INFORME FINAL DEL PROYECTO

Nombre del Programa: AGROINDUSTRIA AZUCARERA

Título del proyecto: Obtención de polihidroxi-ß-butirato a partir de

mieles finales de caña

Código: 223

2011
Título del proyecto: Obtención de polihidroxi-ß-butirato a partir de
mieles finales de caña

Jefe del Proyecto:

Dra. Georgina Michelena Alvarez
Investigador Titular
ICIDCA

Colectivo de autores
Fondo de tiempo
Recursos Humanos Categoría Institución %Participación
ocupacional

Dra. Georgina Michelena Inv. Titular ICIDCA 20

Lic. María Teresa Fernández Inv. Agregado ICIDCA 30
Ing. Arianna Núñez Asp. Investigador ICIDCA 50
Tec. Emilia Carrera Aux. Investig. ICIDCA 20
Dr. Antonio Bell García Inv. Titular ICIDCA 20
MSc. Grisel Ortega Aux. Investig. ICIDCA 20
Ing. Keyla Tortolo Asp. Investigador ICIDCA 20
Téc. Ricardo Readigos Aux. Investig. ICIDCA 20
Esp. en información científica Inv. Agregado ICIDCA 20

Correspondencia entre los objetivos planteados y los resultados alcanzados:

El proyecto se relaciona con la producción del PHB de mayor importancia para la

producción de polímeros, y se propone desarrollar una estrategia de producción y
extracción de PHB mediante el empleo de medios de cultivos y métodos de extracción
más económicos a partir de la selección de una cepa bacteriana.

Objetivos específicos
1. Seleccionar una cepa y un medio de cultivo para la producción de PHB a las
concentraciones informadas en la literatura que permita disminuir los costos
debidos a la composición del sustrato.
2. Establecer las condiciones de aireación y agitación adecuadas para incrementar la
concentración de biomasa con acumulación del polímero.
3. Determinar la influencia de la estrategia de cultivo incrementado para la
producción de PHB.
4. Extraer el biopolímero obtenido en un proceso de mayor economía que los
indicados en la literatura.
5. Estimar preliminarmente la viabilidad económica del proceso..

El proyecto fue realizado según plazos acordados en los Cid 2 entregando en tiempo
todos los puntos de control contratados y realizando todas las tareas comprometidas y
planificadas. Por esta razón el proyecto durante todo el tiempo fue evaluado de NORMAL
en la ejecución de sus tareas.

En el informe científico-técnico se presentan algunos resultados resumidos del trabajo del

proyecto el cual refleja el cumplimiento de los objetivos planteados en su manera total.

Tareas contratadas por el proyecto y su cumplimiento:

Fecha de Fecha de
Inicio Terminación

COD ENUNCIADO DEL (O LOS) RESULTADO (S) MES AÑO MES AÑO

1 Selección de bacterias y medio de cultivo para la 1 2010 9 2010

producción de PHB. Estudio en zaranda.

Estudio del efecto de la aireación y la agitación

2 4 2010 12 2010
sobre la producción de PHB
Estudio del sistema de fermentación incrementada
3 1 2011 9 2011
Extracción – Purificación del PHB a partir de la
4 5 2011 10 2011
biomasa celular.
Diseño preliminar del proceso para la producción de
5 9 2011 12 2011
PHB. Estimación económica.

Nivel de ejecución y análisis del presupuesto de gastos asignados y otros

recursos utilizados, no otorgados por el financista:

En la tabla se exponen los gastos ejecutados por año en el proyecto y el financiamiento

otorgado por el financista, correspondiendo los gastos al 86 % del financiamiento
otorgado. Como se observa, existe correspondencia entre los recursos asignados y los
gastados.

2011
Presupesto
planificado 94,0

Gasto real 80,9

Financiamiento
recibido

% de ejecución 86,1
Vínculo con instituciones extranjeras o internacionales.

En el proyecto se previó la colaboración del Instituto de Ciencias Medioambientales de la

Universidad de Zurich en la caracterización de los polímeros de PHAs. Además en los
estudios de regulación del metabolismo de los PHAs y la caracterización de las enzimas
que participan en el mismo se previó la participación del Instituto de Biología Molecular y
Celular de la Universidad Miguel Hernández, España. Sin embargo, no se concretó la
colaboración extranjera.

Magnitud y características del aporte alcanzado.

Los resultados alcanzados durante el proyecto han sido ejecutados con la utilización de
técnicas modernas de análisis instrumental y equipamiento fermentativo y controlado los
parámetros, todo lo cual ha permitido no sólo cumplimentar los objetivos propuestos, sino
además abrir nuevas perspectivas de los biopolímeros.
El trabajo se realizó teniendo en cuenta la bibliografía más actualizada, se utilizaron los
recursos que ofrece INTERNET y se contrataron los servicios de búsqueda de patentes
de COMITEC (OCPI).
Por otra parte todas las investigaciones, tomas de muestras y conclusiones realizadas
fueron hechas considerando las técnicas estadísticas correspondientes con un nivel de
confianza del 95%.
Los resultados obtenidos permiten ubicar estos estudios en las tendencias más actuales
en cuanto a la obtención de biopolímeros.

SALIDAS GENERALES DEL PROYECTO:

PUBLICACIONES
1) Núñez A., Carrera E. y Michelena, G. (2012) Selección de bacterias y medio de cultivo
para la producción de PHB. Aceptada en Revista ICIDCA

EVENTOS
1. FORUM XVIII – 2011 Obtención de polihidroxi-ß-butirato a partir de
mieles finales de caña.

DOCENCIA: Maestrías
Núñez A. (2011). “PRODUCCIÓN DE POLI-β-HIDROXIBUTIRATO A PARTIR DE UNA
CEPA BACTERIANA UTILIZANDO SUSTRATOS DE LA INDUSTRIA AZUCARERA”,
Tesis presentada en opción del título de Maestro en Ciencias (MSc), en Procesos
Biotecnológicos, Mención Fermentación.
Obtención de polihidroxi-ß-butirato a partir de mieles
finales de caña

INSTITUTO CUBANO DE INVESTIGACIONES DE LOS DERIVADOS DE LA CAÑA DE

AZÚCAR (ICIDCA)
VÍA BLANCA #804 Y CARR. CENTRAL, SAN MIGUEL DEL PADRÓN, CIUDAD DE LA
HABANA CP 11000.

Jefe de Proyecto: Dra. Georgina Michelena Álvarez, Inv. Titular

RESUMEN
El Poli(3-hidroxibutirato) es un biopolímero producido por una variedad de
microorganismos en condiciones desbalanceadas del medio de cultivo y se acumula
intracelularmente como reserva de carbono y energía. Está siendo muy estudiado por sus
propiedades termoplásticas semejantes a la de plásticos convencionales, su
biocompatibilidad y su biodegradabilidad. Su uso se ve limitado por los costos no
competitivos frente a los plásticos convencionales. En este trabajo se realizó a través de
un diseño estadístico de experimentos, la selección de la cepa de Bacillus subtilis B/ 23-
44-4 y un medio de cultivo compuesto por miel final de caña al 1%, hidrolizado de
levadura y sal común; con la reducción de su costo de producción. Los resultados
indicaron una importante contribución al conocimiento pues permitió producir en 24 h PHB
a concentraciones entre 25 y 40 %/p.s., similares a la informada en la literatura, con una
productividad entre 1,1 – 2,4 veces superior y en un medio de cultivo industrial. Se
evaluaron diferentes niveles de aireación y agitación en fermentadores de 5 litros de
capacidad total y se seleccionaron las condiciones de 1vvm y 150 r.min-1. Se determinó
que condiciones de mayor transferencia de oxígeno favoreció el crecimiento microbiano
pero perjudicó la producción. Se encontró carácter no asociado entre el crecimiento y la
producción del PHB. Un sistema en lote incrementado con la adición de pulsos diferentes
de miel final aumentó en 67 % la producción de PHB en relación con el sistema en lote.
Se evaluaron varias estrategias de extracción del PHB a partir de materias primas
industriales. El tratamiento con lejía comercial brindó los mejores resultados con 83% de
recobrado. Un estimado del costo preliminar del producto indicó estar en el entorno de los
biopolímeros comerciales incidiendo fundamentalmente sobre este valor la etapa de
recuperación.

INTRODUCCIÓN

La industria química es un sector de producción y desarrollo importante, sin embargo es

una fuente de generación de desechos que ocasiona un impacto negativo en el medio
ambiente. Para disminuir este efecto es necesario desarrollar procesos químicos
sustentables que minimicen los residuales con menor consumo de energía, por lo que
cada día son mayores los esfuerzos legislativos a nivel mundial con el objetivo de
potenciar la producción de nuevos materiales no contaminantes del medio ambiente a
partir de fuentes renovables.
En la sociedad actual se ha hecho imprescindible el uso de los plásticos en distintas
aplicaciones que incluyen la industria de la construcción, la alimenticia, la farmacéutica y
la del transporte, que presentan múltiples ventajas en relación a materiales tradicionales
como los metales, vidrio y papel. Sin embargo, la mayoría de los polímeros utilizados en la
actualidad permanecen en la naturaleza por largos períodos de tiempo y por tanto se
acumulan, lo cual genera grandes cantidades de residuos sólidos. Esta situación ha
impulsado la necesidad de desarrollar biomateriales como los plásticos biodegradables
que brindan la posibilidad de reducir los daños medioambientales que causa la continua
producción y acumulación de plásticos petroquímicos en los ecosistemas.
Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros biodegradables de origen microbiano.
Ellos son sintetizados por diversos microorganismos, como polímeros de reserva de
carbono y energía, pudiendo, después de su extracción alcanzar propiedades semejantes
a la de los plásticos convencionales. Dentro de los PHAs más estudiados, destaca el
polihidroxibutirato (PHB) (Lee 1996; Sudesh 2000) que posee gran aplicabilidad en varias
esferas por ser no tóxico y biocompatible (Gómez 2003).
A pesar de esta posibilidad de aplicación, la sustitución de los plásticos químicos por los
biopolímeros aun no es viable por las competencias de costos. La producción de PHAs
está costando entre US$ 4 y 10 /kg frente al los polímeros sintéticos que cuestan
alrededor de US$ 1/kg.
Para la reducción de costos de los biopolímeros es importante la reducción del costo de la
materia prima (Silva 2007). Entre las alternativas de viabilizar el proceso de producción de
PHB se destacan los estudios de modificación genética de bacterias para incrementar la
capacidad de acumulación de polímero en el citoplasma y el empleo de fuentes de
nutrientes derivadas de la agroindustria (Gómez 2001). Además es indispensable la
implementación de procesos de recobrado y purificación de los polímeros más sencillos y
económicos.
La búsqueda de opciones de una industria diversificada es una estrategia del sector
azucarero mundial. Dentro de las alternativas más promisorias se encuentra la producción
de polímeros biodegradables a partir de subproductos y residuos azucareros lo cual se
inserta, en el desarrollo de programas de producción de nuevos materiales no
contaminantes del medio ambiente (Bello 2008).
Existe una evaluación preliminar de cepas pertenecientes a la Colección de Cultivos
Microbianos del Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de
Azúcar (ICIDCA) productoras de PHB. El PHB se acumula intracelularmente y es
necesario romper la célula y desarrollar procesos para su extracción. En el siguiente
trabajo se estudiará el proceso de producción y extracción de PHB a partir de la
selección de una cepa bacteriana y utilizando sustratos obtenidos de la industria
azucarera.
Teniendo en cuenta lo anterior los objetivos del presente proyecto están encaminados a:
Objetivo general
Desarrollar una estrategia de producción y extracción de PHB mediante el empleo de
medios de cultivos y métodos de extracción más económicos a partir de la selección de
una cepa bacteriana.

Objetivos específicos

1. Seleccionar una cepa y un medio de cultivo para la producción de PHB a

las concentraciones informadas en la literatura que permita disminuir los
costos debidos a la composición del sustrato
2. Establecer las condiciones de aireación y agitación adecuadas para
incrementar la concentración de biomasa con acumulación del polímero.
3. Determinar la influencia de la estrategia de cultivo incrementado para la
producción de PHB.
4. Extraer el biopolímero obtenido en un proceso de mayor economía que los
indicados en la literatura.
5. Estimar preliminarmente la viabilidad económica del proceso.
RESUMEN DE LOS RESULTADOS DEL PROYECTO

1. Compilación de la información existente sobre la materia (2010)

Se elaboró un informe donde se abordó el estado del arte de la producción de plásticos
biodegradables a partir de fuentes renovables de energía. Se contrato a la OCPI un
estudio de patentes para establecer el estado de la propiedad intelectual en el mundo y
conocer sobre los desarrollos tecnologicos. A continuacion un resumen de esta busqueda:

SERVICIO DE BÚSQUEDA ESPECIALIZADA

Producción de polihidroxibutirato (PHB)
mayo 2011
Oficina Cubana de la Propiedad Industrial
Picota #15 /. Luz y Acosta, Habana Vieja, Ciudad de La Habana, Cuba.
Teléfonos: 866-0550, 866-0557 al 59 Fax: 8665610.
Email: info@ocpi.cu
III.- Título de la Búsqueda: Producción de polihidroxibutirato (PHB).
IV.- Perfil de la Búsqueda: Biotecnología.
Clasificación Internacional de Patentes: no utilicé el
clasificador internacional de patentes para no limitar el campo de
búsqueda.
• Estrategias de búsqueda:
Palabras clave:
- (process or method+) and production and (polyhydroxybutyrate or PHB) and ferment+- production
and (polyhydroxybutyrate or PHB)
Estas estrategias de trabajo se probaron en la base de patentes en texto completo QPAT. Los
resultados obtenidos fueron los siguientes: la primera estrategia arrojó 28 documentos de patentes
y la segunda estrategia arrojó 135 documentos de patentes. Posteriormente se
procedió a revisar cada una de estas estrategias según los resultados recuperados. Más adelante
en los anexos se exponen los resultados seleccionados por cada una de estas estrategias
conjuntamente con los resúmenes de las patentes seleccionadas. También se brinda la
información referativa en la cual se encuentran datos como: inventor(es), titular (entiéndase
persona natural que posee los derechos sobre la patente o alguna entidad que ha asumido estos
derechos), fecha de prioridad, códigos de la Clasificación Internacional de Patentes, la
familia de cada patente, etc. Estos resúmenes se seleccionaron teniendo en cuanta que pueden
estar relacionados con la temática que se investiga. En total se incorporaron los resúmenes de 78
documentos de patentes; es importante señalar que muchos de estos documentos se
repitieron entre las estrategias de trabajo antes señaladas por lo que hubo que eliminarlos en los
casos que salieron repetidos.
A continuación en la tabla No.1 se muestran los países u Oficinas internacionales donde
inicialmente se registraron las patentes seleccionadas para desarrollar este estudio, así como la
cantidad de patentes registradas por país u oficina. Este dato se recoge a partir de los
datos de prioridad de cada documento de patente los cuales están accesibles en la información
referativa de cada documento. La prioridad denota la fecha en que por primera vez se registra una
invención.
Tabla 1. Países de registro de las patentes relacionadas con la producción de
polihidroxibutirato y fecha de prioridad de las mismas.
Países de registro de las patentes
Siglas que identifican los países
No. Patentes registradas por país
Estados Unidos US 25
China CN 9
Letonia LV 1
Corea KR 6
Oficina Europea de Patentes EP 15
Organización Mundial de la
Propiedad Intelectual
WO 16
Países Bajos NL 2
Alemania DE 12
Japón JP 14
España ES 1
Canadá CA 1
Gran Bretaña GB 6
India IN 5
Suiza CH 1
Mauricio MU 1
Rusia RU 1
En la información tabulada se destacan los principales países así como organizaciones
internacionales donde se han efectuado registros de solicitudes de patentes, resaltando entre ellos
Estados Unidos con la mayor cantidad de solicitudes registradas, como se puede observar
también en esta gama de países existen tanto países desarrollados como en vías de desarrollo
poseedores de derechos de patentes. Esta información se extrae de los datos de prioridad de cada
documento de patente, el cual se encuentra en la información referativa de estos
documentos. A modo de señalamiento los documentos de patente de origen japonés y chino rara
vez se pueden recuperar en texto completo debido a que están redactados en su idioma de origen
el cual no resulta asequible por lo que en estos casos solo entregamos el resumen de la
patente, en los otros casos si resulta posible rescatar el documento en texto completo porque están
redactados en inglés o bien se busca el mismo documento (lo que se conoce como patente
análoga) a través de la familia de cada patente, tratando de recuperar el mismo documento en
un idioma asequible para el cliente. En el caso de las patentes rusas pasa algo similar a lo que
sucede con las patentes mencionadas anteriormente, aun así de interesarle al cliente la patente
recuperada en este estudio se entregará en texto completo en caso que no se pueda recuperar por
la familia de la patente en otro idioma.
La familia de la patente no es más que el documento original cuyo titular diseña una estrategia de
registro internacional seleccionando aquellos países que resultan de su interés para la
comercialización de su solución técnica amparada en una patente. Cada país donde el titular
pretenda obtener un derecho de protección para su solución técnica, examinará la
solicitud de la patente de acuerdo a su legislación vigente, por lo que esta puede ser otorgada o
denegada, de manera que no en todos los países que el titular escogió como estrategia para la
posible comercialización de su solución técnica se concederá este derecho de protección.
Las patentes que así lo permitan por el idioma en que fueron redactadas como se explico
anteriormente y que se encuentren disponibles en textos completos, las que a su vez están
reflejadas en los anexos incorporados debajo, serán entregadas en textos completos de acuerdo al
interés de cliente. Del resto de los documentos que no se pueda recuperar el texto
completo, se entregará solamente el resumen incorporado en los anexos. Los solicitantes de los
derechos en materia de patentes que se encontraron en la información recuperada a través de las
diferentes estrategias de trabajo. conjuntamente con las patentes por solicitantes más la fecha de
prioridad de cada documento de patente. Se destacan los solicitantes de derechos de patentes que
mayor número de patentes poseen, siendo las entidades más destacadas según la información
recuperada en este estudio: Metabolix, Massachusetts Institute of Technology e ICI.
V.- Revisión Bibliográfica:
Base de datos visitada:
QPAT, posibilita realizar una búsqueda rápida y brinda los textos completos de las patentes. En
este caso la búsqueda se realizó sin ninguna restricción en cuanto al tiempo. QPAT constituye una
plataforma técnica especializada por más de treinta años y una de las más grandes fuentes de
información tecnológica del mundo, la misma ofrece facilidad de uso y potencia en la búsqueda de
patentes. Está diseñada para ofrecer facilidad de uso y potencia en la búsqueda de patentes.
Contiene información en materia de patentes de más de 75 autoridades. Pertenece a Questel Orbit
un miembro del Grupo France Telecom, el cual es un líder global en la entrega electrónica de
patentes, marcas, noticias generales y de la información.
Anexo I
Estrategia: (process or method+) and production and (polyhydroxybutyrate or PHB) and ferment+
TRANSGENIC MICROBIAL POLYHYDROXYALKANOATE PRODUCERS
• Fampat family
US2010267016 A1 20101021 [US20100267016]
• Abstract :
(US20100267016)
Transgenic microbial strains are provided which contain the genes required for PHA formation
integrated on the chromosome. The strains are advantageous in PHA production processes,
because (1) no plasmids need to be maintained, generally obviating the required use of antibiotics
or other stabilizing pressures, and (2) no plasmid loss occurs, thereby stabilizing the number of
gene copies per cell throughout the fermentation process, resulting in homogeneous PHA
product formation throughout the production process. Genes are integrated using standard
techniques, preferably transposon mutagenesis. In a preferred embodiment wherein multiple
genes are incorporated, these are incorporated as an operon. Sequences are used to stabilize
mRNA, to induce expression as a function of culture conditions (such as phosphate
concentration), temperature, and stress, and to aid in selection, through the incorporation of
selection markers such as markers conferring antibiotic resistance.
28
Method for preparing chiral medicinal intermediate R-3-hydroxy butyric acid ethyl ester by
microbial fermentation
CN101864457
• Patent Assignee
SHENZHEN ECOMANN BIOTECHNOLOGY
• Inventor
XIANGDONG HU; KUNHUA XIAN
• International Patent Classification
C07C-067/00; C07C-067/08; C07C-069/00; C07C-069/675;
C12N-015/70; C12N-015/74; C12N-015/78; C12P-007/40;
C12P-007/42; C12R-001/01; C12R-001/185; C12R-001/19;
C12R-001/38
• Publication Information
CN101864457 A 20101020 [CN101864457]
• Priority Details
2009CN-0106659 20090417
• Fampat family
CN101864457 A 20101020 [CN101864457]
• Abstract :
(CN101864457)
The invention discloses a method for preparing chiral medicinal intermediate R-3-hydroxy butyric
acid ethyl ester. By using the method, a regenerative carbon source such as starch and the like
canbe efficiently and stably converted into (R)-3-hydroxy butyric acid by constructing multiple
enzymes such as pha, phb and phc required for synthesizing the (R)-3-hydroxy butyric acid ethyl
ester into genes of E.Coli, and the (R)-3-hydroxy butyric acid ethyl ester can be obtained by
means of an auxiliary substrate ethanol at the same time. The preparation method of the
invention can greatly lower the production cost so as to break through the technical bottlenecks
of high industrialized cost and low chiral purity of the (R)-3-hydroxy butyric acid ethyl ester.
A METHOD FOR PRODUCING BIODEGRADABLE, BIOCOMPOSITE MATRIX CONTAINING
AGROCHEMICAL AND/OR NATURE ANTIMICROBIAL SUPPLEMENT
LV--13906
• Abstract :
(LV--13906)
Offered method for producing polyhydroxybutyrate (PHB) matrixes containing agrochemical
and/or nature provided antimicrobial supplement in the form of film allows to obtain
connatural, homogeneous and flexible composite films with water soluble agrochemical and/or
nature origin antimicrobial supplement introduced therein.The mentioned matrixes are made
from concentrate PHB of natural granule colloidal water suspension, using cultures of
Azotobacter chroococuum 23. In accordance with one of invention implementer measures,
production of polyhydroxybutyrate matrixes containing agrochemical and/or nature provided
antimicrobial supplement include such steps: diluting colloidal water suspension of natural
granules with water or with fermentation solution till concentration reaches 15-200 g/l; addition
of 7-10% polyvinylalchocol (PVS) water solution, plasticizer, water soluble agrochemical and/or
natural antimicrobial supplement to water or alcohol extract to obtained polyhydroxybutyrate
(PSH) natural granule colloidal water suspension in water or in fermentation solution; stirring
obtained suspension and pouring off thereof on definite size base, and water evaporation at a
temperature of 15 to 20 centigrade.
Recombinant bacillus coli and method for producing PHB by using biomass material and the
same
• Fampat family
CN101392231 A 20090325 [CN101392231]
• Abstract :
(CN101392231)
The invention discloses a recomposed Escherichia coli and a method for producing PHB by using
cheap biomass raw materials fermented by the recomposed Escherichia coli. The invention
knocks out ptsG gene of the Escherichia coli MG1655 by homologous recombination technology,
the Escherichia coli Q3 is obtained by injecting phbCAB gene cluster from alcaligenes eutrophus,
and the strain is collected in China Center for Type Culture Collection on July 9, 2008, with the
collection number of CCTCC NO of M 208105. The Escherichia coli Q3 can compose PHB by
effective utilization of agricultural biomass raw material hydrolyzate, and a maximum
concentration of the strains of 8.88g/L is reached 24 hours after the fermentation; PHB reaches a
maximum concentration of 6.42g/L and the PHB content in the cell reaches 72.3 percent 20
hours after the fermentation. Under the same fermentation condition, by the technology, the
output of PHB equal to that obtained through the utilization of glucose to produce PHB without
reforming Escherichia coli can be obtained, and the production cost is far less than that by the
simple utilization of glucose, thus having great practical value in the actual application.
Method for constructing genetic engineering bacteria and enhancing stress resistance of 1,3-
propanediol producing strain
CN101381696
• Fampat family
CN101381696 A 20090311 [CN101381696]
• Abstract :
(CN101381696)
The invention provides a method for constructing a gene engineering strain to enhance the
resistance of a 1, 3-propanediol (PDO) production strain, which belongs to the technical field of
biochemical engineering and comprises the step of: introducing Beta-ketothiolase PhbA,
NADPHdependent
acetoacetyl CoA, PhbB and polyhydroxyalkanoates synthases, PhbC gene to a wild
bacteria which can produce PDO to accumulate high concentration of PHB while the bacterial
strain produces PDO so as obviously improve the tolerance of the bacterial strain to glycerol and
3-hydroxypropionaldehyde; the method can also be used to co-produce PHB and PDO. The
method has the advantages that the constructed gene engineering strain improves the resistance
of the bacterial strain to the high concentration of glycedrol and the intermediate product 3-
hydroxypropionaldehyde and reduces the abnormal fermentation in industrial production; in
addition, high concentration of PHB can be accumulated while PDO is produced, and PHB can
be used as a separated product, thereby promoting the added valve of products and the
utilization rate of materials and reducing the production cost.

Polyhydroxyalkanoates-hydroxyl alkoxyl alkyl acid ester and biosynthesis production method

thereof
CN101195677
• Abstract :
(CN101195677)
The invention relates to a poly-3-hydroxybutyrate-betahyoroxyetohxy acetate copolymer, which
formula is represented as pattern, wherein x, y are positive integers. The invention further
provides a biological synthesis preparation method of the copolymer, which uses gene
recombination microbiological fermentation to produce poly-3-hydroxybutyratebetahyoroxyetohxy
acetate copolymer. When PHB and HEA are conjugated into copolymer,
tissue engineering eliminates body repellent action, with good thermal stability, which content
can be adjusted according to demand to adjust rigidity and flexibility. The good biological
degradation, biological compatibility and processability of the product expand application in
tissue engineering and medicine fields.
Recombinant escherichia coli and overproduction method of polyhydroxybutyrate using the
strain
US20050227340
• Abstract :
(US20050227340)
The present invention relates to a recombinant Escherichia coli having phbCAB originated from
Alcaligenes eutrophus and an overproduction method of polyhydroxyalkanoate using the same,
more precisely, a recombinant Escherichia coli 'MG1655/pTZ18U-PHB' or 'JIL938/pTZ18U-PHB'
having phbCAB originated from Alcaligenes eutrophus and an overproduction method of
polyhydroxyalkanoate comprising the steps of preparing transformed Escherichia coli having
phbCAB originated from Alcaligenes eutrophus, inoculating and culturing the cells (growth
phase), inducing the production of polyhydroxyalkanoate in the recomibnant Escherichia coli
(stationary phase and producing phase), and inducing the extracellular secretion of the
polyhydroxyalkanoate from the recombinant Escherichia coli. The method of the present
invention facilitates not only overproduction of polyhydroxyalkanoate such as
polyhydroxybutyrate by a simple batch culture but also industrial use of biodegradable
polyhydroxyalkanoate replacing conventional nonbiodegradable plastics by its simple and easy
fermentation, separation and purification process.
Process for production and recovery of fermentation products by means of solvent impregnated
carriers
• Abstract :
(EP1570889)
The invention is directed to a process for the production and recovery of chemicals, in particular
hydrocarbons, from a fermentation medium, wherein solvent impregnated carriers are used.
Accordingly, the invention provides a process for the production of hydrocarbon from a
fermentation liquid comprising: forming said hydrocarbon from said fermentation liquid using a
biocatalyst; contacting said fermentation liquid with a solvent impregnated carrier, whereby said
formed hydrocarbon is sorbed by said solvent impregnated carrier; regenerating said solvent
impregnated carrier, whereby a stream of said hydrocarbon is obtained; and optionally, recycling
said regenerated solvent impregnated carrier. In particular, PHB (4-hydroxybenzoic acid) can be
produced and isolated from the fermentation medium by means of such a "solvent extraction"
procedure, which uses porous solid supports for the "immobilization" of the solvent.
Genetically engineered microorganisms and method for producing 4-hydroxybenzoic acid
US6030819
• Fampat family
US6030819 A 20000229 [US6030819]
WO200018943 A1 20000406 [WO200018943]
• Abstract :
(US6030819)
The present invention pertains to a method for economical biofermentative production of 4-
hydroxybenzoic acid (PHB) using genetically engineered E. coli. According to the invention, a
plasmid is provided which controls the overexpression of chorismate pyruvate lyase, the bacterial
enzyme which catalyzes the production of PHB from chorismate. Mutant E. coli selected with a
unique two-step screening assay to overproduce chorismate have been transformed with this
plasmid, providing a biocatalyst that efficiently converts glucose to PHB.
 2. Trabajo experimental para dar cumplimiento a los objetivos del proyecto
Materiales y Métodos
Microorganismos utilizados en el estudio
Anteriormente a este estudio se realizó una selección de microorganismos productores de
PHB partiendo de 17 cepas todas procedentes de la Colección de Cultivos Microbianos
del Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA)
(Bello 2008). De las cepas mejores productoras se seleccionaron las siguientes tres
bacterias que presentaron mayor % de producción de PHB con el objetivo de seleccionar
una para los posteriores estudios.

Tabla 1 Bacterias empleadas en los estudios de selección de microorganismos

productores de PHB y método de conservación
Cepas Conservación(-20ºC y -80ºC)
Bacillus subtilis B/ 23-44-4 Glicerol 20% en caldo nutriente
Bacillus licheniformis B/ 23-26-4 Glicerol 20% en caldo nutriente
Azospirillum 8i Glicerol 20% en caldo nutriente

Medios y condiciones de cultivo

Conservación de microorganismos
En la conservación de microorganismos se cumplen tres objetivos básicos: i) mantener el
cultivo puro (pureza), ii) garantizar que la célula esté viva (viabilidad), y, iii) garantizar la
estabilidad genética (estabilidad). Los microorganismos se pueden conservar de
diferentes formas cada una de las cuales tiene un período de tiempo límite. El medio de
cultivo empleado para la conservación de los microorganismos empleados en este estudio
tuvo la siguiente composición: Medio Caldo Nutriente (CN) (para un litro): Peptona
bacteriológica (Biocen) 5,0x10-3 kg; extracto de levadura (Biocen) 2,0x10-3 kg; extracto de
carne (Biocen) 1,0x10-3 kg; NaCl (Scharlau) 5,0x10-3 kg.

Producción de polihidroxialcanoatos
Los siguientes medios fueron utilizados para promover la producción de
polihidroxialcanoatos en cultivo líquido (para un litro).

Medio A (Bello 2008)

Sacarosa 1%
Extracto de levadura 1,0x10-3 kg (Biocen)
NaCl 2,5x10-3kg (Scharlau)
pH 7,0 ± 0,1

Medio B
Miel final de caña de azúcar 1%
Hidrolizado de levadura 1,0x10-3 kg
Sal común 2,5x10-3 kg (industrial)
pH 7,0 ± 0,1
Medio C
Miel final de caña de azúcar 3%
Hidrolizado de levadura 1,0x10-3 kg
Sal común 2,5*10-3 kg (industrial)
pH 7,0 ± 0,1

La miel final de caña de azúcar proviene de un mismo lote de producción de la empresa

azucarera Héctor Molina, de Cuba (5 -10 marzo/2010).
El hidrolizado de levadura se preparó con levadura de miel procedente de la Empresa
Mielera Ciro Redondo con 8,07 % de nitrógeno (Rodríguez 2003).

Preparación de los inóculos

Estudio en zaranda
Se tomaron dos asadas de cultivo de los microorganismos y se inocularon en caldo
nutriente. Los inóculos se crecieron a 37ºC, 150 r.min-1 durante 24 h en Erlenmeyers de
150 ml con un volumen de trabajo de 15 ml.
Estudio en microplanta
Se tomaron dos asadas de cultivo de los microorganismos y se inocularon en caldo
nutriente. Los inóculos se crecieron a 37ºC, 150 r.min-1 durante 24 h en Erlenmeyers de
1000 ml con un volumen de trabajo de 300 ml que sirvieron de inoculo. Se trabajó en tres
fermentadores Marubishi MDL 500, Japón de 5l de volumen total, con control automático
de temperatura, pH y agitación. El pH fue ajustado a 7,0 ± 0,1 al inicio del proceso y se
dejó libre durante la fermentación. La temperatura del sistema se estableció en 37oC. La
Figura 1 muestra el equipo de trabajo.

Figura 1 Fermentador Marubishi MDL – 500 (Japón), capacidad total de 5 l, utilizado para
la obtención del PHB a partir de cepa bacteriana.
Procedimiento experimental para la selección de la cepa y el medio de cultivo
Se realizó a nivel de zaranda un diseño de experimentos 32 con réplica en cada punto con
el objetivo de seleccionar una cepa y un medio de cultivo para los posteriores estudios en
microplanta. Las variables que se evaluaron fueron la cepa y el medio de cultivo y como
variable respuesta se consideró la producción de PHB (%PHB/p.s.). En la tabla 2 se
muestran los niveles para cada variable.

Tabla 2 Niveles para cada variable estudiada.

Variables Nivel ( -1) Nivel (0) Nivel (1)
Cepa (X1) Bacillus subtilis B/ 23-44-4 Azospirillum 8i Bacillus licheniformis B/ 23-26-4
Medio (X2) A B C

Se evaluó además, el crecimiento celular, la concentración de azúcares reductores totales

(ART), la materia seca y el pH.
De la mejor respuesta obtenida en el %PHB/p.s. a nivel de zaranda se procedió a estudiar
en microplanta el efecto de la aireación y agitación. Para esto se siguió un diseño
experimental 32 con réplica con el objetivo de seleccionar la condición en la que se obtuvo
la mayor producción de PHB. En la tabla 3 se muestran los niveles para cada variable.

Tabla 3 Niveles para cada variable estudiada.

Variables Nivel ( -1) Nivel (0) Nivel (1)
Aire (X1), v.v.m. 0,7 1 1,3

Agitación (X2), r.min-1 150 300 450

Cada una de las 9 corridas fue realizada por duplicado y fueron realizadas de forma
aleatoria.
Después de seleccionada la mejor condición del efecto de la aireación y agitación sobre el
incremento de la concentración de PHB en microplanta se procedió a estudiar la
estrategia de cultivo en lote incrementado con la alimentación de un pulso de miel final de
caña de azúcar a 350 g/l distribuido en volumen 80, 60 y 60 ml a las horas 5, 7 y 9 del
proceso.

Análisis físico - químicos realizados en el procedimiento experimental

Crecimiento celular
El crecimiento celular de los microorganismos se determinó por medio del cambio en el
valor de la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm en espectrofotómetro UV –
Visible modelo Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech (Suecia).
Determinación de azúcares reductores totales
Se valoraron los azúcares reductores presentes en la miel con una solución alcalina de
cobre (2+). El punto final de la valoración se detectó por cambio de color, utilizando el azul
de metileno (Panreac) como indicador interno (Lane 1923). Se utilizó una solución matriz
de azúcares invertidos que se obtuvo por tratamiento con HCl 37% (ac) (Panreac) y calor
a partir de una solución pura de sacarosa (autores 1974).
Determinación de la materia seca gravimétrica
Se puso en la estufa Heraeus RVT-220 (España) a 105 0C las cápsulas por espacio de 2
h como mínimo, luego se colocaron en una desecadora durante 20 minutos, se tararon en
una balanza analítica Kern ALS (Alemania). Se tomó 2 ml por triplicado del caldo
fermentado y se colocó en la estufa a 105 0C por un tiempo de 6 h para garantizar la
sequedad total de la muestra, luego se sacaron y se pusieron en una desecadora por
espacio de 20 minutos aproximadamente, se pesó en la balanza analítica hasta peso
constante. Se calculó por la ecuación 3.1:
(T + M − T )
% MSG = ⋅100 (ec 1)
M
donde:
T + M: es el peso húmedo de la muestra
T: es el peso seco de la muestra
M: cantidad de muestra empleada para el análisis.

Determinación del pH
Se introdujo el electrodo del pHmetro Hanna instruments (Rumania) en cada solución a
medir y en los experimentos en microplanta se utilizó un sensor en línea.
Cuantificación de la producción de poli-β-hidroxibutirato
A la materia seca celular resultante de 1 ml de caldo de cultivo se le adicionó 0,5 ml de
NaOH 2N. Se incubó la mezcla a 100°C durante 30 minutos y se agitó cada 10 minutos
en Vortex Uzusio VTX-3000 (Japón). Las muestras se enfriaron en hielo, se neutralizaron
con 0,5 ml de HCl 2N y se centrifugaron a 10000 r.min-1, 20 minutos, 4ºC en centrífuga
Eppendorf 5415D (Alemania). Se recuperó el sobrenadante celular y se filtró por filtros de
nylon 0.45μm Milipore (Irlanda) (Brandl 1993). La ecuación utilizada fue:
2 ⋅ D.O − 0,015
0,776
% PHB / p.s = ⋅100 (ec.3.2.)
Peso sec o
donde:
D.O: Densidad óptica
Método espectrofotométrico
La formación de ácido crotónico, producto del tratamiento alcalino de las muestras que
contienen Poli-ß-hidroxibutirato, se detectó por incremento en la absorbancia a una
longitud de onda de 210 nm en Espectrofotómetro UV – Visible modelo Ultrospec 2000
Pharmacia Biotech (Suecia)(Slepecky 1960). La curva de calibración se realizó con patrón
puro de PHB de Aldrich®.

Extracción y purificación del poli-β-hidroxibutirato

Se realizaron tres variantes de purificación que son las siguientes:
Variante 1: tratamiento con hipoclorito de sodio,
Variante 2: tratamiento con hipoclorito de sodio+NaOH 2N
 Variante 3: tratamiento con NaOH 2N
Con el objetivo de determinar la mayor recuperación de PHB a partir de componentes
industriales que disminuyan los costos de producción.
El % de recuperación del PHB se calculó como ( %PHB/p.s. después del tratamiento/
%PHB/p.s. inicial). 100
Tratamiento con hipoclorito de sodio
Se tararon los tubos que se utilizaron en el experimento. Se pesó el polvo seco celular por
triplicado en tubos Falcon de 50 ml con tapa. Se añadió solución de lejía de cloro al 5%
(50 ml) y se ajustó el pH a 12,0 con solución de NaOH 1N. Se incubaron durante una
hora a 37ºC y se agitó cada 10 minutos en Vortex Uzusio VTX-3000 (Japón). Se
centrifugaron a 4000 r.min-1, 15 minutos, a temperatura ambiente en centrífuga Sigma 3-
18K (Alemania) y se desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó sucesivamente con
agua destilada (dos lavados con 50 ml) y con etanol (dos lavados con 10 ml). Los lavados
se centrifugaron a 10000 r.min-1, 5 minutos, a temperatura ambiente en centrífuga Sigma
3-18K (Alemania). Finalmente el precipitado se puso a secar en corriente de aire durante
24 horas y luego se puso en una desecadora.
Tratamiento con hipoclorito de sodio+NaOH 2N
Se tararon los tubos a utilizar en el experimento. Se pesó el polvo seco celular por
triplicado en tubos Falcon de 50 ml con tapa. Se añadió mezcla de solución de lejía de
cloro al 5% (25 ml) y solución de NaOH 2N (25 ml) y se ajustó el pH a 12,0 con solución
de NaOH 1N. Se incubaron durante una hora a 37ºC y se agitó cada 10 minutos en Vortex
Uzusio VTX-3000 (Japón). Se centrifugaron a 4000 r.min-1, 15 minutos, a temperatura
ambiente en centrífuga Sigma 3-18K (Alemania) y se desechó el sobrenadante. El
precipitado se lavó sucesivamente con agua destilada (dos lavados con 50 ml) y con
etanol (dos lavados con 10 ml). Los lavados se centrifugaron a 10000 r.min-1, 5 minutos a
temperatura ambiente en centrífuga Sigma 3-18K (Alemania). Finalmente el precipitado se
puso a secar en corriente de aire durante 24 horas y luego se puso en una desecadora.
Tratamiento con NaOH 2N
Se tararon los tubos que se utilizaron en el experimento. Se pesó el polvo seco celular por
triplicado en tubos Falcon de 50 ml con tapa. Se añadió solución de NaOH 2N (50 ml) y se
ajustó el pH a 12,0 con solución de NaOH 1N. Se incubaron durante una hora a 37ºC y se
agitó cada 10 minutos en Vortex Uzusio VTX- 3000 (Japón). Se centrifugaron a 4000
r.min-1, 15 min, a temperatura ambiente en centrífuga Sigma 3-18K (Alemania) y se
desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó sucesivamente con agua destilada (dos
lavados con 50 ml) y con etanol (dos lavados con 10 ml). Los lavados se centrifugaron a
10000 r.min-1, 5 minutos a temperatura ambiente en centrífuga Sigma 3-18K (Alemania).
Finalmente el precipitado se puso a secar en corriente de aire durante 24 horas y luego se
puso en una desecadora.

Análisis estadístico
Los diseños factoriales de experimentos son eficientes para estudiar los efectos
producidos por dos o más factores. Mediante este se investigan todas las posibles
combinaciones de los niveles de los factores en cada ensayo completo o réplica del
experimento. El diseño factorial 32 consiste en el estudio de dos factores con tres niveles
cada uno. Para las corridas la notación empleada es la de los dígitos 1,0 y -1 para denotar
los niveles.
Los ajustes estadísticos de los datos experimentales, el cálculo de los coeficientes de los
polinomios y las pruebas de análisis de varianza (ANOVA) se realizaron minimizando la
suma de los cuadrados de las desviaciones, empleando un 95% de confiabilidad. El
procesamiento de los datos se llevó a cabo por el programa estadístico computarizado
STATGRAPHICS PLUS para Windows 5.1.
RESULTADOS Y DISCUSION
Selección de bacterias y medio de cultivo para la producción de PHB. Estudio en
zaranda.
Para comprobar la validez estadística de las respuestas obtenidas como datos
experimentales de este trabajo a cada ensayo se le realizó análisis de normalidad. El
Anexo 1 muestra el resumen estadístico y asevera el comportamiento de distribución
normal que permite validar los resultados. Ellos fueron utilizados para cumplir los objetivos
planteados según se describe a continuación:

Relacionado con el primer objetivo de trabajo, se procedió a la selección de una cepa

bacteriana y un medio de cultivo que considere sustratos obtenidos de la industria
azucarera y permita economizar la producción de PHB.
Partiendo del estudio histoquímico y de evaluación de 17 cepas bacterianas de diferentes
géneros entre los que se encontraban: Azospirillum, Rhizobium, Bacillus y Pseudomonas,
realizado por Bello (Bello 2008) se determinó el efecto de las variables cepa productora
(X1) y medio de producción (X2) de acuerdo a un diseño 32 completamente aleatorizado
donde la variable respuesta observada fue la producción de PHB, dada en %PHB/p.s. Los
valores promedios de dos mediciones para las diferentes variantes aparecen en la tabla 4.
De la ejecución del diseño experimental 32 con dos réplicas se obtuvieron los resultados
en la concentración de PHB que se muestran en la tabla 4.

Tabla 4 Resultados de la producción de PHB según las corridas experimentales

correspondientes al diseño experimental 32.
Corridas Cepa (X1) Medio de cultivo (X2) %PHB/p.s.

1 -1 -1 27,03
2 0 -1 19,39

3 1 -1 26,21

4 -1 0 24,84

5 0 0 18,41

6 1 0 25,20

7 -1 1 24,15

8 0 1 16,30

9 1 1 22,87

10 -1 -1 30,23

11 0 -1 20,04

12 1 -1 25,38

13 -1 0 25,43

14 0 0 17,63
 15 1 0 22,61

16 -1 1 26,20

17 0 1 15,80

18 1 1 20,70

La ecuación del modelo ajustado respondió al siguiente polinomio:

%PHB/p.s. = 17,59 – 1,2425 *X1 – 1,855*X2 + 7,1425* X12
r2 = 0,9388 EES = 1,2539

El análisis de varianza para el polinomio mostrado en Anexo 2 indica un error estándar de

1,2539 y el estadígrafo Durbin-Watson muestra la no existencia de correlación entre los
residuos del modelo, por lo que se puede considerar adecuado la descripción de la
concentración de PHB mediante el modelo polinomial, con las variables codificadas.
La producción de PHB se favoreció con la cepa de Bacillus subtilis B/23-444 y se afectó
cuando se utilizó Azospirillum 8i. Por otra parte, también el medio de cultivo tuvo influencia
significativa sobre la producción de PHB según el polinomio, encontrándose los mejores
resultados con el medio sintético utilizado por Bello (Bello 2008). Sin embargo, el análisis
de varianza que descompone el efecto de cada variable determinó que el medio de cultivo
entre las cepas y dentro de cada grupo no ofrece diferencia estadísticamente significativa
para las medias de producción de PHB para un 95% de confianza.

Superficie de Respuesta estimada

31
28
%PHB

25
22
19
0,61
0,2
16 -0,2
-1 -0,6 -0,2 0,2 -1-0,6
0,6 1 Medio
Cepa
Figura 2 Influencia de la cepa y el medio de cultivo sobre la producción de PHB en
zaranda a 37oC y 150 r.min-1.

En general, de este análisis se puede considerar que las condiciones evaluadas para las
variables cepa y medio de cultivo permiten producciones de PHB promedio en los valores
entre 16 y 31 % en base seca según se muestra en la figura 2. El gráfico de Cajas y
Varianzas para cada una de las variables analizadas obtenido según el programa
STATGRAPHICS (Figura 3) y de la tabla ANOVA presentada en el Anexo 2, la variable
cepa tiene un p-valor inferior a 0,05 indicando que tiene significancia sobre la producción
de PHB mientras que el medio de cultivo no resultó significativo.

Gráfico de Cajas y Bigotes Gráfico de Cajas y Bigotes

-1 -1

medio
cepa

0 0

1 1

15 19 23 27 31 20 24 28 32
%PHB %PHB

Figura 3 a y b Gráfico de cajas y varianzas estandarizado para la obtención de PHB.

Al demostrar que el medio no tiene efecto significativo en las modalidades evaluadas para
la obtención del PHB, se propone establecer la producción del PHB con el medio B que
sustituye la sacarosa por miel al 1%, el extracto de levadura reactivo por el hidrolizado de
levadura con un costo casi 60 veces inferior (considerando el extracto de levadura
reactivo en US$ 54,3/kg mientras que el costo del hidrolizado de levadura según
procedimiento de Rodríguez (Rodríguez 2003), se estima en US$ 0,9/kg con el mismo
contenido de nitrógeno), y el NaCl por la sal común, lo cual incidirá en el costo de
producción. En trabajos anteriores, Gouda y colaboradores (Gouda 2001) evaluaron en
Bacillus megaterium concentraciones de miel de caña entre un 1-5 % (p/v), obteniendo
buenos resultados en la producción de PHB utilizando miel final al 2% mejor que al 3% y
superiores donde comenzaba a ocurrir fenómenos de inhibición. Estos autores
encontraron con miel final resultados superiores a los logrados con glucosa.
El uso de fuentes carbonadas y subproductos industriales ha sido estudiado (Bogardts
1998). Existen modelos de integración del proceso biológico de producción de PHB a
partir de suero de leche, glicerol, hidrolizados de la industria del cítrico y otros (Lee
2008),enfocando la conversión del residual agroindustrial como una solución
medioambiental y obteniendo producciones entre 25 y 30 %PHB/p.s.. Aunque la miel de
caña no es un residual, sino un coproducto de la producción de azúcar, altamente
competitivo como fuente de sustrato para otras fermentaciones y comprometido con la
producción de alcohol, alimento animal y la exportación debe considerarse su posibilidad
en la producción de PHB.
Se encontró la factibilidad de la sustitución total de la fuente de nitrógeno reactivo por el
hidrolizado de levadura que se considera una fuente de nitrógeno industrial, de fácil
elaboración y con pocos requerimientos pues se produce a partir de levadura forrajera y
de considerablemente menor precio que el extracto de levadura que es principalmente
una fuente nitrogenada para medios de laboratorio. También (Yüksekdağ 2004);
encontraron en un estudio de fuentes de carbono y nitrógeno que incorporar fuentes
complejas mejoraban la producción de PHB más de 10 veces en relación con el uso de
reactivos puros. Estos autores indicaron que la peptona proteasa producía las máximas
acumulaciones de PHB.
La posibilidad de uso del hidrolizado de levadura es un resultado muy positivo, pues
permite su empleo como fuente de nitrógeno industrial, sustituyendo al extracto de
levadura a la misma concentración de nitrógeno total.
De acuerdo al polinomio obtenido, el análisis de varianza de las variables y según se
muestra en la figura 4, las condiciones mejores para obtener PHB según este estudio
corresponden a: la cepa Bacillus subtilis B/23-444 y el medio de cultivo B, que presenta
potencialidades de uso industrial. Los resultados del estudio indicaron una importante
contribución al conocimiento pues permitió la selección de una cepa y de un medio de
cultivo con atractivo industrial con el que se logran producciones de PHB en 24 horas,
similares a las indicadas en la literatura a 48 h (Gouda 2001). Si se considera 26 %
PHB/p.s. en 24 h, se obtiene 1,08 %PHB/p.s.h-1 de productividad superior a la obtenida
por Gouda utilizando miel de cana a partir de B. megaterium donde indicó 0,96
%PHB/p.sh-1. Autores brasileños informaron de productividades de 0,46%PHB/p.s.h-1 en
procesos semiindustriales. Otro aspecto a considerar es que el PHB producido por una
bacteria Gram + como lo es el Bacillus subtilis tiene mejores propiedades de
biocompatibilidad para aplicaciones biomédicas que el producido por bacterias Gram - .
Por tanto, la producción de PHB a partir de Bacillus subtilis B/23-444 utilizando un medio
de cultivo con potencialidad industrial en 24 h de tiempo de fermentación es un aporte
para este campo ya que lo convierte en un candidato para estudios futuros de
optimización y escalado del proceso.
Con estas condiciones establecidas se prosiguió a realizar el estudio del efecto de las
variables aireación y agitación que influyen en la transferencia de oxígeno sobre la
producción de PHB.

Estudio del efecto de la aireación y la agitación sobre la producción de PHB

Uno de los principales problemas de los sistemas biológicos es la definición del nivel de
oxigenación. La producción de PHB a partir del B. subtilis no discrepa con esta máxima sino
por el contrario, en su característica de ser un microorganismo aerófilo, la concentración de
oxígeno en el medio es un parámetro crítico a controlar.
El estudio de aireación y agitación se realizó según un diseño experimental 32 y los resul-
tados obtenidos en %PHB/p.s. acorde a la matriz con las variables codificadas se muestran
en Anexo 3. Los resultados obtenidos referentes a concentración de PHB (%PHB/p.s.) se
muestran en la tabla 5.
Tabla 5 Resultados de producción y productividad de PHB obtenidos en el diseño
factorial.
Orden de realización X1, vvm X2, r.min-1 [PHB], %PHB/p.s.

1 0,7 (-1) 150(-1) 24,14

5 1,0 (0) 150(-1) 26,23

7 1,3 (1) 150(-1) 27,79

2 0,7 (-1) 300 (0) 32,50

8 1,0 (0) 300 (0) 27,51

9 1,3 (1) 300 (0) 21,61

4 0,7 (-1) 450 (1) 41,20

6 1,0 (0) 450 (1) 23,81

3 1,3 (1) 450 (1) 19,36

14 0,7(-1) 150(-1) 24,23

13 1,0 (0) 150(-1) 27,34

12 1,3 (1) 150(-1) 28,13

17 0,7(-1) 300 (0) 32,98

10 1,0 (0) 300 (0) 27,51

18 1,3 (1) 300 (0) 21,87

15 0,7(-1) 450 (1) 42,05

16 1,0 (0) 450 (1) 24,12

11 1,3 (1) 450 (1) 19,34

El modelo polinomial derivado del procesamiento estadístico del plan factorial resultó:
% PHB = 26, 1744 – 4, 9366 X1 – 6,51X1*X2
r2 = 0,9306 SEE = 2,10852

Lo que señala la significación de la variable aireación y agitación en la producción de

PHB.
La figura 4 muestra los resultados experimentales en la producción de PHB, en el rango de
agitación y aireación estudiado. De su análisis puede observarse que ambas variables pre-
sentan comportamientos diferentes de acuerdo al nivel de aireación, en donde a menores
aireaciones influye en mayor medida la agitación y un posterior aumento produce el efecto
inverso: resultó más dañino para la obtención de PHB altos niveles de agitación-aireación
que trabajar a niveles bajos. Farias (Farias 2009) encontró resultados parecidos al
determinar que altas transferencias de oxígeno favorecen la etapa de crecimiento celular, sin
embargo, una limitación en la concentración de oxígeno disuelto favorece la producción de
PHB.

Superficie de Respuesta

41
37
33
PHB
29
25
21 1
0,5
17 0
-1 -0,5
-0,6 -0,2 0,2 0,6
-1
1 rpm (X2)
vvm (X1)

Figura 4 Efecto de la agitación y aireación para la producción de PHB en fermentadores de 5

litros de volumen total, trabajando a 3 litros, 37oC y pH 7 ajustado al inicio y luego libre.
.
Como resultado del análisis de varianza (Anexo 3) se determinó que la agitación no ofreció
diferencias significativas para la producción de PHB, mientras que la aireación si tuvo efecto.
Estos resultados permiten seleccionar condiciones de agitación bajas y de aireación bajas o
medias (no existiendo diferencias entre ellas). Los estudios posteriores se realizaron a 1vvm
de aireación y 150 r.min-1de agitación.
Las condiciones de transferencia influyen sobre la actividad metabólica, dado por las
diferencias alcanzadas sobre los niveles de PHB y comprobadas al medir el crecimiento y el
pH que asciende hasta casi 2 unidades. El comportamiento cinético del pH durante la
fermentación es similar al comportamiento cinético del crecimiento celular. En procesos con
pH libre, el pH asciende lentamente en la medida que ocurre el agotamiento de los azúcares
reductores del medio. Valores en ascenso del pH indican la ocurrencia del crecimiento
celular, que se detiene en la fase de acumulación de PHB donde también de agotan los
nutrientes. Bajo condiciones aerobias, el microorganismo aumenta su capacidad de produc-
ción de ATP que favorece el crecimiento bacteriano. En etapas posteriores al crecimiento y
para favorecer la acumulación de PHB debe disminuirse la concentración de oxígeno en el
medio que induzca a condiciones de estrés.
La figura 5 indica la influencia en la biomasa producto de los diferentes niveles de aireación
con la variación de la agitación. Se observa que el incremento en los niveles de aireación
acelera la fase de crecimiento exponencial, mientras que agitaciones fuertes incrementan la
biomasa, excepto a 0,7 vvm donde se favorece el crecimiento a 300 r.min-1 (agitación
moderada según este estudio).
 0,7 vvm

6
5
Crecimiento. DO

4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo, h

150 rpm 300 rpm 450 rpm

1,0 vvm

6
5
Crecimiento. DO

4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo, h

150 rpm 300 rpm 450 rpm

1,3 vvm

6
5
Crecimiento. DO

4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo, h

150 rpm 300 rpm 450 rpm

Figura 5 Crecimiento celular a diferentes relaciones de agitación-aireación en fermentadores

de 5 litros de volumen total, trabajando a 3 litros, 37oC y pH 7 ajustado al inicio y luego libre.
.
 0,7 vvm

8.5
8
7.5
pH

7
6.5
6
0 8 16 24
Tiem po (h)

150 r.min-1 300 r.min-1 450 r.min-1

1 vvm

8.5

8
pH

7.5

6.5
0 8 16 24
Tiem po (h)

150 r.min-1 300 r.min-1 450 r.min-1

1,3 vvm

8.5
8
7.5
pH

7
6.5
6
0 8 16 24
Tiem po (h)

150 r.min-1 300 r.min-1 450 r.min-1

Figura 6 Comportamiento cinético del pH a diferentes relaciones de agitación-aireación en

fermentadores de 5 litros de volumen total, trabajando a 3 litros, 37oC y pH 7,0 ajustado al
inicio y luego libre.
Se encontró un comportamiento diferente del crecimiento en relación con la producción de
PHB. Mientras que para el crecimiento la aireación en el intervalo estudiado favorece el nivel
de biomasa alcanzado en sentido general, la producción de PHB alcanza su máximo en una
condición intermedia. Es importante cuidar de las condiciones de fermentación que
garanticen un ambiente adecuado al Bacillus subtilis para evitar esporulación. El pH es una
de las variables de necesaria vigilancia porque pH ácidos inducen la esporulación de Bacillus
que provocan la no acumulación de PHB (Naranjo 2010).
De este análisis se seleccionó la condición 1 vvm y 150 r.min-1 para la producción del PHB
en fermentadores de 5 l de volumen total. Del análisis cinético de los valores de crecimiento
y producción de PHB obtenido para estos niveles (Figura 7) se observa un desplazamiento
entre la máxima velocidad de formación del PHB (que ocurre a la hora 16) y la máxima
velocidad de crecimiento del microorganismo (hora 8) lo cual indica que la producción de
PHB sigue un perfil típico de las reacciones tipo III según Gaden, osea no asociado al
crecimiento lo cual se corresponde a un producto del metabolismo secundario. Esto está en
concordancia con que el PHB es un material de reserva, que se favorece con la limitación de
nutrientes en el medio de cultivo. Dawes y Senior (Dawes y Señor 1973) y Naranjo (Naranjo
2010) también encontraron desplazamiento cinético entre la máxima producción de biomasa
y de PHB, favoreciendo la obtención del polímero la limitación de algún nutriente como el
nitrógeno, el fósforo o el oxígeno que ocasione condiciones estresantes en el cultivo.

0,45 2
0,4 1,8
0,35 1,6
0,3 1,4

dPHB/dt
1,2
dX/dt

0,25
1
0,2
0,8
0,15 0,6
0,1 0,4
0,05 0,2
0 0
0 8 16 24
tiempo, h

Figura 7 Relación entre dP/dt y dX/dt en la producción de PHB

Estudio del sistema de fermentación incrementada

La producción de PHB es controlado por el nivel de carbono consumido por la célula, en
momentos en que están limitados nutrientes esenciales como el azufre, el magnesio, el
nitrógeno, el fósforo y el oxígeno.
En este sistema la producción del polímero se favorece por el crecimiento limitado de la
célula. La obtención de PHB aumenta con la limitación de algún nutriente en el medio y las
células acumulan el biopolímero a mayores relaciones C/N. Por tanto, es necesario que los
medios de cultivo sean suplementados con una relación óptima entre las fuentes de carbono
y los nutrientes esenciales en una primera etapa de fermentación para luego efectuar un
incremento de carbono que propicie la acumulación del polímero. Este efecto puede lograrse
mediante fermentaciones con alimentación incrementada (Reddy 2003).
Con el objetivo de mantener la concentración de sacarosa en un nivel que desbalanceara la
composición de nutrientes una vez obtenido un adecuado crecimiento celular se procedió al
estudio de la producción en fermentación incrementada.
Se alimentó una solución de sacarosa de 350 g/l a partir de la hora 5 de comienzo del
proceso donde prácticamente se ha alcanzado la máxima velocidad de crecimiento celular.
Esta alimentación se repitió a la hora 7 y 9.

48,6191 %PHB/p.s.
Crecimiento, D. O.

5
4
3
2
1 29,1231 %PHB/p.s.
0
0 2 6 10 14 16 18 20 22 24
tiempo, h

lote lote increm

Figura 8 Efecto de la producción en lote y lote incrementado sobre el crecimiento celular y la

producción de PHB en fermentadores de 5 litros de volumen total, trabajando a 3 litros, 37oC
y pH 7 ajustado al inicio y luego libre.

La Figura 8 muestra que la producción de PHB fue sensible a los cambios en la

concentración de sacarosa. La alimentación incrementada provocó un aumento en el
crecimiento celular marcadamente hasta la hora 10 del proceso a partir del cual se
alcanza la fase estacionaria. La producción de PHB aumentó 67 % en el cultivo
incrementado en relación con el cultivo en lote. Este aumento también fue observado a
través de la determinación cinética de la densidad y la viscosidad del caldo fermentado
(Figura 9). Aunque esta producción responde a la obtención de un polímero intracelular
se pudo medir un ligero incremento en las propiedades reológicas del sistema.
 Viscosidad relativa a 30ºC

1.025 1.25
1.02 1.2
1.015
Densidad (g/l)

1.15
1.01
1.1
1.005
1.05
1
0.995 1

0.99 0.95
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (h)

dlote dlote increm visc lote visc loteincre

Figura 9 Comportamiento cinético de la densidad y la viscosidad del cultivo en lote y lote

incrementado en la producción de PHB en fermentadores de 5 litros de volumen total,
trabajando a 3 litros, 37oC y pH 7 ajustado al inicio y luego libre.

Se encontró que alrededor de la hora 6 la viscosidad y la densidad en el sistema en lote

incrementado aumentan de manera continua hasta casi estabilizarse hacia la hora 24 de
fermentación.
Este hecho demuestra la dependencia funcional directa entre el nivel de sacarosa en el
medio (o la relación C/N) y la producción de PHB con desbalance en el resto de los
nutrientes. Otros autores (Oliveira 1999; Dalcanton 2006) han reportado estudios de
sistemas de alimentación incrementada para determinar el efecto de la fuente de carbono,
encontrando la respuesta inmediata de la variable objetivo con este sistema. Farias
(Farias 2009) indicó que la alimentación de reductores totales debe responder a una
estrategia de alimentación donde no se superen los 10g/l en el medio, ni se disminuya por
debajo de 5 g/l que pueda ocasionar degradación del PHB acumulado por estrés celular.
Las células son cultivadas hasta una concentración deseada sin limitación de ningún
nutriente esencial y posteriormente un nutriente esencial se limita en el medio para inducir
la acumulación de PHB en la célula. Durante este estadío de limitación de un nutriente
esencial la concentración residual celular (definida como la concentración celular menos la
concentración de PHB) debe permanecer casi constante y la concentración celular se
incrementa solo por el aumento de la concentración intracelular de los PHB.

Extracción – Purificación del PHB a partir de la biomasa celular

El proceso de separación y purificación del PHB a partir de la biomasa se realizó de
acuerdo a tres variantes que involucran la sustitución de reactivos por soluciones
industriales. Con este proceso se persigue los siguientes objetivos:
a. Conservar la concentración de PHB lograda en fermentación.
 b. Romper la célula y extraer el PHB.
c. Eliminar la mayor cantidad de color, proteína, polisacáridos y otros
componentes celulares.
Las variantes de extracción fueron las siguientes:
VAR 1: Lejía de cloro 5%, pH = 12
VAR 2: 1:1 Lejía de cloro 5%: NaOH 2 N, pH = 12
VAR 3: NaOH 2N, pH = 12

La tabla 6 presenta la recuperación obtenida para cada variante estudiada con tres
réplicas.

Tabla 6 Por ciento de recuperación de PHB a partir de biomasa microbiana considerando

diferentes alternativas de separación – purificación.
% Recuperación de PHB
VAR 1 VAR 2 VAR 3
87,548 64,174 56,759
78,261 63,474 57,851
83,368 66,917 56,029

Para determinar la significancia estadística del efecto del tratamiento sobre la variable
respuesta (% de recuperación de PHB) se procedió a realizar un análisis de varianza de
muestras múltiples y un análisis de medias según el test de rangos múltiples. Los
resultados indicaron que existe diferencia estadísticamente significativa entre las medias
de las tres variantes con un 95 % de confianza y por tanto las recuperaciones más altas
se obtienen con el uso del tratamiento 1, que consiste en emplear lejía comercial al 5%,
según se muestra en la Figura 10. Este análisis se muestra en Anexo 4. Con este proceso
se recupera el 83% del PHB producido en la célula.

Gráfico de Cajas y Bigotes

VAR1

VAR2

VAR3

56 66 76 86 96
% Recuperación de PHB

Figura 10 Recuperación del PHB (% PHB/p.s.) trabajando variantes de extracción con

insumos industriales (VAR 1: Lejía de cloro 5%, pH = 12; VAR 2: 1:1 Lejía de cloro 5%:
NaOH 2 N, pH = 12; VAR 3: NaOH 2N, pH = 12).
Estudios referidos en la literatura (Bello 2008; Farias 2009) realizan la extracción
purificación del PHB en varias etapas con NaOCl reactivo y quelantes, logrando
recuperaciones entre 89 y 92 %. Alcanzar recuperaciones cercanas a este valor en una
etapa, señala una posibilidad atractiva en la sustitución de reactivos por químicos
industriales; proceso que debe ser mejorado en futuros trabajos.

Diseño preliminar del proceso para la producción de PHB. Estimación económica.

Denominación y alcance
Se realiza la estimación preliminar de una planta de polihidroxibutirato (PHB), base para
hacer conformados de plásticos biodegradables y biocompatibles. Dicho proceso
responde a los resultados preliminares obtenidos en este estudio.
Características del suministro de las materias primas y los materiales.
Las materias primas que se utilizan para la producción del PHB son prácticamente todas
insumos o productos del Grupo Empresarial AZCUBA: levadura torula, miel final de caña,
cloruro de sodio, sosa cáustica, lejía comercial a partir de una solución al 5% de
hipoclorito de sodio y alcohol técnico “B”.
Se está considerando envasar el producto en pomos plásticos de boca ancha de 1 kg con
una etiqueta que muestre las características y la entidad responsable de la producción.
Descripción de la planta
La planta de producción de PHB se ubicará en la nave que ocupa actualmente la unidad
fermentativa del área biotecnológica del ICIDCA. El área disponible es suficiente y las
modificaciones asépticas desarrolladas concuerdan con los requerimientos de
bioseguridad para este tipo de producción.
El poseer la edificación civil y tecnológica con los requisitos demandados, contar con la
fuerza de trabajo calificada y cumplir con la capacidad productiva hace adecuada la
instalación. No obstante puede extrapolarse la producción a un tamaño de planta mayor si
la industria básica, médico farmacéutica o alimenticia declararan una mayor demanda del
producto que la considerada en este trabajo.
La planta ha sido concebida de la manera más flexible posible, utilizando al máximo los
recursos de que dispone el ICIDCA, con el objetivo de reducir al mínimo las inversiones y
poder rápidamente cambiar la producción si fuese necesario. En este sentido, dentro de la
planta existirán conexiones de trasiego de productos fijas y otras móviles.
Descripción del proceso
El proceso de producción de PHB se basa en la obtención de este producto mediante la
fermentación utilizando miel de caña, levadura y sal común (Figura 11).
Para el proceso fermentativo se utilizó una cepa de Bacillus subtilis, B/23-444 conservada
en glicerol 20% a - 20ºC.
La fermentación se realiza en dos fermentadores. El prefermentador R-01 es cargado con
el medio de fermentación, esterilizado a 121ºC, 1 atm, durante 15 minutos y
posteriormente es enfriado. Seguidamente se inocula con 10 l de inóculo que se prepara
en el laboratorio de Microbiología.
Después de 24 h de fermentación durante las cuales se mantiene la agitación en 150
r.min-1, 1vvm de aireación, con enfriamiento para controlar la temperatura a 30 ºC y el pH
en 7 ± 0,1, el producto estará listo para inocular el fermentador R-02 que es alimentado a
través de la bomba B-01.
El fermentador R-02 estará cargado con el medio estéril de igual composición que el
empleado en la etapa de prefermentación. El proceso de fermentación tiene una duración
de 24 h a un 1,0 vvm y 150 r.min-1, después de las cuales se centrifuga en la centrífuga C-
01 para la separación de la biomasa. El sobrenadante es llevado a un tanque reservorio
para su tratamiento antes de la deposición en el ambiente.
La biomasa centrifugada es llevada al tanque T-01, donde se adiciona lejía comercial (1%)
durante 1 hora a 150 r.min-1. Este procedimiento destruye los microorganismos,
desnaturaliza las proteínas, degrada los azúcares residuales que puedan haber quedado,
acondicionándolos para que puedan ser separados todos estos productos indeseables en
el sobrenadante por un proceso de centrifugación a 4000 r.min-1donde se obtiene en el
pellet el PHB.
Este paso es repetido dos veces pero utilizando etanol B.
El pellet obtenido del proceso de recuperación es llevado al secador de bandeja S-01 para
la eliminación de agua a un contenido máximo de 2 %. El producto seco pasa a un molino
de cuchillas con diámetro de partícula inferior a 2μm.
Inmediatamente después de terminadas las etapas de fermentaciones en los equipos R-
01 y R-02 ambos pasan al ciclo de limpieza, esterilización, carga del medio, esterilización
y enfriamiento para dejarlo listo para iniciar el nuevo proceso productivo. Para esta
operación se dispone de aproximadamente 12 h.
Figura 11 Diagrama de flujo propuesto del proceso productivo del PHB.

Consideraciones económicas
El balance de materiales mostrado en la Figura 12 establece los insumos unitarios de esta
producción y permite estimar preliminarmente el costo por materia prima y materiales. El
balance económico preliminar con los resultados obtenidos por el costo de la materia
prima y materiales, indica 8,78 Moneda Total/kg de producto, con un componente en
divisa de 6,21 CUC/kg (tabla 7)
Resulta interesante que el precio del producto está dominado por los componentes del
proceso de extracción (lejía comercial y etanol). Pudiera considerarse que es prioritario
optimizar esta etapa productiva, no solo para lograr mayores purezas del producto, sino
también, disminuir los costos y lograr condiciones más favorables en la competencia.
 Base de cálculo: 1 lote (1000g PHB)

Miel (52 oBx) 10kg + Agua 900l Inóculo 100 l

Levadura 1 kg
Cloruro de sodio 2,5 kg FERMENTACIÓN
NaOH (20 %) 5 l

1000 l
(3 g/l biomasa b.

Sobrenadante 990 l
CENTRIFUGACION
3000 g biomasa b. s. + 7 l

Lejía comercial 200 l

(Solución de hipoclorito de EXTRACCION de PHB A recuperar
sodio al 5%) Considerando 70 % de eficiencia en la
recuperación retornaría al proceso 140
Etanol 40 l l de lejía y 28 l de etanol
1290 g de PHB b. s.; 43 % PHB/p.s., según este estudio.

CENTRIFUGACION
2200 g

SECADO 1000 g de agua

1200 g de PHB seco

MOLINADO

1000 g de PHB seco

Figura 12 Balance de materiales para la producción de PHB (según este estudio)

Tabla 7 Estimación económica preliminar del proceso de obtención de PHB.
PHB - Consumo material

Costo
Para 1 kg de producto Precio unitario
Índice De ello: De ello:
Producto Código* UM consumo Interno Divisas Total Divisas

Combustibles 0,0072 0,0026

Fuel oil 2251010000 LT 0,01400 0,5168 0,1886 0,0072 0,0026
Energía eléctrica 2100000001 kW-h 15,00000 0,0190 0,0028 0,2850 0,0424

Materia prima y
materiales 8,4963 6,1709
Miel final comprada kg 10,00000 0,0667 0,0000 0,6665 0,0000
Levadura torula kg 1,0000 0,9150 0,4580 0,9150 0,4580
Sal común 2553010001 kg 2,50000 0,0376 0,0288 0,0940 0,0720
Alcohol técnico "B" 1034050001 HL 0,12000 27,1440 18,9784 3,2573 2,2774
Sosa cáustica 3241010001 kg 1,00000 0,4969 0,4175 0,4969 0,4175
Lejía comercial kg 3,00000 0,9012 0,8653 2,7035 2,5960
Agua 9220000000 m3 2,00000 0,0001 0,0000 0,0001 0,0000
Pomos plásticos U 1,00000 0,3000 0,3000 0,3000 0,3000
Etiquetas U 1,00000 0,0630 0,0500 0,0630 0,0500

Total 8,7885 6,2159

*Código de la nomenclatura del producto en AZCUBA utilizado en la industria azucarera

Uno de los objetivos del Grupo Empresarial AZCUBA es el desarrollo de la industria de los
derivados, en donde la producción de plásticos biodegradables constituye una alternativa
de diversificación interesante y atractiva, al revalorizar las fuentes carbonadas de la
producción azucarera y permitir revitalizar plantas fermentativas.
La comparación del PHB obtenido en estas condiciones con otros plásticos petroquímicos
cuyo valor está entre US$ 0,3 – 2 /kg no compara económicamente, pero debe
considerarse que esta producción se justifica cuando se consideran cuestiones
medioambientales y de utilización con la industria médico-farmacéutica. El costo estimado
muy preliminarmente considerando solo los gastos directos por materias primas y
materiales, está en el orden de otros biopolímeros comerciales (5 - 9 US$/ kg)
considerando además las posibilidades de reducción de costos por optimización del
proceso y que su producción se permita en una planta fermentativa existente para no
incrementar los costos por inversión (ejemplo: Planta de Bioprocesos del Proyecto Cuba
10) y economizar por escala productiva. Esta capacidad permitiría satisfacer una
demanda inicial estimada de 100 kg para su empleo en usos médicos.
Conclusiones

1. Se seleccionó la cepa Bacillus subtilis B/23-444 y el medio de cultivo compuesto por

miel final de caña al 1% de azúcares reductores totales, hidrolizado de levadura y
sal común con potencialidades de uso industrial.

2. Se diseñó un medio de cultivo con potencialidad de producción industrial de menor

costo que sustituye a la sacarosa por miel final de caña; al extracto de levadura por
el hidrolizado de levadura y al cloruro de sodio reactivo por sal común.

3. La producción de PHB a partir de Bacillus subtilis B/23-444 que es una bacteria

Gram+, mejora sus propiedades de biocompatibilidad para aplicaciones biomédicas.

4. Lograr concentraciones de PHB entre 25 y 40 %/p.s. en 24 h de proceso, cuando se

trabajó con el medio de cultivo seleccionado, las mejores condiciones de aireación-
agitación y el sistema en lote incrementado, es un aporte para este campo de
estudio y lo hace un candidato para estudios futuros de optimización y escalado del
proceso. Estos resultados están en el entorno de los mejores publicados en la
literatura referida y supera las productividades informadas.

5. El crecimiento de la biomasa se favoreció con la transferencia de oxígeno; mientras

que los niveles de aireación y agitación presentaron efectos diferentes en la producción
de PHB, en donde a menores aireaciones favoreció la agitación y un posterior aumento
perjudicó la obtención de PHB. Se prefirió trabajar a niveles moderados de aireación y
agitación del sistema (1 vvm y 150 rpm a nivel de fermentadores de 5l).

6. La producción de PHB a partir de Bacillus subtilis B/23-444 tiene un carácter no

asociado al crecimiento y se favorece con la limitación de nutrientes en el medio de
cultivo.

7. El sistema en lote incrementado (aumentando la relación C/N del proceso) favoreció

en 67 % la producción de PHB en relación con el cultivo en lote.

8. Se logró 83% de recuperación del PHB a partir de lejía comercial en un proceso en

una etapa. Este valor está cercano a otros indicados en la literatura utilizando
además quelantes y varias etapas, lo cual señala una posibilidad atractiva en la
sustitución de reactivos por químicos industriales, en la etapa de extracción –
recuperación del biopolímero de manera más económica.

9. El estimado del costo por concepto de materia prima y materiales indicó 8,78
moneda total/kg de producto, con un componente en divisa de 6,21 CUC/kg. Este
valor compara con el precio de otros biopolímeros comerciales (5 - 9 US$/ kg).
10. Los componentes del proceso de extracción (lejía comercial y etanol) dominan el
costo del producto. Es importante optimizar esta etapa productiva para lograr
mayores purezas del producto, disminuir los costos y lograr condiciones más
favorables en el mercado.
Recomendaciones

1. Analizar cinética del consumo de azúcares y nitrógeno para definir relación de

limitación de nutrientes en la producción de PHB.
2. Completar los estudios de transferencia de oxígeno en el sistema determinando la
influencia del oxígeno disuelto sobre la producción del PHB y determinando el kLa.
3. Determinar el efecto de otras estrategias de lote incrementado mediante la
alimentación continua exponencial, por pulsos iguales y considerando la velocidad
de consumo del sustrato.
4. Escalar la producción de PHB en fermentador de 500 l de capacidad total.
5. Continuar el estudio de estrategias de extracción y purificación del PHB que
incrementen los % de recuperación.
6. Caracterizar químicamente al biopolímero obtenido.
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ANEXOS

ANEXO 1. Análisis de normalidad de los datos experimentales

Estudio de la influencia de la cepa y el medio de cultivo sobre la producción de PHB:

 Gráfico de dispersión

15 19 23 27 31
%PHB

Gráfico de Caja y Bigotes

15 19 23 27 31
%PHB

Estudio de la influencia de la aireación y la agitación sobre la producción de PHB:

Resumen Estadístico para PHB

Frecuencia = 18
Media = 27,3256
Varianza = 41,4749
Desviación típica = 6,4401
Mínimo = 19,36
Máximo = 42,05
Rango = 22,69
Asimetría típica = 1,99948
Curtosis típificada = 0,941506
 This table shows summary statistics for PHB. It includes measures
of central tendency, measures of variability, and measures of shape.
Of particular interest here are the standardized skewness and
standardized kurtosis, which can be used to determine whether the
sample comes from a normal distribution. Values of these statistics
outside the range of -2 to +2 indicate significant departures from
normality, which would tend to invalidate any statistical test
regarding the standard deviation. In this case, the standardized
skewness value is within the range expected for data from a normal
distribution. The standardized kurtosis value is within the range
expected for data from a normal distribution.

Scatterplot

19 23 27 31 35 39 43
PHB

Gráfico de Caja y Bigotes

19 23 27 31 35 39 43
PHB
ANEXO 2. Influencia de la cepa y el medio de cultivo sobre la producción de PHB

Analyze Experiment - %PHB

Standardized Pareto Chart for %PHB

AA +
-
B:X2

A:X1

BB

AB

0 2 4 6 8 10 12
Standardized effect
Analysis of Variance for %PHB
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
A:X1 18.5257 1 18.5257 11.80 0.0056
B:X2 41.2923 1 41.2923 26.30 0.0003
AA 204.061 1 204.061 129.96 0.0000
AB 0.154013 1 0.154013 0.10 0.7600
BB 1.0201 1 1.0201 0.65 0.4373
blocks 0.00802222 1 0.00802222 0.01 0.9443
Total error 17.2719 11 1.57017
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 282.333 17

R-squared = 93.8825 percent

R-squared (adjusted for d.f.) = 91.3335 percent
Standard Error of Est. = 1.25306
Mean absolute error = 0.804877
Durbin-Watson statistic = 1.62002 (P=0.1790)
Lag 1 residual autocorrelation = 0.181956

Regression coeffs. for %PHB

----------------------------------------------------------------------
constant = 17,5917
A:Cepa = -1,2425
B:Medio = -1,855
AA = 7,1425
AB = -0,13875
BB = 0,505
----------------------------------------------------------------------

This pane displays the regression equation which has been fitted to
the data. The equation of the fitted model is

%PHB = 17,5917 - 1,2425*Cepa - 1,855*Medio + 7,1425*Cepa^2 -

0,13875*Cepa*Medio + 0,505*Medio^2
 Gráfico de Cajas y Bigotes Gráfico de Cajas y Bigotes

-1 -1

medio
cepa

0 0

1 1

15 19 23 27 31 20 24 28 32
%PHB %PHB

Analysis of Variance for %PHB - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
COVARIATES
Medio 41,2923 1 41,2923 31,33 0,0001
MAIN EFFECTS
A:Cepa 222,587 2 111,293 84,43 0,0000
RESIDUAL 18,454 14 1,31814
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 282,333 17
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for %PHB by Cepa

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent LSD
Cepa Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
0 6 17,9283 0,468712 X
1 6 23,8283 0,468712 X
-1 6 26,3133 0,468712 X
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.

Analysis of Variance for %PHB - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
COVARIATES
Cepa 18,5257 1 18,5257 1,17 0,2975
MAIN EFFECTS
A:Medio 42,3124 2 21,1562 1,34 0,2941
RESIDUAL 221,495 14 15,8211
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 282,333 17
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for %PHB by Medio

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent LSD
Medio Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 6 21,0033 1,62384 X
0 6 22,3533 1,62384 X
-1 6 24,7133 1,62384 X
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
ANEXO 3 Efecto de la aireación y agitación sobre la producción de PHB

Analyze Experiment - PHB

Estimated effects for PHB

----------------------------------------------------------------------
average = 26,1744 +/- 1,11129
A:vvm = -9,87333 +/- 1,21736
B:rpm = 2,00667 +/- 1,21736
AA = 3,52667 +/- 2,10852
AB = -13,02 +/- 1,49095
BB = -0,0733333 +/- 2,10852
block = 0,186667 +/- 0,993968
----------------------------------------------------------------------
Standard errors are based on total error with 11 d.f.

Standardized Pareto Chart for PHB

AB +
-
A:vvm

AA

B:rpm

BB

0 2 4 6 8 10
Standardized effect
Analysis of Variance for PHB
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
A:vvm 292,448 1 292,448 65,78 0,0000
B:rpm 12,0801 1 12,0801 2,72 0,1275
AA 12,4374 1 12,4374 2,80 0,1226
AB 339,041 1 339,041 76,26 0,0000
BB 0,00537778 1 0,00537778 0,00 0,9729
blocks 0,1568 1 0,1568 0,04 0,8545
Total error 48,9046 11 4,44587
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 705,073 17

R-squared = 93,0639 percent

R-squared (adjusted for d.f.) = 90,1739 percent
Standard Error of Est. = 2,10852
Mean absolute error = 1,41296
Durbin-Watson statistic = 2,41728 (P=0,0981)
Lag 1 residual autocorrelation = -0,215285

Regression coeffs. for PHB

----------------------------------------------------------------------
constant = 26,1744
A:vvm = -4,93667
B:rpm = 1,00333
AA = 1,76333
AB = -6,51
BB = -0,0366667
----------------------------------------------------------------------

This pane displays the regression equation which has been fitted to
the data. The equation of the fitted model is

PHB = 26,1744 - 4,93667*vvm + 1,00333*rpm + 1,76333*vvm^2 -

6,51*vvm*rpm - 0,0366667*rpm^2

Multifactor ANOVA - PHB

Analysis Summary

Dependent variable: PHB

Factors:
rpm
Covariates:
vvm

Number of complete cases: 18

Scatterplot by Level Code Scatterplot by Level Code

43 43

39 39

35 35
PHB
PHB

31 31
27 27
23 23
19 19
-1 0 1 -1 0 1
rpm vvm
Analysis of Variance for PHB - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
COVARIATES
vvm 292,448 1 292,448 10,22 0,0065

MAIN EFFECTS
A:rpm 12,0855 2 6,04276 0,21 0,8121

RESIDUAL 400,54 14 28,61

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 705,073 17
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for PHB by rpm

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent LSD
rpm Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
-1 6 26,31 2,18365 X
0 6 27,35 2,18365 X
1 6 28,3167 2,18365 X
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
Multifactor ANOVA - PHB

Analysis Summary
Dependent variable: PHB
Factors:
vvm
Covariates:
rpm

Number of complete cases: 18

Analysis of Variance for PHB - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
COVARIATES
rpm 12,0801 1 12,0801 0,44 0,5199

MAIN EFFECTS
A:vvm 304,886 2 152,443 5,50 0,0173

RESIDUAL 388,108 14 27,722

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 705,073 17
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for PHB by vvm

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent LSD
vvm Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 6 22,9767 2,14949 X
0 6 26,15 2,14949 XX
-1 6 32,85 2,14949 X
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
ANEXO 4 Análisis de varianza para la determinación de diferencia estadística entre
las alternativas 1, 2 y 3 para la separación y purificación de PHB a partir de
biomasa bacteriana.
SnapStat: Comparación de Muestras Múltiples Gráfico de Dispersión
Muestra Frecuencia Media Sigma 96
VAR1 3 83,0592 4,65156

respuesta
VAR2 3 64,8551 1,8194 86
VAR3 3 56,8802 0,916814
9 68,2649 11,8948
76

66

56
VAR1 VAR2 VAR3

Gráfico de Cajas y Bigotes Tabla ANOVA

Suma de Media
Fuente Cuadrados Gl Cuadrado F-Ratio
VAR1 Entre 1080,32 2 540,162 62,84
Dentro 51,5755 6 8,59592
Total 1131,9 8
VAR2 P-Valor = 0,0001
Contraste de Varianza
VAR3 Contraste C de Cochran: 0,839041
P-valor = 0,0777

56 66 76 86 96
respuesta
Gráfico de Medias Gráfico de Análisis de Medias
Con 95,0 Porcentajes Intervalos LSD Con un 95% de Límites de Decisión
93 86 UDL=72,
81 CL=68,26
83
76
Media

Media

LDL=64,0
73 71
66
63
61
53 56
VAR1 VAR2 VAR3 VAR1 VAR2 VAR3