BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Vitamin adalah suatu zat senyawa kompleks yang sangat dibutuhkan oleh
tubuh kita yang berfungsi untuk mambantu pengaturan atau proses kegiatan tubuh.
Tanpa vitamin manusia, hewan dan makhluk hidup lainnya tidak akan dapat
melakukan aktifitas hidup dan kekurangan vitamin dapat menyebabkan
memperbesar peluang terkena penyakit pada tubuh kita.

Vitamin memiliki peranan spesifik di dalam tubuh dan dapat pula

memberikan manfaat kesehatan. Bila kadar senyawa ini tidak mencukupi, tubuh
dapat mengalami suatu penyakit. Tubuh hanya memerlukan vitamin dalam jumlah
sedikit, tetapi jika kebutuhan ini diabaikan maka metabolisme di dalam tubuh kita
akan terganggu karena fungsinya tidak dapat digantikan oleh senyawa lain.
Gangguan kesehatan ini dikenal dengan istilah avitaminosis. Di samping itu,
asupan vitamin juga tidak boleh berlebihan karena dapat menyebabkan gangguan
metabolisme pada tubuh.

Ada dua golongan vitamin, yaitu vitamin yang larut dalam lemak dan
vitamin yang larut dalam air. Vitamin yang larut dalam lemak adalah vitamin A,
D, E, dan K. sedangkan vitamin yang larut dalam air adalah B (thiamin, riboflavin,
niacin, piridoksin, asam pantothenat, biotin, sianokobalamin, choline, inositol) dan
vitamin C. Kedua golongan vitamin ini mempunyai sifat umum yang berbeda-
beda. Ada beberapa senyawa yang berhubungan dengan vitamin, yaitu antivitamin,
yang kerjanya dapat merusak struktur vitamin, dan antagonis vitamin, yang
kerjanya dapat dapat berkompetisi dengan vitamin.

Dalam penentuan apakah makanan itu mengandung vitamin apa tidak,

diperlukan suatu pengujian agar dapat mengetahui kadar vitamin yang ada
seperti vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12, C, D, E, dan K. Untuk
mengetahui adanya suatu vitamin dalam suatu bahan diperlukan suatu analisa
baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Dengan mengetahui kadar vitamin
yang ada dalam bahan pangan, maka kita dapat mengetahui kadar vitamin yang
diperlukan oleh tubuh kita agar tidak terjadi kekurangan vitamin yang dapat
mengganggu kesehatan tubuh kita. Oleh karena itu dalam makalah ini akan
dibahas analisis mengenai beberapa jenis vitamin yakni vitamin B vitamin C
dan vitamin K dengan beberapa metode baik secara kualitatif maupun
kuantitatif.
2 Rumusan Masalah

3. Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi vitamin
2.. Untuk mengetahui apa saja metode yang digunakan untuk menganalisis
vitamin.
 BAB II
PEMBAHASAN

1. Definisi
Vitamin adalah suatu zat senyawa kompleks yang sangat dibutuhkan
oleh tubuh kita yang berfungsi untuk membantu pengaturan atau proses
kegiatan tubuh. Tanpa vitamin manusia, hewan dan makhluk hidup lainnya
tidak akan dapat melakukan aktifitas hidup dan kekurangan vitamin dapat
menyebabkan memperbesar peluang terkena penyakit pada tubuh kita.
Vitamin merupakan bahan makanan bukan penghasil energi, sehingga
harus diberikan dalam makanan sehari-hari untuk mendapatkan kesehatan
yang optimal. Vitamin merupakan senyawa-senyawa organik yang memegang
peranan penting dalam berlangsungnya berbagai proses vital di dalam tubuh.
Masing-masing vitamin memegang peranan yang spesifik yang pada akhirnya
dapat memengaruhi organisme keseluruhannya. Vitamin memiliki peran
sangat penting untuk pertumbuhan, pemeliharaan kesehatan, dan fungsi-
fungsi tubuh lainnya agar metabolisme berjalan normal (Sirajuddin, 2012).

2. Analisis Vitamin
A. Vitamin C
Vitamin C adalah vitamin yang termasuk dalam kelompok vitamin
larut dalam air dan dikenal sebagai vitamin anti askorbut karena dapat
menyembuhkan penyakit skorbut (Wardani,2012). Fungsi lain dari
vitamin C adalah sebagai antioksidan, penghasil senyawa transmiter saraf
dan hormon tertentu, membantu memperbaiki sel tubuh dan
meningkatkan kerja enzim sebagai faktor penyerap dan pengguna zat gizi
lainnya. Juga mengurangi tekanan darah tinggi, menurunkan kolesterol
darah, mengurangi risiko penyakit jantung dengan melindungi kerusakan
jantung dan pembuluh darah yang disebabkan oleh makanan kaya lemak.
Untuk dapat mengetahui kandungan yang terdapat dalam vitamin C maka
dapat dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif.
1. Analisis kualitatif Vitamin C
Analisis kualitatif dari vitamin C dapat dilakukan dengan beberapa
metode diantaranya yaitu titrasi asam basa dan dapat dilakukan dengan
menggunakan pereaksi benedict. Cara kerja dari metode ini yaitu:
a. Titrasi Asam Basa
Langkah awal yang dilakukan adalah dengan memasukkan sampel ke
dalam tabung reaksi sebanyak 2 mL, kemudian ditambahkan 2 tetes NaOH
10% dan 2 mL larutan FeSO4 5%. Kemudian dicampurkan hingga rata
kemudian mengamati perubahan yang terjadi. Uji positif timbul warna kuning.
b. Menggunakan pereaksi benedict
Ekstrak buah jambu biji merah dan filtrat dimasukkan dimasukkan
kedalam tabung reaksi menggunakan pipet sebanyak 5 tetes. Kemudian
ditambah 15 tetes pereaksi benedict dan dipanaskan diatas api kecil sampai
mendidih selama 2 menit. Adanya perubahan warna hijau kekuningan
menandakan adanya vitamin C pada sampel.

2. Analisis kuantitatif vitamin C

Analisis kuantitatif dari vitamin C dapat dilakukan dengan
beberapa metode, diantaranya:
a. Metode iodimetri
Dasar dari metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat. Metode
iodometri (titrasi langsung dengan larutan baku 0,1 N) dapat digunakan
terhadap asam askorbat murni atau larutannya. Prosedur penetapan kadar
vitamin C secara iodometri: Sekitar 400 mg asam askorbat yang ditimbang
seksama dilarutkan dalam campuran yang terdiri atas 100 mL air bebas
oksigen dan 25 mL asam sulfat encer. Larutan dititrasi dengan iodium 0,1
N menggunakan indikator kanji sampai terbentuk warna biru.
b. Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP)
Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP) ini berdasarkan atas
sifat mereduksi asam askorbat terhadap zat warna 2,6-
diklorofenolindofenol membentuk larutan yang tidak berwarna. Pada titik
akhir titrasi, kelebihan zat warna yang tidak tereduksi akan berwarna
 merah muda dalam larutan asam. Metode ini tidak spesifik karena
beberapa senyawa mereduksi lainnya dapat mengganggu penetapan.
Senyawa pengganggu tersebut adalah senyawa sulfhidril, tiosulfat,
riboflavin dll.
c. Metode kolorimetri 4-metoksi-2-nitroanilin

Sebanyak 2 mL pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin ditambah 2 mL

natrium nitrit 0,2% diaduk hingga warna jingga hilang lalu ditambah 75 mL
n-butil alcohol dan dicampur. Larutan ini selanjutnya ditambah 0,5-2mg asam
askorbat 0,5% dan dipindahkan ke dalam corong pemisah. Selanjutnya larutan
ditambah 25 mL natrium hidroksida 10% dan 150 mL dietil eter. Lapisan
organic dicuci tiga kali dengan 15 mL natrium hidroksida 10%. Lapisan air
dan cairan hasil cucian dengan air diencerkan dengan air hingga 200 mL.
absorbansi larutan diukur terhadap blangko pada 570 nm.
d. Metode spektrofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi
maksimum pada 264 nm. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser
oleh adanya asam mineral. Asam askorbat dalam asam sulfat 0,01 N memiliki
panjang gelombang maksimal 245 nm.
e. Metode spektrofluorometri
Metode ini digunakan untuk analisis kuantitatif vitamin C yang linier
pada kisaran konsentrasi asam askorbat 9,0 x 10-8sampai 3,6 x 10-8. Suatu
hubungan linier diperoleh antara penurunan intensitas fluoroensi MB dan
konsentrasi AA pada kisaran 3,0 x 10-7 sampai 6,0 x 10-6 . batas deteksi
metode ini 2,5 x 10-7 m. metode ini telah sukses digunakan untuk menetapkan
kadar vitamin C dalam tablet suplemen vitamin.
f. Metode kromatografi

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah

dikembangkan untuk penentuan asam askorbat dalam minimum ringan dan
jus apel menggunakan tris 2,2-bipiridin ruthenium II. Sampel disaring dan
diencerkan sebelum dilakukan analisis dengan KCKT dan tidak ada pra-
perlakuan lain yang dilakukan. Pemisajhan asam askorbat menggunakan
kolom oktadesil silan (ODS, C18) menggunakan fase gerak larutan buffer
NaH2PO4-K2HPO4 (pH 6,5). Aliran fase gerak 0,3 mL/menit. Asam askorbat
 yang terelusi dicampur dengan (Ru(bpy)32+ 0,5 mM dan diosidasi pada 1,5
V (dengan elektroda Ag/AgCl).

B. Vitamin B
1. Uji kualitatif dan kuantitaif vitamin B1
a. Uji kualitatif :

Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan sedikit serbuk (sampel)

ke dalam tabung reaksi. Kemudian tambhkan 3 tetes NaOH 30%, 3 tetes
K3Fe(CN)6 0,6% dan 1 mL isobutanol. Kemudian dikocok hingga
bercampur rata. Kemudian perhatikan larutan campuran tersebut di bawah
lampu ultraviolet. Apabila hasil campuran tersebut menjadi berwarna biru
maka uji positif pada sampel.

b. Uji Kuantitatif :
1). Metode Kolorimetri
Dasar metode ini adalah reaksi antara tiamin dengan 6-aminotimol
yang telah didiazotasi. Hasil peruraian tiamin tidak menghasilkan
warna dengan pereaksi ini. Dekstrosa, laktosa, maltosa, sukrosa,
tepung, kasein, gelatin, pepton, urea, gliserofosfat dan logam berat,
dengan kadar 100 kali lebih besar dari kadar tiamin tetap tidak
mengganggu. Riboflavin, asam nikotinat, nikotinamid, piridoksin,
asam pantotenat, guanin, adenin, triptopan, tirosin dan histidin yang
terdapat dengan kadar 20 kali lebih besar daripada kadar tiamin juga
tidak mengganggu. Pereaksi 6-aminotimol dibuat dengan melarutkan
50 mg 6-aminotimol dalam 50 mL asam klorida 0,35% dan
mengencerkannya dengan air secukupnya hingga 200 mL. Prosedur
penetapan kadar tiamin murni dengan pereaksi 6-aminotimol: Sejumlah
5,0 pereaksi 6-aminotimol didinginkan dengan es, ditambah 2,0 mL
natrium nitrit 0,1%, lalu dicampur dan didiamkan selama 1 menit.
Larutan selanjutnya ditambah 5,0 mL natrium hidroksida 20% dan
diencerkan dengan air secukupnya sampai 20,9 mL. Sejumlah 1,0
pereaksi ini ditambah 1,0 larutan sampel. Setelah 5 menit larutan
 diencerkan dengan air untuk mendapatkan absorbansi yang sesuai.
Digunakan larutan blanko.
Jika larutan sampel telah berwarna atau keruh, dilakukan
penetapan seperti diatas kemudian warna yang terjadi disari dengan
campuran pelarut yang terdiri atas 90 mL toluen yang telah didestilasi
ulang (redestilasi) dan 10 mL n-butanol. Lapisan pelarut organik
dipisahkan dan ditambah ± 1 gram natrium sulfat anhidrat untuk
mengeringkan pelarut lalu diukur absorbansinya.

2). Metode Alkalimetri

Adanya hidroklorida pada tiamin hidroklorida dapat dititrasi
dengan natrium hidroksida 0,1 N menggunakan indikator brom timol
biru. Prosedur penetapan kadar tiamin hidroklorida dengan metode
alkalimetri: Lebih kurang 500 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang
seksama, dilarutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu dititrasi dengan
NaOH 0,1 N menggunakan indikator brom timol biru. Tiap mL NaOH
0,1 N setara dengan 33,70 gram tiamin hidroklorida. Berat ekivalen
(BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara alkalimetri adalah
sama dengan berat molekulnya (BM). Hali ini disebabkan karena tiap 1
mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 1 mol NaOH.
3). Metode Titrasi Bebas Air (TBA)
Tiamin hidroklorida dalam asam asetat glasial dapat dititrasi
dengan asam perklorat dengan sebelumnya ditambah raksa (II) asetat
berlebihan. Kedua atom nitrogen dalam tiamin hidroklorida tertitrasi
sehingga berat ekivalennya setengah dari berat molekulnya. Sebagai
indikator dapat digunakan p-naftol benzen, merah kuinaldin, atau
dengan kristal violet.
Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode TBA: Lebih
kurang 250 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang seksama ditambah
10 mL asam asetat glasial, 10 mL raksa (II) asetat 5% dalam asam asetat
glasial, dan ditambah 20 mL dioksan. Selanjutnya larutan dititrasi
dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan indikator 3 tetes kristal
violet sampai warna biru. Tiap mL asam perklorat 0,1 N setara dengan
16,86 mg tiamin hidroklorida. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida
 pada penetapan secara titrasi bebas air adalah setengah dari berat
molekulnya (BM/2). Hali ini disebabkan karena tiap 1 mol tiamin
hidroklorida bereaksi dengan 2 mol HClO4.
4). Metode Argentometri

Adanya klorida dalam tiamin hidroklorida dapat ditetapkan

secara argentometri dengan menggunakan metode Volhard. Pada
penetapan dengan metode Volhard suasananya harus asam sebab jika
suasananya basa maka akan terjadi reaksi antara perak nitrat dengan
basa membentuk Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan
membentuk endapan putih Ag2O, akibatnya perak nitrat tidak hanya
bereaksi dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa.
Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara argentometri:
Lebih kurang 100 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang secara
seksama dilarutkan dalam 20 mL air. Larutan diasamkan dengan asam
nitrat encer dan ditambah 10 mL perak nitrat 0,1 N. Endapan yang
terjadi disaring dan dicuci dengan air sampai tidak mengandung
klorida. Filtrat selanjutnya dititrasi dengan larutan baku ammonium
tiosianat 0,1 N menggunakan indikator besi (III) amonium sulfat. Tiap
mL perak nitra 0,1 N setara dengan 16,86 mg tiamin hidorklorida. Berat
ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara argentometri
adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Hal ini disebabkan
karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida (yang mengandung 2 Cl-)
bereaksi dengan 2 mol AgNO3.
5). Metode Gravimetri
Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat
ditetapkan secara gravimetri dengan cara mengendapkan larutan tiamin
menggunakn asam silikowolframat.
Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode gravimetri:
Sejumlah tertentu tablet yang telah ditimbang secara seksama dan setara
dengan lebih kurang 50 mg tiamin hidroksida, diencerkan dengan air
secukupnya hingga 50 mL lalu ditambah 2 mL asam klorida pekat dan
dipanaskan hingga mendidih. Pada larutan yang telah mendidih ini
selanjutnya ditambah dengan cepat tetes demi tetes 4 mL asam
 silikowolframat yang baru disaring lalu dididihkan selama 4 menit.
Larutan disaring melalui penyaring kaca masir lalu dicuci dengan 50
mL campuran mendidih yang terdiri atas 1 bagian volume asam
klorida pekat dan 19 bagian air yang mengandung asam
silikowolframat 0,2% (b/v), kemudian dicuci 2 kali tiap kali dengan
5 mL aseton. Sisa dikeringkan pada suhu 105oC selama satu jam lalu
didinginkan selama 10 menit dan dibiarkan dalam eksikator di atas
larutan asam sulfat 38% dan ditimbang. Tiap gram sisa setara
dengan 192,9 mg tiamin hidroklorida.

2. Uji kualitatif dan kuantitaif vitamin B2

a. Analisis kualitatif Ribofavin (Vitamin B2)
Vitamin B2 disebut juga riboflavin karena strukturnya mirip
dengan gula ribose dan juga karena ada hubungan dengan kelompok
flavin. Riboflavin larut dalam air dan member warna fluorosen kuning-
kehijauan. Riboflavin sangat mudah rusak oleh cahaya dan sinar
ultraviolet, akan tetapi tahan terhadap panas, oksidator, dan asam.
Kelarutan Riboflavin dalam air bervariasi dari 1 bagian riboflavin
dalam 3000 bagian air sampai 1 bagian riboflavin dalam 15.000 bagian
air. Variasi ini disebabkan oleh variasi bentuk kristalnya.
Berdasarkan pada sifat-sifat di atas pada waktu penetapan kadar,
riboflavin harus terhindar cahaya. Penyinaran dengan sinar ultraviolet
atau cahaya tampak terhadap larutan riboflavin dalam basa
menghasilkan lumiflavin sedangkan larutan riboflavin dalam suasana
netral atau asam menghasilkan lumikrom yang berfluorsensi biru.
b . Analisis kuantitatif Ribofavin (Vitamin B2)

1). Metode spektrofluorometri

Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran

yang bebas dari senyawa berwarna yang mengganggu atau senyawa
pengganggu lain yang mengandung riboflavin lebih besar dari 0,1
%.
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran
yang tidak mengandung senyawa berfluorosensi atau senyawa
 berwarna yang larut dalam air atau dalam asam encer. Pengukuran
harus dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar
ultraviolet. Larutan sampel : Sejumlah serbuk yang ditimbang
seksama dan setara dengan lebih kurang 2,5 mg riboflavin
dimasukkan ke dalam labu 250 mL lalu ditambah 1 mL asam asetat
32,5% dan air secukupnya hingga 200 mL. Lalu dipanaskan di atas
penangas air sambil sering dikocok hingga riboflavin larut lalu
didinginkan hingga suhu 20ºC.
Larutan ditambah air secukupnya hingga 250 mL dan dicampur
baik-baik. Larutan riboflavin baku persediaan I, dibuat dengan
melarutkan 50 mg riboflavin yang telah dikeringkan pada suhu 105
ºC selama 2 jam dalam asetat 0,02 N secukupnya hingga 500 mL.
Larutan riboflavin baku persediaan II, dibuat dengan cara
menambah 10,0 mL larutan riboflavin baku persediaan I dengan
asam asetat 0,02 N secukupnya hingga 100 mL. Larutan riboflavin
baku, dibuat dengan mengencerkan 10,0 mL larutan riboflavin baku
persediaan II dengan air secukupnya hingga 100 mL.

2). Metode spektrometri

Larutan riboflavin dalam pH 4,0 menunjukkan absorbs
maksimum (λ maks) pada 444 nm. Cara ini digunakan untuk
menetapkan kemurnian riboflavin atau untuk penetapan riboflavin
dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya. Prosedur penetapan
kadar riboflavin tunggal secara spektrofotometri: Sekitar 100 mg
riboflavin yang ditimbang seksama dilarutkan dengan pemanasan
dalam campuran 2 mL asam asetat glacial dan 150 mL air. Larutan
selanjutnya diencerkan dengan air, didinginkan, ditambah air
secukupnya hingga 1000 mL. pada 10,0 mL larutan ditambah 3,5
mL natrium asetat 0,1 M kemudian ditambah air secukupnya hingga
100 mL. kadarnya dihitung dengan menggunakan riboflavin baku
sebagai pembanding.
 3. Uji kualitatif dan kuantitaif vitamin B6

1). Metode spektrofotometri

Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin dan piridoksal
menunjukkan daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada
maksimum untukketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan buffer ph
6,75 dapat diterapkan pada panjang gelombag 325 nm. Pada panjang
gelombang ini, piridoksin dan piridoksamin menunjukkan absorbansi
maksimum.
Prosedur penetapan dalam tablet tunggal secara spektrofotometri:
Sebanyak 20 tablet ditimbang dan diserbuk. Pada sejumlah serbuk yang
ditimbang seksama yang setara dengan lebih kurang 25 mg piridoksin
hidroklorida ditambah 50 mL asam klorida 0,1 N sambil diaduk. Larutan
diencerkan dengan asam klorida secukupnya hingga 100 mL. larutan diukur
absorbansinya menggunakan kuvet dengan ketebalan 1 cm pada panjang
gelombang maksimum (291 nm)
2). Metode kolorimetri
Metode ini didasarkan pada reaksi fenol dengan 2,6-dikloro-p-benzokuin-
4-kloromina dengan menghasilkan warna biru yang dapat disari dengan pelarut
organik. Reaksi ini merupakan reaksi umum untuk senyawa fenol
berkedudukan para terhadap gugus hidroksil fenol tidak tersubsitusi.
3). Metode titrasi bebas air
Lebih kurang 300 mg piridoksin hidroklorida yang ditimbang seksama,
dilarutkan dalam 40 mL asam asetat glacial lalu dititrasi dengan asam perklorat
0,1 N menggunakan indicator 3 tetes Kristal violet samapai biru hijau. Tiam mL
asam perklorat 0,1 N setara dengan 20,56 mg piridoksin hidroklorida.
4). Metode kromatografi
Kromatofrafi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detector fluorometri telah
digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif vitamin B6 dalam ayam dan
bahan makanan lainnya.

4. Uji kualitatif dan kuantitaif vitamin B12 (sianokobalamin)

Sianokobalamin, C63H88O14N14Pco, merupakan senyawa kompleks
dengan kordinat kobalt berberat molekul 1355,4. Kristal vitamin B12 cepat
 menyerab lembab udara. Sianokobalamin bersifat netral dan mengandung gugus
sian. Gugus ini dapat diganti dengan berbagai ion untuk menghasilkan senyawa
baru seperti klorokobalamin dan hidroksokobalamin. Bila sianokobalamin
dihidrolisis dengan asam maka akan menghasilkan 5,6-dimetilbenzimdazol.
Metode penetapan kadar vitamin (sianokobalamin)
1) Metode spektrofotometri B12

Sianokobalamin dalam air menunjukkan absorbansi maksimun (λ maks) pada

278 ± 1nm, 361 nm dan 550 ±2 nm. Metode spektrofotometri tidak spesifik untuk
sianokobalamina karena senyawa bewarna merah dan pseudosiokobalamin
menunjukkan spektra absorbansi yang serupa. Metode yang paling sederhana adalah
dengan menetapkan pada 550 nm, tetapi metode ini hanya dapat digunakan terhadap
sianokobalamin yang bebas senyawa pengganggu.
Metode yang lebih peka ialah dengan melakukan penetapan pada panjang
gelombang 361 nm. Prosedur penetapan kadar sianokobalamin secara
spekrofotometri:
Lebih kurang 2 mg sianokobalamin yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam
akuades secukupnya dan diencerkan hingga 50,0 mL. Larutan diukur
absorbansinya dengan kuvet 1 cm pada panjang gelombang 361 nm. Harga
E1cm1% pada 361 nm adalah 207.
2) Metode kromatografi

Metode KCKT telah sukses digunakan untuk pemisahan dan analisis

kuantitatif vitamin B1, B2, dan campuran-campurannya dalam bebagai macam
bahan makanan. Berbagai macam isomer vitamin B12(sianokobalamin) yang ada
dalam berbagai macam susu juga telah dipisahkan dengan menggunakan metode
KCKT fase terbalik.
Sianokobalamin diekstraksi dari sampel dengan mencampur 25 mL susu dengan 2-
4 mL HCL 0,1 M pH 4,6. Campuran dipanaskan pada suhu 1200C selama 10 menit
dan selanjtnya disaring. pH filtrat diatur 5,5 dengan natrium hidroksida 0,1 M dan
diencerkan dengan akuades sampai 50mL. Sianokobalamin selanjutnya dipekatkan
pada cartridge oktadesil silan yang telah dikondisikan dengan 2 mL asetonitril dan
dicuci dengan 6 mL akuades. Filtrat selanjutnya dilewatkan melalui cartridge dan
selanjutnya cartridge dicuci dengan 12 mL air. Sianokobalamain dengan asetonitril:
iar(1:1 v/v) dan dipisahkan dengan kolom oktil silika. Elusi gradien dimulai dengan
 asetonitril: larutan amonium fosfat pH 3,0 (5:95) lalu konsentrasi asetonitril
ditingkatkan samapi 30% selama 16 menit. Konsentrasi vitamin B12 selanjutnya
dengan metode radioassay.

C. Vitamin A
1. Uji Kualitatif
 Uji Identifikasi Vitamin A dengan Pereaksi Carr-Price
Cara Analisis : a. Disiapkan alat dan bahan b. Dimasukkan 5 tetes minyak
ikan ke dalam tabung reaksi c. Ditambahkan 10 tetes kloroform, kemudian
homogenkan dengan baik d. Ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrit e.
Selanjutnya, dibubuhkan seujung sendok Kristal Sbcl3 ke dalamnya f.
Perhatikan perubahan warna g. Jika terbentuk warna biru yang akan berubah
menjadi merah coklat berarti vitamin A positif.
 Uji Identifikasi Vitamin A dengan Pereaksi Trikloroasetat (TCA)
Cara Analisis : a. Disiapkan alat dan bahan b. Dimasukkan 5 tetes minyak
ikan ke dalam tabung reaksi c. Tambahkan 1 ml pereaksi asam trikloroasetat
dalam kloroform d. Dihomogenkan dengan baik e. Amati warna yang
terjadi, jika timbul warna biru kehijauan menandakan positif vitamin A.
2. Uji Kuantitatif
Metode Kromatografi (HPLC) :
 Preparasi Sampel Dimasukkan sebanyak 40 mL sampel (makanan formula
atau susu cair) ke dalam tabung digesti 100 ml, tambahkan 10 ml etanolik
pirogallol (2% pirogallol dalam 95% etanol) dan sabunkan dengan etanolik
KOH (10% KOH dalam 90% etanol) pada suhu ruang selama 18 jam.
 Ekstraksi Pipet 3 ml sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung
sentrifus 15 ml dan tambahkan 2 ml air. Ekstrak dengan 7 ml heksan-
dietileter (85:15). Ulangi ekstraksi sebanyak dua kali. Masukkan sampel
terekstrak ke dalam tabung volumetrik 25 ml. Tambahkan 1 ml heksadekan
(heksadekan (1) + hexan (100)) dan diencerkan sampai 25 ml dengan
heksan. Pipet 15 ml ekstrak yang sudah diencerkan ke dalam tabung
sentrifus dan uapkan dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 ml
heptan.
D. Vitamin D
1. Uji Kualitatif
a. Disiapkan alat dan bahan b. Dimasukkan masing-masing 10 tetes minyak ikan
ke dalam 2 tabung reaksi c. Ditambahkan 10 tetes larutan H2O2 5% d. Dikocok
campuran kira-kira 1 menit. e. Dipanaskan di atas api kecil perlahan-lahan
sampai tidak ada gelembung-gelembung gas yang keluar. Usahakan jangan
sampai mendidih. f. Dinginkan tabung dibawah air kran. g. Dilakukan uji
dengan uji pereaksi Carr-Price h. Amati perubahan warna yang terjadi. Adanya
warna jingga kuning berarti positif vitamin D.
2. Uji Kuantitatif
Metode utama analisis kadar vitamin D adalah secara bioassay. Karena
ada perbedaan nilai antirachitis vitamin D dari berbagai sumbernya. 1. Preparasi
sampel & Persiapan alat dan bahan 2. Periode deplesi (penghabisan) :
pemberian diet Rachitogenic selama 18-25 hari. Tikus yang digunakan berumur
≤ 30 hari dengan berat badan ≥ 44 g tetapi ≤ 60 g 3. Pengujian : mulai hari
terakhir deplesi sampai 8 atau 11 hari setelah deplesi. Selama pengujian, tikus
terdeplesi diberi vitamin D dengan jumlah diketahui (standard) dan tidak
diketahui (sampel)
Jumlah vitamin dalam sampel ditentukan dari warna tulang tibia (tulang
kering) proximal paling akhir atau tulang radius atau ulna distal paling akhir. 5.
Dimasukkan 2 ml larutan yang diuji dalam tabung spektrometer dan ditambah
4 ml larutan jenuh Antimoni-trikhlorida dalam khloroform bebas air 6.
Ditunggu 10-15 menit dan serapannya dibaca pada 500 nm 7. Kadar vitamin D
dapat dihitung dengan persamaan kurva standar .

E. Vitamin E (Tokoferol)
1. Uji Kuantitatif
Metode Kromatografi (HPLC) : Produk makanan umum Tambahkan 10
ml pirogallol 6 % ke sampel, campurkan dan aliri dengan N2. Panaskan pada
suhu 70°C selama 10 menit dengan sonikasi. Tambahkan 2 ml KOH 60 %,
campurkan dan aliri dengan N2. Dipanaskan selama 30 menit pada suhu 70°C.
Sonikasi selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang dan tambahkan NaCl dan
air. Ekstrak dengan heksan (0,1% BHT) sebanyak 3 kali. Tambahkan 0,5 g
 MgSO4 dan homogenkan. Saringlah dan encerkan sampai volume dengan
heksan dan injeksi 20 l.
Margarin dan minyak nabati: Tambahkan 40 ml heksan (0,1% BHT) ke
dalam 10 g sampel dan homogenkan. Tambahkan 3 g MgSO4 dan campur,
biarkan  2 jam. Saringlah dan encerkan sampai volume dengan heksan. Injeksi
20 l.
Parameter Kromatografi - Kolom : Hibar RT, Lichrosorb Si60 5m, 25
cmx4.6 mm - Fase gerak : 0,9% isopropanol dalam heksan - Flow : 1 ml/menit
- Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em = 330 nm.

F. Vitamin K (Menadion)
1. Uji Kuantitatif
Cara Analisis Ekstraksi vitamin K diawali dengan penimbangan
sampel (contoh; keong macan, kerang salju, atau kerang tahu) sebanyak
2-5 gr yang mengandung sekitar 40 mikrogram vitamin B12 dimasukkan
ke dalam tabung reaksi tertutup. Bufer asetat sebanyak 20 ml dan 0,2 ml
larutan kalium-sianida ditambahkan pada tabung reaksi. Tabung
dimasukkan ke dalam penangas air mendidih selama 30 menit, lalu
didinginkan dan diencerkan sampai 50 ml dengan air suling dan disaring
dengan kertas whatman 42. Homogenisasi selama 5 menit dengan
ultrasonic dan didiamkan pada suhu ruang sampai dingin. Penambahan
25 ml metanol dan ditepatkan sampai volume 50 ml dengan asam asetat
2 %. Sampel disentrifuse pada 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan
dipisahkan untuk disuntikkan ke HPLC, dengan kondisi HPLC sebagai
berikut : Fase gerak : H2O pH 2 Kolom : C18 Kecepatan aliran : 0,5
ml/menit Pompa : 515 HPLC pump Injector : Cecil 1100 series Program
: Isokratik Detektor : UV visible Panjang gelombang : 280 nm
Sensitivitas : 0,01 AUFS Suhu : kamar Tekanan : 6000 psi