1. La técnica se basa en la propiedad de los linfocitos T humanos de unirse a los
eritrocitos de carnero formando rosetas E. Esta técnica no puede diferenciar entre linfocitos Tc y Th debido a que se basa en el receptor CD2, el cual está presente en ambos tipos de célula (Lomonte, 2009)
2. La citometría de flujo en principio crea microgotas de fluido a través de un
microtubo, la solución de este fluido se ajusta de modo que sea improbable que haya más de una célula por microgota, si se quiere identificar un tipo de célula en particular esta es marcada fluorescentemente, adyacente al tubo por el que fluyen las gotas hay un láser y frente a este un detector. Cuando las células marcadas fluorescentemente son expuestas al láser estas brillan, siendo este brillo detectado y registrado si simplemente se quiere hacer un conteo. Si se quiere separar estas células posteriormente hay unos electroimanes que cargan diferencialmente las gotas según se haya detectado que estas están marcadas o no, según su carga estas se dirigirán a dos caminos diferentes, terminando separadas (Loken MR ,1990).(Ver anexos, figura 1).
3. Cuando una célula presentadora de antígeno ingiere un patógeno, sus proteínas
son degradadas y fragmentos de aproximadamente 20 aminoácidos de estas son unidos al MHC-II. Cuando un linfocito T reconoce estos antígenos, estimula al linfocito B mediante la liberación de citoquinas, finalmente los linfocitos B producen anticuerpos específicos para este antígeno,(Wearsch and Cresswell, n.d.), (Nesmiyanov, n.d.).
Preguntas prácticas
Inmunofluorescencia:
A. Describa los resultados obtenidos.
R. No fue posible observar linfocitos B por fluorescencia, en su lugar se presentó una aglomeración alargada que contiene el fluorocromo, elemento que no se asocia a la estructura esperada. B. Discuta los resultados obtenidos: ¿Pudo observar linfocitos fluorescentes? ¿Por qué si? o ¿Por qué no?
No pudimos observar linfocitos por medio de inmunofluorescencia, esto pudo
deberse a que no se tomaron correctamente las células de la interfaz después de centrifugar, por lo tanto al realizar el procedimiento de unión, estos no se unieron a los anti-IgMs marcados con fluoresceína. Fallas al momento de secar la lámina y fijar las células pueden llevar a que no se una correctamente el segundo anticuerpo, este segundo anticuerpo es el que está marcado con fluoresceína, por lo tanto no se verán los linfocitos en el microscopio. Si hubo errores en el aislamiento de las células, la membrana de estas pudo haberse degradado y por lo tanto no habría unión con los anticuerpos.
Recuento/Viabilidad celular:
a. A partir de los resultados obtenidos calcule el índice de viabilidad de las células
observadas. Discuta sus resultados.
Encontramos dos células vivas y una muerta, para un total de 3 células,
por tanto el IVC es de 66,6% aunque dado el reducido tamaño de la muestra este no es un dato extrapolable o confiable.
b. Calcule el número de células presentes en la suspensión de linfocitos obtenida
al inicio de la práctica. Determinamos que la suspensión inicial contenía 7500 células/mL
Bibliografía
Lomonte, B. (2009). Tecnicas de Laboratorio en Inmunologia Clinica [Ebook] (3rd ed.).
Retrieved from http://www.medic.ula.ve/idic/docs/clases/iahula/curso_2010/suplementario-tema16.pdf Loken MR (1990). "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting" (2nd ed.). Wiley: 341–53.n MR (1990). "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting" (2nd ed.). Wiley: 341–53.
Nesmiyanov, P. Antigen Processing and Presentation | British Society for Immunology.
Retrieved from https://www.immunology.org/public-information/bitesized- immunology/systems-and-processes/antigen-processing-and-presentation Wearsch, P., & Cresswell, P. Poster : Antigen processing and presentation. Retrieved from https://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing/index.html
Anexos Figura 1: Ilustración metodología citometría de flujo.