategias tradicionales (Pereda et al., 2005; Gallardo et al.,
2006; Romero et al., 2009).
Como resultado de las investigaciones científicas, actualmente se cuenta con

estrategias que tienen como objetivo aumentar el rendimiento y efectividad de la
producción, y estas incluyen desde una alimentación adecuada, estrategias de mercadeo,
tratamiento del animal hasta, el mejoramiento genético asistido por marcadores (SAM)
(Cunningham y Meghen, 2001; Dekkers y Hospital, 2002; Van Eenennaam, 2006;
Canizal y Rivera, 2007). El SAM consiste en la selección de animales que son
portadores de genes o variantes génicas que les permitirán un desempeño favorable en
rasgos productivos de interés.
1
Debido a que la producción y el contenido proteico de la leche, en ganado

lechero han sido considerados uno de los principales objetivos de mejora, se han
realizado estudios encaminados a la búsqueda de genes asociados al contenido proteico
en leche (Lara et al., 2002; Matějíček et al., 2007; Rachagani y Dayal, 2008, Dogru y
Ozdemir, 2009). El gen K-caseína, ha sido ampliamente estudiado, se han descrito nueve
variantes, siendo las variantes A y B, las más frecuentemente reportadas en ganado
bovino. La variante B, es la de mayor interés debido a que se ha asociado a resistencia
térmica, menor tiempo de coagulación, mejor formación del cuajo y diferentes tamaños
de micelas, características favorables para la industria de quesos (Azevedo et al. 2008).
Gracias a la gran cantidad de estudios, sobre el efecto de estas variantes en

características productivas es bien conocido en ganado lechero y en algunos países ya
representa un criterio de selección (Lunden, 2005; Octaviano et al., 2005; Rachagani y
Dayal, 2008; Azevedo et al., 2008; Comin et al., 2008; Dogru y Ozdemir, 2009). Sin
embargo, su efecto en razas de ganado con otro fin productivo no ha sido estudiado. En
ganado de carne, la habilidad materna es uno de los principales factores que afecta la
eficiencia productiva y siendo la producción de leche un componente importante de la
habilidad materna, por lo tanto; podría ser importante evaluar si existe alguna asociación
entre los genotipos de las variantes de caseína con el desempeño materno en ganado
bovino de carne y doble propósito.
2
2. ANTECEDENTES
2.1. La ganadería bovina
La explotación del ganado bovino constituye la mayor parte de la producción

pecuaria a nivel mundial, gracias a la característica particular de su sistema digestivo,
que permite transformar su alimento en proteínas, necesarias para la dieta del hombre,
que son adquiridos a través de la carne y leche, (Cruz, 2006). La explotación del ganado
bovino se ha logrado con la implementación de tres sistemas de producción: de carne,
leche y un tercero llamado de doble propósito, aprovechando en esta último, la carne y
leche.
2.2. Ganado bovino con orientación a producción de carne
En México el ganado bovino destinado a producción de carne, representa la

principal actividad del sector pecuario y la más practicada en áreas rurales, ocupando el
53.7% de los 200 millones de hectáreas del territorio nacional (Osuna, 2002).
Entre los principales estados productores de ganado bovino de carne, se

encuentra Veracruz con un promedio de 440 mil toneladas, que representa el 14.2% de
la producción total en México, seguido de Jalisco con 350 mil toneladas con el 11.3%, y
Chiapas con 190 mil toneladas representando el 6.3%. Los estados de Baja California,
Sinaloa y Sonora representan el 13.6%. Todos ellos representan el 45.4% de la
producción nacional, mientras que el 54.6% está dividida entre el resto de los estados del
país (Figura 1).
3
Vercruz
14.20%
Jalisco 11.30%
Resto del país

54.60% Chiapas 6.30%
Baja california
4.60%
Sinaloa 4.50%
Sonora 4.50%
Figura 1. Principales estados productores de ganado bovino de carne en México

(FUENTE: DGEAPEAS, 2009)
El mejor desarrollo del ganado bovino orientado a producción de carne, se logra

con los sistemas de manejo semi-intensivo e intensivo, donde la combinación del
suplemento alimenticio, y el confinamiento por un periodo de tiempo (90 días) permiten
que el animal adquiera una mayor ganancia de peso, obteniendo como subproductos
vaquillas o becerros en pie o la carne de bovino en canal para su venta o exportación
respecto al manejo extensivo donde la alimentación básica es el pastoreo y por ende su
actividad constante para conseguirlo, limitan su buen desarrollo(DGEAPEAS, 2009).
La producción de ganado en pie o en canal, son las dos principales actividades

que generan divisas en la ganadería bovina de carne. En el periodo 2000-2008, se ha
incrementado la producción, alcanzando una tasa media de crecimiento anual (TMCA)
de 1.89 y 2.12 % de ganado en pie y en canal respectivamente. La exportación de
animales en pie, oscila en 1.5 millones de cabezas al año. Por otro lado, el proceso de
engorda del animal, finaliza con su sacrificio, obteniendo de esta manera la carne en
canal y su destino al mercado para su comercialización (DGEAPEAS, 2009)
4
2.3. Ganado bovino con orientación a producción de leche
El inventario de ganado lechero asciende a 2 966 117 cabezas de ganado,

representando el 12.72% del total del hato ganadero bovino (SIAP, 2008).
En el año 2006, se registró una producción de más de 10 mil millones de litros,

alcanzando un incremento de 126.2 millones de litros respecto a la producción reportada
en 2004. Estas cifras posicionan a México en el lugar número 15 de los principales
países productores de leche a nivel mundial (Figura 2) (SAGARPA, 2007). Los sistemas
de producción lechera se clasifican en seis regiones: 1) la Laguna (Coahuila y Durango),
2) el Bajío (Guanajuato, Michoacán, Querétaro, y parte de Jalisco), 3) Altos de Jalisco-
Zacatecas-Aguascalientes, 4) Chihuahua, 5) Puebla-Tlaxcala y 6) México-Hidalgo. Las
regiones 1 y 3 son las principales productoras, aportando un 10.5 y 17.5%
respectivamente (Améndola et al., 2005.).
Australia 10.3 México 10

países bajos 10.5
Italia 11
Polonia 12
Ucrania 13 EUA 82.5
Nueva Zelanda
14.5
Reino Unido 14.6
India 39.8
Francia 24.2
China
32.2
Brasil 25.3
Alemania 28.5 Fed. Rusa 31.1
Figura 2. Principales países productores de leche bovina en 2006 (millones de

toneladas) (FUENTE: SAGARPA, 2007)
5
2.4. Ganado bovino en sistemas de producción de doble propósito
El sistema de producción de bovinos de doble propósito (SPBDP), utiliza razas

Bos indicus y sus cruzas con Bos taurus, y tiene dos objetivos fundamentales, la
producción de leche que se obtiene con ordeña manual y con el apoyo del becerro que
estimula el descenso de la leche, y la producción de carne mediante la cría de becerros al
destete y el recambio o desecho de bovinos para el abasto de carne (Vilaboa-Arroniz,
2009). El SPBDP es el más importante en el trópico de México, con 64% de los
productores practicándolo (Pérez et al., 2001). En México, el inventario de ganado de
doble propósito asciende a 2 466 477 cabezas de ganado, representando el 10.6% del
total del hato ganadero (SAGARPA, 2007). El factor económico en este sistema
depende de la producción de leche pero también de su producción de carne (Lacayo,
2008).
La eficiencia reproductiva depende del intervalo entre partos, con promedio de

447 días; en cambio en vacas de doble propósito es mayor a 490 días, mediante
amamantamiento tradicional, donde el becerro permanece con su madre por 5 a 8 horas
después del ordeño (Pérez et al., 2001). El amamantamiento retrasado por 8 horas
después del ordeño reduce en 21 días el periodo parto-primera ovulación, logrando la
ovulación en los primeros 100 días de posparto alcanzando una mayor probabilidad que
las vacas queden premiadas (Pérez et al., 2001). Los becerros ganan 200-250 g/día de
peso sin afectar la producción de leche ni el peso corporal de la vaca (Pérez et al., 2001).
En México las principales razas de doble propósito están constituidos

primordialmente por cruzas Bos taurus y Bos indicus en diferentes proporciones, las
razas más empleadas son: Pardo Suizo, Holstein y Simmental con Cebú (Arellano et al.,
2006, Vilaboa-Arroniz, 2009). Las principales entidades que cuentan con este sistema de
producción son: Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Campeche, Quintana Roo, Yucatán,
San Luis Potosí, Guerrero, Oaxaca y Chiapas (Arellano et al., 2006; Vilaboa-Arroniz, et
al., 2009).
6
2.5. Mejoramiento genético
El objetivo principal, de todo ganadero es implementar estrategias para mejorar

el desempeño productivo, rendimiento y eficiencia de sus animales, lo que permite
obtener productos en cantidad y calidad. La implementación de programas de
mejoramiento genético contribuye a alcanzar este objetivo. Esta actividad ha sido
practicada desde la domesticación del ganado bovino, mediante la selección tradicional
basada en la diferencia de rasgos fenotípicos del animal (Van Eenennam, 2006). El
mejoramiento genético es la aplicación de la información biológica, económica y
matemática para incrementar el merito del animal a favor de una característica de interés
(productivo, reproductivo o estético) seleccionándola para su mayor rendimiento y
eficiencia (Montaldo y Barría, 1998; Dekkers y Hospital, 2002; Ravagnolo et al., 2005;
Hocquette et al., 2006).
La evaluación de mediciones fenotípicas y pedigrí del animal, es y será

información fundamental, para el mejoramiento animal. La selección intra-razas, inter-
razas y la práctica de cruzamientos, son las tres formas en que se logra el mejoramiento
animal además de conocer la estructura genética de la raza. Su aplicación es de acuerdo
a la característica de interés, objetivo para la conservación o propagación en la
población, controlando costos y la consanguinidad en su implementación (Montaldo y
Barría, 1998).
Se han desarrollado diferentes métodos para el mejoramiento genético, que

favorecen la evaluación genética y distribución del material genético seleccionado.
Dentro de estas tecnologías reproductivas se encuentran la inseminación artificial (AI),
la ovulación múltiple y transferencia de embriones (OMTE), la fertilización in vitro de
embriones, así como el uso de marcadores moleculares (Huanca, 2001; Phillips, 2001;
Ball y Peters, 2004; Keith, 2004; Van Eenennaam, 2006).
7
2.6. Mejoramiento genético en ganado bovino
La selección y los sistemas de apareamiento son la base fundamental del

mejoramiento genético animal. Una selección exitosa, se basa en el conocimiento de los
parámetros genéticos, como la heredabilidad, varianza genética y correlación genética
del rasgo de interés, así como también en identificar que animales poseen los mejores
valores genéticos y como estos pueden ser apareados para aumentar la frecuencia de los
alelos deseados en la progenie, lográndose el mérito genético deseado (Montaldo y
Barría, 1998; VanRaden, 2004; Dekkers y Hospital, 2002; Parra et al., 2005; Visscher et
al., 2008)
2.6.1. Estrategias para la selección artificial en ganado bovino
La selección consiste en determinar que individuos conformaran la base de

progenitores de un hato ganadero. Existen dos tipos de selección: la natural y la
artificial. La primera se define como cambios genéticos producidos por la fuerza de la
evolución en los seres vivos generando cambios graduales anatómicos y fisiológicos,
hasta la creación de nuevas especies (Warwick y Legates, 1992; Rodero y Herrera, 2000;
Majarrez, 2001). La selección artificial por su parte, es controlada por el hombre, y
considera dos aspectos importantes, la selección de reemplazos y la eliminación de
animales no deseados (Warwick y Legates, 1992; Rodero y Herrea, 2000; Perfectti, et
al., 2009).
Algunas de las estrategias empleadas dentro de la selección artificial son:
2.6.1.1. Selección tradicional
Esta estrategia se basa principalmente en la observación de los atributos físicos y

características biológicas del animal candidato a ser parental de la siguiente generación,
las principales características que se toman en esta estrategia son: aplomos,
temperamento, salud, metabolismo, color y pigmentación, las cuales no son
cuantificables y se basan principalmente en el conocimiento, la experiencia y la
8
percepción individual de cada ganadero, esto conlleva a resultados en tiempos

prolongados, sin embargo su aplicación ha sido base en los sistemas de mejoramiento
animal (Vergara y Truffer, 2004; Van Eenennaam, 2006).
2.6.1.2. Selección por pedigrí
La población bovina puede ser clasificada en animales reproductores (registros

de pedigrí) y productores. El pedigrí de un animal es el historial de las características
productivas de sus antepasados o emparentados, lo cual predice el mérito real del animal
a seleccionar con el fundamento de que las características heredables provienen de sus
parentales (http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1012.pdf; SENAFAD,
1985, Warwick y Legates, 1992).
2.6.1.3. Selección por prueba de progenie
La aplicación de esta estrategia, permite evaluar el genotipo de un animal con

base a rasgos cuantitativos de su progenie (Ochoa, 1991; Warwick y Legates, 1992). Su
éxito radica en que haya un número adecuado de animales sometidas a la prueba, por lo
tanto el costo y el tiempo necesario para realizarla, son las principales limitaciones que
resultan de su implementación.
Sin embargo, comparado con la estrategia de selección tradicional genera un

resultado favorable cuando se considera rasgos que pueden ser medidos a gran escala,
por ejemplo la producción y concentración proteica de la leche (Lunden, 2005;
Ciappesoni et al., 2009).
2.6.1.4. Evaluaciones génicas
Las evaluaciones genéticas dependen de la información generada en las pruebas

de progenie. El ganadero busca la certeza de la predicción de características productivas
y reproductivas de los individuos que adquiere para el reemplazo de su hato ganadero.
9
Esta respuesta puede ser obtenida mediante modelos estadísticos que permiten
determinar el valor genético de los animales considerando datos productivos,
morfológicos, genealógicos, influencias ambientales y la variabilidad genética (Ramírez-
Valverde et al., 2008).
El Valor Genético Esperado (VGE) y Diferencia Esperada en la Progenie

(DEP=1/2 VGE) son la estimaciones más precisas del valor genético del animal para
rasgos de importancia económica. Son resultados de evaluaciones que se hacen con las
bases de datos donde se tiene integrada la información de pedigrí, sistemas de control y
registros de producción. La interpretación y la aplicación son relativamente fáciles
durante su implementación, como respuesta permite estimar el desempeño futuro de la
progenie y además facilita la diferenciación de individuos dentro de una raza para un
rasgo especifico (Dekkers y Hospital, 2002; Ciappesoni et al., 2009;
http://www.limousinmexico.com/DOCS/INTERPRETACION%20DE%20EVALUACI
ONES%20GENETICAS%20EN%20BOVINOS%20DE%20CARNE.pdf). En países
productores de carne como Australia, Canadá y Estados Unidos, han obtenido grandes
beneficios con su implementación (Massmann, 2004).
Los DEP´s, son obtenidos por modelos mixtos usando el Mejor Predicción Lineal
no Sesgada (BLUP, por sus siglas en ingles), metodología que permite estimar los
diferentes efectos fijos y aleatorios, que actúan simultáneamente en un rasgo específico
considerando el parentesco y los factores ambientales. El avance en programas
computacionales, ha logrado simular el intercambio genético natural de una población y
la implementación de programas de mejoramiento para sugerir las mejores cruzas que
deben realizarse (Kinghorn, 1999 citado por De la Rosa, 2003).
2.7. Selección asistida por marcadores genéticos
El amplio desarrollo y la implementación de la biotecnología en las diferentes

áreas biológicas incluyendo la industria pecuaria, ha permitido caracterizar la
variabilidad genética presente en la secuencia de DNA de los animales, lográndose tener
10
una mejor comprensión de la relación del genotipo y el fenotipo observado (Casas,

2002; Dekkers y Hospital, 2002; http://www.ias.ac.in/currsci/oct25/articles19.htm). La
aplicación de la selección asistida por marcadores (SAM por sus siglas en inglés) ha
contribuido al incremento de la productividad en la ganadería. En el SAM, se integra la
información genética molecular, considerando el modelo infinitesimal y el desequilibrio
de ligamiento de los marcadores, (Dekkers y Hospital, 2002; Van Ennennaam, 2004;
Dekkers, 2005).
La mayoría de los rasgos seleccionados son rasgos cuantitativos, es decir son el

resultado de la influencia de varios genes y factores ambientales. La arquitectura
genética de las características cuantitativas, es complejo y conocer el número de genes
que participan en la variación genética, es realmente complicado. La caracterización de
los genomas con diferentes tipos de marcadores moleculares como microsatélites y
polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs por sus siglas en inglés) ha permitido
identificar QTL´s (loci de rasgos cuantitativos) y de mayor especificidad QTN´s:
(nucleótidos de rasgos cuantitativos) asociados a rasgos cuantitativos complejos o
costosos de medir (resistencia a enfermedades), y de baja heredabilidad como
fecundidad, eficiencia reproductiva, producción de leche, habilidad materna y
características de crecimiento, que son de gran interés económico y otras con alta
heredabilidad, como las propiedades organolépticas, la calidad y rendimiento de la canal
en la cual es necesario sacrificar al animal para medirlos (Casas, 2002; Casas et al.,
2003; Dekkers y Hospital, 2002; Deyoung y Honeycutt, 2005; Casas, 2006; Van
Eenennaam et al., 2006; Allan y Smith, 2008).
La información que genera un marcador genético, refuerza la decisión para

seleccionar animales altamente productivos, ya que animales que heredan el marcador,
también heredan los efectos positivos asociados a ella (Dekkers, 2004; Naqvy, 2007). El
amplio estudio de los marcadores genéticos, ha permitido definir su efecto positivo sobre
diferentes rasgos de interés económico, independientemente del grupo racial o genético.
11
En el caso particular del ganado lechero, los polimorfismos del gen K-caseína,
son ampliamente empleados por tener gran influencia en las propiedades de la leche en
cuanto al proceso de manufactura de productos lácteos (Farrel, 2004; Azevedo et al.,
2008).
2.8. La leche como alimento y materia prima
La leche es un fluido biológico complejo de color blanquecino opaco con alto

valor nutricional, producida en las glándulas mamarias de los mamíferos (NOM-184-
SSA1-2002; Phadungath, 2005). La leche es la fuente única de alimento para los
becerros y para todo mamífero recién nacido, pues en ella encuentra elementos
esenciales para su crecimiento y desarrollo como proteínas, minerales, carbohidratos,
ácidos grasos y vitaminas (Figura 3) (Rijnkels, 2002; Usme-Ciro et al., 2004;
Phadungath, 2005; Kamiński et al., 2007; Requena et al., 2007). La leche además de ser
considerada como alimento, es la materia prima principal para la elaboración de una
gran cantidad de derivados lácteos. La calidad de los productos derivados de bovinos
depende de la integración de factores entre los cuales se encuentran la seguridad, rasgos
sensoriales y nutricionales, posibilidad de seguir al producto desde su origen
(trazabilidad) y características de su producción (Hocquette y Gigli, 2005).
2.9. Composición de la leche
La proteína es el componente más valioso de la leche, constituye el 3.5% del

total de los compuestos (Figura 3), su concentración y composición varia durante la
lactación y el tipo de raza (Agudelo y Bedoya, 2005). La capacidad de unirse a fosfato
de calcio permite la formación de complejos coloidales, llamados micelas de caseína, y
gracias al medio ácido del estómago, son coagulados y aprovechados por el organismo
de cualquier mamífero recién nacido y durante su infancia. (Rijnkels, 2002; Kamiński et
al., 2007). En la leche hay dos principales grupos de proteínas: caseínas y proteínas
séricas o proteínas del suero de la leche, constituyendo el 80 y 20% respectivamente.
12
Proteínas 3.5 Lípidos 4.8

Carbohidratos 3.7
Vitaminas y
minerales 0.7
Agua 87.3
Figura 3. Composición de la leche en ganado bovino (FUENTE: Usme-Ciro, et al.,

2004).
La caseína es una sustancia orgánica nitrogenada producida en las células de las

glándulas mamarias, cuyas moléculas poseen el elemento fósforo, de color amarillento
sin sabor ni olor e insoluble en agua se encuentran asociadas a calcio. Se obtienen por la
precipitación de las proteínas con agentes coagulantes biológicos (quimosina, pepsina) o
químicos (acido clorhídrico) (a un pH de 4.6 a 20 °C) que rompen el enlace químico
(Rijnkels, 2002; Requena et al., 2007). En el periodo de lactancia, inicia la agregación y
asociación de las caseínas en partículas esféricas, llamadas; micelas de caseína de
estructura sólida y esponjosa formada por un 92% de caseína y un 8% de sales
(principalmente fosfato de calcio en su estado coloidal) (Ferrandini et al., 2006). La
proporción de K-caseína varía en relación inversa con el tamaño de la micela, mientras
que la de β-caseína lo hace en forma directa (Ferrandini et al., 2006). La posición de K-
caseína en la periferia de la micela de caseína, ejerce un efecto en la regulación del
tamaño y mantenimiento de la suspensión de las caseínas de la leche (Ferrandini et al.,
2006).
13
Las caseínas se han agrupado en αs1-caseína (CSN1S1), αs2-caseína (SCN1S2),

β-caseína (CSN2) y K-caseína (CSN3) además de γ-caseína (γ-CN) la cual se encuentra
en menor proporción, y se deriva de la degradación de β-caseína (CSN2) (Bawden y
Nicholas, 1999; Farrell, 2004; Balteanu et al., 2008). Las proteínas de caseína se
caracterizan por la gran cantidad de variantes genéticas que se han descrito así como a la
presencia de un número variable de serin-fosfato, residuos de grupos propilo,
exponiéndose a un número mayor de procesos de fosforilación y modificación de la
estructura respectivamente (Phadungath, 2005; Ferrandini et al., 2006; Kamiński et al.,
2007).
Las proteínas séricas o proteínas del suero de la leche, son proteínas sensibles al
calor, se desnaturalizan fácilmente y se vuelven insolubles después del tratamiento
térmico. Hay dos principales tipos, α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina, el resto en
menor proporción conformado por albúminas del suero, inmunoglobulinas, peptonas
proteasas, enzimas y proteínas con funciones metabólicas específicas como lisozimas y
lactoferrina (Phadungath, 2005; Ferrandini et al., 2006; Kamiński et al., 2007).
2.10. Marcadores asociados a la calidad de la leche
Muchos de los productos lácteos derivados del ganado bovino, dependen de las
propiedades de la proteína de la leche (Phadungath, 2005), su concentración es
considerada como buen indicador para incidir la calidad de la leche; por lo tanto,
mejorar esta característica se ha convertido en uno de los objetivos de mejora del hato
ganadero. Una alimentación apropiada de los animales favorece la producción óptima de
leche, pero limita la variación de su composición, debido a que intervienen factores
ambientales aunado a la composición genética del animal (Requena et al., 2007). La
mayoría de los aspectos de la calidad de la leche pueden estar afectados en cierto grado
por los genes, ya que la mayoría de ellos están asociados a características cuantitativas.
Por lo tanto, la búsqueda de genes asociados a rasgos de calidad de la leche es uno de los
objetivos principales para el mejoramiento de esta característica (Kamiński, 2004;
Lunden, 2005.)
14
Los genes que codifican a las proteínas de caseína se localizan en el cromosoma

6q31-33 en un locus de 250 Kb y están organizados en forma de cluster en el orden; αs1-
caseína, β-caseína, αs2-caseína y K-caseína (Figura 4), La orientación transcripcional va
en el sentido 5´ a 3´, excepto β-caseína, que lo hace en sentido 3´ a 5´ (Jann et al., 2004;
Kamiński, 2004; Azevedo et al., 2008).
Figura 4. Estructura del locus de genes que codifican a las proteínas de caseína.
(FUENTE: Bawden and Nicholas, 1999)
La secuenciación de genes de caseínas en varias especies, han clasificado en dos

grupos: caseínas sensibles a calcio y las que están físicamente y funcionalmente ligados
a ella. Los genes CSN1S1, CSN2 y CSN2S2 están relacionados evolutivamente y se
localizan en una región de 140 Kb y pertenecen al primer grupo mientras que el gen
CSN3 corresponde al segundo y se localiza en una región de 70 kb. El mapeo físico ha
revelado que el orden y orientación de los genes de caseínas son conservadas en varias
especies. El gen CSN3 es altamente conservado en humanos, bovinos, ratón y rata. Esto
puede ser explicado ya que las caseínas sensibles a calcio provienen de un mismo gen
ancestral que reclutaron exones que codifican elementos necesarios para estas proteínas
que funcionan como nutrientes y transportadores de minerales. De la misma manera
pasó con el gen ancestral de CSN3 para participar en la solubilización de las caseínas.
Otra explicación, particularmente para CSN2, su origen parte de mecanismos similares
de genes en respuesta inmunológica que fueron evolucionando para ofrecer elementos
nutricionales y modular la actividad inmune (Rijnkels, 2002; Rijnkels et al., 2003).
15
Como se muestra en el cuadro 1, los genes del locus de las proteínas de caseína,
se han estudiado en diferentes especies domésticas y en particular en el ganado bovino;
se han descrito variantes alélicas de cada uno de los genes que se han asociado a
diferentes rasgos de la calidad de la leche, que incluyen desde los productivos hasta los
relacionados con aspectos sanitarios del animal y de salud en el humano (Rijnkels, 2002;
Kamiński et al., 2007; Keating et al., 2008; Azevedo et al., 2008).
16
Cuadro 1. Principales variantes de los genes de caseína asociados a rasgos de productividad.

Gen Núm. De Principales Posición de Genotipo Asociación a rasgos cuantitativos Razas en donde se ha
variantes variantes aminoácidos estudiado
14-26 Eliminación
192 Glu Producción de proteínas en suero de
A AB la leche
B 53 Ala
αs1-caseína 8 59 Gln BB Elaboración de quesos
(CSN1S1) 192 Glu BC Holstein
Jersey
C 192 Glu CC Tiempo de coagulación
Contenido d proteína en leche
A1 67 His A1A3 Producción de proteína en el suero de

la leche
β-caseína 12 A2 67 Pro A2A3
(CSN2) 137/148 Leu /Pro Mayor producción de proteínas en Holstein
A3 leche
106 Gln A3B
B Mayor firmeza en formación del
122 Arg BB cuajo
Menor tiempo de coagulación
33 Gln
αs2-caseína A 47 Ala
(CSN1S2) 130 Thr Hay poca evidencia que las variantes de éste gen tenga Western
4 alguna asociación. El efecto antibacteriano es la principal Cebú
33 Gly asociación que se ha encontrado.
C 47 Thr
130 Ile
AA Mayor producción de leche Holstein

A 136 /148
K-caseína Thr/Asp
(CSN3) 9 Tamaño de micelas
BB Tiempo de coagulación en la Holstein
B 136/148 AB elaboración de quesos Jersey
Ile/Ala BC Producción de leche y suero de la
leche
17
2.11. Gen K-caseína (CSN3)
El papel importante que desempeña el gen K-caseína en la regulación del tamaño

de las micelas y en mantener en suspensión las caseínas en la leche, han sido el principal
motivo de su amplio estudio en razas lecheras. El producto de este gen constituye el
12% de las caseínas presentes en leche bovina, su tamaño es de 13 Kb y está formado
por cinco exones y cuatro intrones (Figura 5). La proteína tiene un peso molecular de
19,037 Da., y contiene 169 aminoácidos: Asp4, Asn8, Thr15, Ser12, Ser P1, Pyroglu1,
Glu12, Gln14, Pro20, Gly2, Ala14, Cys2, Val11, Met2, Ile12, Leu8, Tyr9, Phe4, Lys9, His3,
Trp1. y Arg5 (Farrel et al, 2004).
Figura 5. Organización estructural de unidad trascripcional de CSN3. Las barras

abiertas representan intrones. Las cajas de mayor tamaño y de color gris representan
exones (extremo 5´y 3´región no traducida), la caja oscura (parte del exón que codifica
el péptido señal) y cajas coloreadas (exones que codifican proteínas). Los tamaños de los
exones esta dado en pb, el número superior de cada caja; indica el número del exón.
La caracterización de sus polimorfismos ha permitido deducir su gran influencia

en las propiedades de la leche para la industria quesera. En la actualidad se han
caracterizado nueve variantes del gen K-caseína (A, B, C, E, F, G, H, I y J) (Cuadro 2) y
la mayoría de los estudios de tipificación mediante las técnicas de PCR-RFLP
(polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción basada en la reacción en cadena
de la polimerasa) y PCR-SSCP (polimorfismos de conformación de cadena simple
basada en la reacción en cadena de la polimerasa) han sido dirigidos hacia la
caracterización de la variante A y B encontrando una alta frecuencia en su segregación.
La diferencia de la variante A y B, es la sustitución de treonina por isoleucina en el
aminoácido número 136 y la sustitución de ácido aspartico por Alanina en la posición
148 respectivamente (Cuadro 2) (Neeling, 1964; Woychik, 1964; Schmidt, 1964;
MacKinlay y Wake, 1964 citados por Formaggioni et al., 1999)
18
Cuadro 2. Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las variantes del gen CSN3.
Polimorfismos Posición y cambio de aminoácidos en la proteína Método Raza o especie Referencia

10 36 97 104 130 135 136 148 148a-151a* 155 Stop (Lugar de estudio)
Arg Pro Arg Ser Pro Thr Thr Asp Ser Bos taurus: Neeling, 1964
A CGC CCT CGT TCA CCT ACC ACC GAT AGC TAA SGE pH Holstein MacKinlay y Wake, 1964
Ile Ala alcalino (Canadá, Australia, USA) Woychik, 1964, 1965
B ATC GCT
Bos taurus: Di Stasio y Merlin 1978, 1979
C His Ile Ala SGE a pH 8.6 . Gris alpina Mariani , 1983
CAT ATC GCT . Brown
(Italia)
Bos taurus: Erhardt y Senft, 1989
E Gly IEF . Angler Erhardt, 1989
GGC . Alemán rojo
. Alemán blanco
(Alemania)
Bos taurus: Ikonen, et al., 1996
F His Val PCR . Yakut Sulimova et al., 1992
CAC GTT (Rusia)
. Finnish Ayrshire
(Finlandia)
Bos taurus:
G Cys Ile Ala IEF-PAGE a . Pinzgauer (Alemania, Erhardt,1996
TGT ATC GCT pH 8.9 Austria)
. Bos grunniens Sulimova, et al., 1996
PCR (Rusia)
Bos indicus:
Ile Hidrólisis .Madagascan zebú
ATC tríptica (Madagascar) Grosclaude et al., 1974
H . Bos taurus: Pinzgauer
SSCP (Austria, Alemania) Prinzemberg y Erhardt, 1998
. Bos taurus x Bos
indicus Prinzemberg et al., 1999
I Ala Bos taurus x Bos indicus Prinzenberg y Erhardt, 1998
GCA SSP Prinzenberg, et al., 1999
Hidrólisis
Ile Ala Arg tripitica Bos taurus: Mahé, et a,. 1999
J ATC GCT AGA IEF Baoulé
RP-HPLC (Costa de marfil, Burkina
MALDI-MS Faso)
Yak * Leu Arg Ala Ala-Ser-Pro-Glu TGA SSCP Bos Grunniens Prinzenberg, et al., 1999
CTT CGT GCT CGTTCTCCAGAA Yak
*Dos polimorfismos, nombrados tipo 1 y 2 fueron revelados en Yak, la diferencia observada es el codón de stop, además presentan el codón (ACC)
en la posición 136 y (GCT) en 148 que codifican a treonina y alanina en la variante A y B, respectivamente, en bovinos. La posición de la
duplicación está indicada en 148a-151a, aunque podría ser desde 147a-151a.
19
Las variantes génicas de K-caseína, han mostrado ejercer un efecto en las

propiedades de la leche, especialmente en la tecnología de quesos (Lara et al., 2002;
Naranjo et al., 2007; Azevedo et al., 2008). La alta frecuencia del alelo B respecto al
alelo A, explica la mayor proporción de K-caseína en la leche (Vann Eenennaam y
Medrano, 1991). El alelo B, ha sido asociado a la resistencia térmica, menor tiempo de
coagulación, mejor cuajo y tamaño de micelas, cualidades óptimas para la industria de
quesos (Azevedo et al., 2008).
El genotipo BB es mayor respecto al genotipo AA, generando micelas de caseína

de menor tamaño, lo que contribuye a la formación de un cuajo más firme y mayor
retención de sólidos obteniendo alto rendimiento en la industria láctea (Requena et al.,
2007).Se ha encontrado que en animales con genotipo BB se obtiene una mayor
producción de quesos respecto al genotipo AA (Azevedo et al., 2008).
En Canadá, Australia y EUA, se llevó a cabo la caracterización de las variantes

A y B con muestras de ganado Holstein mediante el método Electroforesis en gel de
almidón (SGE por sus siglas en ingles) a pH alcalino y con el uso de sustancias
(mercaptoetanol) que rompen el enlace di-sulfuro (S-S), (MacKinlay y Wake, 1964;
Grosclaude, 1988; Levéziel et al,. 1988; Woychik, 1965 citados por Formaggioni et al.,
1999). Estudios posteriores encontraron que la variante A prevalece en la mayoría de las
razas lecheras del genero Bos taurus y Bos indicus a excepción en la raza Jersey en la
cual la variante B es la que predomina (Farrel et al., 2004) la primera ha sido asociado a
mayor producción de leche y la segunda a mayor contenido proteico.
El uso del mismo método pero en condiciones ácidas fue caracterizado la

variante C en razas Gris Alpina Italiana (Merlin y Di Stasio, 1982; Fornaggioni et al.,
1999), ésta misma fue encontrada también en ganado Brown Italiano (Formaggioni et
al., 1999). La determinación de una nueva variante nombrada como D en ganado
Simmental alemán fue confirmada por isoelectroenfoque (IEF) encontrando que es
idéntica a la variante C. Este resultado descarta a D, ser una variante más del gen CSN3;
la diferencia de C respecto a las variantes A y B, es que en la posición 97 presenta una
20
sustitución de Arginina (Arg) por Histidina (His), esta conformación posiblemente sea la
responsable del efecto negativo sobre el tiempo de coagulación del cuajo (Miranda et al.,
1993; Plowman et al., 1997; Smith et al., 1997 citados por Formaggioni et al., 1999).
La variante E fue caracterizada por isoelectroenfoque en la raza alemana Friesian

rojo y blanco (Erhardt y Senft, 1989; Erhardt, 1989 citados por Formaggioni et al.,
1999), y se ha encontrado que ejerce un efecto desfavorable en la calidad de la leche
(Ikonen, et al., 1997 citado por Matějíček et al., 2007). La caracterización de la variante
F fue hecha por PCR en la raza Yakut de origen ruso (Sulimova et al., 1992 citado por
Formaggioni et al., 1999), su estructura primaria reveló una sustitución de Asp por Val
en la posición 148 (Sulimova, 1998 citado por Formaggioni et al., 1999), esta variante
también lleva una segunda sustitución aminoacídica de Arg por His en la posición 10.
La variante G presenta dos cambios nucleotídicos, el primero nombrado como G1

se debe a una sustitución de Arg por Cys en la posición 97, fue encontrada por
isoelectroenfoque en las razas Pinzgauer de Austria y Alemania (Erhardt, 1996 citado
por Formaggioni et al., 1999) y la segunda denominado como G2, se debe a una
sustitución Asp por Ala en la posición 148 fue caracterizada por PCR en Yak (Bos
grunniens, Sulimova et al., 1996 citados por Formaggioni et al., 1999).
El cambio aminoacídico de Ile por Thr en la posición 135 encontrado en la raza

Madagascan zebú (Bos indicus) reveló ser una nueva variante (Grosclaude et al., 1974
citado por Formaggioni et al., 1999) el mismo cambio fue encontrado en la raza
Pinzgauer (Bos taurus) (Prinzenberg y Erhardt, 1998 citados por Formaggioni et al.,
1999). Este cambio fue confirmado por la técnica SSCP en razas Pinzgauer revelando la
presencia de heterocigotos (AH y BG) y por secuenciación de muestras homocigotas de
Brahman y heterocigotas de Pinzgauer revelaron una sustitución de A/T (transición) en
el segundo nucleótido del codón 135 (Ile/Thr), este cambio fue denominado como
variante H (Prinzenberg et al., 1999).
21
La caracterización de la variante I fue hecha con muestras Brahman x Simmental

mediante la clonación de productos de PCR, el análisis por SSCP y por secuenciación, el
64% (16 de 25) de las clonas positivas de PCR secuenciadas revelaron la sustitución
nucleotídica T/G (transversion) en la posición 104 generando un cambio de Ser por Ala
con respecto a la variante A (Prinzenberg et al., 1999). La variante J es la última que ha
sido caracterizada mediante la aplicación de diferentes métodos, desde una hidrólisis
(con carboxipeptidasa), cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-
HPLC), Isoelectroenfoque, MALDI-MS, PCR hasta la secuenciación. La variante J
presenta una sustitución en el tercer nucleótido de C/A (transversión) en el codón 155
generando un cambio aminoacídico de Serina por Arginina, respecto a la variante B
(Mahé et al,. 1999).
Un incremento de 0.08% más de proteínas, mayor contenido en sólidos totales,

menor tiempo de coagulación, mejor consistencia del cuajo, mayor estabilidad al calor y
a la congelación, son efectos positivos encontrados en leche de animales con genotipo
homocigoto BB del gen CNS3 que se traduce en un rendimiento del 5 al 10 % más en la
producción de quesos respecto a la leche de aquellos animales con genotipo homocigoto
AA, que producen 173 kg más de leche (Van Eenennaam y Medrano, 1991; Barroso et.
al., 1998; Lara et al., 2002; Satyanarayana y Dayal, 2008; Matějíček et al., 2007;
Requena et al., 2007; Azevedo et al., 2008; Aranguren et al., 2008). El bajo número de
estudios de caracterización de las otras siete variantes han limitado asociarlos con alguna
característica de producción, reproducción y estética (Prinzenberg et al., 1999).
Los estudios de genotipifiación y efectos de las variantes del gen CSN3 han sido
dirigidos principalmente en razas lecheras, ignorando por completo el efecto que pueden
ejercer en ganado de carne y de doble propósito donde la producción de leche es el
componente básico de la habilidad materna, siendo esta, el principal factor para medir la
eficiencia productiva, y la capacidad que tiene la vaca durante la gestación,
amamantamiento, cuidado hasta el destete del becerro. La caracterización completa de
las nueve variantes del gen de CNS3, en el ganado bovino reforzaría las decisiones en
los programas de selección y mejoramiento genético animal.
22
3. JUSTIFICACIÓN
En México la ganadería bovina es la principal actividad en el sector

agropecuario, su aprovechamiento se ha realizado con los tres sistemas de producción
que se practican, ganado bovino destinado a producción de carne, leche y doble
propósito. Sin embargo, su crecimiento ha sido paulatino ya que aun se perciben grandes
volúmenes de importaciones de productos derivados del ganado bovino, material
genético y la escasa aplicación de estrategias de mejoramiento genético animal.
En la actualidad el mejoramiento genético animal como alternativa para

aumentar el rendimiento productivo y reproductivo, está cobrando gran auge en la
actividad pecuaria. El uso de marcadores moleculares para caracterizar genes asociados
a rasgos productivos ha permitido la identificación temprana de individuos portadores de
alelos favorables para características de importancia económica. En ganado lechero las
variantes de los genes de caseína han sido asociadas a calidad y rendimiento de leche. Su
efecto ha sido muy estudiado y en algunos países representa ya un criterio de selección y
mejoramiento genético animal.
La influencia del gen K-caseína en razas de ganado con orientación a producción

de carne y de doble propósito no ha sido estudiada. Por lo tanto es importante evaluar si
existe alguna asociación entre los genotipos de las variantes de K-caseína con el
desempeño materno (habilidad materna) en ganado bovino de carne y doble propósito.
23
4. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar las variantes alélicas del gen K-caseína y determinar su grado de

asociación sobre rasgos productivos en ganado bovino.
4.1. Objetivos específicos
1) Diseñar y optimizar una estrategia para la determinación de nueve

variantes del gen K-caseína.
2) Genotipificar la población seleccionada para determinar las frecuencias

alélicas y genotípicas del gen K-caseína.
3) Realizar el análisis de asociación entre los genotipos y rasgos productivos

de la población bajo estudio.
5. HIPÓTESIS
La presencia de las variantes alélicas del gen K-caseína en ganado bovino, ejerce
un efecto sobre sus rasgos productivos.
24
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Origen del material biológico
Para el presente estudio se analizaron muestras de tres poblaciones de las razas

bovinas, Gyrholando, Charolais y Carora, provenientes del estado de Tamaulipas,
Sonora y de Venezuela, respectivamente. La población del ganado Charolais es
reconocida como raza cárnica mientras que Gyrholando y Carora son utilizados en
sistemas de doble propósito.
El análisis en la raza Gyrholando se realizó a partir de muestras de animales del

rancho ganadero las Vegas, ubicado en el municipio de Aldama, Tamaulipas. Se
recolectaron muestras de sangre de 8 machos reproductores y 33 hembras en tubos
vacutainer® de 5 ml con anticoagulante EDTA, previamente identificados con el
numero de arete del individuo, las muestras se conservaron en refrigeración a 4 °C, hasta
su procesamiento.
El análisis en la raza Carora y Charolais, se llevó a cabo con el material genético

disponible en el banco de ADN del laboratorio de Biotecnología Animal del Centro de
Biotecnología Genómica. Se evaluaron 35 individuos: 22 machos y 13 hembras de la
raza Carora, provenientes de la Asociación Venezolana de Criadores de Ganado Carora
(ASOCRICA), quienes desde el año 1992 han implementado sistemas de mejoramiento
genético sobre la producción de leche en un ambiente tropical. Para la raza Charolais, se
analizaron 105 toretes candidatos a sementales de un año en promedio, estos animales
fueron sometidos a pruebas de comportamiento en dos periodos (verano de 2008 e
invierno de 2009). Todos estuvieron bajo regímenes basados en dietas isoprotéicas e
isocalóricas, el confinamiento y siete días de adaptación, fueron las características
fenotípicas consideradas durante la prueba. Se registraron cuatro tipos de características
fenotípicas en esta raza: 1) Conformación, 2) Crecimiento, 3) Ultrasonografía en tiempo
real y 4) Reproducción.
25
Para el presente, trabajo se consideraron únicamente las siguientes características

de crecimiento.
a) Peso al nacimiento (PN, kg). Es un indicador de evaluación que infiere el

desarrollo durante la gestación y es afectado por los factores que influyen sobre
la madre en ese periodo. Algunos de estos son época de nacimiento, la edad de la
madre, sexo del becerro, manejo y características de la raza. El peso al
nacimiento se recomienda pesar al becerro máximo a las 24 horas después del
nacimiento (Domínguez, 2010).
b) Peso al destete ajustado a los 205 días (PD205, kg). Es una medida para
evaluar la capacidad lechera, la habilidad materna de las vacas y el potencial que
tiene el becerro para ganar peso de una manera rápida y eficiente. El efecto del
peso al destete puede ser causado también por factores no genéticos (factores
ambientales), por esta razón es necesario realizar ajustes a estos factores
(Domínguez, 2010).
26
6.2. Genotipificación de las nueve variantes del gen K-caseína
6.2.1. Extracción del ADN
La extracción del ADN genómico se realizó únicamente con las muestras de

sangre de la raza Gyrholando, pues de las otras dos razas se contaban con el material
genético en el banco de ADN del laboratorio, siguiendo el protocolo estandarizado de un
estuche comercial de purificación Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega,
Inc.) (Apéndice A y cuadro A1). En tubos eppendorf de 1.5 ml se agregaron 300 μl de
sangre y 900 μl de solución lisis I (155 mM de Cloruro de amonio (NH4Cl); 0.5 mM de
EDTA, 10 mM de Bicarbonato de sodio, pH 7.4). La muestra se mezcló por inversión de
manera suave e incubando durante 15 min en hielo, transcurrido este tiempo se procedió
a centrifugar a 2 000 rpm por 5 min. El sobrenadante se descartó por decantación y se
agregó 900 μl de solución lisis I, se incubó por 5 min en hielo y posteriormente se
centrifugó a 2 000 rpm por 5 min, este procedimiento se repitió hasta obtener una
pastilla blanca compuesta de leucocitos que fue resuspendida en 300 μl de solución lisis
nuclear mezclando por inversión hasta disolver la pastilla y se llevó al vortex para su
agitación por 20 s.
Posterior a esto, se agregó un volumen de 100 μl de solución de precipitación de

proteínas y se agitó al vortex por 20 s y se centrifugó a 2000 rpm por 5 min. El
sobrenadante se transfirió a otro tubo limpio con un volumen de 300 μl de isopropanol,
se mezcló y centrifugó descartando el sobrenadante por decantación, posteriormente se
adicionó 300 μl de etanol al 70% y fue centrifugado de 13 000 a 16 000 x g, por 20 s. El
sobrenadante de etanol fue eliminado por aspiración y se dejo secar la pastilla en el
equipo Concentrador Centrivac por 30 min. Finalmente el ADN, fue rehidratada con 50
μl de agua mili Q estéril mediante agitación suave en el termomixer por una hora a 65
°C. Las muestras fueron almacenadas en refrigeración a 4 °C hasta su procesamiento.
27
6.2.2. Cuantificación del ADN genómico
La cuantificación se realizó en gel de agarosa al 1.2% peso/volumen, utilizando

como estándar de referencia concentraciones conocidas del bacteriófago lambda (25, 50
y 100 ng de ADN). Se tomaron 5 μl de ADN genómico de cada una de las muestras y
mezclando con 5 μl de Sybr gold (SYBR® GOLD Nucleic Acid Gel Stain, Augene, OR,
USA). El volumen total de la mezcla fue depositada en los carriles del gel
respectivamente. De manera semejante, se hizo con el marcador ʎDNA para cada una de
las concentraciones indicadas. Las muestras se separaron por electroforesis aplicando un
voltaje de 80 a 100 volts por 30 min. La visualización y cuantificación de las muestras se
realizó en el fotodocumentador Kodak Digital Science mediante el programa Gel-
Imagen de Kodak Digital Science 3.0.2.
6.2.3. Diseño de la estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína
En este estudio, se diseñó una estrategia para la caracterización de las nueve

variantes del gen K-caseína en bovinos, basada en la técnica de PCR-RFLP a partir de la
amplificación de un fragmento de 550 pb que comprende las diferentes mutaciones del
gen K-caseína empleando iniciadores F-KCAS (5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´) y
R-KCAS (5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´), reportados por Prinzemberg et
al., (2008). La estrategia se basó en el diseño de ensayos de PCR-RFLP para ello fue
necesario la búsqueda de enzimas de restricción que permitieran la discriminación
alélica de cada una de las variantes del gen K-caseína, para lo cual se realizaron
digestiones virtuales de la secuencia de cada variante alélica utilizando el programa
NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/), algunas consideraciones que se
tomaron en cuenta para la selección de la enzima fueron la disponibilidad y además del
costo de la enzima.
En algunos casos, fue necesario aplicar la estrategia de ACRS la cual permite la

creación de sitios de restricción que permita identificar las variantes alélicas de un SNP
(Figura 6).
28
En estos casos para el diseño de los iniciadores se utilizó el programa WatCut

(http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=snp_new), tomando como
referencia la secuencia reportada del locus del gen K-caseína, tomada del GenBank
(NCBI: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/]), con el número de acceso X14908
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=X14908).
Alelo normal Alelo mutado

* *
ADN molde 5´tttaTcAtttatggccattccaccaaag3´ 5´tttaGcTtttatggccattccaccaaag3´
* *
Iniciador 5´gaaaataccggtaaggtggtttTc3´ 5´gaaaataccggtaaggtggtttTc3´

antisentido mutado
* *
Secuencia 5´tttaTcTtttatggccattccaccaaag3´ 5´tttaGcTtttatggccattccaccaaag3´

del producto
de PCR Ausencia del sitio Presencia del sitio
de restricción para Alu I de restricción para Alu I
AG´CT
Figura 6. Diseño de iniciadores para Sitiodetección
de restricciónde SNP.
de Alu I Estrategia para el diseño de
iniciadores creando el sitio de restricción del SNP, para la enzima Alu I.
En del
_ Posición el SNP
cuadro 3 se resumen las características de los ensayos para la detección de
* Sitio
cada de modificación
variante del gendeK-caseína.
la secuencia del iniciador
29
Cuadro 3. Iniciadores y tipos de ensayos para la detección de nueve variantes del

gen CSN3.
Tamaño
Variante Posición del Iniciadores del Tipo de ensayo
cambio AA producto
de PCR
A 136 Thr F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 550 pb PCR-RFLP

148 Asp R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´ (Hind III/Taq I)
B 136 Ile F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 550 pb PCR-RFLP

148 Ala R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT 3´ (Hind III/Taq I)
C 97 His F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 324 pb PCR-ACRS

136 Ile RCR-5´- ATGATAAATGTGGGTGTGGGGGA-3´ (Fok I)
148 Ala
E 155 Gly F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 550 pb PCR-RFLP

R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´ (Hae III)
F 10 His F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 550 pb PCR-RFLP

R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3´ (Rsa I/Hha I)
G 97 Cys F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 438 pb PCR-ACRS

135 Ile RGHM 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´ (Mnl I)
H 135 Ile F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 438 pb PCR-ACRS

RGHM 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´ (Mnl I/Fok I)
FGF 5´- AAGCCCAGCCAACTACCATGGGA-3´ 274 pb
R-KCAS 5´- CAGTGCTCTCTACTGCTTCGGAG-3´
I 104 Ala F-KCAS 5´- AGAAATAATACCATTCTGCAT-3´ 344 pb PCR-ACRS

RI 5´- CTTTGGTGGAATGGCCATAAAAG-3´ (Alu I)
J 155 Arg FJH3 5´- GCTTCTCCAGAAGTTATTGAGGG-3´ 98 pb PCR ACRS

R-KCAS 5´- GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGA-3´ (Hae III)
Teniendo los iniciadores diseñados, se procedió a la optimización de las

condiciones y perfiles de amplificación (Apéndice A y cuadro A2, A3). Todas las
reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 μl, utilizando 0.1 U de
Taq DNA polimerasa, 0.4mM de dNTPs y 0.5μM de cada iniciador. La concentraciones
finales de MgCl2 fue de 1.5 mM, con excepción de las amplificaciones de las variantes C
y H donde se uso 2.5.
30
Los perfiles de amplificación para todas las variantes se basaron en la técnica

“Touch Down”, empleando las siguientes temperaturas: 95 °C durante 5 min por un
ciclo para la desnaturalización, el alineamiento se inicio con 62 °C disminuyéndose 2 °C
durante los primeros 5 ciclos por 45 s cada ciclo hasta alcanzar una temperatura de
alineamiento de 55 °C, manteniéndose por 30 ciclos y una extensión final de 72 °C
durante 10 min por un ciclo. Los productos fueron almacenados en refrigeración a 4 °C
hasta su procesamiento.
El análisis de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1.5%

(Apéndice A y cuadro A6) utilizando para la visualización el fotodocumentador de luz
UV (Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 Kodak Digital Science)
mediante el programa Gel-Imagen de Kodak Digital Science 3.0.2.
Una vez verificada la amplificación, los productos de PCR, se sometieron a

digestión con la enzima diagnóstica para cada variante (Cuadro 3) utilizando las
condiciones de digestión especificadas por la casa comercial de cada enzima.
Dependiendo del patrón de digestión esperado, la separación de los patrones de
restricción se realizó en geles de agarosa al 2.5% o bien geles de Nussieve al 4.5%
(Apéndice B), iniciando con 35 volts para finalmente mantener a 50 volts por 6 a 8
horas.
31
6.3. Análisis estadístico
6.3.1. Cálculo de frecuencias
Las frecuencias genotípicas y alélicas de las variantes del gen K-caseína en las
tres poblaciones de estudio, fueron estimadas con la siguiente ecuación (Falconer y
Mackay, 2001).
p = 2P + H = P + ½H
2N N
q = H + 2Q = ½ H + Q
2N N
Donde:
P=AA, H=AB y Q= BB
Bajo el supuesto de un gen con dos alelos (A, B).
6.3.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg
El análisis de frecuencias genotípicas bajo los supuestos del equilibrio genético

de Hardy-Weinberg y la comparación entre los grupos genotípicos se realizó mediante la
prueba exacta de Fisher, de acuerdo a la frecuencia mínima en cada genotipo (ƒpi ˂ 5
para prueba exacta de Fisher; donde pi es la frecuencia del iésimo alelo en un locus)
empleando el programa Genepop (Raymond and Rousset, 1995)
32
6.3.3. Análisis de asociación
El análisis de asociación entre las características productivas y los genotipos

identificados, se realizó únicamente en la población Charolais, las dos poblaciones
restantes no fueron contempladas por falta de datos productivos.
En la raza Charolais, el análisis de asociación se realizó con características de

crecimiento, que es donde se espera evaluar la influencia de las variantes del gen K-
caseína. Las variables fueron ajustadas en un análisis lineal general conforme al modelo
siguiente:
Yijk = μ + Gi.+ CEj.+ Ɛijk

Donde:
Yijk = PD205, PN
μ = Media general
Gi = Efecto fijo del i-ésimo de los genotipos de K-caseína (i= AA, AB, BB)
CEj = Efecto fijo del j-ésimo de los campos experimentales
Ɛijk = Error aleatorio asociado al muestreo
Los modelos empleados para el análisis de asociación fueron ajustados utilizando

el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS (2002). La estimación de las medias
de cuadrados mínimos, la comparación de medias y nivel de significancia (p<0.05) de
las variables se realizó con método de mínima diferencia significativa del paquete
estadístico SAS (2002).
33
7. RESULTADOS
7.1 Diseño de estrategia para caracterizar nueve variantes del gen K-caseína
La estrategia establecida consistió en la amplificación inicial del segmento de

550 pb que contiene todos los polimorfismos que dan lugar a las nueve variantes del K-
caseína. El producto es inicialmente cortado con las enzimas de restricción Hind III y
Taq I, las cuales dan lugar al agrupamiento de las variantes en lo que se denominó
Cluster A (variante A, E, F, G, H, I) y el cluster B (B, C y J) como se muestra en la
figura 7, la discriminación entre las variantes de cada cluster de las tres poblaciones bajo
estudio, se realizó empleando diferentes ensayos basados en RFLP y ACRS.
7.2 Genotipificación de las poblaciones de estudio
7.2.1 Formación de los cluster A y B

Todas las muestras de las tres poblaciones bajo estudio fueron amplificadas con
los iniciadores para generar el fragmento de 550 pb (Figura 8), el cual posteriormente
fue digerido por las enzimas Hind III y Taq I (Figura 9 a y b). Esto dio como resultado el
agrupamiento de las muestras de cada población en cada cluster (Cuadro 4).
Cuadro 4. Muestras de tres poblaciones bovinas agrupadas en el cluster A y B.

Raza Total de muestras Muestras en el Muestras en el
Cluster A Cluster B
Gyrholando 41 30 11
Carora 35 4 31
Charolais 105 15 90
34
550 pb
5´ 3´
Hind III F-KCAS R-KCAS Taq I
M ND A B C E F G H I J M ND A B C E F G H I J
600 pb 600 pb
550 pb 550 pb
451 pb 418 pb
200 pb 200 pb
132 pb
99 pb
Cluster A (pb)
Variante
Rsa I/Hha I (550) Hae III (550) Mnl I Fok I (274 pb) Alu I (344)
A 367 143 40 330 220 425 13 274 204 140

E 330 145 75
F 407 143
G 438 240 34
H 438
I 204 117 23
Cluster B (pb)
Variante
Hind III (550) Taq I (550) Hae III (98) Fok I (324)
B 451 99 418 132 75 23 324

C 451 99 418 132 286 38
J 451 99 418 132 98
Figura 7. Estrategia basada en PCR-RFLP para la determinación simultanea de nueve variantes del gen K-caseína.
35
Figura 8. Resultado de la amplificación por PCR de la población Charolais.

Electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % de 43 muestras de la población Charolais, que
muestra la amplificación de fragmentos de 550 pb. Marcador de peso empleado λPstI,
carriles 1-43 productos amplificados de 550 pb, carril 44 control negativo.
Figura 9. Patrones de la digestión con Hind III y Taq I. Los resultados de la digestión
con la enzima Hind III se muestra en a y los de la enzima Taq I en b, obtenidos en 17
muestras de la población Charolais, marcador de peso empleado λPstI, carriles 1 y 19
producto de PCR no digerido, carriles 2-18 patrones de restricción obtenidos por
digestión.
36
7.2.2 Diferenciación de las variantes del cluster A
El análisis de discriminación de las variantes de este cluster se inició para

distinguir entre las variantes A, E, F, G, H, I. Se inició con la discriminación de la
variante F, para la cual tal como indica la estrategia se realizó la digestión con las
enzimas Rsa I y Hha I. Ninguna de las 49 muestras ensayadas se identificó como
variante F. A continuación las muestras se digirieron con la enzima Hae III, para
determinar la variante E; y solo una de las muestras de la población Gyrholando
presentó el patrón de bandeo esperado para esta variante E (Figura 10).
Figura 10. Análisis de la variante E. En esta imagen se muestra el resultado de un gel

de agarosa al 2.5% donde la muestra 11 de la población Gyrholando, corresponde a la
variante E. Marcador de peso empleado 50 pb, carril 1 producto de PCR no digerido.
Para confirmar el resultado obtenido en la población Gyrholando, se secuenció

(Apéndice C) la muestra 11, y el resultado fue confirmado por la presencia del codón
GGC que codifica el aminoácido Glicina en la posición 155 de la secuencia de
aminoácido de K-caseína, que corresponde a la variante E (Figura 11).
37
Figura 11. Confirmación de la variante E por secuenciación. Electroferograma de la

secuenciación que confirma la asignación de la variante E para la muestra 11, que
representa el genotipo homocigoto EE.
Los siguientes análisis de discriminación en las 48 muestras del cluster A se

enfocaron en las variante H y G, estas variantes comparten la presencia del aa isoleucina
en la posición 135, razón por la cual el análisis con la enzima Mnl permitiría identificar a
las muestras candidatas para estas dos variantes, y la digestión con Fok I asigna la
identidad de las variantes como H o G. Con excepción de cinco muestras de la población
Gyrholando, este análisis descartó la presencia de las variantes H y G en las muestras
analizadas.
En el caso de las 5 muestras mencionadas la asignación de la variante se

confirmó por secuenciación ya que el análisis de estas muestras por electroforesis fue
dudoso. Solo una de las muestras resultó ser heterocigoto para la variante H en la
posición 135 (Figura 12).
Figura 12. Análisis de un heterocigoto para la variante H determinado por

secuenciación. Electroferograma de la secuenciación que muestra la presencia de un
heterocigoto H/A en la posición 135 de la secuencia del gen K-caseína.
38
Finalmente, la población dentro del cluster A se sometió a digestión con la

enzima Alu I (Figura 13), el patrón de bandeo obtenido en las 47 muestras descartó la
presencia de la variante I y automáticamente estas quedaron asignadas con la variante A.
Figura 13. Patrón de digestión con Alu I para determinar la variante I.

Electroforesis en gel de Nussieve al 4.5%, donde los patrones de restricción (204 y 140)
descartan la presencia de la variante I. Marcador de peso empleado Phi carril 30
producto de PCR no digerido, carriles 31-46 patrones de restricción obtenidos.
39
7.2.3 Diferenciación de las variantes del cluster B
Las 132 muestras agrupadas en el cluster B, fueron sometidas a digestión con la

enzima Hae III para discriminar la variante J, donde el patrón esperado es de 98 pb, sin
embargo el resultado mostró un patrón de bandeo de 75 y 23 pb, este último no se
visualizó durante la migración (Figura 14); esto permitió descartar la presencia de la
variante J en las tres poblaciones.
Figura 14. Patrón de digestión con Hae III para determinar la variante J.
Electroforesis en gel de Nussieve al 4.5%, donde el patrón de restricción observado (75
pb) no corresponde a la variante J. Marcador de peso empleado 50 pb, carril 1 producto
de PCR no digerido, carriles 2-12 patrones de restricción obtenidos.
El siguiente análisis consistió en determinar la variante C, para ello las 132

muestras fueron digeridas con Fok I, los resultados obtenidos por electroforesis no
fueron concluyentes para la diferenciación clara de la variante B de C (Figura 15). Para
ello se secuenciaron 3 muestras representativas, las cuales mostraron la presencia del
codón CGT que codifica el aminoácido Arginina en la posición 97 de la secuencia de
aminoácido de K-caseína (Figura 16), que corresponde a la variante B. Con este
resultado, las 132 muestras del cluster B, fueron asignadas como variante B.
40
Figura 15. Patrón de digestión con Fok I para determinar la variante C.

Electroforesis en gel de Nussive al 4.5%, marcador de peso empleado 50 pb, carril ND
producto de PCR no digerido, carriles 1.50-1.85 patrones de restricción obtenidos, (*)
muestras que fueron sometidas a secuenciación.
Figura 16. Análisis por secuenciación para determinar la variante C.

Electroferograma de la secuenciación que muestra la presencia del codón CGT en la
posición 97, que codifica Arginina y corresponde a la variante B, esto permitió
diferenciar la variante B de C.
41
7.3. Frecuencias genotípicas y alélicas
7.3.1. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Carora
Las variantes A y B fueron encontradas en esta población con una frecuencia

alélica de 0.41 y 0.59, respectivamente (Cuadro 5). Los genotipos encontrados fueron
AA, AB y BB con una frecuencia genotípica de 0.11, 0.60 y 0.29, respectivamente
(Cuadro 5). La frecuencia genotípica BB asociado a contenido proteico (Lara, et al.,
2002, Sulimova et al., 2007, Aranguren, et al., 2008) y la frecuencia genotípica AB,
resultaron ser superiores a la frecuencia genotípica AA asociado a producción de leche
(Lara, et al., 2002, Sulimova, et al., 2007, Aranguren, et al., 2008, Satyanarayana y
Dayal, 2008).La determinación del Equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) y su
comprobación por chi-cuadrada (χ2), determinó que la población Carora se encuentra en
equilibrio para el locus de K-caseína (Cuadro 5). Aunque no haya reportes de
genotipificación para el gen K-caseína en esta población, los resultados eran los
esperados ya que la mayoría de estudios realizados en razas orientadas a producción de
leche, los alelos A y B, son de mayor frecuencia.
Cuadro 5. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Carora.

Raza No. Frecuencias genotípicas observadas Frecuencias alélicas HW
Muestras
AA AB BB A B
Carora 35 0.11 0.60 0.29 0.41 0.59 NS
HW= Equilibrio de Hardy-Weinberg; NS= En equilibrio (P˃0.05).
7.3.2. Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de Gyrholando
Las variantes A, B, E y H, fueron encontradas en esta población, con una

frecuencia alélica de 0.83, 0.13, 0.02 y 0.01, respectivamente (Cuadro 6). Los genotipos
encontrados fueron AA, AB, EE y AH con una frecuencia genotípica de 0.69, 0.27, 0.02
y 0.02, respectivamente, el genotipo BB asociado a calidad de la leche no fue encontrado
(Cuadro 6).
42
En la actualidad no hay reportes que indiquen si las variantes E y/o H muestran

alguna asociación sobre algún rasgo productivo en bovinos. La ley de HW y su
comprobación por chi-cuadrada (χ2), determinó que la población Gyrholando se
encuentra en desequilibrio para el locus de K-caseína.
Cuadro 6. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Gyrholando.

Raza No. Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas HW
Muestras observadas
AA AB EE AH A B E H
Gyrholando 41 0.69 0.27 0.02 0.02 0.83 0.13 0.02 0.01 *
HW: Equilibrio de Hardy-Weinberg; *= En desequilibrio (P˂0.05).
7.3.3. Frecuencias genotipos y alélicas en la población Charolais
En esta población las variantes encontradas fueron A y B, con una frecuencia

alélica de 0.40 y o.60, respectivamente. Los genotipos encontrados fueron AA, AB y BB
con una frecuencia genotípica de 0.14, 0.51 y 0.35, respectivamente. El genotipo
favorable (BB) para la calidad de la leche fue superior al genotipo AA. Es evidente la
relevancia de la frecuencia del alelo B de 0.60 con respecto al alelo A de 0.40 (Cuadro
7). Se determinó HW y se comprobó mediante la prueba de chi-cuadrada (χ2),
encontrando que la población se encuentra en equilibrio para el locus de K-caseína.
Cuadro 7. Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Charolais.

Raza No. Frecuencias genotípicas observadas Frecuencias alélicas HW
Muestras
AA AB BB A B
Charolais 105 0.14 0.51 0.35 0.40 0.60 NS
HW= Equilibrio de Hardy-Weinberg; NS=En equilibrio (P˃0.05).
43
7.4. Análisis de asociación del genotipo sobre PD205
El análisis indicó un efecto significativo (p=0.0474) de los genotipos sobre

PD205 (Cuadro 8) y la determinación de medios de cuadros mínimos obtenidos durante
el análisis de varianza indicó que el genotipo homocigoto BB favorable para el
incremento del contenido proteico en la leche, ejerce un efecto significativo sobre la
ganancia de peso al destete ajustado a 205 días pero no para peso al nacimiento
(p=0.4115). La falta de datos productivos en la población Carora y Gyrholando, limitó
su análisis de asociación.
Cuadro 8. Medios de cuadrados mínimos para el efecto del genotipo sobre

características de crecimiento.
CC Genotipo N x EE P
AB 34 37.45 0.97
PN 0.4115
BB 20 36.31 1.14
AB 34 234.65 5.44
PD205 0.0474
BB 20 218.90 6.41
CC= Característica de crecimiento; PD205= Peso al destete ajustado a 205 días; PN=
Peso al nacimiento; N= número de individuos analizados; EE= Error experimental; P=
Probabilidad, x= Peso promedio.
44
8. DISCUSIÓN
El gran desarrollo de la biotecnología molecular y la genómica en los últimos

años, ha contribuido a la implementación de marcadores moleculares para leer e
interpretar la secuencia de ADN de la mayoría de los animales domésticos de interés
permitiendo manejar y aprovechar mejor el potencial genético que ejercen efectos
significativos sobre características de interés productivo, reproductivo o estético.
La producción de leche, es considerada como uno de los principales rubros que

sostiene la rentabilidad de la industria pecuaria bovina, por lo que desde una perspectiva
genómica es prioritario el estudio de los genes que codifican a las proteínas lácteas, para
así usarlos en las estrategias de manejo asistido por marcadores dentro de los programas
de mejoramiento genético animal.
8.1. Tipificación de las variantes del gen CSN3
En este trabajo se estudio al gen CSN3, que codifica para una de las principales
proteínas lácteas: la K-caseína. Hasta la fecha, la mayoría de estudios de tipificación se
han enfocado en la detección de las dos variantes más comunes (A y B), la cual puede
realizarse utilizando ensayos basados en PCR-RFLP´s. La combinación de PCR con
diferentes técnicas electroforéticas y hasta el diseño de microarreglos ha permitido la
tipificación de al menos otras cuatro variantes del gen CSN3 (Prinzenberg et al., 1996;
Chessa et al., 2007). Barroso et al., (1998) y Naranjo et al., (2007) estudiaron las
variantes A, B, C y E usando PCR-SSCP; Soria et al., (2003) por su parte reportaron un
estudio de genotipificación basado en PCR-RFLP que permite diferenciar 5 variantes
(A, B, C, E y G) del gen CSN3, mientras que un ensayo basado en microarreglos fue
diseñado para genotipificar las variantes A, B, C, E y H (Chessa et al., 2007).
En el presente trabajo se diseñó e implementó exitosamente una estrategia basada

en PCR-RFLP que permite tipificar simultáneamente las nueve variantes del gen CSN3
45
reportadas hasta la fecha, la idea detrás de esta propuesta es que el contar con un método
diagnóstico de las nueve variantes permitirá determinar la prevalencia de cada variante
en los hatos de ganado bovino y posteriormente asociarlas con el efecto positivo o
negativo que ejercen sobre las características productivas, reforzando las decisiones en
los programas de mejoramiento genético.
Las ventajas de la estrategia diseñada sobre las previamente reportadas al menos

para seis variantes son: altamente reproducible, versátil, rápida, codominante, factible
para crear fragmentos de DNA de una región de interés que es reconocida por enzimas
de restricción, eficiente para fragmentos pequeños o grandes en pb, no es indispensable
la purificación de los productos de PCR, no requiere de cámaras de electroforesis con
sistema de enfriamiento (4 a 10 °C), la separación de los patrones de restricción puede
ser en geles de agarosa o nussieve a concentraciones bajas (2.5 o 4 %) y en tiempos
cortos (máximo 4 horas). El uso de la enzima de restricción y su digestión de manera
independiente lo convierte en una de los factores a considerar debido al costo de cada
enzima comparado con PCR-SSCP (Agarwal et al., 2008; Naranjo et al., 2007).
8.2. Análisis de frecuencias
8.2.1. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población de Carora
En Venezuela el mejoramiento genético en bovinos para índices productivos fue

alcanzado mediante la cruza del ganado Criollo Amarillo Limonero de Quebrada Arriba
con bovinos Pardo Suizo ambos razas Bos taurus, originándose así la raza Carora; su
nombre hace referencia a la localidad en donde fue realizado tal mejoramiento (López-
Ortega et al., 2008), siendo una de sus características principales, la alta producción de
leche (Bolla et al., 1997).
En la población Carora, se observó que la frecuencia del genotipo favorable BB

fue superior al genotipo homocigoto desfavorable AA, mientras que la frecuencia del
genotipo heterocigoto AB fue de 0.60.
46
En un estudio sobre efectos de los marcadores lactoproteicos incluyendo K-

caseína, realizados por Bolla et al., (1997), con muestras de Carora, cuyo registros de
producción de leche diaria es controlada por ASOCRICA (Asociación Venezolana de
Criadores de Ganado Carora), encontraron una frecuencia genotípica de 0.261, 0.487 y
0.252 para los genotipos AA, AB y BB respectivamente; observando que el genotipo
AA es ligeramente superior al genotipo BB, sin embargo los resultados de asociación
indicaron que las variantes del gen K-caseína no ejercen un efecto significativo en la
producción diaria de leche, sino que es afectada por el alelo B de β-lactoglobulina y por
los factores ambientales. Lopéz-Ortega et al., (2008), en un estudio realizado con
becerras mestizas de la raza Carora concluyen también, que los factores ambientales
determinan la evolución de los niveles nutricionales del animal durante el primer año de
vida.
Rojas et al., (2009) en un estudio realizado en ganado criollo limonero,

encontraron una frecuencia genotípica de 0.11, 0.56 y 0.33 para los genotipos AA, AB y
BB respectivamente, y una frecuencia alélica de 0.39 para el alelo A y 0.61 para el alelo
B, declarando que el locus de CSN3 se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg
(P˃0.05).
La diferencia en las frecuencias genotípicas encontradas en este trabajo respecto

a los publicados puede deberse a que las muestras corresponden a animales élite que
están sometidos a selección productiva, por lo tanto y asumiendo la asociación reportada
para las variantes del gen se esperaría que cuenten con los alelos favorables para
eficiencia y calidad lechera.
8.2.2. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Gyrholando
En esta población, los resultados de tipificación fueron valiosos ya que

permitieron comprobar la efectividad de la estrategia de detección/diferenciación de las
variantes del gen CNS3, se encontró una frecuencia genotípica de 0.69 para el genotipo
homocigoto AA, 0.27 para el genotipo heterocigoto AB pero no se encontró al genotipo
47
homocigoto BB, sin embargo se encontró una baja frecuencia de 0.02 para el genotipo
AH y EE, siendo el hallazgo de la variante H, relevante en este trabajo, ya que no había
sido reportado. Los resultados obtenidos son similares a los que reporta Azevedo et al.,
(2008) en un estudio de genotipificación del ganado brasileño, incluyendo razas Gyr y la
cruza de este con Holstein (Gyrholando), en la cual encontraron una frecuencia
genotípica de 0.64 y 0.26 para los genotipos AA y AB respectivamente, además de una
frecuencia de 0.10 para el genotipo AE al igual que en el presente estudio, tampoco
encontraron el genotipo BB. Mientras que en ganado Gyr encontraron una frecuencia
genotípica en un rango de 0.81 a 0.97 para el genotipo AA, de 0.03 a 0.18 para el
genotipo AB y 0.01 para el genotipo BB. Otro estudio realizado por Kemenes et al.,
(1999) en siete razas bovinas, incluyendo a Gyr, encontraron una frecuencia alélica de
0.93 y 0.07 para los alelos A y B respectivamente, sin embargo la prevalencia del alelo
A no fue significativa para producción de leche con respecto a Holstein, Nelore y
Guzerat concluyendo que el efecto del alelo A es especifico para cada raza.
En este sentido, aunque es necesario el estudio de asociación, el rendimiento en

producción de leche; es una de las características que se prefieren en el ganado lechero
mexicano, y la raza Gyrholando posee ésta característica, esto lo convierte fuertemente
en una de las razas, candidatas para la producción de leche en ambientes tropicales
donde una alimentación basada en pastoreo es suficiente para dicha productividad
aunado a las propiedades heredadas de sus progenitores como la habilidad materna
(sobrevivencia del ternero, excelente ganancia de peso y rendimiento de carcasa del
novillo), mayor precocidad (es preñada a los 18 a 24 meses), menores intervalos entre
parto (13 a 14 meses), longevidad mayor (9 a 10 partos) y una producción de leche de 15
a 20 kg en dos ordeñas en verano
(http://www.supercebu.com.bo/ver/articulo.php?num=83). Algunos estados de México,
como Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Campeche, Quintana Roo, Guerrero, Oaxaca y
Chiapas, cuentan con las condiciones ambientales optimas para la cría de esta raza
(Arellano et al., 2006), y en algunos hatos del estado de Tamaulipas han sido ya
establecidos
48
Las variantes E y H, encontradas en este estudio, son poco comunes y el efecto

que ejercen sobre características de interés es poco conocido, por tanto; es necesario
continuar con la tipificación y hacer el análisis de asociación para determinar el efecto
positivo o negativo para alguna característica productiva y posteriormente validar el
efecto de estas variantes.
8.2.3. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población Charolais
La mayoría de estudios de genotipificación del gen K-caseína han sido realizados

en razas lecheras y se sabe muy poco del efecto de sus variantes en animales con otro fin
productivo, como la producción de carne. Lara et al., (2002) en un estudio de
polimorfismos del locus de K-caseína concluye que es importante evaluar la relación
que existe entre los genotipos del locus de K-caseína con el desempeño materno en
ganado de carne y doble propósito, establecidos en condiciones tropicales. En este
trabajo se estudio el efecto de las variantes del gen CSN3 sobre la habilidad materna en
la raza cárnica Charolais.
Las frecuencias alélicas analizadas indicaron que el alelo favorable B, se

presentó en mayor proporción (0.60) respecto al alelo A (0.40), los resultados obtenidos,
son similares a los reportados por Jann et al., (2004) quien encuentra en un estudio
poblacional una frecuencia alélica de 0.58 y 0.42 para los alelos B y A respectivamente.
Otro estudio realizado por Curi et al., (2005) en cuatro razas cárnicas, incluyendo la raza
Canchim (5/8 Charolais x 3/8 Zebú) encontraron frecuencias alélicas de 0.767 y 0.233
para los alelos A y B respectivamente; como puede observarse existe una mayor
frecuencia del alelo A lo que puede ser consecuencia de su trasfondo genético a pesar de
que la raza Canchim su base está constituida principalmente de Charolais.
49
8.3. Análisis de asociación de las variantes del gen CSN3
El análisis de asociación en la población Carora y Gyrholando no fue realizado

por falta de datos productivos, sin embargo, se sabe que la variante A predomina en gran
frecuencia en la mayoría de las razas lecheras a excepción en Jersey en la cual la
variante B es la que predomina (Farrel et al., 2004). Las variantes A y B han sido
asociadas a producción y contenido proteico de la leche respectivamente, el resto de las
variantes han sido encontradas en baja frecuencia y en razas específicas. Las variantes C,
E, F, G, han sido asociados desfavorablemente a las propiedades de coagulación de la
leche (Prinzenberg et al., 1999), para el resto de las variantes se desconoce el grado de
asociación hacia alguna característica productiva, esto quizás por la baja prevalencia
reportada para las variantes.
En el caso de la raza Charolais, se encontró un efecto significativo (p˂0.05) de

los genotipos AB y BB de CSN3 sobre peso al destete ajustado a 205 días pero no para
peso al nacimiento, donde el alelo A incrementa ligeramente el peso al destete y al
nacimiento (Cuadro 8). Los resultados obtenidos, coinciden con uno de los estudios
realizados en tres poblaciones de ganado Hereford por Moody et al., (1996), donde
encontraron que la variante B del gen CSN3 se asocia a bajo peso al nacimiento y al
destete a 180 días, influencia que es deseable para peso al nacimiento, pero no para peso
al destete en razas cárnicas, donde se espera un mayor desempeño de crecimiento y
rendimiento al destete.
Aunque estos efectos pueden ser atribuidos a las tres características a las que se
ha asociado las variantes del gen CSN3 en razas lecheras: cantidad y calidad proteínica,
así como rendimiento en la producción de leche; no es posible determinar de forma
precisa cual es el rasgo sobre el cual se está ejerciendo el efecto favorable en ganado
cárnico. Incluso se podría pensar que el efecto observado es también consecuencia de la
interacción entre loci. Las variantes A y B de CSN3 han sido ampliamente estudiadas en
bovinos, los haplotipos formados con las variantes de β-caseína han demostrado que
ejercen un efecto significativo sobre las propiedades de coagulación (tiempo de
50
coagulación, tiempo y firmeza del cuajo), producción de leche y proteínas; pero no sobre
el contenido de proteínas y grasas. La presencia de al menos un alelo B en ambos loci
(CSN2 y CSN3: A1BAB, A2BBB, A2BAB) ejercen un efecto significativo sobre las
propiedades de coagulación de la leche, mientras que para los haplotipos más frecuentes
A2A2AA, A1A2BE, A1A2AE, su efecto es pobre. Los haplotipos de CSN2 y CSN3 no
ejercen un efecto significativo para producción de grasa, contenido de grasa, caseínas,
proteínas y células somáticas, sin embargo son más favorables para producción de leche
y proteína(A2A2BB y A1A1AB) de acuerdo a un estudio realizado en ganado Holstein
italiano por Comin, et al., (2008).
En el caso de razas cárnicas es evidente la necesidad de realizar estudios que

permitan de manera precisa evaluar el efecto de CSN3 sobre rasgos de crecimiento ya
que la heterogeneidad de los factores ambientales y los grupos raciales con los que hasta
ahora se han realizado los trabajos no permiten llegar a una conclusión. Hasta ahora,
Regitano et al., (1999) en un estudio realizado en ganado Canchim, Tambasco et al.,
(2003) en un estudio de evaluación de genes candidatos (CSN3, GH y β-LG) para rasgos
de crecimiento en cruzas de Bos taurus y Bos indicus (Aberdeen Angus x Nelore,
Canchim x Nelore, Simmental x Nelore) y Curi et al., (2005), en cuatro razas cárnicas
incluida Canchim llegan a la misma conclusión respecto a la falta de asociación positiva
o negativa de las variantes de CSN3 sobre rasgos de crecimiento.
51
9. CONCLUSIONES
El diseño de la estrategia basada en PCR-RFLP y PCR-ACRS, permitió la

determinación simultánea de las nueve variantes del gen CSN3 reportadas hasta la fecha
a excepción de la diferenciación de la variante B de C que se hizo por secuenciación
debido a que en el análisis de electroforesis fue dudoso, la estrategia diseñada es rápida,
económica y sería reproducible en laboratorios que disponen de equipo básico en
biología molecular.
Las frecuencias genotípicas y alélicas de las variantes del gen CSN3 en la

población Carora y Charolais revelaron estar en equilibrio de Hardy-Weinberg, no así
para la población de Gyrholando, ya que los individuos muestreados están en proceso de
cruzamiento y no han llegado al nivel racial deseado (5/8 Holstein y 3/8 Gyr) además
una posible presión de selección dirigida a producción de leche haya contribuido al
desequilibrio genético.
Las variantes de CSN3, en la población Charolais, mostraron un efecto negativo

del alelo B (P=0.0474) sobre el peso al destete ajustado a 205 días.
52
10. RECOMENDACIONES
La mayoría de estudios de genotipificación han sido dirigidos a las variantes A y

B, por tanto es recomendable continuar tipificando las nueve variantes del gen K-caseína
para tener un panorama más completo del efecto que ejerce cada variante sobre los rasgo
productivos del ganado bovino independientemente de su fin productivo.
En estudios posteriores es recomendable incluir al análisis, la determinación de

proteínas, grasas, sólidos totales, conteo de células somáticas; de la leche de animales
analizados.
El resultado de asociación obtenido en Charolais es un buen indicador del efecto

que ejerce el genotipo sobre características de crecimiento (peso al destete ajustado a
205 días), por tanto se sugiere aumentar el tamaño de la población incluyendo familias
completas. En cualquier estudio se deberá considerar poblaciones con datos productivos.
53
11. REFERENCIAS
Agarwal M., Shrivastava N. and Padh H. 2008. Advances in molecular marker

techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports 27: 617-631.
Agudelo G. D. A. y Bedoya M. O. 2005. Composición nutricional de la leche de Ganado

vacuno. Revista Lasallista de Investigación 2 (001): 38-42.
Allan M. F. and Smith T. P. L. 2008. Present and future applications of DNA

technologies to improve beef production. Meat Science 80: 79-85.
Améndola R., Castillo E. and Martínez P. A. 2005. Country Pasture/Forage Resource

Profiles, México. In: J. M. Suttie and S. G. Reynolds (Eds.) Country Pasture Profiles.
Plant Production and Protection Division, FAO (Food and Agriculture Organization of
the United Nations). Roma. Disponible en:
http://www.fao.org/ag/AGP/agpc/doc/Counprof/Mexico/Mexico.htm. Fecha de consulta:
Agosto de 2009.
Aranguren M. J. A., Villasmil Y., Yañez L. y Román R. 2008. Perspectiva de la genética

molecular en el mejoramiento genético bovino. Congreso Venezolano de Producción e
Industria Animal: Conferencia No. 17. 348-362.
Arellano S., Martínez J., Romero E., Briones F., Domínguez M. y De la Garza F. 2006.
Factores genético-ambientales que afectan el intervalo entre partos y días a primer parto
en ganado de doble propósito en el norte de Veracruz. Avances en Investigación
Agropecuaria 10 (1): 43-53.
54
Azevedo A. L. S., Nascimento C. S., Steinberg R. S., Carvalho M. R. S., Peixoto M. G.

C. D., Teodoro R. L., Verneque R. S., Guimaraes S. E. F. and Machado M. A. 2008.
Genetic polymorphism of the kappa-casein gene in Brazilian cattle. Genetics and
Molecular Research 7 (3): 623-630.
Ball P. J. H. and Peters A. R. 2004. Reproduction in Cattle. Third Edition. Balckwell

Publishing. Australia. 242 p.
Balteanu V. A., Vlaic A., Pop F. D., Rusu Anda Raluca., Martin P., Miranda G. y
Creanga S. 2008. Caracterization at protein level of the new αs1-casein allele IRV
discovered in Romanian Grey steppe cattle breed moldavian variety. Lucrări ştiinţifice
Zootehnie şi Biotehnologii 41 (1): 1-10.
Barroso A., Dunner S. and Canon J. 1998. Technical note: Detection of bovine kappa-
casein variants A, B, C and E by means of polymerase chain reaction-single strand
conformation polymorphism (PCR-SSCP). Journal of Animal Science 76: 1535-1538.
Bawden W. S. y Nicholas K. R. 1999. Molecular genetics of milk production. In: R.

Fries and A. Ruvinsky (Eds): The Genetics of Cattle. C.A.B. International. Australia Pp
540-564.
Bolla P., Rizzi R., Oropeza M. J. y Cerutti F. 1997. Efectos de los marcadores
lactoproteicos sobre algunos aspectos de la lactancia en vacas de raza Carora. Archivos
Latinoamericanos de Producción Animal 5 (1): 503-505.
Canizal J. E. y Rivera M. S. E. 2007. Situación actual de la ganadería bovina para abasto

en México. Disponible en:
ftp://fmvz.uat.edu.mx/bovinos/MVZ.Zertuche/Material%20de%20apoyo%20a%20alum
nos/Situaci%F3n%20y%20Perspectivas/situaactganad2007.pdf. Fecha de consulta:
Septiembre de 2009.
55
Casas E. 2002. Identificaction of quantitative trait loci in beef cattle. Archivos

Latinoamericanos de Producción Animal 10 (1): 54-60.
Casas E., Keele J. W., Shackelford S. D., Koohmaraie M. and Stone R. T. 2003.
Identification of quantitative trait loci for growth and carcass composition in cattle.
Animal Genetics 35: 2-6.
Casas E. 2006. Aplicación de la genómica para identificar genes que influyen sobre
características económicamente importantes en animales. Archivos Latinoamericanos de
Producción Animal 14 (1): 24-31
Chessa S., Chiatti F., Ceriotti G., Caroli A. Consolandi C., Pagnacco G. and Castiglion
B. 2007. Development of a single nucleotide polymorphism genotyping microarray
platform for the identification of bovine milk protein genetic polymorphisms. Journal of
Dairy Science 90 (1): 451-464.
Ciappesoni G., Ganzábal A. y Vázquez A. 2009. ¿Qué es la DEP?. Instituto Nacional de

Investigación Agropecuaria Uruguay. 1-2.
Comin A., Cassandro M., Chessa S., Ojala M., Dal Zotto R., De Marchi M., Carnier P.,
Gallo L., Pagnacco G., Bittante G., 2008. Effects of composite β- and K-casein
genotypes of Milk Coagulation, Quality and Yield Traits in Italian Holstein Cows.
Journal of Dairy Sciencce 91 (10): 4022-4027.
Cruz Z. A. 2006. Principales factores que afectan la prolificidad del ganado vacuno en
Latinoamérica. Revista electrónica de Veterinaria 7 (10): 1-11.
Cunningham E. P. & Meghen C. M. 2001. Biological identification systems: genetic

markers. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz 20 (2): 491-499.
56
Curi R. A., De Olivera H. N., Gimenes M. A., Silveira A. C., Lopes C. I. 2005. Effects
of CSN3 and LGB gene polymorphisms on production traits in beef cattle. Genetics and
Molecular Biology 28 (2): 262-266.
CSN3 casein kappa [Bos Taurus]. Disponible en:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=X14908. Fecha de consulta: Mayo del 2009.
De la Rosa R. X. F. 2003. Evaluación de regiones asociadas a ganancia de peso en el

genoma de individuos de la raza Beefmaster. Tesis de maestría en Ciencias en
Biotecnología. Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional.
Reynosa, Tamaulipas, México. 87 p.
Dekkers J. C. M. 2004. Commercial application of marker-and gene-assisted selection in

livestock: strategies and lessons. Journal of Animal Science 82: E313-E328.
Dekkers J. C. M. 2005. Implementation of marker assisted selection into breeding

programs. In: 4th. European Poultry Genetics Symposium. Croatia. Pp 1-9.
Dekkers J. C. M. and Hospital F. 2002. The use of molecular genetics in the

improvement of agricultural populations. Nature Reviews of Genetics 3: 22-32.
Deyoung R. W. and Honeycutt R. L. 2005. The molecular toolbox: Genetic techniques

in wildlife ecology and management. Journal of Wildlife Management 69 (4): 1362-
1384.
Dirección General Adjunta de Planeación Estratégica y Análisis Sectorial

(DGEAPEAS). Financiera Rural. Marzo, 2009, 1-4.
Dogru U. and Ozdemir M. 2009. Genotyping of kappa-casein locus by PCR-RFLP in

Brown Swiss cattle breed. Journal of Animal and Veterinary Advances 8 (4): 779-781.
57
Dominguez V. J. 2010. Importancia de los registros y características a evaluar. En:

Montaño B. M. y Martínez V. G. (Eds): Guía técnica Bovinos de carne. Pp 5-13.
Falconer D. S. y Mackay T. F. C. 2001. Introducción a la genética cuantitativa. Editorial

Acribia S. A. Zaragoza España. 469 p.
Farrel Jr. H. M., Jiménez-Flores R., Bleck G. T., Brown E. M., Butler J. E., Creamer L.
K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F. and Swaisgood H. E. 2004.
Nomenclature of the proteins of cows’Milk-Sixth revision. Journal of Dairy Science 87
(6): 1641-1674.
Ferrandini E., Castillo M., López M. B. y Laencina J. 2006. Modelos estructurales de la

micela de caseína. AN. VET. (MURCIA) 22: 5-18.
Formaggioni P., Summer A., Malacarne M. y Mariani P. 1999. Milk protein

polymorphism: Detection and diffusion of the genetic variants in Bos genus. Disponible
en: http://www.unipr.it/arpa/facvet/annali/1999/formaggioni/formaggioni.htm. Fecha de
consulta: Agosto de 2009.
Gallardo N J .L., Luna M. E., Albarrán D. M. 2006. Situación actual y perspectiva de la

producción de carne de bovino en México. pp. 1-45.
Grosclaude F. 1988. Le polymorphisme génétique des principales lactoprotéines

bovines. INRA Producción Animal. 1 (1): 5-17.
Hocquette J. F., Lehnert S., Barendse W., Cassar-Malek I. and Picard B. 2006. Recent
advances in cattle functional genomics and their application to beef quality. Animal 1:
159-173.
Hocquette J. F. y Gigli S. 2005. Indicators of milk and beef quality. In: European
Association for Animal Production (EAAP). Publicatión no. 112. 464 p.
58
Huanca L. W. 2001. Inseminación artificial a tiempo fijo en vacas lecheras. Revistas de

Investigaciones Veterinarias del Perú 12 (2): 161-163.
Ibarra G. H. Ajustes de los pesos al destete. Disponible en:

http://cedhyp.uat.edu.mx/pdf/022.pdf. Fecha de consulta: Octubre de 2009.
Iggman D., Birgisdottir B., Ramel A., Hill J., Thorsdottir I. 2003. Differences in cow’s
milk composition between Iceland and the other Nordic countries and possible
connections to public health, 194-198.
Jann O. C., Ibeaghua-Awemu E. M., Özbeyaz C., Zaragoza P., Williams J. L., Ajmone-
Marsan P., Lenstra J. A., Moazami-Goudarzi K., Erhardt G. 2004. Geographic
distribution of haplotype diversity at the bovine casein locus. Genetics Selection
Evolution 36: 243-257.
Kamiński S. 2004. Polymorphism of milk protein genes in coding and regulatory regions
and their effects on gene expression and milk performance traits. Animal Science and
Reports 22 (1): 109-113.
Kamiński S., Cieślińska A. y Kostyra E. 2007. Polymorphism of bovine beta-casein and

its potential effect on human health. Journal of Applied Genetics 48 (3): 189-198.
Keating A. F., Smith T. J., Ross R. P. and Cairns M. T. 2008. A note on the evaluation
of a beta-casein variant in bovine breeds by allele-specific PCR and relevance to β-
casomorphin. Irish Journal of Agricultural and Food Research 47: 99-104.
Keith J. B. 2004. New reproductive technologies in cattle: A veterinary perspective.

International Veterinary Information Service. 1-5.
59
Kemenes P. A., De Almeida R. L. C., De Magalhães R. A J., Packer I. U., Razook A. G.,
De Figueiredo L. A., Aparecida S. N., Etchegaray M. A. L. and Lehmann C. L. 1999. K-
casein, β-lactoglobulin and growth hormone allele frequencies and genetic distances in
Nelore, Gyr, Guzerá, Caracu, Charolais, Canchin and Santa Gertrudis cattle. Genetics
and Molecular Biology 22 (4): 539-541.
Lacayo M. 2008. Manejo del hato reproductivo. En Guía técnica lechera. Occidente
Ganadero (1): 1-4.
Lara M. A. C., Gama L. T., Bufarah G., Sereno J. R. B., Celegato E. M. L. and De
Abreu U. P. 2002. Genetic polymorphisms at the K-casein locus in Pantaneiro cattle.
Archivos de Zootecnia 51 (193-194): 99-105.
Levéziel H., Méténier L., Mahé M-F., Choplain J., Furet J-P., Pabceuf G., Mercier J-C.
and Grosclaude F. 1988. Identification of the two common alleles of the bovine k-casein
locus by the RFLP technique, using the enzyme Hind III. Genetics Selection Evolution
20 (2): 247-254.
López-Ortega A. A., Márquez Y. C., Mendoza C. A., Ferraro S. M. y Márquez A. A.

2008. Perfil lipídico en becerras mestizas Carora durante el primer año de vida, en época
de lluvias y de sequía, en Venezuela. Revista Veterinaria 19 (1): 2-7.
Lunden A. 2005. Indicators of milk and beef quality. In: European Association for
Animal Production (EAAP). Publicación no. 112. 464 p.
MacKinlay A. G. and Wake R. G. 1964. The heterogeneity of k-casein. Biochimica et

Biophysica ACTA 93: 378-386.
Magaña M. J. G., Ríos A. G., y Martínez G. J. C. 2006. Los sistemas de doble propósito
y los desafíos en los climas tropicales de México. Archivos Latinoamericanos en
Producción Animal 14 (3): 105-114.
60
Mahé M-F., Miranda G., Queval R., Bado A., Zafindrajaona P- S. and Grosclaude F.
1999. Genetic polymorphism of milk proteins in African Bos taurus and Bos indicus
populations. Characterization of variants αs1-Cn H and k-Cn J. Genetics Selection
Evolution. 31: 239-253.
Manjarrez S. J. 2001. Selección natural, genética cuantitativa y evolución de las

culebras. Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe 8 (1): 56-61.
Massmann C. P., 2004. ¿Podrán las evaluaciones genéticas reemplazar el juzgamiento?.

Revista Hereford 69 (635): 1-5.
Matějíček A., Matějíčková J., Němcová E., Jandurová O. M., Štípková M., Bouška J.,
Frelich J. 2007. Joint effects of CSN3 and LGB genotypes and their relation to breeding
values of milk production parameters in Czech Fleckvieh. Czech Journal of Animal
Science 52 (3): 83-87.
Merlin P. and Di Stasio L. 1982. Study on milk proteins loci un some decreasing Italian
cattle breeds. Ann. Genetics Selection Evolution 14 (1): 17-28.
Mitra A., Yadav B. R., Nazir A. G., Balakrishnan C. R. Molecular markers and their
aplications in livestock improvement. Disponible en:
http://www.ias.ac.in/currsci/oct25/articles19.htm. Fecha de consulta: Mayo 2009.
Montaldo V. H. H. y Barría, P. N. 1998. Mejoramiento genético de animales. Ciencia al

día 1 (2): 1-19.
Montaño B. M. Interpretación de evaluaciones genéticas en bovinos de carne y la

importancia de los grupos contemporáneos. 1-5. Disponible en:
http://www.limousinmexico.com/DOCS/INTERPRETACION%20DE%20EVALUACI
ONES%20GENETICAS%20EN%20BOVINOS%20DE%20CARNE.pdf. Fecha de
consulta: Marzo de 2010.
61
Moody D.E., Pomp D., Newman S., MacNeil M. D. 1996. Characterization of DNA
polymorphisms in three populations of Hereford cattle and their associations with
growth and maternal EPD in line 1 Herefords. Journal of Animal Science 74: 1784-
1793.
Naqvi A. N. 2007. Application of molecular genetics technologies in livestock

production: potentials for developing countries. Advances in Biological Research 1 (3-
4): 72-82.
Naranjo J., Posso A., Cárdenas H. y Muñoz F. J. E. 2007. Detection of allelic variants of
Kappa-casein in Harton del Valle cattle. Acta Agronómica 56 (1): 43-47.
NCBI (National Center for Biotechnology Information). Disponible en:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/. Fecha de consulta: Mayo de 2009.
NEBcutter V2.0. Disponible en: http://tools.neb.com/NEBcutter2/. Fecha de consulta:

Agosto de 2009.
Norma Oficial Mexicana NOM-184-SSA1-2002. Productos y servicios. Leche, fórmula

láctea y producto lácteo combinado. Especificaciones sanitarias. 1-59.
Ochoa G. P. 1991. Mejoramiento genético del Ganado bovino productor de leche.

Ciencia Veterinaria 5: 67-85.
Octaviano A. R., Tonhati H., Desidérico S. J. A. and Cerón M. M. F. 2005. Kappa-

casein gene study with molecular markers in female buffaloes (Bubalus bubalis).
Genetics and Molecular Biology 28 (2): 237-241.
Oltra C. J. Criterios de selección pruebas de progenie interpretación de catálogos. 1-9.

Disponible en: http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1012.pdf. Fecha de
consulta: Marzo de 2010.
62
Osuna S. O. 2002. La problemática de la ganadería en México. En memorias: IX

Encuentro Nacional de Legisladores del Sector Agropecuario. Nuestro Congreso.
Sinaloa, 86-90.
Parra B. G. M., Magaña J. G., Delgado M. M., Osorio A., Segura C. J. C. 2005. Genetic
and non-genetic effects on productive and reproductive traits of cows in dual-purpose
herds in southeastern Mexico. Genetics and Molecular Research 4 (3): 482-490.
Pereda S. M. E., González M. S.S., Arjona S. E., Bueno A. G., Mensoza M. G.D. 2005.
Ajuste de modelos de crecimiento y cálculo de requerimientos nutricionales para
bovinos Brahman en Tamaulipas, México. Agrociencia 39: 19-27.
Pérez H. P., Solaris M. F., García-Winder M., Osorio-Arce M. y Gallegos-Sanchez J.

2001. Comportamiento productivo y reproductivo de vacas de doble propósito en dos
sistemas de amamantamiento en el trópico. Archivos Latinoamericanos Producción
Animal 9 (2): 79-85.
Perfectti F., Pico F. X., Gómez J. M. 2009. La huella genética de la selección natural.
Revista Científica y Técnica de Ecología y Medio Ambiente 18 (1): 10-16.
Phadungath C. 2005. Casein micelle structure: a concise review. Songklanakarin Journal

of Science and Technology. 27 (1): 201-212.
Phillips C. J. C. 2001. Principles of cattle production. CABI Publishng. Australia. 288 p.
Prinzenberg E. M., Hiendledes S., Ikonen T. y Erhardt G. 1996. Molecular genetics

characterization of new bovine kappa-casein alleles CSN3F and CSN3G and genotyping
by PCR-RFLP. Animal Genetics 27: 347-349.
63
Prinzenberg E. M., Jianlin H. and Erhardt G., 2008. Genetic variation in the K-casein
gene (CSN3) of chinase Yak (Bos grunniens) and phylogenetic analysis of CSN3
sequences in the Genus Bos. Journal of Dairy Sience 91 (3): 1198-1203.
Prinzenberg E. M., Krause I., Erhardt G. 1999. SSCP analysis at the bovine CSN3 locus
discriminates six alleles corresponding to known protein variants (A, B, C, E, F, G) and
three new DNA polymorphidms (H, I, A1). Animal Biotechonology 10 (1&2): 49-62.
Rachagani S. and Dayal G. I. 2008. Bovine kappa-casein gene polymorphism and its
association with milk production traits. Genetics and Molecular Biology 31 (4): 893-
897.
Ramírez-Valverde R., Núñez-Domínguez R., Ruíz-Flores A., García-Muñiz J. G.,

Domínguez-Viveros J. y Hernández-Ramos H. 2008. Estabilidad de las evaluaciones
genéticas en poblaciones mexicanas de bovinos para carne. Técnica Pecuaria en México
46 (1): 13-24.
Ravagnolo O., Ciappesoni G., Aguilar I. y Pravia M. I. 2005. Mejoramiento genético

animal herramienta para un crecimiento permanente. Instituto Nacional de Investigación
Agropecuaria 2: 6-9.
Raymond M., Rousset F. 1995. GENEPOP (versión 1.2) Population genetics software
for exact test and ecumenicism. Journal of Heredity 86: 248-249.
Regitano L. C. A., Azevedo J. L., Veconvsky R., Packer I. U., Barbosa P. F., Rosa A. J.
M., Silva N. A., Etchegaray M. A. I. y Coutinho L. L. 1999. Selecction for breed-
specific growth hormone and IGF-I alleles in a synthetic beef cattle cross, Canchim.
Genetics and Molecular Biology 22 (4): 531-537.
Requena F. D., Agüera E. I. y Requena F. 2007. Genética de la caseína de la leche en el

bovino Frison. Revista Electrónica de Veterinaria 8 (1): 1-9.
64
Rijnkels M. 2002. Multispecies comparison of the casein gene loci and evolution of
casein gene family. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia 7 (3): 327-345.
Rijnkels M., Elnitski L., Miller W. and Rosen J. M. 2003. Multispecies comparative
analysis of a mammalian-specific genomic domain encoding secretory proteins.
Genomics 82: 417-432.
Rodero E. y Herrera M. 2000. El concepto de raza. Un enfoque epistemológico. Archivo

de Zootecnia 49 (185): 5-16.
Rojas I., Aranguren-Méndez J., Portillo M., Villasmil-Ontiveros Y., Valbuena E.,
Rincón X., Contreras G. y Yañez L. 2009. Polimorfismo genético de la kappa-caseína en
ganado criollo limonero. Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe,
España y Portugal 19 (6): 645-649.
Romero, S. F., Espinosa, G. J. A., Cuevas, R. V., Moctezuma, L. G., Jolalpa, B. J. L.

2009. Demandas tecnológicas y de política para mejorar la competitividad de la cadena
agroalimentaria de leche en el estado de Hidalgo. Revista Mexicana de Agronegocios
24: 774-787.
Statistical Analysis System (SAS). 2002. User´s guide. Versión 9.0. Cary. North
Carolina, USA.
Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación

(SAGARPA). Programa nacional pecuario 2007-2012. Disponible en:
http://sagarpa.gob.mx/ganaderia/Publicaciones/Paginas/ProgramaNacionalPecuario.aspx
. Fecha de consulta: Octubre de 2009.
Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP). 2008. Disponible en:

http://www.siap.gob.mx/index.php?option=com_content&view=article&id=21&Itemid=
330. Fecha de consulta: Octubre de 2009.
65
Servicio Nacional de Aprendizaje de Formación Abierta y a Distancia (SENAFAD).

1985. Selección del pie de cría.1-6.
Soria L. A., Iglesias G. M., Huguet M. J. and Mirande S. L. 2003. A PCR-RFLP test to
detect allelic variants of the bovine kappa-casein gene. Animal Biotechnology 14 (1): 1-
5.
Sulimova G. E., Azari M. A., Rostamzandeh J., Mohammad A. M. R. and Lazebny O. E.

2007. K-casein gene (CSN3) allelic polymorphism in Russian cattle breeds and its
information value as a genetic marker. Russian Journal of Genetics 43 (1): 73-79.
SuperCebu. Disponible en: http://www.supercebu.com.bo/ver/articulo.php?num=83.

Fecha de consulta: Septiembre de 2010.
Tambasco D. D., Paz C. C. P., Tambasco-Studart M., Pereira A. P., Alencar M. M.,
Freitas A. R., Coutunho L. L., Packer I. U. y Regitano L. C. A. 2003. Candidate genes
for growth traits in beef cattle crosses Bos taurus x Bos indicus. Journal of Animal
Breeding and Genetics 120: 51.56.
Usme-Ciro J., Restrepo F. y Tujillo-Bravo E. 2004. Kappa-caseína bovina y su

asociación con el recuento de células somáticas en ganado Holstein. Actual Biology 26
(80): 17-22.
Van Eenennaam A. 2004. Marker-Assisted selection backgrounder. Universidad de

California Department of Animal Science. 1-4.
Van Eenennaam A. L., 2006. What is the future of animal biotechnology?. California
Agriculture 60 (3): 132-139.
66
Van Eenennaam A. L., Li J., Thallman R. M., Quaas R. L., Dikeman M. E., Gill C. A.,
Franke D. E. and Thomas M. G. 2006. Validation of commercial DNA tests for
quantitative beef quality traits. Journal of Animal Science. 1-34.
Van Eenennaam A. and Medrano J. F. 1991. Milk protein polymorphisms in California

dairy cattle. Journal of Dairy Science 74: 1730-1742.
VanRaden P. M. 2004. Selection on Net Merit to Improve Lifetime Profit. Journal of

Dairy Science 87 (10): 3125-3131.
Vergara E. M. y Truffer R. 2004. Selección genética en bovinos ¿Por qué breedplan?.

EN: Conferencia IV Jornadas Nacionales de Cría Bovina Intensiva Venado Tuerto,
Santa Fe, Argentina. Pp 1-6.
Vilaboa-Arroniz J., Díaz-Rivera P., Ruiz-Rosado O., Platas-Rosado D. E., González-

Muñóz S. and Juárez-Lagunes F. 2009. Caracterización socioeconómica y tecnológica
de los agroecosistemas con bovinos de doble propósito de la región del Papaloapan,
Veracruz, México. Tropical and Subtropical Agroecosystems 10: 53-62.
Visscher P. M., Hill W. G. & Wray N. R. 2008. Heritability in the genomics era-
concepts and misconceptions. Nature Reviews Genetics 9: 255-264.
Warwick E. J. y Legates J. E. 1992. Cría y mejora del Ganado. 3ed. Editorial McGraw-
Hill. México. 614 p.
WatCut: An on-line tool for restriction analysis, silent mutation scanning, and SNP-
RFLP analysis. 2007. Disponible en:
http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=snp_new. Fecha de consulta:
Agosto de 2009.
67
12. GLOSARIO
ADN: Molécula del ácido nucleíco que contiene la información genética de un

organismo vivo y está compuesta por pares de cuatros bases nitrogenadas denominadas
Adenina (A), Timina (T), Citocina (C) y Guanina (G).
Alelo: Forma alternativa de un gen ó una región de un marcador dentro de un

cromosoma. Se segrega durante la meiosis y el hijo recibe solo uno de cada par de alelos
de cada progenitor.
Aminoácido: Molécula orgánica compuesto por un grupo amino (-NH2) y un grupo

carboxilo (-COOH). Son los componentes básicos de las proteínas.
Aplomo: Es la relación entre el eje del miembro y sus ángulos, respecto del plano medio
del cuerpo del animal y la horizontal del suelo.
Calidad: Conjunto de propiedades de un objeto ó producto que le confieren la capacidad

de compararlo con otro de su misma especie.
Codón: Un triplete de nucleótidos adyacentes del mRNA que codifica un aminoácido

específico en la cadena polipectídica durante la síntesis de proteínas o determina el cese
de dicha síntesis.
Cuajo: Es una sustancia presente en el abomaso de los mamíferos rumiantes, contiene

principalmente la enzima llamada renina (quimosina).
Diferencia Esperada en la Progenie (DEP): Es el valor genético de un animal que

permite predecir genéticamente la superioridad productiva del animal y compararla con
otros animales para determinar el comportamiento del animal evaluado en alguna
característica de importancia económica en las hijas de generaciones futuras.
Desequilibrio de ligamiento: La propiedad de algunos genes de las poblaciones

genéticas de no segregar de forma independiente. El desequilibrio disminuye cuando
aumenta la distancia (y por tanto la recombinación) entre los loci.
Diversidad genética: Es la variación en la composición de la información genética o

unidades hereditarias (genes) contenida en todas las especies vivientes, encontradas en
un área específica y que pueden reproducirse entre sí a través del tiempo.
Electroforesis: Técnica de separación de moléculas mediante su movimiento a través de

un campo eléctrico y una matriz porosa.
Enzima de restricción: Son enzimas que reconocen secuencias de ADN en particular y

cortarlos, separar una cadena de ADN, allí donde se encuentren las secuencias que han
sido codificados a reconocer.
68
Equilibrio de Hardy-Weinberg: Modelo teórico que permite predecir el equilibrio

dado en una población grande con apareamiento aleatorio, donde las frecuencias génicas
y genotípicas permanecen constantes de generación en generación en ausencia de
migración, mutación y selección.
Exón: Región codificante de un gen que contiene la información para producir una
proteína específica.
Fenotipo: Característica física de un organismo, observable y mensurable, producida

por su composición genética (genotipo) en combinación con el ambiente.
Frecuencia alélica: Porcentaje de un alelo específico del total de los alelos posibles
observados en un locus concreto en una población determinada.
Frecuencia genotípica: Porcentaje de un genotipo especifico del total de los genotipos

posibles observados en un locus concreto en una población determinada.
Gen: Segmento de ADN que codifica un cierto producto, generalmente una proteína. La
secuencia de ADN que constituye un gen incluye intrones, exones y regiones
regulatorias.
Genotipo: Constitución genética (genes) de un individuo.
Habilidad materna (efecto materno): Es un carácter complejo, que incluye la

producción de leche y un conjunto de factores que caracterizan las formas de atención
que la vaca presta a su ternero desde el nacimiento hasta el destete. Se mide por el peso
al nacer, al destete y por la sobrevivencia o no del ternero. Es la capacidad de una
hembra de gestar, amamantar, cuidar y destetar una cría.
Haplotipo: Serie de alelos en varios loci ligados en un mismo cromosoma.
Heredabilidad: Es una proporción de la varianza fenotípica total que se atribuye al

efecto de los genes.
Heterocigoto: Individuo que porta dos alelos diferentes en un determinado locus de un

par de cromosomas homologas.
Homocigoto: Individuo que porta dos alelos idénticos en un determinado locus de un

par de cromosomas homologas.
Intron: Secuencia de nucleótidos de ADN intercaladas entre los genes de eucariotes y

que son eliminados antes de la transcripción del ARN.
Lactación: Periodo de amamantamiento del becerro entre el nacimiento y el destete.
69
Manejo asistido por marcadores (MAS): Determinación del tipo de manejo a utilizar
mediante la ayuda de marcadores moleculares identificando el potencial genético de los
animales.
Marcador genético: Son regiones conocidas dentro del ADN que están relacionadas
con características fenotípicas.
Microsatélite: Un tipo de marcador genético, consiste en secuencias de ADN repetidas

de nucleótidos en el ADN, en un locus específico y variable en el número de
repeticiones de la secuencia.
Polimorfismo: La existencia de dos o más variantes en un locus determinado. Diversas

formas de un individuo en una población.
Proteína: Molécula compuesta de una o más cadenas de aminoácidos en un orden

específico. Las proteínas son requeridas para la estructura, función y regulación de las
células, tejidos y órganos del cuerpo de un ser vivo. Por lo tanto, cada proteína tiene una
función única.
Prueba de comportamiento: evaluación del comportamiento de una población de

animales en un hato con las mismas condiciones ambientales, alimentación y manejo.
Rasgos cualitativos: Características en las que hay una diferencia marcada entre los
fenotipos, como blanco y rojo. La expresión de estas características se involucra sólo
uno o pocos pares de genes.
Rasgos cuantitativos: Característica medibles del individuo en las que intervienen

varios genes con dos o más alelos en loci diferentes.
Sistema extensivo: Aprovechamiento de las condiciones naturales, se requieren grandes

extensiones de pastizales. Los animales permanecen un tiempo más prolongado para ser
ofrecidos al mercado, pero el costo de producción es mínimo, no se requiere de mucha
mano de obra, y no exige instalaciones costosas.
Sistema intensivo: Mantienen al ganado en confinamiento por un periodo de tiempo (90

días) con alimentación a base de raciones balanceadas. No se requiere solo de una
reducida superficie y en cortos tiempos obtienen más peso debido a la tranquilidad,
menor ejercicio y por ende menor desgaste de energía.
Sistema semintensivo: Combina el sistema extensivo e intensivo mediante dos

modalidades: 1) suplementación: se le proporciona diariamente determinada cantidad de
alimentos balanceados; 2) encierro: los animales pastan medio día y el resto son
encerrados en corrales, donde se les proporciona mezclas alimenticias.
Valor genético: El promedio de la suma de los efectos de los genes que los progenitores
transmiten a su descendencia.
70
APÉNDICES
APÉNDICE A
Cuadro A1. Volúmenes de soluciones y de tamaño de muestras utilizadas del

estuche de extracción de ADN genómico Promega Wizard®
Tamaño de Soluciones de lisis Solución de Isopropanol Solución de
muestra Celular Núcleo precipitación de rehidratación de ADN
proteínas
20 µl 60 µl 20 µl 6.7 µl 20 µl 10 µl
50 µl 150 µl 50 µl 16.5 µl 50 µl 25 µl
300 µl 900 µl 300 µl 100 µl 300 µl 50 µl
1 ml 3 ml 1 ml 330 µl 1 ml 150 µl
3 ml 9 ml 1.5 ml 1 ml 3 ml 250 µl
10 ml 30 ml 10 ml 3.3 ml 10 ml 800 µl
Solución de lisis I=155 nM de cloruro de amonio (NH4Cl), 0.5 mM de EDTA, pH 7.4,
10 mM bicarbonato de sodio (NaHCO3).
Cuadro A2. Optimización de la PCR para la determinación de las variantes del gen
K-caseína.
Reactivos Experimento 1 Experimento 2 Experimento3 Experimento 4
Buffer 1X 1X 1X 1X
MgCl2 Bajo Alto Bajo Alto
dNTP´s 0.4mM 0.4mM 0.4mM 0.4mM
Iniciadores Alto Bajo Bajo Alto
Taq polimerasa 0.1U 0.1U 0.1U 0.1U
ADN Bajo Bajo Alto Alto
Agua Por diferenciación
Volumen final 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
Programa TD55 TDTG TDTG TD55
Cuadro A3. Programas evaluados para la PCR.
Tiempo TD55 TDTG

Temperatura No. De ciclos Temperatura No. De ciclos
5min 95 1 95 1
45 s 95 95
45 s 62–2 c/ciclo 5 58-2 c/ciclo 5
45 s 72 72
45 s 95 95
45 s 55 30 50 30
45 s 72 72
10 min 72 1 72 1
71
Cuadro A4. Preparación de EDTA 0.5 pH 8.0.

Reactivo Unidad
EDTA 186.1 g
H2O destilada estéril 1L
Cuadro A5. Preparación de TBE 10X

Reactivo Unidad
Tris base 108 g
Ácido bórico 55 g
EDTA 40 ml
H2O destilada estéril 1L
Cuadro A6. Preparación de Agarosa al 1.5%.

Reactivo Unidad
Agarosa 1.5 g
Buffer TBE 1X 100 ml
72
APÉNDICE B
Protocolo de preparación de Agarosa Nussieve® al 4%
1. Pesar el matraz erlenmeyer de 500 ml vacío y registrar su peso.
2. Pesar 4 g de agarosa Nussieve en un recipiente molde.
3. Agregar al matraz 500 ml de buffer TBX 0.5X y un agitador magnético ajustando

su velocidad de agitación (la agitación debe ser rápida).
4. Poner en la placa de agitación el matraz de solución y agregar lentamente la

agarosa.
5. Dejar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente. Sacar el agitador

auxiliado de otro agitador magnético.
6. Pesar el matraz con la agarosa y cubrir la boca con parafilm (hacer un hueco en
el parafilm para ventilar y evitar el derramen).
7. Calentar la solución en el microondas a potencia media durante 1 min. Sacar la

solución y dejar reposar a temperatura ambiente por 15 min.
8. Calentar nuevamente la solución en el microondas a potencia media durante 2

min, transcurrido el tiempo agitarlo y calentarlo una vez más a potencia alta
durante 1 min.
9. Pesar la disolución para verificar que este completa, en caso contrario agregar
buffer 0.5X suficiente hasta alcanzar el peso inicial.
10. Dejar enfriar a temperatura ambiente y transferir la disolución al molde.
73
APÉNDICE C
Protocolo de la reacción de secuenciación en el equipo ABI
1. Purificación con EXOSAPT IT
Mezclar en un tubo eppendorf de 100 µl:
Producto de PCR 2.0 µl

ExoSAP 1.0 µl
Vol. Total 3.0 µl
Poner los tubos en el programa EXO2 (carpeta EXO-SAP) del termociclador MJ

Research.
2. Reacción de secuenciación
Preparar por muestra la siguiente reacción de secuenciación:
X
Dna templado 1.0 µl
Primer (5 µM) 0.5 µl
Readly Reacc. Premix 2X 2.0 µl
Big Dye Seq. Buffer 2.0 µl
Agua destilada 4.5 µl
Vol. Total 10 µl
Poner los tubos en el programa SEC3130 (carpeta SEC3130) del termociclador MJ

Research.
3. Purificación Xterminator
Sam buffer 22.5 µl

Xterminator* 5.0 µl
Reacción de secuenciación 5.0 µl
*IMPORTANTE: Asegurarse de mezclar al vortex la resina del Xterminator antes de

agregar a la reacción.
Asegurarse que la resina se encuentre totalmente resuspendida. Incubar con agitación en

el termonixer durante 30 min a 25 °C. Centrifugar las reacciones a 2000 rpm durante 2
min. Tomar 15 µl del sobrenadante sin tomar nada de resina y pasar a un tubo nuevo
previamente identificado, que se enviará a secuenciar en el ABI.
NOTA: Conservar las muestras a -20 °C, si no se concreta en cada etapa hasta su envío
al secuenciador.
74

190

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

190

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DEL GEN DE K-CASEÍNA EN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

I.B.Q. VÍCTOR INOCENCIO PACHECO CONTRERAS

REYNOSA, TAMPS. NOVIEMBRE, 2010

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DEL GEN DE K-CASEÍNA EN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

I.B.Q. VÍCTOR INOCENCIO PACHECO CONTRERAS

REYNOSA, TAMPS. NOVIEMBRE, 2010

Al Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, por abrirme

Agradezco a CONACYT, Becas PIFI, GRUPO FINANCIERO SANTANDER,

Dedico este trabajo a mis padres

A mi hermano Rolando y a la memoria de mi hermano Roberto,

A Cliz, Mary, Eliseo, Belinda, Josafath, Thamar, Matías, Gris, Chuy,

A cada uno de mis amigos de San Peter, Puebla, Toño, Leo,

LISTA DE CUADROS ................................................................................................. X

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI

LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA ................................................. XIII

ABSTRACT ............................................................................................................ XVII

2.1. La ganadería bovina ............................................................................................ 3

4. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 24

4.1. Objetivos específicos ........................................................................................ 24

6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 25

6.1. Origen del material biológico ........................................................................... 25

8.1. Tipificación de las variantes del gen CSN3 ...................................................... 45

8.2.2. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen CSN3 en la población

10. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 53

11. REFERENCIAS ..................................................................................................... 54

12. GLOSARIO ........................................................................................................... 68

1 Principales variantes de los genes de caseína asociados a rasgos de

2 Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las variantes del gen CSN3…... 19

3 Iniciadores y tipos de ensayos para la detección de nueve variantes del

4 Muestras de tres poblaciones bovinas agrupadas en el cluster A y B………. 34

5 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Carora………………….. 42

6 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Gyrholando……………. 43

7 Frecuencias genotípicas y alélicas de la población Charolais……………….. 43

8 Medios de cuadrados mínimos para el efecto del genotipo sobre características

1 Principales estados productores de ganado bovino de carne en

2 Principales países productores de leche bovina en 2006……………………. 5

3 Composición de la leche en ganado bovino………………………………… 13

4 Estructura del locus de genes que codifican a las proteínas de caseína……... 15

5 Organización estructural de unidad transcripcional de CSN3………………. 18

6 Diseño de iniciadores para detección de SNP………………………………. 29

7 Estrategia basada en PCR-RFLP, para la determinación simultanea de nueve

8 Resultado de la amplificación por PCR de la población Charolais…………. 36

9 Patrones de la digestión con Hind III y Taq I……………………………….. 36

10 Análisis de la variante E…………………………………………………….. 37

11 Confirmación de la variante E por secuenciación………………………….... 38

12 Análisis de un heterocigoto para la variante H determinado por

13 Patrón de digestión con Alu I para determinar la variante I………………..... 39

14 Patrón de digestión con Hae III para determinar la variante J………………. 40

15 Patrón de digestión con Fok I para determinar la variante C………………... 41

16 Análisis por secuenciación para determinar la variante C…………………... 41

LISTA DE SÍMBOLOS Y/O NOMENCLATURA

BLUP Best linear unbiased prediction

DEP Diferencia esperada en la progenie

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucleotidos trifosfatados

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

GLM General Lineal Models (Modelos lineales generales)