CAPITULO 19 Inmunohistoquimica (I): técnicas de inmunofluorescencia GUION DE CONTENIDOS332 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 1. GENERALIDADES SOBRE METODOS INMUNOHISTOQUIMICOS Los métodos inmunohistoquimicos sirven para detectar antigenos celulares o tisulares mediante reacciones antigeno-anticuerpo. Para visualizar el lugar don- de ocurre la reaccién antigeno-anticuerpo es preciso emplear un trazador o marcador. El marcaje puede realizarse con fluorocromos (técnicas de inmuno- fluorescencia), enzimas (técnicas inmunoenzimaticas), iones metélicos en forma coloidal (técnica de inmuno-org) is6topos radiactivos. El antigeno puede detectarse tanto por marcaje directo del anticuerpo (técni cas disectas) como por alguno de los muchos métados de marcaje secundario. 2. FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA Las técnicas de inmunofluorescencia fueron introducidas por Coons y cola- boradores en 1941 y desde entonces se han utitilizado profusamente tanto para el diagnéstico clinico como en investigaciones basices. La fluorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose esta ultima como la emisién de luz que se produce a pa térmica. La fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquella que presen- tan determinadas sustancias de forma esponténea, sin necesidad de ser modifi- cadas; por ejemplo, la lamina elastica de las arterias muestra autofluorescencia en determinadas condiciones. En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir fluorescencia —fluorescencia secundaria— mediante tincién histoquimica con moléculas fluorescentes denominadas fluorocromos, © unien- do fluorocromos a anticuerpos dirigidos contra antigenos tisulares: de este dlti- mo procedimiento se sirven las técnicas de inmunofluorescencia. de una fuente de energia no FLUOROCROMOS Son sustancias quimicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta energia procedentes de la radiacién ultravioleta 0 del espectro visible. Ello pro- voca una redistribucién de los electrones de las moléculas fluorescentes, puesta de manifiesto por la emisién de una radiacién luminosa de longitud de onda distinta, aunque dentro del espectro visible. En este proceso siempre existe una cierta pérdida de energia, ya que la cantidad de energia de la radiacion emitida es inversamente proporcional a su longitud de onda: la luz que provoca el fenomeno de fluorescencia siempre tiene menor ‘angitud de onda que la luz emitida por 'a sustancia fluorescente (ley de Stoke). Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenémeno similar al descrito y la liberacién de energia se produce de forma gradual, proiongéndose la emision de luz después de cesar la iluminacién del objeto, el fendmeno recibe el nombre de fosforescencia. Los fluorocromos més utilizados en las técnicas de inmunofluorescencia son la fluorescefna, la rodamina y la ficoeritrina, La fluoresceina se usa generalmente en forma de isotiocianato (FITC), absorbe luz azul y emite fluorescencia verde manzana. La rodamina se emplea en forma de isotiocianato de tetrametilroda-INMUNOHISTOQUIMICA (I): TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 333 mina (TRITC), absorbe luz verde y emite fluorescencia rojo-anaranjada. Por Ultimo la ficoeritrina (PCE) absorbe luz azul y produce fluorescencia roja. Un fluorocromo se considera optimo para las técnicas de inmunofluorescen- cia si retine las siguientes condiciones: 2) Minima interferencia en la reaccién antigeno-anticuerpo. b) Maxima estabilidad para las condiciones de almacenamiento. c) Disponibilidad sencilla en su forma purificada. d) Maximo de emisién comprendido dentro del espectro de luz visible. e) La longitud de onda de la luz excitadora de la fluorescencia y la de la luz emitida por el fluorocromo deben estar lo suficientemente distantes co- mo para que puedan diferenciarse facilmente. f) El fluorocromo debe descomponerse lo menos posible con la exposicién de la luz. Aunque no existe un fluorocromo perfecto, el isotiocianato de fluorescein es la molécula que redne mayores ventajas como tal. Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la capacidad de estos Ultimos para unirse a sus correspondientes anti- genos, Por ello, los fluorocromos ligados a anticuerpos especificos constituyen un medio Util de visualizar los lugares donde ocurre la reaccién antigeno- anticuerpo. En consecuencia, fa utilizacién de dos anticuerpos marcados con fluorocromos distintos permite llevar a cabo dobles tinciones. UNION DE FLUOROCROMOS A PROTEINAS: UNION A ANTICUERPOS El modo de unién depende del tipo de fiuorocromo. Los isotiocianatos de fluoresceina y de rodamina se ligan mediante enlace covalente con los grupos amino y carboxilo de las proteinas. Esta unién tiene lugar a pH alcalino. Cuando se trata de conjugar el fluorocromo con anticuerpos deben usarse moléculas purificadas de estos Uitimos, evitando asi la posibitidad de unién a otras protei- nas. Omitimos e! procedimiento técnico de la conjugacién porque en la mayor parte de los laboratorios fos anticuerpos marcados con el fluorocromo se obtie- nen en el comercio, No obstante, puede resultar conveniente que cada laborato- rio evalize algunos parametros de anticuerpos con los que trabaja, como por ejemplo el cociente fluorocromo/protena del conjugado. Este cociente se deter- mina por andlisis espectrofotométricos, de forma que se mide la densidad éptica del conjugado a 280 nm (dicho valor corresponde al pico de absorcién de la tirosina presente en la molécula de proteina) y se compara con la densidad Optica a 495 y 415 nm de longitud de onda, que corresponden a los picos de absorcién de la fluoresceina y rodamina, respectivamente, Para la mayor parte de las aplicaciones de inmunofluorescencia este cociente sera Sptimo si se encuen- tra entre 0.5 y 2, 0 lo que es igual, cuando existen entre 0.5 y 2 moléculas de fiuorocromo por molécula de anticuerpo. Si el resultado de las técnicas se observa con un microscopio de incidencia (epiiluminacién), la proporcién fluo- rocromo/proteina puede ser mas baja. Por otra parte, si se va a investigar un antigeno presente en grandes cantidades, el cociente debe ser menor que cuan- do ef antigeno aparece en menor proporcién.334 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 3. TIPOS DE TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 3.1. Preparaci6n del tejido para inmunofluorescencia Las técnicas de inmunofluorescencia se realizan casi siempre sobre tejido congelado porque el procedimiento de fijacién en formol ¢ inclusién en parafi- ‘na presenta numerosos inconvenientes para el desarrollo de estos métodos. Entre estos inconvenientes figuran el aumento de los fendmenos de autofluores- cencia y el bloqueo de gran cantidad de determinantes antigénicos provocado por los agentes fijadores. En la técnica de inmunofluorescencia directa se utiliza un anticuerpo especifico frente al antigeno que se desea detectar, conjugado a un fluorocromo (tig. 19.1). En las técnicas de inmunofluorescencia de tipo indirecto, se emplea en un primer paso el anticuerpo especifico no marcado y en una segun- da tase, un anticuerpo marcado con el correspondiente fluorocromo, que reac- ciona de forma especifica con el anticuerpo primario (fig. 19.1) a MA Figura 19.1. Diversos tipos de técnicas de inmunofiuorescencia. 4 ee La técnica indirecta ofrece algunas ventajas en relaci6n con la directa: es més sensible y resulta muy Util para detectar en el suero de pacientes enfermos determinados tipos de anticuerpos, tales como aquéllos que son capaces de reaccionar con antigenos presentes en ios propios tejidos (véase «Procedimiento técnico y resultados»). Por otra parte, la técnica indirecta permite utilizar un Gnico anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo frente a muchos anti- sueros primarios: éstos s6lo deben cumplir el requisito de proceder todos ellos dei animal frente a cuyas inmunoglobulinas va dirigido el anticuerpo secundario (para mas detalles, véanse las técnicas homélogas de inmunoperoxidasa en el capitulo 20).INMUNOHISTOQUIMICA (I): TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 335 écnica directa para tejido congelado PROCEDIMIENTO TECNICO (=aeeae on ose i cule puch peblgnse Sims] 1. Se realizan cortes en el criostato de aproximadamente 5 micras de espesor. 2. Se delimita, mediante un circulo realizado con un |Apiz de diamante alre- dedor de cade seccién, la superficie de incubacién con los anticuerpos (pueden utilizarse portaobjetos disefiados especificamente para metodolo- gla inmunohistoquimica). 3. Fijar en acetona fria a -20°C, entre 5 y 15 minutos. 4. Secar los cortes al aire. 5. 6 Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos cada uno, Drenar el exceso de PBS y secar alredador del circulo usando un pafiuelo de papel. 7. Cubrir la seccién con el antisuero primario conjugado, a la dilucién éptima determinada previamente. La incubacién se realizara en cémera himeda breservada de la luz a temperatura ambiente y durante 30 minutos. 8. Realizar otros 3 lavados como en el paso 5 y secar igualmente en torno al circulo. 9. Montar utilizando un medio hidrosoluble especifico para inmunofluores- cencia, o en su defecto en PBS-glicerol gelatina. Sellar los bordes de! cu- breobjetos con esmalte de ufias 0 usar en su lugar polivinilalcohol. 10. Alnacenar a 4°C hasta su lectura en un microscopio de fluorescencia pre- servando en todo momento de la tuz. Resultados: | —Mareaje con FITC ............. Fluorescencia verde-manzana | —Mareaje con TRITC Fluorescencia rojo-anaranjada 1 Observaciones: La técnica directa de inmunofiuorescencia se usa fundamentalmente en el diag- néstico de la patologia renal (fig. 19.2) y de determinadas lesiones cutaneas (para més detalles, consiltense los capitulos 29 y 36). Figura 19.2. Determinacién de depésitos de Ig G en glomérulos renales de un enfermo con glomerulonefritis mediante técnicas de inmunofluores- cencia directa (10).336 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 3.3. Técnica indirecta Este método se emplea sobre todo para detectar autoanticuerpos en el suero de pacientes con enfermedad autoinmune. Puede ser muy itil fabricar un bloque que contenga distintos tejidos porque ello permite detectar diferentes autoanti- cuerpos de forma simultanea y con una Gnica muestra de suero. Acontinuacién se n los tejidos recomendados para determinar los tipos més usuales de autoanticuerpos: —Anticuerpos antinucleares ANA (higado y rifién de rata). —Anticuerpos antimisculo liso SMA (rifén y estémago de rata). —Anticuerpos antimitocondriales AMA (rifién y estémago de rata). — Anticuerpos antimicrosomiales frente a higado y de rifién (higado y rifién de rata). —Anticuerpos antimicrosomas tiroideos (tejido tiroideo humano). —Anticuerpos antimiisculo estriado (eséfago de rata). — Anticuerpos antineutréfilos ANCA (granulocitos humanos) PROCEDIMIENTO TECNICO [WwINMUNOHISTOQUIMICA (1): TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 337 Figura 19.3. Anticuerpos antineutrofilos en el suero de un enfermo con granulomatosis de Wegener, detectados mediante técnica de inmunofluores~ cencia indirecta (10) 3.4. Otras técnicas de inmunofluorescencia Otros procedimientos técnicos de inmunofluorescencia, bastante menos uti- lizados que los anteriores, son la «técnica sandwich» y la técnica de incuba- cién con complemento (fig. 19.1). La primera de ellas se emplea para detec- tar la presencia de inmunoglobulinas especificas frente a un determinado anti- geno en las células plasmaticas de tejidos pertenecientes a un animal previa mente inmunizado con ese antigeno. Para ello, se toman secciones de ganglio linfatico procedente del animal inmunizado, se afiade el antigeno en un primer paso y después un anticuerpo marcado con fluoresceina frente a dicho antigeno (fig. 19.1). Si en el tejido existian anticuerpos frente al antigeno, se uniran a éste, que quedard a su vez fijado sobre el tejido y podrd ser detectado con el anticuerpo marcado. La técnica de incubacién con complemento es una modificacién de la técni- ca indirecta, y en ella el anticuerpo que se emplea en el primer paso de la técnica ha de ser capaz de fijar el complemento. Una vez realizada la primera incubacion con dicho anticuerpo, que a su vez es especifico frente a un determinado antigeno, se afiade suero fresco de cobaya como fuente del complemento y se incuba a 37°C. En una tercera fase se incuba con un anticuerpo especifico frente a una determinada fraccién del complemento marcado con fluorocromo. Esta técnica se usa generalmente con el fin de conocer la capacidad de determi- nados anticuerpos para fijar el complemento. 3.5. Dobles tinciones en inmunofluorescencia La determinacién de dos antigenos diferentes puede hacerse de forma simulténea o secuencial. En el primer caso se incuba el tejido con una mezcla de dos antisueros especificos frente a los antigenos que se quiere determinar, marcados con dos fluorocromos distintos. En la tecnica secuencial se incuba en338 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA primer lugar con uno de los antisueros marcado con un fluorocromo y se fotogratian los campos mas significativos. A continuacién se elimina la positivi- dad destruyendo los grupos fluorescentes mediante la aplicacién de luz ultravio- leta. Una vez comprobado que la destruccién es completa, se elimina el cu- breobjetos sumergiendo la preparacién en una solucién buffer y se incuba con un segundo antisuero marcado con fluorocromo. Este método presenta una serie de inconvenientes; asi, es preciso realizar fotogratias seriadas para identificar las células positivas; ademas, no pueden detectarse mas de dos antigenos diferentes ya que por encima de una determ: nada dosis de luz ultravioleta se deteriora el tejido, lo cual repercute en las ulteriores secuencias técnicas. 4. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Las técnicas de inmunofluorescencia deben examinarse siempre con un mi- croscopio especial —microscopio de fluorescencia— (fig. 19.4). Este tipo de microscopio lleva incorporado: a) una fuente de luz ultravioleta y luz visible; b) uno 0 varios filtros que seleccionan la longitud de onda de la luz que incide sobre la muestra —filtros de excitacién o filtros primarios— y c) un filtro que selecciona las longitudes de onda emitidas dentro del espectro de la luz visible, dejando pasar sélo la luz emitida por la sustancia fluorescente e impidiendo el paso de la luz excitadora —filtro secundario 0 de barrera. La fuente de luz puede ser una lampara de vapor de mercurio a alta presin o una lampara halégena de cuarzo. La primera produce més energia y es preferible cuando se espera una inmunofluorescencia de intensidad baja. No obstante, tiene algunos inconvenientes: es cara, encierra el riesgo de explosion y se oscurece conforme pasa el tiempo, con progresiva reduccién de la luz emitida. Las lamparas halégenas son més seguras y baratas, y la energia que producen aunque menor, es mds constante. Figura 19.4. Microscopio de fluorescencia de luz de incidenciaINMUNOHISTOQUIMICA (I): TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA 359 Existen dos tipos fundamentales de microscopio de fluorescencia: en uno de ellos, la luz de excitacién se transmite a través del espécimen —microscopio de transmisién— en el otro, la luz se refleja en el tejido procedente de un foco de iluminacién superior —microscopio de luz de incidencia o de epiilu nacién. 44. Microscopio de luz de transmisién (fig. 19.5) La luz procedente de la fuente pasa primero por un filtro excitador que selecciona las tongitudes de onda més eficaces para producir fluorescencia sobre el fluorocromo presente en la muestra. La luz contacta con la muestra y se transmite a través del objetivo. Estos microscopios llevan acoplado un conden- sador de campo oscuro. La luz que no es absorbida por el espécimen y entra dentro del objetivo, queda excluida por un filtro de barrera (filtro supresor): de lo contrario no podria visualizarse correctamente la fluorescencia. Cuando el fluo- rocromo de la muestra absorbe la luz, emite otra radiacién de mayor longitud de ‘onda, la cual entra en el objetivo. El filtro de barrera, que es impermeable para la luz de excitacién permite sin embargo el paso de luz emitida por el fluorocromo, fenémeno que puede observarse entonces a través del ocular. Figura 19.5. Esquema del microscopio de fluorescencia del tipo de trans- mision. La luz emitida por la fuente luminosa (L) pasa por él filtro primario (FE), se refleja sobre un espejo (E) y llega al corte de tejido (C). La luz emitida por el fluorocromo en la muestra alcanza el filtro secundario (FB), se refleja en espejo (E’) y sale por el ocular (O). 4.2. Microscopio de luz de incidencia (fig. 19.6) ‘También se denomina de epifiuorescencia o de iluminaci6n vertical. La luz de excitacién procedente de la fuente pasa a través de un filtro excitador y contacta con un espejo dicroico que la refleja sobre el espécimen a través del objetivo. Este espejo, a su vez, deja pasar la fluorescencia emitida por la muestra hasta el340 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA Figura 19.6. Esquema del microscopio de incidencia. La luz emitida por la fuente luminosa (L) pasa un filtro primario (FE), se refleja en un espejo dicroico (ED) y alcanza el corte de tejido (C). La luz emitida atraviesa el ‘espejo ED, se refleja sobre un espejo (E) y puede observarse por el ocular (0). ‘ocular. Debido a sus ventajas sobre el microscopio de transmisién, la mayor parte de los microscopios de fluorescencia que se usan hoy dia son de este tipo. Entre esas ventajas destacan las siguientes: a) existe menor pérdida de luz de excitacion porque ésta atraviesa menos superficie de cristal; b) no es necesario el uso de aceite de inmersi6n; c) la vision de la fluorescencia es mas brillante, ya que la luz de excitacién incide sobre la superficie de la muestra mas proxima al ‘objetivo; d) la luz excitadora proviene del objetivo y no se necesita, como con el microscopio de transmisién, que esté centrado el condensador.CAPITULO 20 Técnicas inmunohistoquimicas (Il) GUION DE CONTENIDOS342 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICATECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (11) 343, 1. FUNDAMENTO TEQRICO DE LAS TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS Las técnicas inmunohistoquimicas son técnicas de inmunolocalizacién que utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por este motivo, el lugar de la reaccién antigeno-anticuerpo se visualiza afadiendo al final de la reaccién el sustrato de la enzima més una sustancia denominada cromégeno. El producto originado ai actuar la enzima sobre el sustrata interacciona a su vez sobre el cromégeno y da lugar a un precipitado insoluble y coloreado, al igual que ocurre en todas las reacciones histoenzimolégicas. Como trazadores pueden emplearse distintos tipos de enzimas; la m4s utilizada es la peroxidasa, a la que siguen la fosfatasa alcalina y, a gran distancia, la glucosa oxidasa. 1.1, Tacnicas de inmunoperoxidasa La enzima peroxidasa, obtenida del rébano picante, es el trazador enzimatico més utilizado. Puede emplearse en técnicas con anticuerpos marcados (técnicas directa 0 indirecta o con anticuerpos sin marcar (técnica de peroxidasa anti- peroxidasa) TECNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS En este tipo de métodos el trazador va unido de forma covalente al anti- cuerpo, pudiendo procederse mediante los métodos directo o indirecto, similares en su fundamento a los analizados en el capitulo dedicado a la inmunofluores- cencia. Método directo Es el procedimiento mas sencillo, pero también el menos sensible para la deteccién de antigenos. En él, el anticuerpo o antisuero primario se conjuga directamente con la enzima peroxidasa (fig. 20.1). El método presenta las si- iseeenseeean T. INMUNOHISTOQUIMICA DIRECTA Representacién esquemética de la técnica de inmunojeroxi- jante ef uso de anticuerpos marcados (método directo)aa LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA guientes dificultades: a) puede ser dificil conseguir la conjugacién entre el anticuerpo y el trazador; b) durante el procedimiento de conjugacién puede destruirse en parte la actividad del anticuerpo, la de la enzima o ambas, y ¢) es posible que se produzca una mezcla de anticuerpos conjugados y no conjuga- dos, de forma que sea casi imposible purificar los primeros. Método indirecto En este procedimiento el anticuerpo primario 0 especifico sin conjugar se une en un primer paso con el antigeno presente en Ja seccién de tejido. En una segunda fase se afiade un anticuerpo marcado con el trazador enzimético, obte- nido de un animal diferente a! primario y especifico para el animal y la clase de inmunoglobulina que constituye el anticuerpo primario (fig. 20.2). Este anti- cuerpo recibe también la denominacién de secundario. El complejo asi formado puede visualizarse incubando el corte de tejido con un sustrato cromégeno adecuado. ERMC TOOUN aE [se nmnanine 420 9 con00 Figura 20.2. Representacién esquemética de la técnica de inmunoperoxi- dasa mediante el uso de anticuerpos marcados (método indirecto). En resumen, para la técnica de inmunoperoxidasa indirecta se utilizan dos anticuerpos: a) Uno primario sin marcar. b) Uno secundario dirigido frente al primario, marcado con peroxidasa y obtenido de un animal distinto. Ei método indirecto posee las siguientes ventajas: a) es mas sensible que la técnica directa, y b) el anticuerpo secundario puede utilizarse para todos los antisueros primarios posibles obtenidos de una misma especie. Por ejemplo, un anticuerpo de cabra anticonejo puede emplearse siempre que el anticuerpo primario para miltiples antigenos sea obtenido de este ultimo animal, lo cual evita tener que marcar sisteméticamente todos los anticuerpos primarios. Conviene destacar dos caracteristicas de los métodos directo e indirecto: 1) en (os dos existe una sola molécula de peroxidasa por cada una de anticuerpo, es decir, se trata de métodos estequiométricos, puesto que los dos reactivosTECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 348, estan en proporcién 1/1, y 2) debido a que cada molécula de peroxidasa es capaz de desdoblar miltiples moléculas de sustrato, la sensibilidad de ambos métodos es superior a la de la inmunofluorescenc No obstante, el procedimiento de unién de la enzima al anticuerpo secunda- rio es laborioso y a veces proporciona resultados irregulares. En cambio, las técnicas con anticuerpos no marcados ofrecen muchas mas ventajas y han supuesto un considerable avance en el desarrollo de las técnicas inmunohisto- quimicas. Por otra parte, los métodos de marcaje con peroxidasa, encierran dos incon- venientes principales: 1. En los tejidos existe normalmente peroxidasa endégena que puede dar lugar a falso-positivos. Por esta razén como fase previa a la realizacin de la técnica, es necesario inhibir ia actividad endégena de dicha enzima sobre el tejido objeto de estudio. 2. La gran toxicidad que como agente carcinogénico pose el cromégeno diaminobencidina (DAB), utilizado para revelar la reaccién, hace que deba ser manipulado con muchas precauciones (véase mas adelante). TECNICAS CON ANTICUERPOS NO MARCADOS. METODO DE LA PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP) Este procedimiento, desarrollado por Sternberger y cols. en 1970, utiliza como trazador inmunocomplejos formados por la enzima peroxidasa y anti- cuerpos especificos frente a ella, en lugar de anticuerpos marcados. La peroxida- sa se obtiene del rébano picante mediante un proceso de purificacién y se inocula a un animal para obtener los anticuerpos dirigidos frente a la enzima. De este modo, al poner en contacto «in vitro» los anticuerpos con la peroxidasa, se forman complejos antigeno-anticuerpo (complejo peroxidasa-antiperoxidasa o complejo PAP) a través de una reaccién de precipitacion. Estos complejos estan formados por tres moléculas de peroxidasa y dos de anticuerpo antiperoxidasa (fig. 20.3). Figura 20.3. Representacién esquemética del método de la peroxidasa- antiperoxidasa con anticuerpos no marcados.346 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA Para este procedimiento de inmunotincidn se utilizan sucesivamente tres reactivos inmunes diferentes: 1, Anticuerpo primario, semejante a los empleados para los métodos de inmunoperoxidasa directa e indirecta (p. ej., |gG de conejo frente a un antigeno humano). Anticuerpo puente o secundario, que uniré el anticuerpo primario al complejo PAP (p. ej., inmunoglobulina de cerdo frente a conejo). El anticuerpo puente se aplica en exceso, de tal forma que uno de los dos lugares posibles de unién se asocie al anticuerpo primario y el otro quede libre para fijarse posteriormente al complejo PAP (fig. 20.3) Complejo PAP, que contiene la enzima que actuara como trazador de la reaccion inmune. Este procedimiento de inmunolocalizacién es de 100 a 1000 veces mas eficaz que los métodos indirectos que emplean anticuerpos marca- dos con fluorocromos o peroxidasa, y 20 veces mas sensible que las técnicas en que el anticuerpo antiperoxidasa y la peroxidasa se aplican como soluciones separadas. Con respecto al procedimiento de PAP, es importante tener en cuenta que: 1. Las El anticuerpo primario se obtendrd siempre del mismo anima\ (general- mente conejo 0 ratén) que el complejo PAP, ya que ambos han de quedar ligados por el anticuerpo puente. El anticuerpo puente o secundario ha de ser de cabra 0 cerdo cuando el primario es de conejo, o de conejo si el primario es un monoclonal de ratén. Como norma, se aplicaré siempre en exceso para que uno de sus dos lugares activos quede libre y puedan unirse a él los complejos PAP. El complejo PAP se une, por la fraccién constante Fe de los anticuerpos que lo componen, a la porcién variable del anticuerpo secundario debido a que todas las IgG de los anticuerpos primarios de conejo o raton tienen una fraccion constante idéntica. Cuando la triple reaccién inmune se ha completado, se procede al revela- do de la peroxidasa mediante agua oxigenada y diaminobencidina o cualquier otro de los cromégenos adecuados para esta enzima El revelado es el procedimiento histoquimico por ei cual se visualizan los lugares de reaccién antigeno-anticuerpo. Se realiza afiadiendo el sustrato natural de la peroxidasa, en este caso agua oxigenada (peroxide de hidrégeno), mas una sustancia denominada cromégeno. Cuando la pe- roxidasa acta sobre su sustrato liberando oxigeno naciente, el cromége- no se oxida para originar un producto insoluble y de color pardo (para mas detalles quimicos, véase «Reaccién de demostracién de peroxidasay en el capitulo 17). ventajas mas relevantes dél método de PAP son: Con él pueden demostrarse antigenos sin necesidad de marcar los anti- cuerpos empleados para el procedimiento inmune, de forma que se evita su manipulacién y la consiguiente pérdida de actividad. Por cada molécula de anticuerpo primario ligada al antigeno existen al menos tres de peroxidasa en el complejo final, lo cual incrementa consi- derablemente la sensibilidad de la técnica.TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 347 1.2. Técnicas con fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa como enzimas trazadoras La fostatasa alcalina es una enzima capaz de hidrolizar los ésteres de fosfato en un medio alcalino. Debido a la mayor dificultad de su manejo, se utiliza menos que la peroxidasa. La demostracién de actividad o revelado de esta enzima se realiza empleando naftol-AS-fosfato como sustrato y sales de diazo- nio tipo fast red TR 0 fast blue BB como agente de copulacién; el resultado de la reaccion es un colorante azoico rojo 0 azul (para més detalles quimicos, véanse capitulos 14 y 17). El principal inconveniente de los métodos que utilizan la fosfatasa alcalina como trazador es la necesidad de utilizar un medio de montaje acuoso para la confeccién definitiva de las preparaciones, Sin embargo, con los nuevos procedimientos de revelado mediante neofucsina al 5 por 100 combina- da con nitrito sédico al 4 por 100, se obtiene un compuesto también de color rojo e insoluble tanto en agua como en disolventes organicos. La mayor ventaja para la utilizacién de la fosfatasa alcalina como trazador es que debido a la escasa proporcién de tejidos que en condiciones normales la contienen, no suele ser necesario inhibir su actividad endégena. La glucosa oxidasa es una enzima aislada de! caspergillus nigem y de la que no existe actividad endégena en los mamiferos. Histoquimicamente se demues- tra por oxidacién de la glucosa con reduccién simultdnea de una sal de tetrazolio incolora que se transforma en un azul formazan estable y no difusible. Los métodos que utilizan estas enzimas como trazador pueden emplear anti- cuerpos marcados segiin procedimiento directo 0 indirecto 0 anticuerpos no marcados, como la técnica de fostatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (APAAP) equivalente a la de peroxidasa-antiperoxidasa. 1.3. Métodos de avidina-biotina Se trata de procedimientos técnicos muy sensibles que utilizan anticuerpos marcados y se basan en la gran afinidad que entre si poseen las moléculas de biotina y las de avidina, de forma que se genera un fuerte enlace no inmune. La avidina es una glicoproteina de alto peso molecular que esta presente en la clara de huevo y en la bacteria Streptomyces avidinii. En este tiltimo caso, la molécula recibe la denominacién de estreptavidina y presenta algunas ventajas sobre la obtenida del huevo, tales como carecer de residuos oligosacéridos y poseer un punto isoeléctrico neutro, En ambos casos, la molécula est formada por cuatro subunidades, que configuran una estructura terciaria con cuatro regiones hidrofébicas de unién con la biotina. La biotina es una vitamina de bajc peso molecular perteneciente al complejo B (vitamina H) que se encuentra en la yema de huevo. Se conjuga facilmente con anticuerpos y enzimas trazadoras por ligarse de forma covalente a cadenas laterales amino 0 carbonilo de residuos aminoacidos 0 de aziicares de proteinas y glicoproteinas. Se considera que pueden unirse hasta 150 moléculas de bioti- na a una sola molécula de anticuerpo. Por otra parte, la avidina puede combinarse covalentemente con una gran variedad de proteinas, glicoproteinas y polisacéridos, y al oro coloidal. Aunque, como se ha dicho tanto la avidina como la biotina pueden unirse a anticuerpos 0sas LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA moléculas enziméticas, es la biotina la que normalmente se conjuga con los primeros debido a su pequefio tamajio. En todos los métodos inmunoenzimaticos que utilizan el procedimiento de avidina y biotina para poner de manifiesto una reaccién antigeno-anticuerpo, es posible realizar el marcaje con biotina del anticuerpo primario (técnica directa) 0, lo que es mucho mas habitual, del anticuerpo secundario (técnica indirecta).. La fase no inmunolégica del proceso puede implicar: a) realizar una unin del anticuerpo biotinilado con avidina sin marcar para ligar a continuacién el com- plejo con una enzima también biotinilada (método puente avidina-biotina), o b) apiicar un complejo de avidina y trazador enzimético biotinilado que contenga lugares de unién libres en la avidina para que se produzca la fijacién sobre el anticuerpo primario 0 secundario biotinilado (método de complejo avidina- biotina 0 ABC) —fig. 20.4—. En todas las variantes expuestas puede unirse un gran numero de moléculas de biotina a un anticuerpo unico, por lo que la proporcién trazador/anticuerpo es muy elevada. Esto hace que \a sensi este tipo de métodos sea muy alta y permite que el anticuerpo primario pueda emplearse muy diluido. [_METODO AVIDINA-BIOTINA | Figura 20.4, Representacién esquematica del método de la avidina-biotina. 1.4. Técnica del hapteno-antihapteno En este procedimiento se utilizan en un primer paso el antisuero primario conjugado con un hapteno —uno de los mas empleados es el dinitrofenol; a continuacién se emplea como reactivo inmune secundario un anticuerpo anti hapteno; por dltimo, se afiade un anticuerpo enzima o complejo PAP marcado con el hapteno (fig. 20.5). Con este método se consigue disminuir la tincién de fondo inespecifica y se pueden emplear antisueros primario y secundario obte- nidos de la misma especie animal, ya que este ultimo va ditigido contra el hapteno, y no contra el anticuerpo primario.TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (1) 349 Sa DE HAPTENO ANTIHAPTENO. ome | Uk se. sironnunso ccmivaano con un naPreno. | Representacién esquematica de la técnica de hapteno-anti- hapteno, Figura 20. 1.5, Procedimientos que incluyen dobies tinciones Si se realiza de forma secuencial cualquiera de los métodos anteriores y se emplean cromégenos que originen una coloracién distinta en cada caso, es posible determinar mas de un antigeno sobre una sola seccién tisular. Para evitar que se produzcan reacciones cruzadas deben emplearse anti- ‘sueros obtenidos de distinta especie animal o de subclases diferentes. Ademas, cuando se lleva a cabo este tipo de técnicas deben tenerse en cuenta ciertas normas: 1. Se debe realizar siempre en primer lugar el procedimiento que utiliza el anticuerpo con reaccién més intensa, En este sentido, algunos antisueros originan una inmunotincién mayor que la de otros, como ocurre con el LeuMI! (CD15) o el antigeno epitelial de membrana (EMA). 2. Si se van a emplear simultaneamente anticuerpos de tipo policional y monoclonal, primero se llevaré a cabo la técnica con el policlonal. 3. Si se observa que la inmunotincién con el anticuerpo empleado en segundo lugar es muy débil o negativa, puede repetirse el procedimiento técnico para este segundo anticuerpo. 1.6. Técnicas del oro coloidal y del oro coloidal-plata Estos métodos se han utilizado fundamentalmente en inmunoquimica ul- traestructural ligando el oro coloidal a proteina A o directamente a inmunoglo- bulinas. La proteina A esté presente en la pared bacteriana de «Staphilococcus 2ureus», y tiene la capacidad de unirse selectivamente y por un mecanismo no inmune a la porcién Fe de las inmunoglobulinas. Por otra parte, la proteina A puede unirse a diversos marcadores entre los que destaca el oro coloidal. El procedimiento técnico puede llevarse a cabo por método directo 0 indirec- to equivalente este Gltimo al descrito para la inmunoperoxidasa, La técnica del oro coloidal empez6 a generalizarse en microscopia éptica a taiz del desarrollo de un procedimiento combinado de oro coloidal y plata que350 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA he METODO DE INMUNO ORO [ [RR J, se annumano OBTENOO EN RATON ‘igura 20.6. Representacién esquemitica de la técnica de proteina A-oro coloidal, incrementaba de forma notable su sensibilidad (fig. 20.6). En este ultimo caso, se usa un método indirecto en el cual el anticuerpo secundario esta marcado con Particulas de oro coloidal que, por reflexion de la luz, provocan una suave coloracién roja. Si las particulas de marcaje son de gran tamafio, pueden visuali- zarse histolégicamente pese a que penetran poco en los tejidos; si por el contra- rio son pequefias, originan un marcaje mas nitido en color, pero por su tamafio no son visibles con el microscopio éptico a menos que se utilicen iones de plata para intensificar la coloraci6n. En tal caso, la plata se emplea en forma de lactato que acta como dador de iones; asi, la formacién de plata metalica se produce lentamente, lo que mejora la tolerancia a la luz. demas, a lo largo del procedi- miento se utiliza un agente reductor, como la hidroquinona, que acelera la transformacién a plata metélica, y goma arébiga como agente protector. En general, este procedimiento es mas sensible que la técnica pura del oro coloidal y requiere concentraciones mas bajas de oro. En él no deben usarse tinciones de contraste que puedan alterar los depésitos de plata metélica. La fijacién en sublimado seguida de un tratamiento con solucién de lugol da excelentes resultados, ya que la débil capacidad oxidante de! mercurio intensifi- ca la reaccién del oro una vez fijado a los lugares antigénicos. 1.7. Fundamentos técnicos y principales aplicaciones de las lectinas en histopatologia Las lectinas son proteinas 0 glucoproteinas de origen no inmune, general- mente obtenidas de plantas y que tienen la propiedad de unirse especificamente a determinados hidratos de carbono o a sus formas nitrogenadas presentes en el glicocdlix celular. Esta unién ocurre de forma habitual con el azticar terminal de las glicoproteinas, si bien es posible que se establezca también con gliicidos situados en cadena laterales ramificadas de la molécula, Por la capacidad de hemaglutinar los eritrocitos sanguineos, estas moléculas fueron denominadas en un principio «Hemaglutininas vegetalesy. En la actuali- dad reciben el nombre genérico de «lectinas» (del latin: captar, seleccionar), propuesto por Boyd y ShapleighTECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 351 Hasta el momento se han purificado mas de 100 tipos de lectinas, sintetiza- das en su mayor parte por plantas inferiores y en menor cuantia por micraorga- nismos (bacterias y hongos) y por algunos animales vertebrados inferiores (an- quilas) e invertebrados (caracoles). Las funciones que ejercen estas proteinas son variadas, pero en general se encuentran relacionadas con los fenémenos de reconacimiento y adhesin celu- lar, especialmente con los implicados en la organizacién de la matriz extracelular yen procesos de secrecién. En las plantas, las lectinas intervienen en los meca- nismos de defensa contra agentes fitopatégenos. Debido a la heterogeneidad de su origen y estructura, la clasificacion mas adecuada de las lectinas se basa en su afinidad hacia el hidrato de carbono, al que se unen espacificamente. De este modo, puede considerarse: 1, Lectinas que se unen a D-manosa/D-glucosa. Ejemplo —Con A 0 concanavalina A (canavalina ensiformis). 2. Lectinas que se unen en N-acetil D-galactosamina. Ejemplos 3. Lectinas que se unen a N Ejemplo —UEA Ulex europaeus. 4. Lectinas que se unen a D-galactosa. Ejemplo —RCA Ricinus communis. 5. Lectinas que se unen a L-fucosa. Ejemplos —UEA Ulex europaeus. —LTA Lotus tetragonolobus. 6. Lectinas que se unen a acido sidlico 7. Lectinas que se unen a hidratos de carbono complejos. Ejemplo —PHA Phaseolus vulgaris. METODOS PARA LA DEMOSTRACION DE LECTINAS Las lectinas son moléculas faciles de conjugar con distintos fluorocromos (isotiocianato de fluoresceina, ficoeritrina, etc.), con oro coloidal o con enzimas (peroxidasa de rébano), por lo que es posible demostrar su presencia sobre tejidos mediante métodos inmunohistoquimicos directos. No obstante, son mas empleados los anticuerpos antilectinas con PAP o lectinas biotiniladas, que son detectadas mediante el método de la avidina-biotina, principalmente por el procedimiento ABC, para conseguir la maxima amplificacién de la sehal. En cuanto al mecanismo Ultimo de unién molecular entre las lectinas y el hidrato de carbono que reconocen, debe tenerse en cuenta que la unién no tiene caracter inmune, por lo que es labil, no covalente, de carécter reversible y requiere para su estabilidad la presencia de iones Ca**, Mn** y Mg! *352 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 1 Observaciones: 1. Los métodos de lectinas pueden emplearse para el estudio de secciones en congelacién 0 embebidas en parafina. 2. Antes del empleo de algunas lectinas puede ser util la digestion enzima- tica. El tratamiento enzimético mas usado es la tripsinizacién. 3. La manipulaci6n de las lectinas no esta exenta de riesgos: algunas son potentes venenos, y por ello es necesario manipularlas en adecuadas condiciones de seguridad (utilizacién de campanas de extraccién de gases, guantes y mascarillas). 4. En cada laboratorio es necesario establecer la dilucién precisa de trabajo para cada lectina 5. Es conveniemte, por ditimo, establecer un control negativo. Este control consiste en reservar una de las secciones histoldgicas problema con el fin de bloguear la lectina a estudio mediante la preincubacién con el aziicar especifico. PRINCIPALES USOS Y APLICACIONES DE LAS LECTINAS Las primeras aplicaciones de las lectinas aprovechaban su capacidad mitogé- nica (concavalina A) y para identificar los grupos sanguineos ABO. Debido a la especificidad con que se unen a distintos hidratos de carbono, las lectinas han contribuido a desvelar la distribucién de éstos en los diferentes tejidos y sus variaciones de expresién durante les procesos de maduracién y diferenciacion celular. Actualmente se reconocen distintos cambios en la ordenacin de los receptores de las lectinas una vez establecida la transformacién neoplisica e incluso en casos de displasia celular. 2. ASPECTOS PRACTICOS DEL DESARROLLO DE LAS TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS Durante las inmunotinciones es conveniente aplicar alguna forma de fijacién para preservar el tejido, aun cuando se manejen secciones en congelacién. Las condiciones en que se realiza la fijacién repercuten grandemente en el resultado de las técnicas inmunohistoquimicas. Por ello debe tenerse en cuenta que: 1. Los fijadores que actiian por precipitacién de proteinas, como los fijado- res acidos (Bouin o Carnoy), el alcohol etilico y los compuestos a base de metales pesados (B5 0 Zenker), suelen producir mejores resultados que los fijadores por reticulacién (formalina) 0 los que contienen oxi- dantes, como la solucién de Helly. 2. El tiempo de fijacién debe ser el-necesario para preservar la imagen histolégica: un exceso de fijacion reduce la inmunorreactividad del teji- do. 3. El efecto de cada fijador sobre un antigeno puede ser distinto segin la localizacién histolégica y anatémica de dicho antigeno. 4, En muestras de gran volumen, la fijacién por inmersién en la soluciénTECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (II) 359 dora proporciona resultados variables en cuanto a la positividad imu- nohistoquimica, ya que las zonas mejor fijadas se teniran mas que las mas profundas. 5. Existen determinados antigenos de superficie o receptores nucleares cu- ya determinacién en tejidos fijados no proporciona buenos resultados: por ello deben detectarse en tejido congelado sin fijar o usando una fijacién breve en acetona, en cloroformo o en una mezcla de ambos. 6. La fijacién debe ser inmediata para evitar la autolisis, Si no fuera posible, puede frenarse el proceso de autolisis de los tejidos manteniéndolos a 4°C 0 en soluciones conservantes (para més detalles, véase fijacién del tejido linfoide en el capitulo 34). En la mayor parte de los estudios inmunohistoquimicos el formol tamponado al 10 por 100 y la solucién de Zenker dan buenos resultados. No obstante, en casos especiales pueden emplearse otras soluciones como el paraformaldehido al 4 por 100 en buffer fostato 0.05 M a pH 7.2, 0 los liquidos de Bouin o Karnowsky. En inmunohistoquimica la formalina debe emplearse tamponada cuando se utilice como fijador. No obstante, la formalina disminuye la inmunorreactividad de los antigenos tisulares porque produce reacciones cruzadas entre grupos amino terminales de las proteinas que se encuentran fundamentalmente en los residuos lisina. En ocasiones lo que ocurre es un fenémeno de enmascaramiento antigénico dependiente de la fijacién del formaldehido sobre grupos vecinos que contienen residuos de lisina. En cuanto a la pérdida de inmunorreactividad vinculada a la fijacién en formol, los antigenos més afectados son los linfocitarios de membrana que resisten la inclusion en parafina (véase capitulo 34), citoqueratinas, vimentina, fibronectina e inmunoglobulinas tanto de superficie como intracitoplasmaticas, si bien estas Gltimas podran recuperarse con digestién proteolitica (vase mas adelante). En general, tras la fijacién en formol tamponado los antigenos ricos en carbohidratos se alteran menos que los proteicos. El uso de fijadares alcohélicos se recomienda para la determinacién de filamentos intermedios tales como vimentina, desmina, citoqueratinas, proteina acidica glial fibrilar y neurofilamentos, Aparentemente, la disolucion de los lipi- dos de membrana por este tipo de fijadores aumenta la penetracién de los anticuerpos y mejora la inmunotincién. Sin embargo, los fijadores alcohdlicos previenen menos la autolisis de los tejidos, hecho que debe tenerse en cuenta si se realizan incubaciones prolongadas. Los fijadores acidos que actéan por precipitacion de proteinas y contienen Acido picrico y acético preservan mejor que la formalina y los alcoholes la anti genicidad de las inmunoglobulinas y polipéptidos. Para las hormonas polipepti- dicas y aminas biégenas la solucién de Bouin es el fijador de eleccién, puesto que produce la interrupcion de la membrana de los grénulos que las contienen. La acetona determina muy mala preservacién morfolégica pero conserva muy bien los antigenos de superficie celular. Los fijadores que contienen paraformaldehido proporcionan en gene- ral buenos resultados inmunohistoquimicos. Para tejidos incluidos en plastico puede ser eficaz la fijacién en paraformaldehido vehiculado en buffer cacodilato354 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 0.1 M (pH 7.2) con clorure calcico 50 Mm. Para la identificacién de enzimas y proteinas de gran tamajio se recomienda el paraformaldehido al 4 por 100, ya sea solo 0 con glutaraldehido ai 50 por 100 (del 0.1 al 0.5 por 100) en buffer fosfato 0.1 M (pH 7.2 a 7.4). Como se desprende de todo lo anterior, las pautas de fijacién en inmunohis- toquimica seran distintas segin el antigeno que se desee estudiar. Cuando se utiliza un anticuerpo por primera vez, es aconsejable usar secciones de tejido congelado como control a fin de determinar la fijacién mas adecuada asi como las diluciones 6ptimas del anticuerpo primario. Ademés, siempre deben utilizarse preparaciones de control positivo y negativo que seran fijadas de la misma forma que el tejido objeto de estudio. Para acortar el tiempo de fijacién puede recurrirse a la fijacion por mi- croondas, que disminuye ademas la tincién de fondo. Este método, que reduce la duracién del proceso a segundos, es especialmente itil para antigenos que requieren digestion proteolitica, como el relacionado con el factor VIII y las citoqueratinas, ya que hace innecesario el pretratamiento enzimatico. El procedimiento técnico para realizar este tipo de fijacién incluye: 1, Toma de un volumen aproximado de hasta 1 cm* de tejido fresco. 2. Fijacién de las muestras en una mezcla diluida de un aldehido (formalde- hido al 2 por 100 o glutaraldehido al 0.05 por 100 en tampon cacodilato 0.1 M y cloruro calcico al 0.025 por 100 para un pH final de 7.35) 3. Inradiacién en horno de microondas entre § a 8 segundos para una temperatura final de la solucién de 45°C + 5 °C). 2.2. Procesamiento histolégico DECALCIFICACION La inmunorreactividad de las inmunoglobulinas, polipéptidos, hormonas, lamentos intermedios, antigenos tumorales y proteina S-100 se conserva bien tras la aplicacin de algunos procedimientos rutinarios de decalcificacién (EDTA 0.5 M, Acido acético acuoso al 10 por 100 0 acido formico al 5 por 100). Sin embargo, la resistencia a la decalcificacion sera distinta en el caso de otros antigenos, en especial si se utilizan soluciones fuertes que contengan Acido nitrico (en este dltimo caso, la inmunorreactividad desaparece al cabo de pocas horas de tratamiento). En este sentido, las inmunoglobulinas son particular- mente sensibles a la decalcificacién en acidos fuertes. PROCEDIMIENTO DE INCLUSION Aunque los procedimientos habituales de deshidratacién y aclaramiento no deterioran excesivamente los antigenos tisulares y en particular los intracitoplés- micos, la inclusién habitual, tanto en parafina como en alguna de las resinas sintéticas, puede afectar a los resultados inmunohistoquimicos. Asi, el uso de acetona en lugar de etanol y el de cloroformo 9 benzoato de metilo en lugar de! xileno mejoran notablemente la inmunotincién, ya que aumentan la tinci6n especifica y disminuyen la de fondo, sobre todo en el caso de ciertos antigenos como las inmunoglobulinas presentes en las células plasmaticas.TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (II) 385 En cuanto al medio de inclusién, la tincién inespecifica de fondo es mayor en el materiai embebido en parafina que en las secciones criostaticas. Precisamente se ha sefialado que la inclusion en parafina caliente produce pérdida de la antigenicidad, por lo que el tiempo de infiltracién deberia reducirse al minimo y se ha llegado a recomendar el empleo de parafinas de bajo punto de fusién. Por otra parte, para asegurar una tincidn uniforme es de gran importancia realizar una desparafinacién completa de las preparaciones histolégicas antes de la inmunotincién. OBTENCION DE CORTES Y FROTIS CELULARES. UTILIZACION DE ADHESIVOS TISULARES Si el procedimiento de inmunotincién se realiza sobre tejido congelado, se obtendrén en el criostato cortes de 4-6 micras de espesor que se secan al aire (ventilador) a temperatura ambiente durante dos horas; a continuacion se fijan en acetona absoluta a 4°C durante cinco minutos y se vuelven a secar al aire otros 30 minutos. Si la técnica se va a efectuar més tarde, las secciones pueden guardarse envueltas en papel de aluminio y con un desecante, a -20°C 0 a temperaturas inferiores. En el momento de realizar la inmunotincidn se llevan los cortes a temperatura ambiente (no se desecha el envoltorio de papel de aluminio hasta que los cortes hayan alcanzado dicha temperatura) y se vuelven a secar al aire del ventilador, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 60 minu- tos. Luego se realiza una refijacién en cloroformo de 20 a 30 minutos y se pasan al bafio de TBS. Los cortes en parafina se obtienen con un grosor de 3-5 micras y se dejan secar toda la noche en estufa a 37°C. A continuacién se desparafinan cuidado- samente en xileno, se llevan hasta el alcohol absoluto y se hidratan. Cuando se aplican los métodos inmunoenziméticos es bastante facil que se desprendan los cortes debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar, sobre todo si se ha realizado digestion con proteasas (véase mas adelante). Por ello se recomienda emplear un adhesivo que fije las secciones a los portaobjetos. Existen varios tipos de adhesivos: albtmina de huevo, gelatina, poli-L-lisina, cromo gel, etc. (véase capitulo 3). Por lo que se refiere a los resultados de las técnicas, hay que tener presente que un exceso de adhesivo puede ser causa del aumento de la tincién inespecifi- ca de fondo. Por idéntico motivo, en la técnica de avidina-biotina se evitard el uso de la albGmina de huevo como adhesivo: Los frotis e improntas citolégicas se realizan sobre portaobjetos limpios y desengrasados en etanol-clorhidrico. Las células procedentes de cultivos celula- res se extienden de igual forma o se cultivan directamente sobre cubreobjetos o portaobjetos estériles Una vez confeccionadas las preparaciones histolégicas, se debe trazar un circulo con lapiz de diamante en torno a la seccién para evitar que se difundan los antisueros. En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presen- tan una 0 varias superficies ligeramente deprimidas a donde pueden adherirse los tejidos para realizar la incubacién sin que ocurran fenémenos de difusién de Jos reactivos.356 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 2.3. Restablecimiento de la inmunorreactividad tisular: digestion enzimatica y deslipidizacion La pérdida de antigenicidad ocasionada por los fijadores que contienen aldehidos, come el formol tamponado, puede compensarse de dos formas: a) utilizando un procedimiento inmunoenzimatico de maxima sensibilidad, y b) mediante digestion proteolitica con enzimas 0 por desiipidizacion. DIGESTION ENZIMATICA: CONSIDERACIONES GENERALES 1. La digestion con proteasas no aumenta la reactividad de los antigenos ricos en carbohidratos, tales como el antigeno carcinoembrionario, 10s antigenos especificos de lectinas y el antigeno LeuM1 0 CD15. 2. La digestién enzimatica es util principalmente para los métodos realiza- dos sobre tejides fijados en formalina, en especial si éstos han permane- cido mucho tiempo en la solucién fijadora. Sin embargo, no mejora demasiado la inmunotincién de tejidos fijados en B-5, formol-acético o liquido de Zenker 0 Bouin. 3. Con el tratamiento enzimatico de duracién optima se reduce en gran medida la tincién no especifica, probablemente porque se suprimen al- gunas de las moléculas proteicas responsables de la misma. 4. El aumento en antigenicidad que proporciona la digestién con proteasas facilita el uso mas diluido de los antisueros, 1o que contribuye a reducir la tincion no especifica. 5. La digestién enzimatica tiene inconvenientes tales como: a) Si es excesiva, puede llegar a producir la destruccién del tejido, con desprendimiento de porciones de éste b) Por digestién del antigeno puede debilitarse la tincién o crear falso- negativos. ¢) La digestién proteolitica excesiva de antigenos tisulares puede de- senmascarar fragmentos proteicos comunes a diversos antigenos y, por tanto, incrementar la tincién no especifica. Conviene recordar, no obstante, que la tincién no especifica puede ser también debida al uso de antisueros en diluciones inapropiadas, siendo una causa frecuente el empleo de concentraciones de anticuerpos disefiadas para secciones sin digestion previa, concentraciones que re- sultan muy elevadas cuando se ha practicado tratamiento enzimatico. 6. Cuando por las caracteristicas del antigeno o del tejido no sea aconseja- ble la digestion enzimatica se puede recuperar parcialmente la anti- genicidad de las muestras tijadas en formaldehido por otros medios: como por ejemplo, empleando una solucion de sucrosa al 10 por 100, de forma que las secciones desparafinadas se almacenan en sucrosa al 10 por 100 en PBS durante 16 horas antes de la inmunotinci6n. 7. Cualquier actividad enzimética proteolitica residual debe eliminarse una vez completado el tratamiento de los cortes. Los métodos para ello son: —Inmersién en tampén frio, por ejemplo, PBS 0 TBS a 4°C, de 10 a 30 minutos; después se enjuaga en agua corriente fria de 5 a 10 minutos.TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 357 —Uso de inhibidores de las proteasas. — Lavado en PBS glicinado al 0.2 por 100. DIGESTION ENZIMATICA: AGENTES PROTEOLITICOS No existe una proteasa universal que sea adecuada para todos los tipos de antigenos. No obstante, pueden obtenerse muy buenos resultados con tripsina porcina de tipo Il, 0 pronasa (véase mas adelante). Para un ajuste correcto de! procedimiento es aconsejable llevar a cabo el pretratamiento enzimatico para varios tiempos diferentes de incubacién. En todo caso, la utilizacién de las diversas proteasas est4 condicionada en gran medida por el tipo de antigeno sobre el que se quiere incrementar la inmunorreactividad. A continuacién se exponen algunos de los ejemplos mas caracteristicos de desviacion de la norma: —Proteina S-100 ash neal aaeiceRe Rave e Says aH . Bromelaina —Vimentina .. 5 ahr seseeeeeesss Pepsina —Queratina .. 6 sain ai yaes o-ygeeig BION — Factor VIll-RAg : Ee ceereeeeeees Figina Para controlar la digestion de! tejido fijado como de costumbre e incluido en parafina pueden utilizarse los siguientes procedimientos: 1. Proteasa 0.1 (tipo Vil) en PBS (pH 7.4) durante 60 minutos a 37 °C. 2. Pronasa (0.0025 por 100 en Tris-CIH de 4.a 6 minutos. 3. Pronasa (0.5 a 1 mg/mL) en PBS de 1 a 5 minutos a temperatura ambiente. 4. Solucién de pepsina (4 mg/mL) en CIH 0.01 N (pH 2.25) durante 30 minutos a 37 °C. 5. Tripsina (porcina tipo I) en concentracién de 25 mg/dL de 30 a 45 minutos, 0 de 50 mg/dL durante 20 minutos a 37 °C 6. Tripsina al 0.06 por 100 o subtilisina 0.003 por 100 en TBS 0.15 M (pH 7.4), de 15 2 60 minutos a temperatura ambiente. 7. Para las inmunoglobulinas extracelulares, incubar en tripsina 0.1 mg (tipo Ill) en buffer fosfato 0.1 M a pH 7.4 durante 30 minutos, enjuagar en PBS seguido de solucién salina de citrato tamponado (pH 2.6) y nuevo pase en PBS. 8. Para eliminar los glicosaminoglicanos que enmascaran la fibronectina en el tejido cartilaginoso maduro humano, se puede realizar un pretrata- miento con hialuronidasa (275 U/mg en buffer fostato 0.1 M) de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. RESTABLECIMIENTO DE LA INMUNORREACTIVIDAD POR DESLIPIDIZACION La inmunorreactividad de ciertos antigenos de membrana se restablece mejor por medio de la exposicién a solventes de lipides como el cloroformo que mediante tratamiento con enzimas proteoliticas. Al parecer, las glucoproteinas como el Leu-7+ (CD57) estén parcialmente enterradas en la doble capa de lipidos de la membrana celular, por lo que se requiere una exposicién prolonga-388 LABORATORIO DE ANATOMA PATOLOGICA da (24 horas) al cloroformo de las secciones de parafina una vez hidratadas. Resultados similares proporciona este reactivo en el caso de la proteina acidica glial fibrilar (PAGF). 2.4. Bloqueo de la actividad enzimatica endégena Si en las técnicas inmunoenzimaticas se utiliza como marcador una enzima normalmente presente en el tejido que se examina, debe inhibirse su actividad endégena antes de la inmunotincién; de lo contrario, la enzima enddgena reac- cionaré con el sustrato empleado para localizar la enzima marcadora, dando lugar a faiso-positivos. La peroxidasa y otras sustancias que originan reacciones similares a ella (como la hemoglobina) se encuentran en tejidos normales y en tumores; en especial estan presentes en leucocitos y hematies, por lo que se han disefiado varios procedimientos para inhibir su actividad. E| método més empleado es la incubacién de las secciones, antes del proce- dimiento inmunol6gico, con metanol absoluto al que se aiiade perdxido de hidrégeno (metanol absoluto que contenga agua oxigenada al 0.3 por 100 durante 10-30 minutos a temperatura ambiente). La actividad de la fosfatasa alcalina, a excepcién de la de tipo intestinal, puede bloquearse con levamisol en concentraciones de 1 mM. La fosfatasa alcalina de tipo intestinal es sensible al tratamiento con acido acético al 20 por 100, perdxido de hidrégeno al 0.3 por 100 y acido periddico al 2.5 por 100. La glucosa oxidasa y otras enzimas como la alfa-2-galactosidasa no presen- tan problemas, ya que no existe actividad en los tejidos humanos. Si durante el revelado se emplea diaminobencidina como cromégeno, debe prepararse bajo campana de extraccién de gases, utilizando guantes y mascarilla, si bien en lugar de diaminobencidina pueden usarse otros cromégenos (véase posteriormente) 2.5. Bloqueo de la tincién de fondo La tincién de fondo o cbackground» de una preparacién inmunohistoqui- mica puede ser especifica 0 inespecifica. La tincién de fondo especifica es debida a varias causas: 1, Ala presencia del antigeno objeto de estudio en lugares distintos a aquel en que se quiere detectar. Por ejemplo: si se estan determinando inmu- noglobulinas en células plasméticas, se tefiran los elementos celulares que las contengan, asi como jas moléculas de inmunoglobulinas presen- tes en el suero. 2. Ala existencia en el antisuero primario de anticuerpos frente a antigenos distintos al que quiere determinarse. Este problema apenas se manifiesta cuando se utilizan anticuerpos policlonales de buena calidad o anti- cuerpos monoclonales. En todo caso, la dificultad se resuelve en gran medida usando altas diluciones del antisuera primario. 3. At atrapamiento pasivo del antigeno o a su difusién hacia lugares donde habitualmente no se encuentra. Esto ocurre por lo general si laTECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (II) 369 retrasa 0 es inadecuada, o cuando existen areas extensas de necrosis € infiltrado inflamatorio. La causa més frecuente de tincién de fondo inespecifica es la unién no inmunolégica del antisuero a ciertos componentes de los tejidos, sobre todo colagena y reticulina, debido a fuerzas hidrofdbicas y electrostaticas. General- mente produce un color uniforme de fondo y es menos intensa con las técnicas que usan anticuerpos no marcados. Por lo comin es el antisuero primario el que proporciona los niveles ms altos de tincién de fondo inespecifica. En estos casos Ia coloracién del fondo puede reducirse bloqueando los lugares con afinidad no inmune por las inmunoglobulinas. En la practica, el procedimiento implica incubar los cortes con una inmunoglobulina que no interfiera con el antisuero primario. Para ello, en las técnicas multisecuenciales se usa suero normal de la especie animal de la que se ha obtenido el anticuerpo secundario. En otras ocasiones se aconseja afiadir este suero bloqueante al antisuero primario y al complejo PAP. La tincién de fondo inespecifica también puede reducirse usando el antisuero primario en diluciones muy altas, afadiendo grandes concentraciones de sal (2.6 por 100 de NaCl) al tampén, empleando preferentemente Tris buffer 0 agregando al tampén detergentes tales como el Triton X-100. La digestién enzimatica, como ya se ha indicado, reduce igualmente la tin- cién de fondo inespecifica. 2.6. Penetracién de los reactivos. Detergentes Para obtener buenos resultados en las técnicas inmunohistoquimicas es esencial que los antisueros penetren de forma adecuada y alcancen los anti- genos que se desea detectar. Para contrarrestar la escasa penetracion de algunos conjugados se puede recurrir al uso de detergentes como el Tritén X-100 y la saponina, que actéan permeabilizando las membranas. Estas sustancias son muy Uitiles cuando se trabaja con células intactas de improntas, frotis y monocapas de cultivos celulares 0 con cortes gruesos en congelacién o en parafina, Los deter- gentes que alteran mucho la estructura fina de las membranas no son recomen- dables para microscopia electronica. 2.7. Controles Se dice que una tincién inmunohistoquimica es especifica si se demuestra que: 1. No ocurre tinci6n si se omite el antisuero primario. 2. Se inhibe la tincién si se adsorbe el antisuero primario con el antigeno frente al cual se ha obtenido, pero no con otros antigenos. Para un buen desarrollo de la técnica es conveniente realizar siempre los siguientes controles: Control negativo: se omite el antisuero primario o se sustituye por suero no inmune o buffer, utilizando el mismo tejido que para el control positivo; si el resultado técnico es positivo sera debido a una positividad inespecifica.360 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA Control positivo: se utiliza una seccién de tejido del que se tenga certeza absoluta de que contiene el antigeno por determinar. De este modo, si con un control positivo la técnica es negativa en la preparacién problema, este hecho seré debido a un defecto de fijacién o a cualquier fallo en el procedimiento técnico. Control de absorcién: el control negativo ideal consiste en demostrar que desaparece la inmunorreactividad si el antisuero primario es preabsorbido por el antigeno, pero no si es preabsorbido por moléculas similares. Este tipo de control se usa en la valoracién de nuevos anticuerpos y no de forma rul Control de bloqueo: no resulta imprescindible, pero puede ser de utilidad. Consiste en bloquear la unién entre el antisuero primario y el antisuero conjuga- do en la técnica indirecta o la unién entre el anticuerpo «puentey y el complejo PAP en la técnica de peroxidasa-antiperoxidasa. Se realiza intercalando en las incubaciones de los anticuerpos mencionados una incubacién con inmunoglo- bulinas del mismo tipo que las marcadas. Todos los controles que se utilizan en inmunohistoquimica tienen como finalidad determinar los falso-positivos y negativos, confirmando que la técnica se ha desarrollado bien. Causas de falso-negativos 1. Enmascaramiento de los antigenos. 2. Desnaturalizacién de los antigenos por el calor, 1 que impide que los anticuerpos los reconozean. Causas de falso-positivos 1. Presencia de peroxidasa endégena por una mala inhibicién. 2. Reacciones cruzadas inespecificas entre antigenos y anticuerpos: algunos anticuerpos pueden reaccionar con antigenos parecidos a los antigenos problema y, sobre todo, existe la posibilidad de que se produz- ca una fijacién quimica no inmune entre los anticuerpos y la colagena del tejido conectivo. 2.8. Tipos de anticuerpos. Diluciones Al hablar del fundamento tedrico de las técnicas inmunohistoquimicas he- mos hecho abstraccién del caracter policlonal 0 monoclonal de los anticuerpos primarios. Aunque algunos anticuerpos monoclonales dan buenos resultados en parafina, en general la consecucién de resultados éptimos para la mayoria de ellos requiere cortes en congelacién. Por lo que se refiere @ las incubaciones, todos los métodos inmunohistoqui- micos consisten en tratamientos sucesivos con antisueros, separados por lava- dos en tampones, Para obtener una tincién éptima es importante que cada antisuero se use en la dilucién mas adecuada, que no se evapore durante la incubacién y que el anticuerpo no unido al antigeno se elimine por completo antes de la incubacién siguiente. Las diluciones inadecuadas pueden dar lugar a falso-negativos y a incremento de la tincién de fondo. Por ello, siempre debe ensayarse una amplia gama de diluciones cuando se usa un anticuerpo porTECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 381 primera vez 0 cuando un antisuero conocido se emplea por primera vez sobre un tejido problema. En !a prdctica, la variacién en las diluciones afecta exclu- sivamente al anticuerpo primario: las de los restantes antisueros son siempre iguales. 2.9. Incubaciones Para prevenir Ja evaporacién de los antisueros, las incubaciones se llevan a cabo en una atmésfera hameda, preferentemente en cdmaras de incubacién. De esta forma se ahorra considerable cantidad de anticuerpos. Puesto que la tempe- ratura influye en la velocidad de reaccién antigeno-anticuerpo, si se realizan incubaciones cortas el procedimiento se haré @ temperatura ambiente; si por el contrario se aplican incubaciones largas durante toda la noche, por ejemplo, la camara de incubacién se mantendrd a 4°C. 2.10. Lavados En cualquier procedimiento inmunohistoquimico es preciso eliminar todo el antisuero no unido al antigeno durante una incubacién antes de pasar a la siguiente, lo cual se realize lavando en el tampén elegido, habitualmente TBS. Para ello se extrae primero e| exceso de antisuero lavando las preparaciones sobre varillas de vidrio con frasco lavador, procurando no incidir directamente sobre los cortes para evitar su dafio. A continuacién o se cubren de nuevo las preparaciones con tampén en esta posicion o se introducen en une jarra de Coplin o se colocan en un cristalizador introducidas en una cestilla de portaob- jetos, donde reciben tres bafios de 2-5 minutos cada uno. Para que la solucion de lavado se agite continuamente sobre la superficie del corte se deposita el recipiente con los portaobjetos sobre un agitador magnético o en un bafio de agitacion vacio, 2.11. Revelado de las técnicas inmunoenzimaticas: cromégenos y sustratos En tas técnicas inmunoenziméticas se denomina revelado el proceso median- te el cual se pone de manifiesto el lugar de la reaccién antigeno-anticuerpo por la adicién del sustrato de la enzima y un cromégeno. El cromégeno mas empleado en las técnicas inmunohistoguimicas que utili- zan peroxidasa es la diaminobencidina (DAB) y, en segundo lugar, el 3-amino- 9-etilcarbazol. Por lo comin la DAB produce resultados mejores que el 3- amino-9-etilcarbazoi y otros cromégenos tales como el 4-Cl-nattol, el reactivo de Hanker-Yates o la tetrametilbencidina. Ademés, en el caso de la DAB la tincién puede aumentar afiadiendo al final del proceso metales pesados, como ocurre en la intensificacién con plata Cuando la enzima peroxidasa se incuba con un sustrato adecuado, general- mente perdxido de hidrégeno, libera oxigeno naciente que por oxidacion de la DAB origina un producto de reaccién insoluble y de color pardo (fig. 20.7,382 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA véase paginas en color), Un incremento o disminucién en la proporcién entre cromégeno y sustrato asi como la exposicién a luz intensa, que puede actuar como oxidante, puede afectar al grado de tincién especifica y de fondo de \a reacci6n final. Por todo ello, se recomienda que el revelado se realice en condiciones de iluminacién no muy intensa y que el agua oxigenada no exceda la concentracién del 3 por 100 y la DAB Ia de 0,5 por 100. Por otra parte, la reaccién de la DAB puede intensificarse manteniendo el pH por debajo de 7.6. No obstante, en estas Condiciones existe el riesgo de aumentar la tincién de fondo no especifica causada por la oxidacién espontanea que originan los metales que puedan estar presentes en el tejido, La penetracién de la DAB en el tejido puede incrementarse sin riesgo de sobretehir, incubando los tejidos durante 30 minutos en DAB con una cantidad despreciable de agua oxigenada, De los tres a los cinco Ultimos minutos se afiade Ia cantidad apropiada de perdxido de hidrégeno en una concentracién final de! 0,05 por 100. La reaccién de revelado con la DAB se detiene lavando cinco veces tas preparaciones en soluciones frias de agua destilada, Tris buffer 0.05 M a pH 7.6 © TBS, o por la adicion de azida sédica. Para preparar la solucién de revelado se puede emplear el siguiente procedi- miento: PROCEDIMIENTO TECNICO 1, Afiadir 6 ma de DAB a 10 mL de TBS 0.05 Ma pH 7.6 y agitr haste | | que se disuelva. Para mayor comodidad, la DAB puede almacenarse en | alicuotas a -20°C. 2. Ajiadir 0.1 mL de agua oxigenada al 3 por 100 recién preparada por cada 3 mL de la solucién de DAB. 3. Las secciones se incuban a temperatura ambiente hasta que se obtenga un producto de color pardo. generalmente durante 5 a 10 minutos, Si es po- sible, e! revelado se realizaré bajo control microscépico procediendo a de- tener el proceso en el momento en que la tincién sea éptima con la minima tincién de fondo. @ Observaciones: Debido al potente efecto carcinogénico de la DAB, se ha difundido el uso de otros cromégenos tales como pirocatecol y tetrametilbencidina, pese a que sus resultados son menos satisfactorios que los de la DAB. Para manipular la DAB es preciso adoptar ciertas precauciones: debe ser manejada bajo campana de gases y | usando guantes de goma y mascarilla. |. Ademés, cualquier objeto que se pongs en contacto con ella debe introducirse después en tej(a. Al final del revelado, el exces de DAB debe decantarse sobre un recipiente que contenga \ejfa. El 3-amino-9-etilcarbazol, que se incluye generalmente en tos preparados comerciales, da lugar a un producto de color pardo rojizo y soluble en etanol, por lo que requiere montaje en medio acuoso. La intensidad de la tincién se borra con el tiempo. Si se emplea este cromégeno, se puede preparar la solucion reveladora de la siguiente forma:TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (II) 363 1. Disolver 10 mg de 3-amino-9-etilcarbazol en 6 mL de dimetilsulf6xido y afiadir luego 50 mL de tampén acetato 0.02 M a un pH entre 5.0 y 5.2. 2. Agregar 0.4 mL de peréxido de hidrégeno al 3 por 100 y utilizar inmedi tamente, 3. Enjuager las secciones en tempén acetato 0.02 M a pH 6, fitrar la solucién | L e incubar de 5 2 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se montan en un medio acuoso. Para las técnicas que emplean la fosfatasa alcalina como enzima trazadora, se utiliza como sustrato el naftol AS fosfato y como cromégeno en fast red TR 0 la neofucsina hexazotizada, que producen color rojo 0 el fast blue BB, que origina color azul. PROCEDIMIENTO TECNICO Coloracion con fast red T —Nattol-AS-MX fosfato libre de Scido . —N, N-dimetil formar —Tris buffer 0.1 M pH 82 . - 9.8 aL —Levamisol Paeeern sta . 24 mg —Sal fast red TR. oe 10.0 mg Modo de opera Se disuelve ef naftol-AS-MX fosfato en la N.N-dimetil formamida y se ai el Tris buffer. Afiadir y disolver el levamisol y la sal fast red TR y filtrar inmediata- mente sobre las secciones. Incubar los cortes de 10 20 minutos: como e! pro- ducto de reaccién, de color rojo brillante, es soluble en alcohol, se monta en medio acuoso. Se puede obtener un producto de reaccién azul usando 2.1 mg de la sal fast | blue BB en lugar de la fast red TR. 2.0 mg 0.2 mL, | PROCEDIMIENTO TECNICO | Procedimiento de la neotu —Naftol-AS-B1 fosfato . 5mg —N,N-dimetil formamida . . . 60 pL —Tris buffer 0.05 M pH 8,7 10 mL —Levamisol 1M. 10 pL itrito sédico al 4 por 100 (recién prepé 5) . 50 wl —Neofucsina al 5 por 100 en CIH2M . ae 20 pl Modo de operat | El sustrato debe prepararse bajo campana extractora. Afjadir la neofucsina al nittito sédico, mezclar de 30 60 segundos e incorporar entonces el Tris buffer y | el levamisol. Inmediatamente antes de tefiir, agregar ef naftol AS-bifosfato suelto en la N,N-dimetil formamida y filtrar directamente sobre las secciones. In-LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA ‘cubar las secciones de 10 a 20 minutos. E1 producto de reacci6n es rojo brillante; | Jas secciones deben ser deshidratadas répidamente, aclaradas en xileno y montadas con un medio sintético permanente. 3. PROCEDIMIENTOS TECNICOS 3.1. Técnicas de inmunoperoxidasa TECNICA DE PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP) PARA ANTICUERPOS POLICLONALES PROCEDIMIENTO TECNICO a 2 3. 10. 1. 12. 13. 14, 15. Resultados (fi —Lugares con inmunotincion (+) «+. Color pardo negruzco Modo de oper: Realizar dos circulos concéntricos con lapiz de diamante alrededor de! corte. Desparafinar e hidratar. Inhibir la peroxidasa endégena con cualquiera de los procedimientos para ello (véase pagina 358). Incubar con suero de cerdo (o del animal del que se haya obtenido ol anti- ‘cuerpo puente) normal o diluido en TBS al 1/20 durante 20-30 minutos. Drenar el exceso de suero y secar alrededor del circulo. Incubar con el antisuero primario de conejo a la dilucion Optima, usando | ‘como diluyente suero riormal de cerdo al 1:20 0 TBS. Incubar 30 minutos en cémara hémeda a temperatura ambiente o toda la noche en cémara himeda a 4°C Eliminar el exceso de antisuero con TBS y aplicar tres lavados en TBS de 3 minutos cada uno. | Incubacién con el anticuerpo secundario (habitualmente, suero de cerdo anti-IgG de conejo), usando para diluirlo el mismo solvente que para el anticuerpo primario. La incubacién se realiza en cmara himeda durante 30 minutos. Proceder como en el paso 6. Incubar en cémara himeda, de 30 4 60 minutos con el complejo peroxida- | sa-antiperoxidasa en Ia dilucién éptima: para diluir, emplear el mismo reactivo que en los pasos 3 y 5. Proceder como en el paso 6. Revelar con DAB aproximadamente 10 minutos bajo control microscé- pico. Lavar en agus corriente. | Si se desea mejorar la inmunotinci6n, incubar en sulfato de cobre al 0.5 por 100 en cloruro sédics al 0.9 por 100, durante 10 minutos. Lavar en agua corriente. Contrastar con hematoxilina —preferentemente de Mayer—, deshidratar, aciarar y monta 20.7, véase paginas en color):TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 365, TECNICA DE (PAP) PARA ANTICUERPOS MONOCLONALES PROCEDIMIENTO TECNICO Si se utiliza como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal de rat6n, el procedimiento es idéntico al descrito, con la salvedad de que se utilizaran: | 2) Como suero bloqueante no inmut | suero normal de conejo en lugar de suero de cerdo; 6) Como antisuero secundario, una IgG de conejo frente a ratén, y ¢) Un complejo peroxidase antiperoxidasa procedente de raton. ‘Aunque no se disponga de un complejo PAP de ratén, puede realizarse la téc- nica, a condici6n de que tras la incubacién con él anticuerpo primario y el corres- pondiente lavado, se proceda a incubar con suero de conejo frente a raton, en la diluci6én dptima, durante 30 minutos. A continuaci6n, y después de lavar, se siguen los pasos 4 y sucesivos con la técnica para anticuerpos policlonales. Si el método se |leva a cabo sobre cortes en congelacién, una vez obtenidas las secciones se fijan en acetona como se indica en «Obtencién de cortes». En este caso no suele inhibirse la peroxidasa endégena, 3.2. Técnica de inmunofosfatasa alcalina TECNICA DE FOSFATASA ALCALINA ANTI-FOSFATASA ALCALINA (APAAP) PROCEDIMIENTO TECNICO | Se procede igual que para la técnica de PAP, aunque usando un complejo de fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalin La reaccién puede mejorarse repitiondo una o dos veces todos los pasos a partir de la incubacién con el anticuerpo secundario o puente. Resultados (fig. 20.8, véase paginas en color): —Lugares con inmunotincién (+) ... - Rojo intenso 3.3. Técnicas de avidina-biotina Usan como trazador tanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina366 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA METODO DE LA AVIDINA MARCADA PROCEDIMIENTO TECNICO Modo de operar: 1. Incubar con suero normal de cerdo (SNC), diluido 1:20 en TBS durante 20 minutos. | 2. Drenar el exceso de SNC. | 3. _Incubar con el anticuerpo primario en fa dilucién optima, usando como disolvente SNC en dilucién 1:20, durante 30-45 minutos 8 temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. 4. Eliminar el exceso de antisuero con TBS y lavar en TBS, tres cambios de 5 minutos cada uno. 5. Incubar con el anticuerpo secundario biotinado, en la dilucién éptima, usando como disolvente SNC a 1:20, de 30 @ 45 minutos. &. Proceder como en el paso 4. | 7. Incubar con la avidina marcada con la enzima, en la dilucién éptima, usando como disolvente SNC a 1:20 de 30 a 60 minutos. 8. Proceder como en los pasos 4y 6. 9. Incubar con la solucién correspondiente de revelado segin que el marcaje se haya realizado con peroxidasa 0 con fosfatasa alcalina 10. Lavar en agua corriente. 11, Contrastar con hematoxilina, preferentemente de Mayer, y montar. TECNICA DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC) PROCEDIMIENTO TECNICO Los pasos 1 al 6 son iguales que en la técnica anterior. Después se procede a incubar con e! complejo avidina-biotina durante 30 minutos. Los pasos 8 al 11 ‘son asimismo iguales. M Observaciones: Algunos tejidos tienen la capacidad de atrapar la avidina (ya sea por afinidad molecular o por su alto contenido en biotina endégena), lo cual puede determinar i Iso-positivos. Es posible bloquear este fendmeno incubando las secciones antes de la tincién con avidina al 0.1 por 100 y tratando después con biotina al 0.01 por 100.TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS (I!) 367 3.4. Métodos del oro coloidal para microscopia éptica TECNICA DIRECTA PROCEDIMIENTO TECNICO Modo de operar: 1, Tratar las secciones con solucién yodo-yodurada de lugol durante 5 minu- tos, aclarar con tiosulfato s6dico al 2.5 por 100 y lavar bien en agua corriente. Incuber con suero de cabva normal al 1/20 en albamina sérica bovina (ASB) al 0.1 por 100 y pH 8.2 en TBS, durante 10 minutos. Drenar (no lavar) el exceso de soluci6n anterior. Incubar con el anticuerpo primario en la dilucién éptima en ASB-TBS durante una hora. Eliminar el exceso de antisuero primario y lavar en ASB-TBS: tres bafios de 5 minutos de duracién cada uno. ae Laver en PBS: tres bafios de 2 minutos cada uno. Ne Refijar con glutaraldehido al 2 por 100 an PBS durante 10-16 minutos. Este paso no es necesario si se ha realizado tratamiento previo con yodo y tiosulfaro, ‘ | 8_Lavarbien en agua destilada. Si es neceserio se puede intensificar la tinci6n con plata (veése a continuacién) | 9. Contraster con hematoxilina, deshidrater, aclarar y montor. TECNICA INDIRECTA PROCEDIMIENTO TECNICO Modo de operar: 13. Como en la técnica directa. | 4. Incubar con el anticuerpo primario en ta dilucién Optima en ASB-TBS durante 60 minutos. 5. Lavar con ASB-TBS hasta eliminar el exceso de antisuero. A continua- | én, realizar tres bafios con ASB-TBS de § minutos cada uno. 6. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con el oro a la dilucién ‘6ptima en ASB-TBS durante una hora. 7. Eliminar el antisuero secundario lavando con ASB-TBS. A continuacién, realizar tres lavados de 2 minutos cada uno en ASB-TBS. 8. Lavar con PBS 0.1 M a pH 7.6: tres bafios de 2 minutos cada uno. 9. Refijar con glutaraldehido al 2 por 100 en PBS de 10 a 15 minutos (este | paso no es necesario si se ha llevado a cabo el paso 1). 10. Lavar bien en agua destilada y, si se desea, intensificar la coloracién con plata (véase a continuacion) 11. Contrastar, deshidratar, aclarar y montar.268 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA INTENSIFICACION CON PLATA DE LA COLORACION DEL ORO COLOIDAL PROCEDIMIENTO TECNICO Soluciones: a) Tampén citrato 2 M: —Citrato sédico 23.59 —Acido citrico 2559 —Agua destilada 100.0 mL. b) Solucién de plata: —Lectato de plata 110.0 mg —Agua destitade 15.0 mL. ¢) Solucién de hidroquinon: —Hidroquinona . 950.0 mg — Agua destileda 18.0 mL d) Solucién de gom: 7.0 mL 2) Solucién de trabajo: —Solucion de tactato de plata 15.0 mL. —Solucién de hidroquinona 15.0 mL. —Tampén citrato 2M 10.0 mL — Agua destilada f 60.0 mL. —Solucién de goma ardbiga 7.0 mL Modo de operar: 1. Lavar los cortes en tampén citrato 2 M durante 2 minutos. 2. Incubartos en la solucién de plata a temperatura ambiente y protegidos de la luz (cuarto oscuro con luz de seguridad) durante 3 minutos. 3. Lavarlos en agua destilsda, contrastar con hematoxilina si se desea, des- hidratar, aclarar y montar.