Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi adanya antibodi atau antigen

dalam suatu sampel. ELISA menggunakan indikator berupa enzim. Macam-macam enzim

yang bisa digunakan pada teknik ELISA diantaranya adalah Horse Radish Peroxidase (HRP),

alkaline phospatase, dan urease. Enzim pada teknik ELISA berfungsi sebagai konjugat,

selanjutnya enzim akan bereaksi substrat sehingga menghasilkan warna pada hasil reaksi

(Rantam, 2003).

Pada teknik ELISA sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan,

selanjutnya antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan

dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim. Pada tahap terakhir ditambahkan

substrat yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA

fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel

maka kompleks antigen atau antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada

sampel dapat diketahui berdasarkan besarnya fluoresensi. Penggunaan ELISA melibatkan

setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu (Rantam, 2003).

Macam-m,acam ELISA yang sering digunakan yaitu Double Antibodi Sandwich ELISA,

direct ELISA, indirect ELISA, dan kompetitif ELISA. Kelebihan metode ELISA

dibandingkan dengan metode yang lain adalah teknik pengerjaan yang relatif sederhana,

reagen yang digunakan cukup stabil, relatif ekonomis karena jenis antibodi yang digunakan

hanya satu saja sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi, cukup

spesifik karena antibodi monoklonal hanya akan melekat pada antigennya, hasil yang

didapatkan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi, dapat digunakan untuk mendeteksi

keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah, lebioh aman karena tidak

menggunakan senyawa radioaktif dan juga dapat digunakan sebagai uji diagnostik berbagai

penyakit yang disebabkan oleh virus mupun bakteri (Baker et al, 2007).
Kelemahan dari metode ELISA yaitu menggunakan antibodi monoklonal yang mahal dan

sulit dicari, dapat terjadi kesalahan deteksi (false positive) jika larutan blocking yang

digunakan tidak efektif jarena dapat menyebabkan perlekatan non-spesifik antara antigen

maupun antar antibodi, reaksi antara enzim dan substrat di dalamnya hanya terjadi dalam

waktu cukup singkat sehingga harus segera dibaca absorbansinya sesuai waktu standar yang

ditetapkan untuk mendapatkan hasil (Machmud, 2006).

Prinsip

Sampel serum atau plasma yang mengandung HbsAg ditambahkan ke sumuran yang dilapisi

anti-HBs selanjutnya ditambahkan dengan konjugat berupa anti-HBs peroksidase dan

diinkubasi. Maka kompleks antara antibodi-HbsAg dan antibodi peroksidase akan terbentuk

pada sumuran.

Setelah plate mikrotiter dicuci untuk menghilangkan material yang tidak terikat. Kemudian

ditambahkan larutan substrat berupa TMB (Tetrametyl-benzidine) ke semua sumuran dan

diinkubasi. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan jumlah HbsAg yang terikat

dengan Anti-HBs.

Reaksi antara enzim dan substrat yaitu antara enzim peroksidase dengan TMB dihentikan

dengan penambahan asam sulfat. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan nilai

absorbansi yang dapat dibaca pada fotometer pada panjang gelombang 450 nm dengan

panjang gelombang referensi yang dapat dipilih yaitu antara 620 sampai 690 nm.

Sampel

Serum atau plasma

Reagen
a. Plate HbsAg : plate mikrotiter yang dilapisi dengan anti-HBs monoklonal tikus (1

plate untuk 96 tes / 5 plate untuk 480 tes)

b. Anti-HBs peroksidase solution : 1 botol 8 ml untuk 96 tes atau 1 botol 25 ml untuk

480 tes. Konjugat poliklonal Anti-HBs HRP yang diencerkan dalam buffer dengan

stabilisator protein. Pengawet : 0.003% Gentamisin dan 0.01% Thimerosal

c. Kontrol positif HbsAg : 1 botol 1.5 ml untuk 96 tes atau 1 botol 3 ml untuk 480 tes.

Serum manusia yang diinaktivasi positif untuk HbsAg tetapi tidak reaktif untuk anti

HCV dan anti HIV ½ diencerkan dalam buffer dengan stabilisator protein. Pengawet :

0.003% Gentamisin dan 0.01% thimerosal

d. Kontrol negatif HB : 1 botol 2 ml untuk 96 tes atau 1 botol 3 ml untuk 480 tes. Serum

tidak reaktif untuk penanda HBV, anti-HCV dan anti HIV 1/2 diencerkan dalam

buffer dengan stabilisator protein. Pengawet : 0.003% Gentamisin dan 0.01%

thimerosal.

e. TMB substrat solution A : 1 botol 12 ml untuk 96 tes atau 1 botol 35 ml untuk 480

tes. Mengandung 0.6 mg/ml dari 3,3’5,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) pada basis

organik.

f. TMB substrat solution B : 1 botol 12 ml untuk 96 tes atau 1 botol 35 ml untuk 480

tes. Mengandung buffer asam sitrat yang mengandung 0.03% H2O2.

g. Washing solution D (20x) : 1 botol 58 ml untuk 96 tes atau 1 botol 250 ml untuk 480

tes. Konsentasi fosfat buffer dengan Tween-20

h. 2NH2SO4 : 1 botol 12 ml untuk 96 tes atau 1 botol 50 ml untuk 480 tes. Mengandung

asam sulfat 2N.

Alat-alat

 Mikropipet 50 μl dan 100 μl

  Tip kuning

 Waterbath

 Plate pencuci

 Pembaca microwell ELISA : panjang gelombang 450 nm dengan panjang

gelombang referensi 620 sampai 690 nm

 Fully automatic EIA micro-plate analyzer

Cara kerja

1. Sebelum reagen dan sampel digunakan terlebih dahulu biarkan pada suhu ruang (20

sampai 30˚C). Siapkan inkubator pada suhu 37˚C

2. Siapkan satu sumuran kosong yang digunakan sebagai blanko. Tambahkan 50 μl

kontrol atau sampel pada masing-masing sumuran pada plate mikrotiter (3 kontrol

negatif dan 2 kontrol positif). Selalu gunakan tip pipet yang bersih pada masing-

masing sampel

3. Tambahkan 50 μl Anti HBs-Peroksidase solution pada masing-masing sumuran

kecuali pada blanko (jangan menyentuh dinding sumuran untuk mencegah

kontaminasi)

4. Homogenkan dengan cara mengetuk plate secara perlahan

5. Tutup plate dengan menggunakan perekat dan pastikan masing-masing sumuran

tertutup dengan baik. Kemudian inkubasi selama 37˚C pada inkubator atau waterbath

selama 80 menit

6. Pada akhir waktu inkubasi buka dan buang perekat dan cuci plate sesuai dengan

prosedur yang telah ditentukan

 7. Setelah dilakukan pencucian tambahkan l TMB substrat solution A sebanyak 50 μl

kemudian tambahkan 50 μl TMB substrat solution B pada masing-masing sumuran

kecuali pada sumuran blanko. Campur dengan baik.

8. Tutup plate dengan cover berwarna hitam dan inkubasi pada suhu ruang selama 30

menit

9. Tambahkan 100 μl H2SO4 2N pada masing-masing sumuran kecuali sumuran blanko

untuk menghentikan reaksi yang terjadi

10. Tentukan absorbansi dari kontrol dan sampel dalam 30 menit dengan menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 450nm .

Baker GB, Dunn S, Lajtha A, Holt A. 2007. Handbook of neurochemistry and molecular

biology.

Rantam FA. 2003. Metode Imunologi. Cetakan Pertama. Surabaya. Airlangga University

Press.

Machmud, M. dan Y. Suryadi. 2006. Deteksi dan identify-kasi strain R. Solanacearum

dengan teknik ELISA Tidak Langsung. Penelitian Pertanian