CARA PEMBUATAN DAN PEWARNAAN BAKTERI

PEMBUATAN SEDIAAN

Cara pembuatan sediaan bakteri yang siap untuk diwarnai dari bahan yang diambil
langsung dari pasien.

Bahan yang diambil langsung dari pasien dapat berupa nanah (pus), dahak (sputum),
discharge telinga, discharge hidung, dan urine (perlu disentrifuse terlebih dahulu, endapannya
dibuat sediaan / preparat). Cara pembuatan sediaan:

 Bahan diambil dengan ose steril atau lidi kapas steril.

 Menggoreskan pada gelas obyek secara tipis.
 Fiksasi sediaan dengan cara melewatkan sisi gelas obyek yang tidak ada sediaanya di atas
api spiritus beberapa kali agar sediaan kering, menempel kuat pada gelas obyek dan
bakteri mati.
 Setelah kering, menetesi sediaan dengan formalin 1%, tunggu lima menit, kemudian
keringkan sekali lagi.
 Sediaan / preparat siap diwarnai.

PEWARNAAN BAKTERI

1. Cara melakukan pewarnaan Gram sebagai berikut ini:

 Sediaan bakteri / preparat yang telah siap dicat ditetesi dengan cat Gram A. Tunggu
selama 1 menit. Kemudian cat dibuang tanpa dicuci. Pada tahap ini bakteri baik bakteri
Gram positif maupun bakteri Gram negatif akan tampak berwarna ungu.
 Kemudian ditetesi dengan cat Gram B. Tunggu selama 1 menit. Akibat pemberian cat
gram B maka pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih baik. Setelah itu cat dibuang
dan sediaan di cuci dengan air mengalir pelan sampai tetesan air menjadi jernih.
 Kemudian ditetesi dengan cat Gram C. Tunggu selama 1 menit. Setelah pemberian cat
Gram C ini maka akan terjadi:
 Pada bakteri Gram positif: tahan terhadap alkohol, sehingga ikatan antara cat sebelumnya
dengan bakteri tidak dapat dilunturkan oleh alkohol, sehingga bakteri tetap berwarna
ungu.
 Pada bakteri Gram negatif: tidak tahan dengan alkohol, sehingga ikatan antara cat
sebelumnya dengan bakteri dapat dilunturkan oleh alkohol, sehingga bakteri menjadi
tidak berwarna lagi.
 Setelah itu cat dibuang dan sediaan di cuci dengan air mengalir pelan sampai tetesan air
menjadi jernih.
 Kemudian tetesi dengan cat Gram D. Tunggu selama 1 menit. Cat Gram D bertindak
sebagai kontras. Akibat pemberian cat Gram D ini terjadi:
 Pada bakteri Gram positif: karena telah jenuh dan mengikat cat Gram A maka ia tidak
mampu lagi untuk mengikat cat Gram D, sehingga bakteri tetap berwarna ungu.
 Pada bakteri Gram negatif: karena cat gram A telah dilunturkan oleh cat Gram C sehingga
bakteri tidak berwarna lagi, maka ia akan mengikat cat Gram D, sehingga bakteri akan
berwarna merah.
 Setelah itu cat dibuang dan sediaan dicuci dengan air mengalir pelan sampai tetesan air
menjadi jernih.
 Mengeringkan sediaan pada udara kamar (sediaan / preparat dalam posisi miring).
 Siap diperiksa menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1000x (lensa okuler
pembesaran 10x dan lensa obyektif pembesaran 100x). Pembesaran 1000x ini
memerlukan 1 tetes minyak emersi yang diteteskan di atas preparat.

2. Cara melakukan pewarnaan ZN sebagai berikut ini:

 Sediaan bakteri yang sudah siap dicat ditetesi dengan cat ZN- A. Kemudian sediaan
dipanasi dengan api spiritus sampai kering. (Pemanasan tidak boleh sampai mendidih,
karena akan menimbulkan gelembung udara yang akan mengganggu pengamatan).
 Tunggu selama 5 menit, kemudian cuci dengan air mengalir pelan, sampai air yang
menetes jernih.
 Kemudian tetesi dengan cat ZN-B sampai warna cat terlunturkan. Kemudian cuci dengan
air mengalir pelan. Pada tahap ini akan terjadi:
 Pada bakteri tahan asam, warna cat ZN-A tidak dilunturkan oleh bahan ZN-B, sehingga
bakteri tetap berwarna merah.
 Pada bakteri tidak tahan asam, warna cat ZN-A terlunturkan oleh bahan ZN-B, sehingga
bakteri kembali tidak berwarna.
 Kemudian tetesi dengan cat Zn-C, tunggu 2 menit. Kemudian cuci dengan air mengalir
pelan. Pada tahap ini akan terjadi:
 Pada bakteri tahan asam, telah jenuh oleh cat ZN-A, sehingga tidak lagi mampu mengikat
cat ZN-C. Bakteri tetap berwarna merah dengan latar belakang biru.
 Pada bakteri tidak tahan asam, mampu mengikat cat ZN-C, sehingga bakteri berwarna
biru dan latar belakangnya juga biru.
 Kemudian sediaan dicuci dan dikeringkan di udara kamar.
 Sediaan siap diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1000x.
 IDENTIFIKASI BAKTERI

Demonstrasi
1. Preparat staphylococcus pada pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan Gram
2. Biakan S. aureus pada lempeng agar nutrient
Biakan S. epidermidis pada lempeng agar
nutrient
Biakan S. saphrophyticus pada lempeng agar nutrient

3. Biakan S. aureus pada lempeng agar darah

Biakan S. epidermidis pada lempeng agar
darah
Biakan S. saphrophyticus pada lempeng agar darah

4. Uji koagulase positif (ada gumpalan) dan negatif. Cara melihat adalah
dengan mengangkat tabung, miringkan sedikit, jangan dikocok.
5. Uji katalase positif (ada gelembung-gelembung gas) dan negatif (tidak ada gelembung
gas)
6. Uji fermentasi manitol positif (warna kuning) dan negatif (warna merah)
7. Uji kepekaan antibiotika cara difusi (dengan cakram antibiotika)
8. Uji kepekaan novobiosin

I. Pembuatan preparat dari material langsung untuk pemeriksaan mikroskopik

Bila material berasal dari pus atau sputum, akan didapat morfologi staphylococcus
yang khas yakni, merupakan bakteri:

- Bentuk bulat, diameter kira-kira 1 um

- Sifat pengecatan: Gram positif, makin tua makin kearah Gram negatif
- Susunan: biasanya mempunyai susunan yang khas menggerombol seperti buah
anggur. Tapi dapat juga tunggal, berpasangan atau berempat. Susunan yang tidak
 khas tersebut terutama bila preparat dibuat dari media cair.
II. Mannitol Salt Agar (MSA)
Medium ini selektif untuk Staphylococcus aureus karena mengandung 7,5% NaCl.
Medium ini mengandung indikator pH phenol red dan gula mannitol. Bila ditanami S.
aureus akan terjadi fermentasi manitol yang menghasilkan asam, akibatnya medium
berwarna kuning. S. epidermidis dan S, saprophyticus tidak memermentasi manitol dan
medium tetap berwarna merah.
Catatan: Fermentasi manitol (+) : S. aureus , (-):S. epidermidis dan S, saprophyticus

III. Uji Katalase

Untuk membedakan staphylococcus dari streptococcus
dilakukan uji katalase. Reaksi: H2O2 -------------------- H2O + O2
Cara:
a. Tube test
Trypticase Soy Broth + 1 koloni kuman, lalu diinkubasi 24 jam dan ditetesi dengan
H2O2 3%.
b. Slide test
- Ambil koloni kuman dan hapuskan pada obyek glass bersih
Tetesi beberapa tetes H2O2 3% dan lihat adanya gelembung
gas
- Bila ragu-ragu tutup dengan cover glass
- Positif : adanya gelembung=gelembung gas, negatif: tidak ada gelembun
gas
- Catatan:
- Jangan dari klutur yang usianya lebih dari 24 jam (bisa false negatif)
- Jangan dari blood/chocolate agar plate, karena katalase ditemukan di sel darah merah
- Uji katalase untuk staphylococcus harus positif (+).

IV. Koagulase test

 Pemeriksaan ini bertujuan untuk membedakan Staphylococcus aureus dengan
staphylococcus dari species yang lain. S. aureus menghasilkan enzim koagulase
sedangkan staphylococcus dari species yang lain tidak. Enzim ini mengubah fibrinogen
menjadi fibrin. Fibrin ini akan melapisi
S. aureus dan akan melindungi kuman ini
dari phagocytosis. Bahan:

Plasma EDTA kelinci, dibagi dalam tabung screw cup, setiap tube berisi 0,5 ml
plasma
- t abung bisa disimpan di lemari es 10 hari atau reezer untuk beberpa bulan
- jangan ambil kuman dari MSA (hasil bisa false negatif) tetapi dari medium
netral seperti Mueller Hinton (MH).

Cara :
- tanamkan satu koloni Staphylococcus pada 0,5 ml plasma Kelinci.
- Inkubasi pada suhu 37oC selama 4 jam, Bila ada gumpalan berarti positif.
- Bila tidak ada gumpalan, inkubasi pada temperatur ruang hingga 24 jam.
- Positif: ada gumpalan (walaupun sedikit) pada 4 jam atau 24 jam.
- Negatif : tidak ada gumpalan (setelah 24 jam)

V. Tes Kepekaan Novobiocin

Pemeriksaan ini bertujuan untuk membedakan S. saprophyticus dengan S, epidermidis . S.
saprophyticus resisten terhadap novobiocin, sedangkan S, epidermidis sensitif.

Bahan:
a. Reagen
- Antibiotik disk novobiocin 5 ug
- TSB broth 1 ml dalam tabung tertutup yang steril
b. Peralatan
- Swab steril
 c. Prosedur
- Metode: sama dengan metode kepekaan KIRBY BAURER
- Interpretasi:
Jika zona hambatan < 15 mm berarti resisten terhadap novobiocin -----S.
saprophyticus. Bila sensitif > 15 mm --------- S, epidermidis

Tabel 1, Identifikasi Staphylococcus

S.
No. Pemeriksaan S. aureus S. epidermidis
saprophyticus
1. Tes Koagulase + - -

2. Hemolisis + +/- -

3. Tes Mannitol + - -

4. K epekaan terhadap +/- Sensitif Resisten

Novobiocin