Anda di halaman 1dari 7

Apoptosis plasenta pada preeklampsia, retardasi pertumbuhan

intrauterin, dan sindrom HELLP: Studi imunohistokimia dengan


caspase-3 dan bcl-2

U. Cali1, S. Cavkaytar2, L. Sirvan3, N. Danisman4


1
Department of Obstetrics and Gynecology, Ataturk Education and Research Hospital, Ankara
2
Department of Obstetrics and Gynecology, Kecioren Education and Research Hospital, Ankara
3
Department of Pathology, Dr. Zekai Tahir Burak Woman Health Education and Research Hospital,
Ankara
3
Department of Obstetrics and Gynecology, Dr. Zekai Tahir Burak Woman Health Education and
Research Hospital, Ankara (Turkey

Ringkasan
Tujuan: Untuk menguji ekspresi plasenta dari caspase-3 dan bcl-2 pada kehamilan dengan
komplikasi preeklamsia, IUGR, dan sindrom HELLP. Bahan dan Metode: Sebuah studi kasus-
kontrol prospektif dilakukan pada 50 wanita hamil antara Desember 2006 dan Agustus 2007 di
Penelitian Dr. Zekai Tahir Burak Wanita Kesehatan dan Rumah Sakit Pendidikan, Ankara,
Turki. Sampel jaringan plasenta diperoleh dari 15 kehamilan dengan komplikasi preeklamsia,
15 kehamilan dengan IUGR normotensif, lima kehamilan dengan sindrom HELLP, dan 15
kehamilan usia kehamilan yang sesuai dengan usia kehamilan tanpa infeksi intrauterin sebagai
kelompok kontrol. Ekspresi plasenta caspase-3 dan bcl-2 telah diteliti dengan pewarnaan
imunohistokimia. Hasil: Skor imunostaining Caspase-3 secara signifikan lebih tinggi pada
setiap kelompok bila dibandingkan dengan kelompok kontrol (p = 0,002). Namun tidak ada
perbedaan yang signifikan secara statistik dengan immunostaining bcl-2 di setiap kelompok
bila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kesimpulan: Apoptosis marker caspase-3
meningkat secara signifikan di trofoblas viliar pasien dengan preeklampsia, sindrom HELLP,
dan IUGR menunjukkan peningkatan apoptosis plasenta.
Kata kunci: Caspase-3; Bcl-2; Apoptosis; Preeclampsia; IUGR; HELLP syndrome.

Kata Pengantar
Gangguan kehamilan hipertensi seperti preeklamsia, hemolisis, peningkatan enzim
hati, dan sindrom trombosit yang rendah (HELLP), serta retardasi pertumbuhan intrauterin
(IUGR) masih merupakan salah satu penyebab paling umum morbiditas dan mortalitas
ibu-janin. Meskipun etiologi gangguan kehamilan ini masih belum jelas, umumnya
diyakini bahwa gangguan invasi trofoblas memainkan peran kunci dalam etiologi.
gangguan / invasi interstitial trofoblastik yang dangkal menyebabkan maladaptasi dari
arteri uteroplasenta, kemudian faktor plasenta dilepaskan ke dalam sirkulasi ibu yang
menyebabkan kerusakan endotel maternal
Apoptosis, suatu bentuk kematian sel terprogram, dari trofoblas telah terdeteksi pada
plasenta manusia normal dan pada plasenta preeklampsia, IUGR, dan sindrom HELLP.
Pada preeklampsia atau IUGR, perubahan dalam regulasi apoptosis dari trofoblas vili
dan ekstravili menghasilkan perubahan invasi trofoblastik dan kemudian terjadi pada
sirkulasi maternal yang menimbulkan gejala klinis. Namun, dalam literatur penilaian
apoptosis plasenta berbeda karena teknik dan metode kuantifikasi yang berbeda
mekanisme molekuler yang mengarah ke apoptosis yang kompleks dan termasuk jalur
transduksi sinyal yang memicu atau menghambat apoptosis. Pemicu apoptosis tergantung
pada keseimbangan antara protein pro dan anti-apoptosis
Caspase 3 adalah anggota dari bagian asam sistein-aspartat (caspase) dan ada sebagai
zymogen (pro-caspase) di hampir semua sel dan terlibat dalam pengembangan kematian
sel apoptosis.
Bcl-2 adalah protein anti-apoptosis yang diekspresikan pada lapisan trofoblas vili
plasenta dan ekspresi bcl-2 yang tinggi di sinsitiotrofoblas akan melindungi lapisan kunci
vili plasenta dari apoptosis.
Hasilnya ada kontroversi tentang peran apoptosis plasenta pada gangguan kehamilan
hipertensi dan IUGR. Peningkatan apoptosis plasenta dan penurunan apoptosis plasenta
pada gangguan kehamilan hipertensi dan IUGR telah dilaporkan dalam literatur.
Dalam penelitian ini, penulis telah menyelidiki ekspresi caspase-3 dan bcl-2 dalam
sampel jaringan plasenta dari kehamilan disertai dengan preeklamsia, sindrom HELLP,
dan IUGR.

Bahan dan Metode


Ini adalah studi kasus-kontrol prospektif yang dilakukan pada 50 wanita hamil antara
Desember 2006 dan Agustus 2007 di Departemen Obstetri dan Ginekologi di Rumah Sakit
Penelitian dan Pendidikan Kesehatan Dr. Zekai Tahir Burak, Ankara, Turki.
Sampel jaringan plasenta diperoleh dari 15 kehamilan dengan komplikasi
preeklamsia, 15 kehamilan dengan IUGR normotensif, lima kehamilan dengan sindrom
HELLP, dan 15 kehamilan usia kehamilan yang sesuai dengan usia kehamilan tanpa
infeksi intrauterin sebagai kelompok kontrol. Informed consent tertulis diperoleh dari
semua subyek dan protokol penelitian telah disetujui oleh Komite Etika Kelembagaan.
Gambar 1. - Pewarnaan sitoplasma dengan caspase-3 dalam plasenta.
A) Immunostaining Lemah dan focal (+1) pada sindrom HELLP plasenta dari 27
minggu (200x).
B) Lemah dan immunostaining difus (+2) pada IUGR plasenta dari 38 minggu (200x).

Preeklampsia dan HELLP sindrom didefinisikan menurut Program Pendidikan


Tekanan Darah Tinggi Nasional. IUGR didefinisikan sebagai perkiraan berat janin atau
pengukuran dari abdomen janin <5 persentil untuk usia kehamilan, dikonfirmasi saat
persalinan (berat lahir <5 persentil untuk usia dan jenis kelamin) dan tidak terkait dengan
aneuploidy, anomali struktural, atau infeksi kongenital.
Sampel plasental diambil dari kedua persalinan pervaginam dan seksio sesaria.
Analisis dilakukan dalam dua sampel plasenta dari bagian tengah setiap masing-masing
dari plasenta per pasien. Sampel dipotong kecil-kecil (2 x 2 x 2 cm) dan dengan cepat tetap
di 10% formalin selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah fiksasi, sampel ditanam dalam
lilin parafin. Dari blok-blok ini, tiga bagian 5 μm dipotong untuk setiap sampel plasenta
dan dipasang pada slide. Slide ini diwarnai dengan hematoxylin dan eosin dan setidaknya
20 bidang diperiksa per slide. Jenis sel yang berbeda dalam plasenta diidentifikasi di
bawah mikroskop cahaya dan dipilih untuk imunohistokimia. Imunohistokimia untuk
caspase-3 dan bcl-2α dibentuk menggunakan kombinasi metode streptavidin-biotin-
peroksidase dan pengambilan kembali antigen microwave pada jaringan tertanam
parafinin formalin. Setelah deparaffinisasi, sampel diberi dengan 10% hidrogen
peroksidase dalam air yang disaring untuk memblokir aktivitas peroksidase endogen.
Untuk mendapatkan antigen, slide diperlakukan dengan 10 mmol / l citrate buffer (pH:
6.8) selama 10 menit. Setelah preinkubasi dengan blok Ultra V (Lab Vision) selama 20
menit, sampel diinkubasi dengan antibodi primer selama satu jam pada suhu kamar untuk
caspase-3 (antibodi poliklonal kelinci, CPP32.7 ml, Neomarkers) dan bcl-2α Ab-1 (
antibodi monoklonal tikus, Clone 100 / D5.7 ml, Neomarkers).
Kontrol positif adalah jaringan limfoid untuk caspase-3 dan limfoma untuk bcl 2α.
Kontrol negatif dicapai dengan cara yang sama tanpa penerapan antibodi primer. Bagian
diperiksa oleh ahli patologi pada daya tinggi (x200) dalam desain buta. Evaluasi
imunohistokimia dilakukan di epitel sel-sel trofoblas. Persentase daerah yang diwarnai
positif ke total luas trofoblas vili di setiap bagian dihitung
Skor pewarnaan untuk caspase-3 dan bcl-2 diberi label sebagai ‘0’ tanpa
immunostaining, ‘1 +’ untuk immunostaining lemah dan fokus, ‘2 +’ untuk
immunostaining lemah dan menyebar, ‘3 +’ untuk kuat dan immunostaining difuse. Hasil
dari semua empat skor dari masing-masing kasus dirangkum untuk mencapai hasil
immunostaining akhir.
Analisis statistik dari data dilakukan dengan menggunakan SPSS 13. Untuk
menganalisis korelasi antara skor dari masing-masing kelompok, tes Kruskal-Wallis
digunakan. Perbedaan diterima sebagai signifikan untuk p <0, 05

Table 1. — Karakteristik klinis masing-masing kelompok.


Preeclampsia Control IUGR HELLP
n = 15 n = 15 n = 15 n=5

Age (yrs) 28.9 ± 8.6 27.1 ± 4.9 25.3 ± 5.6 29 ± 4.6

Parity 1.9 ± 0.7 2.1 ± 1.2 2.3 ± 1.4 2±1

Gestational age(wks) 35.7 ± 3.4 35.1 ± 4.2 37.8 ± 2.3 26.5 ± 1.8¶
Fetal weight (g) 2070 ± 754 2633 ± 1078 2146 ± 415 650 ± 241†
Data are shown as means and standard deviations.

p < 0.05.

p < 0.05.
\
Table 2. — Analisis kualitatif skor ekspresi caspase-3 dan bcl-2 di masing-masing
kelompok.
Preeclampsia Control IUGR HELLP P
n = 15 n = 15 n = 15 n=5

Caspase-3 1.0 ± 0.4* 0.5 ± 0.5 1.2 ± 0.4¶ 1,2 ± 0,5† 0.002

Bcl-2 1.9 ± 0.8 2.3 ± 0.5 2.1 ± 1.0 2,2 ± 0,8 0.518
* Data ditampilkan sebagai sarana dan standar deviasi.
* Intensitas immunostaining dinilai '0' tanpa immunostaining, '1+' untuk immunostaining
lemah dan fokal, '2+' untuk immunostaining lemah dan menyebar, '3+' untuk
immunostaining yang kuat dan menyebar.
* Jika dibandingkan dengan kelompok kontrol * p = 0,015, ¶p = 0,001, † p = 0,015.

Hasil

Karakteristik klinis pasien dirangkum dalam Tabel 1. Tidak ada perbedaan yang
signifikan dalam usia materal dan paritas antara kelompok studi. Namun usia kehamilan
dan berat janin secara signifikan lebih rendah pada kelompok HELLP daripada kelompok
kontrol (p <0, 05).
Analisis imunohistokimia dari caspase-3 dan bcl-2 dalam sampel jaringan plasenta
pasien ditunjukkan pada Tabel 2. Contoh pewarnaan plasenta dengan caspase-3 dan bcl-2
ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2.

Figure 2. — Pewarnaan sitoplasma dengan bcl-2 pada plasenta.


a) Immunostaining yang lemah dan fokal (+1) dalam plasenta 28 minggu pada kelompok
preeklampsia (200x).
b) Imunostaining yang lemah dan difus (+2) dalam plasenta 39 minggu pada kelompok
kontrol (200x).
c) Imunostaining kuat dan difus (+3) dalam plasenta 37 minggu pada kelompok IUGR
(200x).
Skor ekspresi imunostaining caspase-3 adalah 1,0 ± 0,4 pada kelompok
preeklampsia, 1,2 ± 0,4 pada kelompok IUGR, 1,2 ± 0,5 pada kelompok HELLP, dan 0,5
± 0,5 di kelompok kontrol.
Akibatnya, skor imunostaining caspase-3 secara signifikan lebih tinggi pada setiap
kelompok bila dibandingkan dengan kelompok kontrol (p = 0,002). Ketika penulis
membandingkan masing-masing kelompok dengan kelompok kontrol secara terpisah,
setiap kelompok berwarna lebih kuat dengan caspase-3 daripada kelompok kontrol.
Pembahasan
Aliran darah uteroplasenta yang berubah merupakan sebuah peristiwa kehamilan
abnormal baik pada preeklampsia atau IUGR. Sebuah model terbaru untuk patogenesis
preeklampsia menggambarkan suatu proses dimana faktor plasenta dilepaskan ke dalam
sirkulasi ibu yang menyebabkan kerusakan endotelium maternal dengan respon inflamasi
sistemik.
Respon inflamasi sistemik maternal juga terjadi pada kehamilan normal tetapi lebih
parah pada preeklamsia. Faktor plasenta tampaknya menjadi puing-puing sinsiotrofoblas
dilepaskan ke dalam sirkulasi ibu sebagai akibat dari apoptosis sinsiotrofoblas, yang
merupakan bagian dari pergantian dan perbaikan sel normal.
Apoptosis adalah istilah deskriptif untuk morfologi kematian sel dan dapat menjadi
bagian dari fisiologi normal atau sekunder untuk kondisi patologis. Apoptosis trofoblas
telah terdeteksi pada plasenta manusia normal dan plasenta preeklampsia, IUGR, dan
sindrom HELLP.
Dalam literatur penilaian apoptosis plasenta berbeda karena teknik dan metode
kuantifikasi yang berbeda dan sebagai hasilnya ada kontroversi tentang peran apoptosis
plasenta pada gangguan kehamilan hipertensi dan IUGR.
Meskipun peningkatan apoptosis plasenta pada kehamilan abnormal umumnya
diterima, ada juga beberapa penelitian yang menunjukkan penurunan apoptosis plasenta
pada gangguan kehamilan hipertensi dan IUGR.
Dalam penelitian ini, penanda apoptosis caspase-3 meningkat secara signifikan di
trofoblas viliar pasien dengan preeklamsia, sindrom HELLP, dan IUGR dibandingkan
dengan kelompok kontrol. Namun pewarnaan plasenta anti apoptosis plasenta bcl-2
menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik di antara kelompok-
kelompok.
Dalam literatur, ada hasil yang sama menunjukkan peningkatan apoptosis plasenta
pada kehamilan rumit dengan IUGR dan preeklampsia seperti dalam penelitian ini.
Ishihara dkk. telah menunjukkan peningkatan apoptosis seluruh fas antigen dan bcl-
2 pada plasenta jangka manusia baik oleh preeklampsia atau IUGR. Laporan lain yang
mempelajari plasenta pada kehamilan dengan komplikasi preeklampsia menunjukkan
apoptosis luas dengan penurunan ekspresi bcl-2.
Namun ada juga beberapa penelitian melaporkan penurunan apoptosis plasenta pada
kehamilan dengan komplikasi IUGR dan preeklamsia. Kadyrov dkk. menunjukkan
penurunan apoptosis dalam trofoblas ekstravili di plasenta preeklampsia menggunakan
antibodi M30 [15] dan studi lain oleh Stepan et al. menunjukkan bahwa mediator apoptosis
BNip3 dan Nix mengalami penurunan dalam sel-sel trofoblas vili pasien dengan
preeklamsia, sindrom HELLP dan IUGR. Mereka menjelaskan penurunan apoptosis
sebagai toleransi terhadap hipoksia kronis pada plasenta yang dapat menyebabkan
apoptosis trophoblas yang kurang seperti yang diharapkan.
Fitur apoptosis plasenta ini kontroversial karena pembatasan metodologis yang
terkait dengan keterbatasan penyelidikan jaringan manusia dan penelitian pada hewan.
Basal plate dari plasenta atau spesimen kuretase yang telah digunakan dalam kebanyakan
penelitian, tetapi kejadian patogenik terjadi di bagian alas dari plasenta.
Spesimen biopsi plasenta hanya tersedia dalam beberapa kelompok yang diperoleh
biasanya pada saat operasi caesar atau dari uteri histerektomi. Juga patogenesis IUGR dan
preeklampsia terjadi pada tahap awal kehamilan, sehingga tidak mungkin mendapatkan
biopsi plasenta pada waktu itu.
Dalam kasus hewan percobaan, hal ini juga sulit untuk membuat model yang mirip
dengan kehamilan manusia karena variasi dalam invasi trofoblas antara hewan percobaan.
Sebagian besar studi terkait plasenta telah berfokus pada perubahan nuklir yang terjadi
dalam proses apoptosis yang merupakan kriteria yang relatif subjektif. Namun apoptosis
pada trofoblas manusia adalah proses yang sangat kompleks yang terdiri dari banyak jalur
transduksi sinyal, regulator bcl-2, caspase, dan substrat. Juga untuk mengurangi bias dalam
kuantifikasi pewarnaan imunohistokimia di plasenta, metode yang lebih kuantitatif seperti
analisis citra harus lebih disukai.
Akibatnya, kaskade kompleks apoptosis pada plasenta manusia, kesulitan dalam
mendapatkan biopsi plasenta, sejumlah kecil bahan studi, dan variasi dari invasi trofoblas
pada hewan percobaan terdiri kontroversi tentang apoptosis plasenta manusia pada
kehamilan abnormal. Masalah-masalah metodologis ini tampaknya sulit dipecahkan saat
ini, namun untuk penelitian di masa mendatang kita harus menyadari keterbatasan ini.