PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
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Taller de Genética III: Pruebas de diagnóstico molecular
Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los
fundamentos moleculares de la electroforesis de ácidos nucleicos y su uso en las técnicas de
Southern blot, PCR y secuenciación.
Ejercicio 1
Problema. Una pareja ha tenido dos hijos: una niña de diez años sana y un niño de cuatro
años con anemia de células falciformes. La mujer está esperando un nuevo hijo y se ha
realizado un muestreo de vellosidades coriónicas para determinar si su nuevo hijo (el
probando), heredará la enfermedad.
Se muestra el resultado de la prueba de diagnóstico tal como se describió previamente:
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A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de
cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta
el patrón de bandas en cada caso.
B- Con los datos obtenidos, dibuje el árbol genealógico de la familia
Ejercicio 2
Una vez identificada la amplificación en el número de repeticiones CTG como la base genética
de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentrañar cómo la expansión podría
producir la enfermedad.
Algunos grupos de investigación han demostrado que en células en cultivo, la expansión del
número de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la proteína MDPKi.
El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un
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elevado número de repeticiones CTG en el extremo 3’ del gen podría de algún modo producir
una disminución en la tasa de síntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente.
Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el árbol
genealógico se les realizó una prueba de diagnóstico molecular. Partiendo de sangre periférica,
la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restricción
NcoI y usando como sonda específica una secuencia que hibrida con una región del gen MDPK
muy cercana a la ubicación de los tripletes CTG.
El resultado se muestra a continuación. Los números corresponden con los individuos del árbol
genealógico. M: marcador de peso molecular
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Los números que figuran en el árbol genealógico hacen referencia al estudio molecular posterior.
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C- ¿Encuentra discordancias entre los resultados de la prueba molecular y el
diagnóstico clínico? En caso afirmativo, indique a qué pueden deberse.
Ejercicio 3
Problema. Una niña recién nacida presenta signos compatibles con la fibrosis quística, pero el
diagnóstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para
determinar la presencia de la mutación F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR
una región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se
resuelven luego en un gel de poliacrilamida.
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Para realizar la búsqueda de la mutación G551D se utilizó PCR alelo específica. En este
abordaje experimental uno de los primers del par utilizado sólo puede hibridar con la secuencia
si está presente la mutación buscada. De modo tal que sólo habrá amplificación en ese caso, y
de allí viene el nombre de esta variante de la técnica de PCR.
El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica (los números hacen referencia los
individuos analizados):
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E- ¿Por qué hay un ‘doble pico’ en la posición mutada?
F- ¿Puede concluirse que la mutación hallada explica el diagnóstico clínico de
fibrosis quística? Discuta
Ejercicio 4
existen entonces, 6 109 bases diferentes entre dos personasii . Esa variabilidad interindividual
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puede ser estudiada a nivel fenotípico, es decir, a través del producto génico, o a nivel
genotípico mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la
variabilidad humana de interés cada vez mayor con el curso de los años, es su aplicación en
pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la identificación de seres humanos
involucrados en hechos delictivos, ya sea como víctimas o criminales. Con esos objetivos, la
identificación se realizaba inicialmente con análisis morfológicos, bioquímicos e inmunológicos,
correspondientes éstos últimos a productos de genes ubicados en una fracción del genoma
menor del 10%. Quedaba así un 90% de ADN, no codificante, cuyo potencial para el estudio de
la variabilidad humana empezó a ser descubierto a partir de los años 80, cuando se reconoció
que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso
de las enzimas de restricción y los fragmentos de longitud variable que éstas generaban
(RFLP)iii.
El genoma humano nuclear extragénico está constituido por secuencias únicas y repetidas. Un
subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las
secuencias repetidas en tándem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron
nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de
discriminacióniv
;
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Metodología. Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción,
seguida por la separación de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del
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ADN y la hibridación con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern
propiamente dicho).
La identificación de individuos, mediante el análisis de ADN, se basa en el alto nivel de
polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un número muy alto de genotipos
posibles, a diferencia de los sistemas biológicos de identificación clásicos proteicos, tales como
enzimas, grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en
cada caso Otra ventaja del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su
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Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran más abajo, intentan determinar si un individuo
que alega ser el padre de un niño es su padre biológico. A tal fin se ha analizado los VNTR de
un locus de minisatélite con la metodología descripta previamente.
A- Explique por qué el patrón de bandas de cada individuo consta de dos bandas
B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas ¿Qué conclusiones puede sacar en
cada uno de los casos acerca del lazo biológico entre el padre** y el niño?
C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba ¿Son un 100% certeras? Discutir
Ejercicio 5
Determine para cada uno de los siguientes casos si haría alguna prueba molecular para
realizar el diagnóstico. En caso afirmativo, diga cuál es la prueba que considera más
adecuada, y describa brevemente como discrimina un diagnóstico positivo de uno negativo.
1- Enfermedad monogénica con gen identificado. La mutación más frecuente es una
sustitución (A por T) en una posición puntual.
2- Enfermedad monogénica con patrón de herencia ligado al X recesivo y gen no
descripto.
3- Enfermedad autosómica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones más
frecuentes es una inserción de un par de bases en una posición particular.
4- Enfermedad autosómica dominante con gen conocido. El mecanismo mutacional
implica expansión de tripletes.
5- Enfermedad multifactorial. Algunos de los genes involucrados se conocen.
6- Enfermedad cromosómica. Translocación robertsoniana entre el cromosoma 14 y el 21.
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Ejercicio 6
Introducción:
1- De acuerdo a la información del párrafo anterior, puede afirmarse que la ELA familar
es una entidad con heterogeneidad de locus. Defina este concepto.
Objetivo y metodología:
Con el objetivo de identificar nuevos genes causantes de ELA familiar, los autores del trabajo
de investigación seleccionaron dos familias con miembros afectados por ELA, sin mutaciones
en los genes SOD1, FUS y TDP-43. La familia 1 posee origen caucásico y la familia 2 origen judío
sefaradí. Los pedigrees de ambas familias se muestran en la Figura 1. Para preservar la
identidad de las familias se omitió indicar el sexo de los individuos allí representados.
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“Mutations in the profilin 1 gene cause familial amyotrophic lateral sclerosis”. Wu CH et al.
Nature. 2012 Aug 23;488(7412):499-503. doi: 10.1038/nature11280.
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Familia 1
Familia 2
Para identificar los genes causantes de ELA familiar, se escogieron de cada una de esas familias
2 miembros afectados para realizar una secuenciación de exoma completo (SEC) a partir de
una muestra de sangre de los mismos. La SEC es una de las variantes de la secuenciación de
alto rendimiento y se basa en la secuenciación en paralelo de millones de moléculas de ADN
que provienen del ∼1,5% del genoma que codifica para proteínas (exoma). La potencia de
esta técnica, en el contexto del presente trabajo de investigación, se basa en el hecho de que
la gran mayoría de variantes patogénicas conocidas (∼85%) surgen por mutaciones que se
encuentran dentro de la región codificadora de proteínas del genoma3.
3- Los investigadores utilizan la técnica de SEC para identificar los genes causantes de
ELA familiar. ¿Podría haberse utilizado, en forma alternativa, secuenciación de
Sanger? ¿PCR? ¿CGH array? Justifique su respuesta en cada caso
Resultados:
Se analizó el gen del que provino cada transcripto secuenciado mediante la comparación de su
secuencia con una base de datos del genoma humano. Para determinar cuáles de esos
transcriptos podrían corresponder a la variante patogénica causante de ELA familiar, fueron
filtrados progresivamente utilizando los criterios señalados en la Tabla 1. Notar que en cada
paso de filtrado sólo se analizan los transcriptos que han superado el filtrado de los pasos
anteriores.
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“Ten years of next-generation sequencing technology”. van Dijk EL, et al. Trends Genet. 2014;30:418-
426.
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Tabla 1: Descripción de los pasos de filtrado (=selección progresiva) de los transcriptos secuenciados
Familia 1 Familia 2
Número total de transcriptos identificados en las 2 muestras de cada familia 282.782 382.751
1- Número de transcriptos codificantes 29.777 42.661
Un hecho a destacar es que ambas familias contienen diferentes mutaciones (C71G y M114T)
para un mismo gen: PFN1 (gen de profilina 1), localizado en el cromosoma 17p13.2. La
proteína PFN1 posee 140 aminoácidos y es un regulador central del crecimiento de los
filamentos de actina mediante su unión a la actina monomérica.
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Bases de datos consultadas (disponibles online): Single Nucleotide Polymorphism database (dbSPN
132), 1000 Genomes Project (May 2011 release) y NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) Exome Variant
Server.
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El paso de filtrado número 6 está basado en información adicional al de la secuenciación del exoma
completo de los dos individuos por familia. Esa información adicional fue obtenida de otros miembros
afectados de las familias en los que se analizaron los transcriptos-candidatos que surgen del paso 5
mediante secuenciación de Sanger.
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En base al resultado obtenido mediante la secuenciación del exoma y los pasos de filtrado
posteriores los investigadores sugieren que mutaciones en el gen PFN1 pueden causar ELA
familar.
5- Clasifique a las mutaciones encontradas en el gen PFN1 según los siguientes criterios
señalados a continuación. Justifique en cada caso su elección:
a- Mutaciones somáticas/ de línea germinal
b- Mutaciones puntuales/ de extensión variable
c- Mutaciones de sustitución/ inserción/ deleción
d- Mutaciones sinónimas /de cambio de sentido/ sin sentido
e- Mutaciones de pérdida/ ganancia de función
6- Los datos encontrados muestran que en los casos de ELA familiar en los que está
implicado PFN1 hay heterogeneidad alélica. Defina este concepto. Compárelo y
diferéncielo del concepto definido en la pregunta 1
La Figura 2 muestra el genotipo de aquellos miembros de las familias cuyo ADN estuvo
disponible para el análisis de secuenciación (de Sanger) del gen PFN1.
Los cuatro miembros afectados que fueron analizados de la familia 1 poseían la variante C71G
del gen PFN1. Un único portador obligado de la variante C71G (III:13), no desarrolló la
enfermedad; sin embargo, la muerte de este individuo ocurrió antes de los 50 años, que es la
edad promedio de aparición de síntomas en esta familia. Todos los miembros no afectados de
la familia 1 que fueron analizados poseen el genotipo wild type.
En familia 2, los ocho individuos afectados que fueron analizados poseían la variante M114T.
Un noveno individuo, cuyo ADN no estaba disponible, fue confirmado como poseedor de la
variante M114T (III:2) sobre la base de los genotipos de su compañero reproductivo y sus hijos
(no mostrados en el pedigree). De los 7 miembros no afectados que fueron analizados, 5 no
poseen la variante M11T. Uno de los individuos que no está afectado y es portador de la
mutación tiene 45 años (III:15) y un segundo portador obligado (II:4) fue asintomático hasta su
muerte, que ocurrió a los 78 años.
Familia 1
Familia 2
7- El genotipo del individuo III:2 es inferido a partir del análisis del genotipo de otros
individuos ¿Cúal debe ser el genotipo del compañero reproductivo y de los hijos para
inferir que ese individuo es heterocigota para la variante M114T?
Para validar a las mutaciones C71G y M114T del gen PFN1 como causantes de ELA familiar, son
necesarios ensayos de investigación básica. En ese contexto, dados los impedimentos éticos y
prácticos de la experimentación en humanos, el uso de modelos animales es una herramienta
particularmente informativa.
i
Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mRNA as a result of a triplet repeat
expansion in myotonic dystrophy. Genomics 1993; 18: 340-348.
ii
Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995.
iii
Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA
fingerprinting: State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag,
1993, pp. 257-260.
v
Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of
family relationship, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840,1991.
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