LAPORAN PRAKTIKUM

FITOKIMIA
“Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom”

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2015
1. TUJUAN UMUM
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan kromatografi
kolom.

2. TINJAUAN PUSTAKA
 Tinjauan Tanaman (Psidium guajava)
Klasifikasi
Nama Species : Psidium guajava
Familia : Myrtaceae
Nama Daerah : Jambu biji, Jambu klutuk
Simplisia : Tanin 9-12%, minyak atsiri, minyak lemak, asam malat
Penggunaan : Antidiare
Kandungan
Mengandung Tanin 9-12%, minyak atsiri, minyak lemak, asam malat
 Tinjauan Kromatografi
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini
memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran
dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik
pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa
larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada
sampel dijerap oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang
terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan terjadi
migrasi senyawa dan senyawa tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya.
Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka
senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin
melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan baik. Dan apabila
kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang baik dan tidak berdasarkan
tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan menyebabkan fase
diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi cracking. Permukaan adsorben
harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat
yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.
Cara kerja kromatografi kolom adalah komponen tunggal ditahan pada fasa diam
berupa adsorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan
 melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-
masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam
melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi.
Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk
mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi
dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat
diamati lebih lanjut meggunakan spektroskopi.
Kromatografi kolom atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi
(gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi
keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Persyaratan
penting dalam penggunaan KLT adalah bahwa zat atau campuran zat yang akan
dianalisis harus larut dalam pelarut atau campuran pelarut. Jenis-jenis kromatografi
antara lain :
1. Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar
seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu
bentuk dari LSC. Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai
partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ. Teknik ini biasanya digunakan
untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik
ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.
2. Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak
dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya
sebagai fasa gerak. Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert
dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian fasa gerak dilewatkan melalui kolom.
Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC). Bentuk
kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase
Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer
dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam
lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase
diam.
3. Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak
dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari
kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam
sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan
Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas
dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat
dipakai untuk keduanya kation dan anion.
4. Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari
zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil
(porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan danditahan
dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang
lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi
gel (GPC) dan filtrasi gel.
5. Kromatografi pasangan ion (IPC)
Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk
baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai
metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa
keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi,
kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC).
Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
 Tinjauan Konstatnta Dielektrik
 n-heksana = 2.0
 kloroform = 4.8
 etil asetat = 6.0
 methanol = 30.0
semakin tinggi nilai konstanta dielektrik suatu pelarut, maka semakin polar senyawa
pelarut tersebut.
3. PROSEDUR KERJA
o Lakukan optimasi ekstrak dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-
ganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan
untuk fraksinasi.
o Siapkan kurang lebih 50 gram silica gel.
o Siapkan eluen dari butir (a) sebanyak 300 ml
o Silica gel dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen,
kocok selama 15 menit.
o Campur butir (d) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas.
o Tuangkan ke dalam kolom sampai penuh, tutup deengan aluminium foil, biarkan
semalam.
o Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak
ditambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur denga silica gel sama
banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogeny dan kering.
o Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel
o Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan kedalam kolom (diatas
permukaan silica gel), lalu ditambahkan eluen kira-kira setinggi 3 cm. eluen
dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan
eluen, sementara penetesan tetep dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.
o Penempungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml.
o Dilakukan uji KLT untuk setiap kelipatan 10 vial (vial no. 1, 10, 20, 30, 40 dst). Pada
uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi
kolom.
o Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diantaranya dapat digabung.
o Bila uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan pada vial
diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no 15 dilakukan uji KLT)
o Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada uji KLT.
 4. HASIL PENGAMATAN

Sinar λ Sinar λ

Fase diam : Kiesel Gel 254

Fase gerak : Heksan : Etil Asetat (4:1)

Harga Rf:
Fraksi 1 (Vial 1-6) Fraksi 2 (vial 7-10)
4,1 2,5
Rf: =0,5152 Rf : =0,3125
8 8
4,8 3,5
Rf : =0,6000 Rf : = 0,4375
8 8
5,3 3,7
Rf : =0,6625 Rf : =0,4625
8 8
4,1
Rf : =0,5125
8
4,8
Rf : =0,6000
8
5,1
Rf : =0,6375
8
5,5
Rf : =0,6875
8
Fraksi 3 (vial 11-22) Fraksi 4 (Vial 23-38)
2,3 1,2
Rf : =0,2875 Rf : =0,1500
8 8
2,6 1,7
Rf : =0,3250 Rf : =0,2125
8 8
3 2,6
Rf : 8 =0,3750 Rf : =0,3250
8
3,5 5,0
Rf : =0,4375 Rf : =0,6250
8 8
3,7
Rf : =0,4825
8
4,2
Rf : =0,5250
8
5,0
Rf : =0,6250
8
5,5
Rf : =0,6875
8

Fraksi 5 (Vial 39-43) Fraksi 6 (Vial 44-50)

1,2 1,2
Rf : =0,1500 Rf : =0,1500
8 8
1,8 1,9
Rf : =0,2250 Rf : =0,2375
8 8
2,6 2,6
Rf : =0,3250 Rf : =0,3250
8 8
5,0 5,0
Rf : =0,6250 Rf : =0,6250
8 8

Fraksi 7 (Vial 51-60)

1,3
Rf : =0,1625
8
2,0
Rf : =0,2500
8
5,0
Rf : =0,5250
8
 PEMBAHASAN

Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama yang lainnya.
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan
perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam tumbuhan.
Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian
campuran dengan memakai kolom. Sebelum melakukan percobaan kromatografiperlu
dipastikan kondisi dari eluennya, seperti pemilihan pelarut yang cocok. Pada pemisahan
menggunakan kromatografi kolom ini, campuran yang akan dipisahkan diletakkan
dibagian atas kolom yang terlebih dahulu telah dibuat.pelarut fase gerak dibiarkan
mengalir melewati kolom, karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat (gravitasi)
atau didorong dengn tekanan. Pita senyawa larut bergerak melalui kolom dengan laju
berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi-fraksi ketika keluar dari kolom (
sudjadi 1986).

Pada praktikum kromatografi ini digunakan metode kromatografi kolom basah,

dimana silica gel tersebut dilarutkan terlebih dahulu atau disuspensikan didalam cairan
atau pelarutnya yang nantinya akan digunakan, kemudian dimasukkan kedalam kolom
sedikit demi sedikit dan perlahan, pastikan tidak terdapat gelembung udara yang ada di
dalam kolom. Penambahan pelarut atau eluen harus tetap dilakukan terus menerus yang
fungsinya mecegah terjadinya kerusakan atau pecahnya kolom yang diakibatkan
adanya rongga udara. Tambahkan kolom tersebut hingga batas tanda sambil keran
bawah tabung dibuka. Setelah kolom berada pada batasnya, tutp bagian bawah keran.
Sambil menunggu kolom preparatif siap untuk digunakan, maka kita persiapkan ekstrak
atau campuran yang nantinya akan dipisahkan. Pertama ekstrak dikeringkan dengan
silica gel hingga berbentuk butir-butir yang menyerupai pasir. Kemudian ditambahkan
dengan eluen untuk melarutkan dan setelah itu dimasukkan kedalam tabung diatas
kolom yang telah dibuat sebelumnya. Setelah itu ditambahkan eluen hingga batas pada
tabung sekitar 3 cm. kemudian eluen dialirkan keluar tabung melalui kran bawah,
sambil eluen dialirkan keluar kolom, penambahan eluen harus tetap dilakukan untuk
mencegah keringnya kolom didalam tabung.

Jika kolom masih berwarna putih maka penambahan eluen serta pengeluaran
eluen tetap dilakukan sampai seluruh kolom sudah tidak berwarna putih seperti
awalnya. Setelah kolom kromatografi tidak berwarna maka mulai diatur kecepatan
tetesan yang keluar dari tabung kolom kromatografi tersebut, cairan yang keluar dari
tabung kolom kromatografi tersebut ditampung dalam vial yang sudah dikalibrasi
sebesar 5 ml pada tiap tabungnya. Sambil tetap ditambahkan eluen dari atas tabung
hingga didapat 60 vial. Dari 60 vial tersebut kita tutup dan diberikan lubang udara pada
penutup vial tersebut, dan dibiarkan selama 3 hari. Setelah itu fraksi dalam vial tersebut
dilarutkan terlebih dahulu dengan eluennya, setelah itu baru dilakukan uji KLT pada
tiap-tiap fraksi yang sudah didapat. Dari hasil KLT tersebut didapatkan gambaran atau
nilai Rf smentara yang nantinya akan dikelompokkan lagi. Dari fraksi yang sama
kemudian fraksi-fraksi tersebut dijadikan satu dan di lakukan uji KLT untuk yang
kedua.
5. DOKUMENTASI

Memasukkan ekstrak
Proses fraksinasi
Psidium guajava
6. KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan,

fraksinasi secara kromatografi kolom dari ekstrak tanaman Psidium guajava dengan
eluen n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 4:1 menghasilkan 7 fraksi.

Pelarut yang digunakan pada kromatografi kolom harus dioptimasi terlebih

dahulu dan harus dilakukan penggantian pelarut secara bertahap, non polar-semi polar-
polar agar terbentuk fraksi yang beragam. harus dipilih pula eluen yang tepat untuk
melakukan analisa pada KLT.