Guia Biologia Molecular UNFV 2002

U NI VE R S I D AD NACI ONAL F E D E R I CO VI L L AR R E AL
F ACU L T AD D E CI E N CI AS NAT U R AL E S Y MAT E MAT I CAS

L abor at or io de B ioquím ica y B iología Molecu lar
_______________________________________________________
GU I A D E P R ACT I CAS
B I OL OGÍ A M OL E CU L A R
AU T OR E S :
B iól .W .I s r ael B ar r ant es B us t i nz a

Mg. Car l os S ant a Cr uz Car pi o
L im a, Agos t o de 2 0 0 2 .
I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

Lab.Bioquímica y Biol.Molecular UNFV
T abla de Contenidos
Presentación ........................................................................... 3
Medidas de Biosegur idad ............................................................. 4
Aisl amiento de Ácidos Nucleicos .................................................... 5
Electr ofor esis de Ácidos Nucleicos................................................ 10
Cl onamiento Molecular ............................................................. 14
Amplificaciones ...................................................................... 18
T ransferencia de Ácidos Nucleicos................................................ 21
Apéndice No.1: Relaciones de Uso Fr ecuente en Biol ogía Mol ecular . ...... 23
Apéndice No.2: Composición de Buffers y Sol uciones Stock. ................. 24
Apéndice No.3: Guía de Pr obl emas. .............................................. 26
Bibliografía........................................................................... 28
Biól.I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

Presentación
El Laboratorio de Bioquímica y Biol ogía Molecular de la Facultad de Ciencias

Natur ales y Matemáticas de la Univer sidad Nacional Feder ico Villar r eal
presenta esta Guía de Pr ácticas par a el Cur so de Biología Mol ecular . Las
prácticas que se han incluido tienen la finalidad de familiar izar al alumno con
los métodos de mayor importancia en la Biología actual. Pocas univer sidades
de nuestr o país están en la capacidad de br indar a sus estudiantes prácticas
del nivel que aquí se propone, por lo que es necesario compr ender el esfuerzo
que hacen los pr ofesores integr antes del Labor ator io en proporcionar l os
mater iales y reactivos que se usar án dur ante las prácticas, y sean
aprovechados al máximo.
Lima, Agosto del 2,002.
Profesor es del Cur so de Biología Molecular :
Biól. W.Isr ael Bar r antes Bustinza.

Mg. Car los Santa Cr uz Car pio.

Medidas de Bioseguridad
1. Asumir de que toda muestr a que contiene fluidos biológicos es

potencialmente patógena, dado de que no existe un método que
garantice la inocuidad total .
2. Usar mandil dur ante todo el tiempo que se per manezca en el
laboratorio, par a pr oteger l a r opa y el cuerpo, y vestir
apropiadamente de acuer do al procedimiento a r ealizar, es decir,
usar mascar ill a, guantes y cubrir el cabello de ser necesario.
3. No inger ir al imentos ni fumar en el interior del laborator io. Algunas
sustancias tóxicas tienen la capacidad de ser volátiles y por lo tanto
se encuentr an tr azas de ellas suspendidas en el air e.
4. Leer cuidadosamente el procedimiento a seguir durante una
práctica, con el obj eto de luego estar al tanto de las consideraciones
de seguridad específicas de cada reactivo utilizado (Par a tal fin se
r ecomienda leer los Mater i al Saf ety Data Sheet que viene incl uido
con cada r eactivo)
5. No utilizar la llama del mecher o sin cer ciorar se antes de que no haya
cerca l íquidos inflamables, ni mantenga el mecher o o cocina
encendida sin necesidad.
6. Descontaminar apr opiadamente: El ár ea de tr abaj o deberá siempr e
cubr ir se con papel toalla o absorvente. Los mater iales descar tables
deber án ser desechados de acuer do a l a natur al eza del mater ial
(vidrios, derivados del caucho o del plástico, etc.). Los r eactivos o
r estos de r eacciones deber án eliminar se en contenedores apr opiados
(En ningún caso ar r oj ar un químico o cual quier mater ial al l avabo).
7. Rotular apropiadamente los r ecipientes, tubos y demás dispensables
empl eados par a almacenar, con el nombre del mater ial,
r esponsabl e(s), fecha.
8. En caso de ingerir o entrar en contacto con algún r eactivo, o de
cualquier accidente, descontaminar r ápidamente el ár ea de trabaj o
y luego per sonalmente, siguiendo las instr ucciones requer idas
específicas par a cada caso.

Practica N° 1
Aislamient o de Ácidos Nucleicos

El ADN genómico puede obtener se a par tir de cual quier micro- organismo,
planta o animal en cual quier instante durante su desar r ollo, y nos pr ovee de
copias mol ecular es de genes de cada organismo. Este mater ial puede
entonces ser util izado par a l a construcción de bibliotecas, en análisis de
hibridación, como molde en reacciones de amplificación y secuenciamiento,
entr e otras aplicaciones. Los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, sin
importar de que tipo o procedencia, siguen siempr e cuatr o etapas
fundamentales: l ísis de células, inhibición de nucleasas, despr oteinización y
precipitación de ácidos nucleicos. La difer encia entr e cada método radica en
el pre- tratamiento, lo cual depender á del or igen del mater ial; además
deber á tener se en cuenta de que el método de purificación tiene que ser
per fectamente compatible con el uso futur o que se piensa dar al ADN o ARN
pur ificado. El ADN puede aislarse mediante r uptura de tej idos, y luego
expl otando las diferencias en las pr opiedades de los ácidos nucleicos, las
proteinas y demás constituyentes celular es. T ras la l ísis cel ul ar , se trata de
inhibir las nucleasas, que de otra for ma degr adar ían el mater ial a pur ificar ,
para l uego despr oteinizar la muestr a, ya sea mediante métodos químicos
(solventes or gánicos, deter gentes no iónicos) o enzimáticos (pr oteasas).
Finalmente, los ácidos nucleicos son concentr ados mediante pr ecipitación en
presencia de etanol o isopropanol, y sales monovalentes como acetato de
sodio o de amonio, a baj as temperatur as (Sambr ook et al., 2001; Ausubel et
al., 1999; T owner, 1994)
Exper imento I
Obj etivo.- Aislar el ADN Genómico de Escher i chi a col i
F undament o.- El ADN genómico es fácil de aislar y car acter izar per o será de
escasa utilidad a menos de que sea de elevado peso molecular como par a ser
poster ior mente manipulado mediante tratamientos enzimáticos (T owner ,
1994). En el caso de las bacterias, el pr e- tr atamiento se lleva a cabo está
destinado a la digestión de la pared celular par a liber ar el contenido
citosólico, par a luego separ ar el cr omosoma usando sus propiedades
diferenciales.
Mat er iales y Reactivos.-
T r is-HCl 50 mM pH 7.7; High T E (T r is-HCl 25 mM, pH 8.0; EDT A 20 mM); Low

T E (T r is-HCl 50 mM, pH 8.0; EDT A 1 mM); SDS 20%; NaCl 5M; Fenol satur ado
con T E; Cl or ofor mo; Al cohol isopropílico; Etanol al 70%.
Pr ocedimiento.-
1. Cultivar por 14 horas las cepas de Escher i chi a col i en 5 mL del medio LB
a 37° C con agitación.
2. Colectar l as células por centr ifugación durante 10 minutos a 2500 RPM

3. Resuspender las células en 1 mL de la solución "High T E".
4. Adicionar 30 uL del stock de NaCl 5M y 10 uL del stock de SDS. Agitar el
contenido del tubo.
5. Agr egar 0.5 mL de Fenol satur ado con T E y homogenizar por inver sión
cuidadosamente por 5 minutos.
6. Centrifugar a 3000 RPM por 10 minutos, par a separar las fases.
7. Aspir ar la fase super ior (acuosa) que contiene al ADN, y tr ansfer ir la a
un tubo nuevo.
8. Adicionar a la fase acuosa 1 mL de Clor ofor mo, y homogenizar por
inversión dur ante 5 minutos. Centrifugar 10 minutos. Aspirar la fase
acuosa que contiene al ADN y tr ansferir la a un tubo nuevo de centr ífuga
de 2 mL.
9. Repetir el pr ocedimiento (8) hasta obtener una fase acuosa
completamente clar a.
10. Adicionar 1 vol umen de alcohol isopropílico helado, y dej ar en reposo
por una hora en hielo. Luego centr ifugar por 15 minutos.
11. Eliminar cuidadosamente el sobr enadante, y enj uagar el sedimento con
1 mL de etanol al 70%. T rasladar el contenido a un tubo de
micr ocentrífuga.
12. Centrifugar en la micr ocentr ífuga dur ante 10 minutos. Eliminar el
alcohol y dej ar secar a medio ambiente.
13. Resuspender el sedimento con 300 uL de l a solución "Low T E".
Exper imento II
Obj etivo.- Purificar ADN cr omosómico animal.
F undament o.- Método de aislamiento de ADN genómico sin emplear

extr acción con fenol ni centr ifugación. Adaptado de Lair d (1991). El método
gener al es descrito en Sambrook et al .(2001).
100mM T r is HCl pH 8.5; 10mM T r is HCl pH 7.5; 0.5M EDT A; 10% SDS; 5M NaCl;
20mg/ml Proteinasa K; isopr opanol; agua bidestil ada.
Pr ocedimiento
1. Lí si s: El buffer de lísis se agr ega al tej ido o células (usual mente 0.5
mL). La digestión se completa después de var ias hor as a 37° (células, 2-
3 hrs.) o 55° (tej idos) en agitación.
Buffer de Lísis:
100mM T r is HCl pH 8.5 5ml

0.5M EDT A 0.5ml
10% SDS 1ml
5M NaCl 2ml
20mg/ml Proteinasa K 0.25ml
Completar hasta 50ml con agua bidestilada.

2. Pr eci pi taci ón: Se agrega un volumen de isopropanol al l isado, y se
mezcla por inver sión hasta que se complete la precipitación (unos 10-
20 minutos); (debe desapar ecer l a vi scosi dad).
3. Recuper aci ón del Pr eci pi tado: El ADN pr ecipitado se r ecuper a

levantándol o con una punta descar table de micropipeta. Debe secarse
al ambiente el exceso de l íquido. El ADN luego se debe resuspender en
20 a 500ul de 10mM T r is HCl, 0.1mM EDT A, pH 7.5., dependiendo del
volumen de células o tej ido pr ocesado. La r esuspensión total r equier e
de varias horas de agitación a 37 ó 55° (mej or over night). Es
i mpor tante que el ADN esté total mente r esuspendi do par a asegur ar se
de r emoci ón r epr oduci bl e en al í cuotas par a el anál i si s.
Exper imento III
Obj etivo.- Purificar ADN cr omosómico vegetal .
F undament o.- El ADN vegetal es más dificil de obtener de una for ma que sea
luego cl onable o diger ibl e, que el proporcionado por células animal es, debido
principalmente a l a pr esencia de metabolitos secundarios y polisacar idos, los
cuales interfier en con el procedimiento de extr acción y se co- purifican con el
ADN; algunos de estos pr oblemas pueden superar se usando hoj as sin expandir.
Los tej idos de plantas son r obustos y por lo tanto r equier en pr e- tratamientos
intensivos, tales como largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno
líquido con polvo de al úmina seguida por extracción con el tampón CT AB, etc.
El método aquí descr ito proporciona cantidades relativamente puras de ADN
genómico, que puede usar se como molde de amplificación con fines de
fingerprinting molecul ar (RAPDs, micr osatélites u otr as metodologías) (Gr iffin
y Gr iffin, 1994).
T r isHCl 1 M pH 7.4, EDT A 0.5M, NaCl 5M, SDS 10%, Cloroformo, Alcohol
Isopr opìlico, Etanol Absoluto, Buffer T E (T r isHCl 50 mM pH 8.0, EDT A 1 mM).
Pr ocedimiento.-
1. Colocar hoj as de quinua (0.15 gr s) con 400 µL del buffer de macer ación
en un tubo de micr ocentrífuga nuevo. Homogenizar hasta que se
muestre de color ver de intenso.
Buffer de Maceración:
1M T r is HCl pH 7.4 10ml

0.5M EDT A 2.5ml
10% SDS 2.5ml
5M NaCl 2.5ml
Agua Bidestilada hasta completar 50 mL
2. Sedimentar en l a micr ocentr ífuga a 14,400 RPM por 1 minuto.

3. Agr egar un volumen de cl or ofor mo y mezclar por inver sion. Dej ar
r eposar 5 minutos a temper atur a ambiente. Centr ifugar por 5 minutos
en la micr ocentrífuga. T rasvasar el sobr enadante a un tubo nuevo.
4. T r asvasar 300 µL del sobrenadante, y pr ecipitar con 0.1 volumenes de

NaCl 5M con uno de los siguientes alcohol es:
Al cohol Isopropílico 1 volumen

Etanol Absoluto 2 volumenes
5. Dej ar r eposar a temper atura ambiente por 5 minutos, luego sedimentar

en la micr ocentrífuga a velocidad máxima por 5 minutos.
6. Dej ar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 µL de agua

libr e de nucleasas (deionizada – 18 MOhm), o en buffer T E (T ris-HCl 10
mM, EDT A 1 mM). El producto final es de 20 ng/µL de ADN
aproximadamente.
Exper imento IV
Obj etivo.- Aislar ADN Pl asmídico de cepas de E.coli usadas comúnmente en

tecnologías de ingenier ía genética.
F undament o.- Existen numer osas for mas de aislar pl asmidos pero un método
en particular (Birboim y Doly, 1979) sigue siendo univer salmente popular por
ser rápido, r epr oducible y pr ovee de var ios microgr amos de plásmido, el cual
estará l isto par a manipul ar se l uego con enzimas. El aislamiento se consigue en
tres pasos esencialmente: La par ed cel ul ar bacter iana es debil itada usando
lisozima, y l uego se lisan las células usando un agente quelante y un
detergente a pH elevado; finalmente el debr i s celular insol uble, que consiste
de ADN genómico y pr oteinas, es pr ecipitado util izando concentraciones
elevadas de sales y centr ifugación, dej ando el plásmido en sol ución.
T r isHCl 1M pH 8.0, EDT A 0.5M pH 8.0, SDS 20%, NaOH 10N, Acetato de Potasio
3M pH 5.2, Etanol al 70%, Etanol Absoluto.
Pr ocedimiento.-
1. T r ansferir una sòla colonia bacter iana a 2 mL de medio LB que contiene

el antibiótico apropiado (en nuestr o caso, Ampicil ina hasta 100 ug/mL).
Incubar el cul tivo toda la noche (over ni ght) a 37°C, con agitación
vigor osa.
2. T r asvasar 1.5 mL del cul tivo a un tubo de microcentr ìfuga. Centrifugar

a 12,000g por 30 seg. Remover el medio (sobr enadante), dej ando el
pel l et seco.
3. Resuspender el pel l et en la 100 uL de la Solución I fría (T r isHCl 25 mM

pH 8.0, EDT A 10 mM) mediante agitaciòn vigor osa
4. Agr egar 200 uL de la Solución II (NaOH 0.2N, SDS 1%). Mezcl ar el
contenido por inversión cinco veces; conser var el tubo en hielo.
5. Añadir 150 uL de Solución III (Acetato de Potasio 3M pH 5.2). Mezclar en

el agitador por diez segundos; conser var en hielo por 5 minutos.
6. Centrifugar a 12,000g por 5 minutos a temper atur a ambiente.

T r ansferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
7. Agr egar 2 volúmenes de etanol a temperatura ambiente. Mezclar en el

agitador . Permitir que la mezcl a permanezca 2 minutos a temper atur a
ambiente.
8. Centrifugar a 12,000g por 5 minutos. Remover el sobr enadante por

aspir ación o invertir lo sobr e papel toalla.
9. Enj uagar con 1 mL de etanol al 70% a 4°C; remover el sobrenadante y

secar el pel l et al aire por 10 minutos.
10. Redisolver los ácidos nucleicos en 50 uL de T E (T risHCl 10mM, EDT A

1mM pH 8.0). Agitar brevemente. Al macenar a -20°C.
Pr eguntas de Repaso
1. Porqué los ácidos nucleicos precipitan en pr esencia de alcohol y

sal es?
2. Cuáles pre- tr atamientos deber án emplearse, primer o en el caso de
aislar ADN genómico a par tir de pequeños inver tebrados, y luego
para aislar ADN de levadur as?
3. Qué estrategia deber á utilizar se para separar las diferentes
fracciones de transcritos nacientes y maduros?
4. Qué cantidad de ADN genómico se pueden aisl ar a par tir de cien
linfocitos humanos?

Practica N° 2
Elect r ofor esis de Ácidos Nucleicos

El pr oblema de r ealizar separaciones de biomoléculas gr andes es enfr entado
frecuentemente en las ciencias de l a vida, tanto par a análisis cuali- como
cuantitativos de mezclas o de preparaciones individuales. En la mayor ía de
casos es deseable causar el mínimo de daño a l as moléculas de manera que
sus pr opiedades no cambien de manera significativa. Los métodos actuales
para la separación de biomoléculas descansan por lo tanto en pr ocesos físicos
que causan el mínimo de desnaturalización, lo cual r esulta en la máxima
r etención de cual quier actividad biológica. Un gr an gr upo de métodos de
separación están basados en al gunas propiedades químicas o biol ógicas, o en
inter acciones de l a molécula que se investiga, y algunas otras están basadas
en difer encias en pesos mol ecular es o cargas netas, o a veces una
combinación de las dos pr opiedades. Los métodos electroforéticos pueden
diseñar se para explotar cualquier a de los dos, o ambos par ámetros, aunque
las difer encias en tamaño son las pr incipales en el caso de las separ aciones de
ácidos nucleicos.
Exper imento I
Obj etivo.- Car acter izar los ácidos nucleicos usando electr ofor esis en geles de
agarosa
F undament o.- Los geles de agar osa son el medio más popular par a
separaciones electroforéticas de ácidos nucleicos de mediano y gran tamaño.
Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5 %, y esta
concentración depende de l os tamaños de los ácidos nucleicos a separar .
Aunque los gel es de agar osa car ecen de fuerza mecánica (especialmente los
más diluidos), la manipulación se facilita por el uso de geles horizontales, los
cuales pueden ser sopor tados por láminas de vidr io o de plástico (Andr ews,
1994).
Mater iales: Camar a electr ofor etica, fuente de poder, camar a fotogr afica,
r ol lo fotografico B/N ASA 100, r ecipiente para tincion, T r ansIluminador UV,
Lentes UV, Cinta maski ng. Reactivos: Agar osa (gr ado biologia molecular),
Buffer de Corr ida T AE 10X (T r is-Acetato 400 mM, EDT A 20 mM), Buffer de
Muestr a (Concent r aciones finales: Ficoll-400 2%, EDT A 10 mM, SDS 0.1%, Azul
de br omofenol 0.025%, Xylene-Cyanol 0.025%), Br omuro de Etidio 10 mg/mL
Pr ocedimiento.-
1. Pr epar aci on del Gel de Agar osa: Se preparan 150 mL de Buffer de

Cor rida T AE 1X a par tir del stock 10X. Luego se disuel ven 0.24 gr de
Agar osa en 30 mL de Buffer T AE 1X en un vaso de precipitado, par a
tener un gel de 0.8% de concentr acion (apr opiado para separ ar
fragmentos de acidos nucleicos entr e 0.5 – 10 Kb.). Calentar
brevemente el r ecipiente par a disol ver , y dej ar enfriar .

2. Pr epar aci on de l a Camar a El ectr ofor eti ca: Colocar la base del gel
sobr e la camar a el ectrofor etica, y delimitar con cinta maski ng tape
los limites del gel, y luego el peine que mar car a los pozos. Ver tir la
agarosa cuando este lista, y dej ar solidificar . Una vez solido, se
agrega un poco de Buffer de Corr ida T AE 1X, y se r etira el peine. Lo
siguiente ser a colocar los electrodos, ayudandose de cinta maski ng
para suj etarlos.
3. Pr epar aci on de l as Muestr as: Los acidos nucl eicos a estudiar se
mezclan en una propor cion 1:6 con el Buffer de Muestra sobr e un
trozo de parafilm o luna de reloj , y cada muestr a se siembr a en uno
de los pozos del gel.
4. Cor r i da El ectr ofor eti ca: Se conectan los electrodos a la Fuente de
Poder , y se dej a cor rer a 60 – 80 voltios durante 1½ - 3 horas, o
hasta que el azul de br omofenol haya migrado 2/3 de la longitud del
gel.
5. T i nci on del Gel de Agar osa: T r asl adar el gel a un r ecipiente que
contenga Bromur o de Etidio (concentr acion final 0.5 ug/mL). Agitar
por 5 minutos. Luego, enj uagar pr imer o con agua corr iente y despues
con agua destilada. (Sharp et al ., 1973).
6. Vi sual i zaci on y Fotogr afi a: El gel teñido se coloca sobre el T r ans
Il uminador UV y se observan teniendo en cuenta el usar lentes de
proteccion. La vista se toma en cuar to oscur o con una camara fij a
usando un fil tr o r oj o, con el diafragma completamente abierto si se
utiliza pel icula blanco y negr o ASA 100. La fotografia es tomada con
una exposicion de 15 – 20 segundos.
Exper imento II
Obj etivo.- Car acter izar los ácidos nucleicos usando electr ofor esis en geles de
poliacrilamida
F undament o.- Los geles de poliacr ilamida son for mados por la polimer ización
viníl ica de los monómer os de acr ilamida en lar gas cadenas aleator ias de
poliacrilamida, l as cuáles son entr e- cr uzadas por l a inclusión en l a mezcl a de
pequeñas cantidades de un co- monómer o bifuncional apr opiado, de forma
usual bis- acr ilamida. Las cadenas entr e- cruzadas for man una estructura de
gel, cuyo tamaño de por o viene determinado por las concentr aciones iniciales
tanto de acrilamida como del co- monómero. La polimer ización pr ocede por
un mecanismo de radicales libr es, y la maner a más común de iniciarlo es
empl eando persulfato de amonio, el cual pr oduce radicales libr es de oxígeno
via un mecanismo de catálisis por base, siendo l as bases usadas general mente
aminas al ifáticas ter ciarias (como el T EMED, por ej emplo).
Mater iales: Camar a electroforética, fuente de poder , papel fotográfico,

equipamiento para impr esión de fotografías, r ecipiente par a tincion, Cinta
maski ng, cinta sell ador a de gel es, papel ti ssue. Reactivos: Poliacrilamida
(Acr ilamida: BisAcril amida 19:1 en Ur ea 7M, grado biologia molecular ), Buffer
de Cor r ida T BE 10X (T r is-Bor ato 400 mM, EDT A 20 mM), Per sulfato de amonio
10%, T EMED, Sol ución Fij adora – Stop (Acido Acético Glacial 10%), Solución de
T inción (AgNO3 1 gr /Lt, HCOH 0.056%), Solución de Revelado (Na2CO3 30 gr /Lt,
HCOH 0.056%, Na2S2O3 . 5 H2O 2 mg/Lt), Solución de Unión (3 uL Bind Sil ane
en 1 mL etanol 95%, ácido acético glacial 0.5%)
Pr ocedimiento.-
1. Pr epar aci ón de l a Cámar a El ectr ofor éti ca: Limpiar meticulosamente

las placas de vidr io primer o dur ante cinco minutos con papel tissue
saturado con 1 mL de l a solución de unión r ecién pr peparada, y luego
con 2 mL etanol al 95%. Repetir este pr ocedimiento al menos una
vez. Ensamblar las placas de vidr io con los espaciador es y clamps, y
sel lar con cinta selladora de geles; asegur arse de el iminar l os canales
de aire pr esionando fir memente.
2. Pr epar aci ón del Gel de Pol i acr i l ami da: Preparar un gel de
poliacrilamida al 6% en buffer T BE, mezclando ambas soluciones en
un beaker de 50 mL. Agregar 250 uL de la solución APS y 15 uL de
T EMED (par a un gel de 40 mL). Car gar inmediatamente en una pl aca
de electroforesis vertical pr epar ada con anti ci paci ón, utilizando una
pipeta, y evitando la for mación de burbuj as; luego colocar el peine
espaciador y esperar la gel ificación completa (unos 30 minutos).
Luego de l a polimer ización, r etir ar los clamps y la cinta, luego
cuidadosamente retir ar el peine. Enj uagar l a par te superior del gel
con buffer de corr ida y el peine con agua destilada.
3. Pr epar aci on de l as Muestr as: Despues del ter mociclaj e de
secuenciamiento, se añaden 3 uL de Sol ución Stop de
Secuenciamiento (ver pr otocol o de secuenci ami ento). Calentar las
r eacciones a 70°C por 2 minutos inmediatamente antes de cargar de
3.0 a 3.5 uL de cada reacción en el gel de poliacril amida al 6%..
4. Cor r i da El ectr of or éti ca: Llenar los electr odos con buffer de corr ida
T BE 1X. Se conectan los electr odos a la Fuente de Poder, y se dej a
corr er a 300 voltios dur ante toda la noche, (Cor rer a un voltaj e
constante).
5. Fi j aci ón del Gel : T r asl adar el gel a un r ecipiente que contenga la
Solución de Fij ación – Stop y agitar bien por 20 minutos o hasta que
el buffer de muestr a haya desapar ecido.
6. Lavado del Gel : Enj uagar el gel tres veces (de dos minutos cada uno)
con agua ultra-pur a con agitación. Levantar el gel y dej arl o secar
dur ante 10 – 20 segundos antes de tr ansferir lo al siguiente l avado.
7. T i nci ón del Gel : T r ansferir el gel a l a solución de tinción y agitar
bien por 30 minutos.
8. Revel ado del Gel : Sumer gir el gel en un recipiente que contenga
agua ultrapur a, secar y colocar i nmedi atamente el gel en un
r ecipiente con l a solución de r evelado helada. Agitar bien hasta que
las pr imeras bandas sean visibl es, agr egar todo el resto de la
sol ución de revelado, y continuar hasta que todas las bandas sean
visibles. Luego agregar 1 Lt de la sol ución de fij ación – stop e incubar
en agitación por 2 – 3 minutos. Enj uagar el gel dos veces por 2
minutos cada vez en agua ultrapura. Dej ar secar el gel a
temperatura ambiente o utilizando pr ocedimientos de
calentamiento.

9. Vi sual i zaci ón del Gel : Colocar el gel sobr e un fondo de luz blanca
visible o amar illa. Par a registros per manentes, r evelar en papel de
impr esión fotogr áfico.
1. Por qué la electroforesis se r ealiza en concentr aciones baj as de sal es?

2. El oxígeno es un impulsor de la polimer ización, pero por encima de
cier tos niveles se convier te en un inhibidor de l a misma. Qué
estr ategias pueden emplearse par a evitar este tipo de pr oblemas?
3. Qué diferencias funcional es existen entr e los principios de
electr ofor esis ver tical es y hor izontales de ácidos nucleicos?
4. Porqué la movilidad electroforética de los ácidos nucl eicos no es
alter ada por el pH (como sí ocur r e con las proteinas)?

Practica N° 3
Clonamiento Molecular
Exper imento I
Obj etivo.- Digerir el ADN empleando enzimas de r estr icción.
F undament o.- Reacción de digestión con endonucleasas de r estr icción

estándar , segun la guía de pr otocolos de la fir ma Promega Cor p. (Madison,
EE.UU.).
Buffer de Digestión E 10X, Albúmina de Suer o Bovino Acetil ada 10 µg/µL,

Enzima de Restr icción Bam HI 10 U/µL (Promega); Agua deionizada (Sigma);
ADN para diger ir .
Pr ocedimiento.-
1. Deter minar la concentr ación del ADN a cortar con la enzima de

r estricción, por su absorvancia a 260 nm (espectr o ultr avioleta)
usando el cociente de conversión. Alter nativamente, puede
estimar se la concentr ación por compar ación con estándar es de
cantidad de ADN sobre un gel de agarosa.
2. Sedimentar br evemente por centrifugación los tubos con el ADN a
cortar , el buffer de digestión E, el Ac-BSA, y la enzima Bam HI, para
colectar sus contenidos al fondo de l os tubos.
3. Disponer de una reacción y seguir las indicaciones que se descr iben a
continuación:
Component e Cantidad
Agua Deionizada 17.3 – X µL
RE 10X Buffer E 2 µL
Ac-BSA 10 µg/µL 0.2 µL
ADN a diger ir X µL
Mezclar por pipeteo
Bam HI 10 U/µL 0.5 µL
Incubar a 37° C por 2 – 4 horas
4. Llevar 5 µL de la reacción de digestión a una electroforesis en gel de

agarosa al 0.8 – 1% par a verificar la acción de l a enzima. El
fragmento liber ado o linealizado podr á recuper arse desde el gel para
su poster ior subcl onamiento.

Exper imento II
Obj etivo.- Clonar ADN en un vector pl asmídico
F undament o.- Método descr ito por Mezei y Stor ts (1994). Patente
comercial izada por la fir ma Promega Cor p. (Madison, EE.UU.)
T 4 DNA Ligasa 3 U/µL, Buffer de T 4 DNA Ligasa 10X, Vector Plasmídico pGEM-T
(Pr omega); Agua Deionizada 18 Mohm (Sigma); Producto de Amplificación por
PCR.
Pr ocedimiento.-
1. Deter minar la concentr ación del producto de PCR (amplificado) por

su absorvancia a 260 nm (espectro ultr avioleta) usando el cociente
de conver sión. Alter nativamente, puede estimarse la concentr ación
por compar ación con estándares de cantidad de ADN sobre un gel de
agarosa.
2. Optimizar la r elación inserto : vector según la ecuación de r elación.
3. Sedimentar br evemente por centr ifugación los tubos con el vector
pGEM-T , el ADN contr ol de inserción, el ADN amplificado, y el vector
sin cortar, para col ectar sus contenidos al fondo de los tubos.
4. Disponer de un j uego de reacciones, como se descr ibe a
continuación:
Componente Reacción Estándar Control Positivo Control de Fondo

Agua Deionizada 7 –X 5 7
Buffer 10X 1 1 1
Vector pGEM-T 50 ng 1 1 1
Producto de PCR X - -
ADN Control Inserto - 2 -
T 4 DNA Ligasa 1 1 1
Vol umen Final 10 µL 10 µL 10 µL
5. Mezclar las tr es reacciones por pipeteo. Incubar por una noche a

4° C. Esta reacción de ligación deberá ser utilizada inmediatamente
en una tr ansformación de cél ul as competentes par a facil itar su
propagación. El amplificado podrá ser subcl onado a otr o vector
plasmídico par a su posterior estudio, pr evia digestión con enzimas de
r estricción (Mezei y Storts, 1994).
Exper imento III
Obj etivo.- Pr eparar y tr ansfor mar cél ul as competentes
F undament o.- Método descr ito en Sambr ook et al ., (1989) basado en Mandel
y Higa (1970).

E.col i cepa DH5α, medio de cultivo Luria Ber tani (LB) caldo, LB agar,
Ampicilina 100 ug/mL, CaCl 2 100 mM, ADN plasmídico.
Pr ocedimiento.-
Pr epar ación de Células Compet ent es:
1. Inocular 10 mL de medio LB cal do con una sola colonia de E.col i

cepa DH5α, e incubar toda l a noche a 37 gr ados
2. Inocular 10 mL de LB caldo con 400 uL del crecimiento noctur no, e

incubar hasta que l a densidad óptica alcance 0.5
3. Colectar las célul as por centr ifugación y trasvasar las a un tubo

nuevo. Resuspender las células en 1 mL CaCl 2 100 mM en hielo
dur ante 5 minutos; colectar nuevamente las células por
centr ifugación, y resuspender en 200 uL de CaCl 2 100 mM e
incubar en congelación por una hora.
T r ansfor mación con ADN Plasmídico:
4. T omar 50 uL de cél ul as competentes y agregarl es 1-20 ug de ADN

plasmídico (pADN) e incubar por congelación por una hor a.
5. Heat Shock: Colocar las células en baño mar ía a 42 gr ados por 2

minutos; luego enfriar el tubo en hielo por 5 minutos.
6. Opcional. T i empo de Expr esi ón: Agregar 1 mL de medio LB,

r esuspender las células e incubar a 37 grados por 1 hora. Mej or a
l a ef i ci enci a uti l i zando medi o SOC.
7. Concentr ar las células por centrifugación; sembr ar todo o

diluciones, en placas con medio LB agar que contienen ampicil ina
hasta una concentración de 100 ug/mL; incubar a 37 gr ados
over ni ght.
Exper imento IV
Obj etivo.- Real izar el seguimiento de un clón recombinante
F undament o.- Método descrito por Dale y Gr eenaway (1984).
Mondadientes estér iles al autoclave; buffer de cor rida de electroforesis T AE

1X; buffer de lísis (SDS 5%, Azul de Br omofenol 0.05%, Glicer ol 50%, en buffer
de cor r ida); agar osa; bromuro de etidio.
Pr ocedimiento.-

1. Preparar una solución de agar osa al 1% en buffer de cor r ida de
electr ofor esis T AE 1X, calentar y distr ibuir como un gel horizontal.
2. Utilizando un extr emo romo de un mondadientes estér il, coger una

colonia bacteriana y r esuspender la en 100 uL de buffer de corr ida de
electr ofor esis T AE 1X mediante r otación.
3. Agr egar 25 uL de buffer de lísis y calentar los tubos a 65°C en baño

mar ía dur ante 30 minutos. Agitar cada tubo por 20 segundos en un
vortex, y r egresar lo al baño mar ía hasta que esté listo el gel de
electr ofor esis.
4. Car gar 15 uL de cada muestr a mientr as se encuentre caliente en

cada pozo del gel de agar osa al 1%. Corr er el gel hasta que el azul de
bromofenol alcance el ter cio infer ior. Desempacar el sistema
electr ofor ético y teñir con bromuro de etidio, y visualizar las bandas
en un tr ansiluminador .
1. Con qué propósito se emplea la albúmina durante el exper imento de

digestión con enzimas de restr icción?
2. Qué propiedad se apr ovecha par a ligar directamente fragmentos de
PCR con el vector pGEM-T ?
3. Qué cambios subcelulares se esperan durante la etapa del heat shock
en la transfor mación con células competentes?
4. Mencione la importancia de aplicar el seguimiento sobr e muestr as
clínicas de impacto en sal úd públ ica.

Practica N° 4
Amplificaciones
Exper imento I
Obj etivo.- Clonar ácidos nucleicos in vitr o mediante PCR.
F undament o.- Método ideado por Mull is et al .(1987). El protocol o descr ito
está basado en el ar tículo original (Saiki et al ., 1988). Reacción de digestión
con endonucleasas de r estricción estándar , segun la guía de pr otocolos de l a
fir ma Pr omega Cor p. (Madison, EE.UU.).
Soluciones: PCR Buffer 10X (Per kin El mer ), MgCl 2 25mM (Perkin Elmer ), dNT Ps
2.5 mM (Perkin Elmer), Pr imer For ward INT GF 10 µM (Life T echnologies),
Primer Rever se INT ER 10 µM (Life T echnologies), λ DNA 25 ng/µL (New
England Biolabs), AmpliT aq DNA Polimerasa 5 U/µL (Per kin Elmer ).
Pr ocedimiento.-
1. A un tubo nuevo de microcentr ífuga de 0.2 mL agr egar :
Reactivo Volumen (µL)

Agua 18 MOhm 33.5
PCR Buffer 10X 5.0
MgCl 2 25mM 3.0
DNT P mix 2.5 mM 4.0
Primer INT GF 10 µM 1.0
Primer INT ER 10 µM 1.0
Mezclar y centrifugar
λ DNA molde 25 ng/µL 2.0
T aq DNA Polymer ase 5 U/µL 0.5
Volumen Final 50µL
2. Cubrir con aceite mineral si el ter mociclador lo r equier e.
Concentr aciones Finales.

T r is-HCl , 20 mM pH 8.4 (a 22°C)
KCl, 50 mM
MgCl 2, 1.5 mM
Primer s, 200 mM cada uno.
dNT Ps, 200 µM de cada uno.
AmpliT aq DNA Polymerase, 2.5U
3. Realizar el siguiente ciclaj e:

Denatur ación Inicial 94°C 5´
Denatur ación 94°C 45”
Hibr idación 40°C 30”
Extensión 72°C 2´
Extensión Final 72°C 10´
4. Analizar 10 µL de l a r eacción mediante una electr ofor esis en gel de

agarosa al 2%, o almacenar la reacción a -20°C hasta su uso.
Exper imento II
Obj etivo.- Secuenciar ácidos nucleicos mediante el método de ter minación de

cadena por didesoxinucleótidos.
F undament o.- Método ideado por Sanger (1977). El pr otocolo corr esponde al
del kit Silver Sequence - DNA Sequencing System (Promega, Madison). Método
ideado por Mull is et al . (1987).
Soluciones: PCR Buffer 10X (Per kin El mer ), MgCl 2 25mM (Perkin Elmer ), dNT Ps
2.5 mM (Perkin Elmer), Pr imer For ward INT GF 10 µM (Life T echnologies),
Primer Rever se INT ER 10 µM (Life T echnologies), λ DNA 25 ng/µL (New
England Biolabs), AmpliT aq DNA Polimerasa 5 U/µL (Per kin Elmer ).
Pr ocedimiento.-
1. Para cada j uego de r eacciones de secuenciamiento, etiquetar cuatr o

tubos de micr ocentrífuga (G, A, T , C). Agr egar 2 µL del d/ddNT P mix a
cada tubo. Agr egar una gota (unos 20 µL) de aceite miner al a cada
tubo. T apar los tubos y almacenar en hielo hasta que se utilizen.
2. Para cada j uego de cuatr o reacciones de secuenciamiento, mezcl ar los

siguientes r eactivos en un tubo de microcentr ífuga:
Reactivo Volumen (µL)

pGEM-3Zf(+) ADN molde, 4 µg. 4.0
Buffer de Secuenciamiento 5X 5.0
pUC/M13 For war d Primer (4.5 pmol) 3.6
Agua Libr e de Nucl easas hasta: 16.0 µL
3. Agr egar 1.0 µL de T aq DNA Polimer asa gr ado secuenciamiento (5 U/µL)

al mix pr imer /mol de. Mezclar br evemente por micr opipeteo.
4. Agr egar 4 µL del mix enzima/primer /molde a las par edes de cada tubo
que contiene el mix d/ddNT P, y mezclar br evemente. Centrifugar en
una microcentr ífuga.

5. Colocar los tubos de r eacción en un termocicl ador que ha sido
precalentado a 95°C, y utilizando el perfil siguiente, comenzar el
progr ama de ciclaj e.
Denatur ación Inicial 95°C 2´

Denatur ación 95°C 30”
Hibr idación 42°C 30”
Extensión 70°C 1´
45 - 60 cicl os, luego 4°C
6. Después de completado el ter mociclaj e, agregar 3 µL de solucion stop

de secuenciamiento a l a pared de cada tubo. Centr ifugar br evemente
en una microcentr ífuga par a detener las reacciones.
7. Calentar las r eacciones a 70°C por 2 minutos inmediatamente antes de

cargar 3.0-3.5 µL de cada r eacción a un gel de poliacr ilamida al 4-6%
(19:1 acr ilamida : bisacrilamida) con Ur ea 7M en buffer T BE, con
espaciadores de 0.4 mm.
1. Porqué se necesita emplear una polimerasa termoestable dur ante el

clonamiento in vitro?
2. Proponga un método que permita amplificar cadenas de aminoácidos
con las mismas ventaj as que el PCR tiene para los ácidos nucleicos
3. Qué ventaj as presenta el método de Sanger (enzimático), sobr e el de
Maxam – Gil ber t (de degr adación de la cadena)?
4. Qué condiciones del método de ter minación de cadena hacen posibl e
su automatización?

Practica N° 4
T r ansfer encia de Ácidos Nucleicos
Exper imento I
Obj etivo.- Llevar a cabo tr ansferencia de ADN a filtr os de nylon par a verificar
su identidad mediante hibridación a secuencias sonda.
F undament o.- Método descr ito desar rol lado por E.Souther n (1975). El
presente pr otocolo es descr ito por T .Brown (1991) del texto Cur r ent Pr otocol s
i n Mol ecul ar Bi ol ogy (Ausubel et al ., Eds.).
Solución de Depurinación (HCl 0.25M), Sol.Denatur ación (NaOH 0.5N, NaCl

1M), Sol.Neutr al ización (T ris-HCl 0.5M pH 7.4, NaCl 3M), SSC 20X (Citrato de
Sodio); material es y r eactivos para electroforesis en geles de agar osa.
Pr ocedimiento.-
1. El ectr ofor esi s: Realizar una el ectr ofor esis en gel de agar osa al 0.9%
con digeridos de ADN genómico cor respondiente al or ganismo de
estudio, utilizando como mar cador el ADN del fago Lambda digerido
con Hi nd III biotinilado (Gibco BRL, Bethesda)
2. T i nci ón: T er minada la electroforesis, teñir con br omur o de etidio y
visualizar las bandas en un transiluminador UV. Fotogr afiar
inmediatamente, cuidando de no exponer mucho tiempo el gel a la
luz ultraviol eta.
3. Depur i naci ón: Sumergir el gel en HCl 0.25M contenido en una
bandej a por 15 minutos.
4. Denatur aci ón: Devol ver la solución de depur inación a su r ecipiente,
y ver ter la solución de denaturación (NaOH 0.5N, NaCl 1M) sobr e el
gel en la bandej a. Dej ar el gel en la denatur ación por media hor a a
temperatura ambiente en agitación suave.
5. Neutr al i zaci ón: Regresar la solución de denaturación a su
r ecipiente, y vertir la solución de neutralización (T ris-HCl 0.5M pH
7.4, NaCl 3M). Dej ar el gel en neutralización por 30 minutos a
temperatura ambiente en agitación suave.
6. Ar mado del Si stema: Se armar á el sistema de transferencia capilar
que consta en l a figur a. Par a el lo se cortarán 5 láminas de papel
Whatman 3MM y una lámina de nyl on Zeta Probe (BioRad) de tamaño
exactamente igual al del gel. Además, cortar una buena cantidad de
papel filtro, de un tamaño 1 mm menor del gel por lado (suficiente
como par a hacer una tor re de 15 cms). La esponj a a utilizar deberá
ser de un tamaño mayor al del gel. Vertir l a sol ución SSC 10X en el
sistema de tr ansfer encia hasta que la mitad de la altura de la
esponj a se haya sumergido. Colocar tres de l as láminas de papel
Whatman cor tadas sobr e la esponj a. Remoj arlas con buffer de

transfer encia y colocar el gel una vez que se haya cumplido con la
neutral ización.
7. T r ansf er enci a: Llevar a cabo la transfer encia en un per íodo de 2 a 24
horas dependiendo de la concentr ación del gel y del tamaño de los
fragmentos de DNA que se van a transferir. Al final de la
transfer encia separ ar a la membrana del gel y enj uagarla
brevemente en la sol ución SSC 2X.
8. Fi j aci ón Coval ente: Col ocar la membrana con la cara de unión al DNA
hacia abaj o sobre un papel Whatman 3MM satur ado con 400 mM de
NaOH por 10 minutos. Lavar en SSC 2X y secar al aire. La membr ana
secada de esta manera es establ e a temperatura ambiente por 2
días; par a r eal izar inmediatamente la hibridación, se debe secar al
vacío a 80 gr ados por 30 minutos. La membrana seca se almacena
entr e dos láminas de papel Whatman en una bol sa pl astica a
temperatura ambiente.
1. Cuáles son las pr incipales difer encias entre el Souther n, Northern y

Western blot?
2. Qué ventaj as y desventaj as se presentan al emplear nitr ocelul osa o
nylon como membr ana sopor te par a la transfer encia?
3. Existen actualmente tecnol ogías que per miten el seguimiento de
miles de tr anscr itos de maner a cuali- y cuantitativa automatizada.
Mencione al menos tres de estas nuevas tecnologías (3) con su
r espectivo pr incipio.

Apéndice No.1: R elaciones de U so F r ecuent e en B iología Molecular .
Conversiones Comunes:
1 µg = 1 x 10-6 gr 1 Unidad A260 DNA dobl e cadena = 50 µg/mL

1 ng = 1 x 10-9 gr 1 Unidad A260 DNA cadena simple = 33 µg/mL
1 pg = 1 x 10-12 gr 1 Unidad A260 RNA cadena simple = 40 µg/mL
1 µg de 1,000 pb DNA = 1.52 pmol 1 µg de DNA pBR322 = 0.36 pmol
1 Kb DNA = 333 aminoácidos de = 3.7 x 104 MW

capacidad codificante
Igualdades en Bases Nitr ogenadas:
A + G = C + T (DNA de cadena doble)
T m = 4 (G+C) + 2 (A+T ) T h = T m - 5° (*) valores aproximados
 1 
G + C + S + 2 (N + X + M + Y + K + R ) + 0.67( B + V ) + 0.33( H + D)
%GC =
nts
675
Tm = 59.9 + 41(%GC ) − ( )
nts
(*) val ores reales
Concentr ación del ADN de Doble Cadena:
OD 260 ×1 mg
[DNA] = mL 1 Unidad OD260 = 50 µg/mL
20
Relación Inserto – Vector:
vector ( ng ) × inserto ( Kb )
× relación_m olar = inserto ( ng )
vector ( Kb )
Biblioteca Genómica:
C : capacidad del vector ln (1 − p )

N=
g : tamaño del genoma  c
p : probabilidad ln 1 − 
 g
N : número de clones r equerido
Eficiencia de T r ansfor mación:
número _ colonias
ET =
plásmido (µg)

Apéndice No.2: Composición de B uf f er s y S oluciones S t ock.
T r is-HCl 1M.
Disolver 121.1 gramos de T ris base en 800 mL de agua destil ada. Aj ustar el pH
al valor deseado añadiendo las siguientes cantidades de HCl concentrado:
pH HCl (mL)
7.4 70
7.6 60
8.0 42
Llevar a un l itro, distr ibuir en alícuotas y ester ilizar en el autoclave.
EDT A 0.5M, pH 8.0

Añadir 186.1 gr amos de acido etilen-diamino-tetr a-acético disódico
dihidratado (EDT A) a 700 mL de agua destilada. Agitar vigor osamente con un
agitador magnético. Aj ustar el pH a 8.0 con NaOH 10N, apr oximadamente 50
mL. Enrazar a un litro con agua destilada. Distr ibuir en alícuotas y autoclavar.
Buffer T E.
T r is-HCl 10 mM pH 8.0
EDT A 1 mM
Buffer de T r ansfor mación

CaCl 2 50 mM
MOPS 100 mM, pH 6.5
RbCl 10 mM
SDS 20%
Disolver 20 gr amos de SDS en 80 mL de agua destilada, calentar a 68° C par a
disol ver . Aj ustar el pH a 7.2 añadiendo gotas de NaOH 10N. Enr azar a un
volumen de 100 mL.
NaCl 5M
Disolver 292.2 gr. de NaCl en 800 mL de agua destilada. Aj ustar el vol umen a
un litr o con agua destilada. Distr ibuir en alícuotas y esterilizar en el
autoclave.
Acetat o de Sodio 3M
Disolver 408.1 gr amos de acetato de sodio trihidr atado en 800 mL de agua
destilada. Aj ustar el pH a 5.2 con ácido acético glacial. Aj ustar el volumen a
un litr o con agua destil ada. Dispensar en alícuotas y esterilizar en el
autoclave.
Acetat o de Potasio 5M
Disolver 49.1 gr amos de acetato de potasio en 50 mL de agua destilada,
aj ustar el pH a 7.5 con ácido acético glacial 3M. Llevar a 100 mL. Dispensar en
alícuotas y ester ilizar en el autoclave.
Glucosa 0.5M
Disolver 9.01 gr amos de glucosa en agua destil ada y l levar a 100 mL. Dispensar
en alícuotas y esterilizar en el autoclave.
Br omur o de Etidio.
Añadir 100 mg. de br omur o de etidio en 10 mL de agua destil ada. Disolver
utilizando un agitador magnético, por varias hor as hasta asegur ar se total
disol ución. Envolver el recipiente en papel de aluminio, o transfer ir l a
sol ución a una botella oscura, y almacenar a temper atur a ambiente.
T AE 10X
Para 500 mL, pesar 24.2 gr amos de T ris base; adicionar 5.71 mL de ácido
acético glacial par a aj ustar el pH a 7.4, mas 10 mL de EDT A 0.5M, disolver los
hasta 500 mL con agua destilada. Dispensar en alícuotas y esterilizar en el
autoclave.
Buffer de Muest r a 10X

Ficoll 400 20% (en su lugar se puede utilizar sucrosa); SDS 1%; Xylene Cyanol
0.25%; EDT A disódico pH 8.0 100 mM; Azul de Bromofenol 0.25%.
St ock de Ampicilina 50 mg/mL

Disolver 500 mg de Ampicilina en 5 mL de etanol absoluto y 5 mL de agua
destilada. Conser var a -20•C.
St ock de IPT G 100 mM

Disolver 1.2 gramos de isopr opil - tiogal actósido (IPT G) en 40 mL de agua
destilada, l uego enrazar hasta 50 mL con agua destil ada. Filtr ar y al macenar a
4•C.
St ock de X-Gal 50 mg/mL

Pesar 100 mg de 5-bromo-4-clor o-3-indolil -beta-D-galactosido (X-Gal) y
disol ver los en 2 mL de N,N´-dimetilfor mamida. Cubr ir con papel de aluminio y
almacenar a -20•C.
Medio de Cultivo L ur ia Ber t ani.

Para un l itr o de caldo, disolver 10 gr amos de bactopeptona (o bactotr iptona),
5 gramos de extr acto de levadur a y 5 gr amos de NaCl. Aj ustar el pH a 7.5 con
NaOH 1N, y ester ilizar en el autoclave. Cuando sea necesar io agregar
ampicilina hasta 100 ug/mL, despues de autocl avar . Par a placas L B-Amp,
agregar 15 gramos de agar granulado, autocl avar ; dej ar enfr iar el medio hasta
55•C, y agr egar ampicil ina (hasta 100 ug/mL). Ver ter 30 mL en placas petr i de
85 mm. Si es necesar io, fl amear la super ficie del medio con un mecher o par a
eliminar bur buj as. Dej ar endur ecer el agar. Almacenar a temper atur a
ambiente por una semana o a 4•C por un mes. Par a placas L B-Amp/IPT G/X-
Gal, agregar IPT G hasta 500 mM y X-Gal 80 ug/mL, y verter a las placas.
SSC 20X
Para un l itr o, pesar y disolver 175 gr amos de NaCl y 88.2 gr amos de citrato
trisódico en 800 mL de agua destilada. Una vez disuelto llevar a un litro y
esterilizar .

Apéndice No.3: Guía de Pr oblemas.
1. Qué condiciones de termocicl aj e aplicar ía par a ampl ificar un fragmento X,

utilizando como pr i mer s los siguientes oligonucl eótidos:Upstream 5´ AGG
T T C GT T CGG GC 3´ ; Downstr eam 5´ GT C GT A T AT T AT TAT 3´ ; si el
amplificado esper ado es de 1.5 Kb?
2. Qué cantidad de un inserto (en ng) de 1.7 Kb de longitud, se necesitar án

para clonar con 50 ng del vector pUC19, si se quier e una r el ación inserto -
vector de 1:3 [Dato: tamaño de pUC19 = 2.8 Kb]
3. Cuál es el T m del siguiente oligonucl eótido: 5´ AGG T T C GAT CGA T CG G

3´ , en condiciones de PCR (NaCl 50 mM)?
4. Una molécula de ADN es cor tada con una enzima de r estricción, y luego
analizada mediante una electr ofor esis en gel de agar osa. Una sóla banda
es vista tras la tinción del gel. Explique.
5. Se quier e constr uir una bibl ioteca genómica del chimpancé (6 x 109 pb por
célula dipliode). Calcular cuantos cl ones se necesitarán, si se quiere que el
99.5% de los genes del mono estén en la biblioteca, si el tamaño pr omedio
de fragmentos a clonar es 2 x 104 pb; además decidir que tipo de vector
ser ía el más apropiado par a estos fines.
6. Cuál de los siguientes oligonucleótidos es el sitio de la enzima de

r estricción Iba VI?
(a) 5´ AAT T T C 3´ (b) 5´ GAT CCG 3´

(c) 5´ AGT ACT 3´ (d) 5´ AAT AT C 3´
(e) 5´ GGACT A 3´
7. En un experimento se contaron 4500 colonias transfor mantes en una pl aca

con medio selectivo, cuando se sembr ó una dilución 1/100 de células
tratadas con 3 ul de una muestr a de cccDNA, de concentr ación 200 ng/ul .
Deter minar el método de tr ansfor mación utilizado, y la eficiencia de
transfor mación obtenida.
8. La absor vancia de una muestra de ácidos nucl eicos a 260 nm es 0.48.

Calcular su concentr ación en ng/ul, si para cuantificar se dil uyó 1/100;
determinar además si dicha muestr a podr ía ser utilizada para una digestión
con enzimas de r estr icción, si la OD280=0.36.
9. Calcular el tamaño de un fr agmento de ADN que migr ó 5.4 cms, si los

fragmentos del estándar (lambda DNA/Hind III) migr aron 1.9, 4.0, 4.8, 5.7,
7.2, 7.5, y 10.5 cms en una electr ofor esis en gel de agarosa al 1%.
10. Qué cantidad de ADN mitocondr ial (en ug) se podrían aislar de cien
linfocitos humanos?
11. Calcular la concentración del ol igonucleótido 5´ GT C GT A T AT T AT AT T 3´ ;

en µmol/mL, cuyo OD260=0.42, utilizando una cubeta de cuarzo de 1 cm de
gr osor [Coeficientes de Extinción (ml /µmol): A=15.4; G=11.7; C=7.3;
T =8.8]
12. Deter minar l a cantidad de un producto de PCR de 200 bp, obtenido tras 25
ciclos de amplificación a par tir de 1 µg de ADN humano.
13. Cuántas unidades de la enzima Eco RI se necesitar án para digerir 4 µg del

plásmido pBluescr iptIISK(+), si dicho vector tiene un solo sitio par a l a
enzima? [Datos: tamaño del vector=2.9 Kb; factor de digestión del
vector =2.5; sitios Eco RI en λ DNA=5; tamaño de λ DNA=48 Kb]
14. Qué cantidad de ADN genómico se podr ían aislar de 24 par ásitos de
Lei shmani a mexi cana (8 x 107 pb por genoma diploide)?
15. Con la finalidad de construir una bibl ioteca genómica del “gallito de las
r ocas” (1 x 10 8 pb por célula dipl oide), se llevan a cabo digestiones con la
enzima de restr icción Not I (5´ GCGGCCGC 3´ ). Determinar :
• T amaño y número de los fr agmentos obtenidos;
• T ipo de vector de clonamiento más apr opiado; y
• El número de clones mínimo necesar io, con 95% de éxito.
16. Una muestr a de ADN tiene 23% de adenosina. Calcular su T m si su longitud

aproximada es de 100 nucl eótidos.
17. La densidad óptica a λ=260 nm de una muestr a de ácidos nucleicos es de

OD260=0.56; descr iba el tipo de ácido nucleico analizado, si l a
concentración aproximada obtenida por electr oforesis es de 19.8 µg/mL.
18. Calcular la cantidad de una muestr a de ADN (en gramos) de 1 Kb, obtenida
tras 30 ciclos de amplificación por PCR, si se partió de una sóla molécul a
como molde [Dato: 1 Kb ≅ 3.7 x 104 Da]

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U NI VE R S I D AD NACI ONAL F E D E R I CO VI L L AR R E AL

F ACU L T AD D E CI E N CI AS NAT U R AL E S Y MAT E MAT I CAS

B iól .W .I s r ael B ar r ant es B us t i nz a

I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

Biól.I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

El Laboratorio de Bioquímica y Biol ogía Molecular de la Facultad de Ciencias

Lima, Agosto del 2,002.

Profesor es del Cur so de Biología Molecular :

Biól. W.Isr ael Bar r antes Bustinza.

I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

1. Asumir de que toda muestr a que contiene fluidos biológicos es

Biól.I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

Aislamient o de Ácidos Nucleicos

Obj etivo.- Aislar el ADN Genómico de Escher i chi a col i

Mat er iales y Reactivos.-

T r is-HCl 50 mM pH 7.7; High T E (T r is-HCl 25 mM, pH 8.0; EDT A 20 mM); Low

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Obj etivo.- Purificar ADN cr omosómico animal.

F undament o.- Método de aislamiento de ADN genómico sin emplear

Mat er iales y Reactivos.-

100mM T r is HCl pH 8.5 5ml

Biól.I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

3. Recuper aci ón del Pr eci pi tado: El ADN pr ecipitado se r ecuper a

Exper imento III

Obj etivo.- Purificar ADN cr omosómico vegetal .

Mat er iales y Reactivos.-

1M T r is HCl pH 7.4 10ml

2. Sedimentar en l a micr ocentr ífuga a 14,400 RPM por 1 minuto.

I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

4. T r asvasar 300 µL del sobrenadante, y pr ecipitar con 0.1 volumenes de

Al cohol Isopropílico 1 volumen

5. Dej ar r eposar a temper atura ambiente por 5 minutos, luego sedimentar

6. Dej ar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 µL de agua

Obj etivo.- Aislar ADN Pl asmídico de cepas de E.coli usadas comúnmente en

Mat er iales y Reactivos.-

1. T r ansferir una sòla colonia bacter iana a 2 mL de medio LB que contiene

2. T r asvasar 1.5 mL del cul tivo a un tubo de microcentr ìfuga. Centrifugar

3. Resuspender el pel l et en la 100 uL de la Solución I fría (T r isHCl 25 mM

5. Añadir 150 uL de Solución III (Acetato de Potasio 3M pH 5.2). Mezclar en

6. Centrifugar a 12,000g por 5 minutos a temper atur a ambiente.

7. Agr egar 2 volúmenes de etanol a temperatura ambiente. Mezclar en el

8. Centrifugar a 12,000g por 5 minutos. Remover el sobr enadante por

9. Enj uagar con 1 mL de etanol al 70% a 4°C; remover el sobrenadante y

10. Redisolver los ácidos nucleicos en 50 uL de T E (T risHCl 10mM, EDT A

1. Porqué los ácidos nucleicos precipitan en pr esencia de alcohol y

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1. Deter minar la concentr ación del ADN a cortar con la enzima de

4. Llevar 5 µL de la reacción de digestión a una electroforesis en gel de

Biól.I srael Barrantes israelbarrantes@universia.edu.pe

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