Teknik protein vol.14 no.7 pp.

505-512 2001

Determinan α- amilase pH-aktivitas pro fi les

Jens Erik Nielsen 1,2, Torben V.Borchert 3 dan Gerrit Vriend 1
1 Eropa Biologi Molekuler Laboratory (EMBL), Meyerhofstrasse 1, 69117 Heidelberg, Jerman
dan 3 Departemen Enzim Desain, Novo Nordisk A / S, Novo Alle 1, 2880 Bagsværd, Denmark
oleh tidak teratur β- domain (domain B) disisipkan di antara ketiga β- untai dan
yang ketiga α- helix dari TIM-barel. Domain C adalah motif kunci Yunani yang
terletak sekitar di sisi berlawanan dari TIM-barrel sehubungan dengan B.
domain Situs aktif terletak di lekuk pada antarmuka antara domain A dan B.

2 Untuk siapa korespondensi harus ditangani. Hadir alamat: 4222 Urey Hall, Departemen Kimia dan
Biokimia, University of California, San Diego, Mail Kode 0365, La Jolla, CA 92.093-0.365, USA.
Situs aktif terdiri dari sejumlah besar kelompok dibebankan, di antaranya
Email: jnielsen@mccammon.ucsd.edu adalah tiga asam penting untuk aktivitas katalitik. Dua ini, Asp231 dan Glu261
(penomoran sesuai dengan urutan BLA), diyakini kedua kelompok katalitik.
Asp231 adalah nukleofil katalitik, sementara bukti-bukti telah disajikan untuk
The hidrolase glikosil menyajikan sebuah keluarga besar enzim yang dari
Glu261 menjadi katalitik hidrogen donor (McCarter dan Withers, 1996;
besar signifikansi untuk industri. Akibatnya, ada minat yang cukup besar
Uitdehaag et al., 1999). Asam esensial ketiga (Asp328) diyakini untuk
dalam rekayasa enzim dalam keluarga ini untuk kinerja yang optimal di
membantu katalisis oleh ikatan hidrogen dengan substrat dan dengan
bawah berbagai kondisi yang sangat beragam. Sampai saat ini, menjahit
meninggikan p K Sebuah dari Glu261 (Klein et al., 1992; Knegtel et al., 1995;
hidrolase glikosil untuk proses industri spesifik terutama yang terlibat
Strokopytov
rekayasa stabilitas, tetapi akhir-akhir ada juga bunga mampu
mempertimbangkan- dalam rekayasa mereka pH-aktivitas pro fi les. Kami
et al., 1995; Uitdehaag et al., 1999). Reaksi katalitik diyakini terdiri dari tiga
bermutasi empat residu netral (N190, F290, N326 dan Q360) di chimeric Basil Ba2
langkah (Sinnot, 1990; McCarter dan Withers, 1994; Davies dan Henrissat,
α- amilase untuk kedua asam amino bermuatan dan netral. Hasil penelitian
1995; McCarter dan Withers, 1996) (lihat Gambar 1). Langkah pertama adalah
menunjukkan bahwa pH-aktivitas pro fi le dari Ba2 yang α- amilase dapat
protonasi oksigen glikosidik oleh donor proton (Glu261). Ini diikuti dengan
diubah dengan menyisipkan residu dibebankan dekat dengan situs aktif.
serangan nukleofilik pada C1 dari residu gula dalam posisi -1 oleh Asp231
Perubahan pH-aktivitas pro fi le untuk netral ini →
[nomenklatur seperti yang dijelaskan oleh Davies et al. ( Davies et al.,

mutasi dibebankan tidak, bagaimanapun, berkorelasi dengan prediksi

1997)]. Setelah bagian aglikon dari substrat telah meninggalkan, sebuah
dari perhitungan p K Sebuah nilai-nilai residu situs aktif. Lebih mengejutkan,
molekul air diaktifkan, mungkin dengan Glu261 sekarang de- terprotonasi.
netral → mutasi netral mengubah pH-aktivitas pro fi le sebanyak netral → mutasi
molekul air ini menghidrolisis ikatan kovalen antara oksigen nukleofil (dari
dibebankan. Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa faktor-faktor
Asp231) dan C1 dari residu gula dalam posisi -1, sehingga menyelesaikan
lain selain elektrostatika, mungkin aspek dinamis dari situs aktif, penting
siklus katalitik.
untuk bentuk pH-aktivitas pro fi les dari α- amilase.

Kata kunci: α- amilase / elektrostatika / pH-aktivitas pro fi le / p K Sebuah
perhitungan / dinamika protein
pengantar
α- Amilase digunakan dalam beberapa proses industri seperti pati pencairan,
pencucian, penghapusan pewarna dan pakan pengolahan pra
(Guzman-Maldonado dan Paredes-Lopez, 1995). Beberapa proses ini
berlangsung pada pH yang sangat berbeda dari orang-orang di mana α- amilase
tampil maksimal (Nielsen dan Borchert, 2000) dan akibatnya ada minat besar
dalam mengubah pH-kinerja pro fi le dari
α- amilase (Nielsen et al., 1999a; shaw et al., 1999) dan terkait enzim (Fang dan
Ford, 1998; Angin et al., 1998). Rekayasa pH-kegiatan pro fi les untuk enzim ini
telah terbukti sangat sulit dan dalam tulisan ini kami menyajikan eksperimen
dan perhitungan yang menunjukkan beberapa alasan untuk kesulitan-fi dif
ditemui ketika rekayasa pH-aktivitas pro fi les dari α- amilase dan enzim yang
terkait.
α- Amilase katalisis diduga dibatasi oleh tion protona- dari nukleofil pada pH
rendah dan dengan deprotonasi donor hidrogen pada pH tinggi (Qian et al., 1994;
Strokopytov
et al., 1995; Fang dan Ford, 1998). Langkah tingkat-membatasi pada pH antara
tidak diketahui. Langkah ini harus menjadi umumnya tidak tergantung dari pH
karena banyak α- amilase memiliki pH-aktivitas pro fi le dengan 'fl di atas'.
Pengikatan substrat dan pelepasan produk diharapkan untuk menjadi independen
dari pH dan karena itu telah berspekulasi bahwa langkah tingkat-membatasi
adalah baik substrat mengikat atau rilis produk pada pH menengah.
Mengubah pH-aktivitas pro fi le
Jika kita menerima asumsi bahwa α- amilase katalisis terbatas pada pH rendah
dengan protonasi nukleofil (Asp231) dan pada pH tinggi dengan deprotonasi
donor hidrogen (Glu261), maka pH-aktivitas pro fi le ditentukan oleh p K Sebuah nilai-nilai
dari dua kelompok situs aktif ini (Kyte, 1995) .Kami mempertimbangkan dua jenis
pH-kegiatan pro fi les: k kucing pro fi les dan k kucing/ K m pro fi les. Itu
k kucing pro fi le dari enzim ditentukan oleh p K Sebuah nilai-nilai kelompok situs aktif
dalam bentuk substrat terikat enzim (Kyte, 1995).

Karena substrat hadir dalam konsentrasi tinggi pada sebagian besar proses
α- amilase industri di mana α- amilase yang digunakan, itu jelas k kucing pro fi le dan bukan k kucing/
Itu α- amilase terdiri dari tiga domain yang disebut A, B dan C. Domain A K m pro fi le yang membatasi aktivitas enzim. Dalam rangka untuk mengubah k kucing pro
adalah TIM barel [( α / β) 8- barrel], yang terputus fi le, kami

© Oxford University Press 505

JENielsen, TVBorchert dan G.Vriend
Gambar. 1. mekanisme katalitik dari hidrolisis glikosil mempertahankan. ( SAYA) Protonasi oksigen
glikosidik oleh donor hidrogen (Glu261) dan serangan terhadap C1 glukosa oleh nukleofil (Asp231).
Keberangkatan dari akhir mengurangi substrat. ( II) Aktivasi dari molekul air, pembelahan C1-Asp231
ikatan kovalen. ( AKU AKU AKU) Regenerasi negara protonasi awal.
Oleh karena itu harus mengidentifikasi faktor-faktor yang menentukan p K Sebuah
nilai-nilai residu situs aktif ketika substrat terikat. Lingkungan protein tentu
penting dan meskipun tidak banyak yang diketahui tentang efek dari substrat,
itu tidak diragukan lagi juga penting, karena pergeseran α- amilase pH-aktivitas
pro fi les telah beenmeasuredwhen mengubah substrat (Keating et al.,
1998). Juga, percobaan elegan dengan circulans Bacillus
xilanase telah menunjukkan bahwa p K Sebuah nilai 'siklus' katalitik hidrogen
donor selama reaksi katalitik untuk ful fi l peran ganda sebagai donor hidrogen
dan hidrogen akseptor (McIntosh et al., 1996).
Mengubah substrat sayangnya bukan pilihan ketika mencoba untuk insinyur
pH-kinerja pro fi le dari α- amilase untuk proses industri yang spesifik dan oleh karena
itu kita dibiarkan dengan pilihan untuk mengubah enzim (dalam kasus kami dengan
mutagenesis situs-diarahkan) dan dengan cara itu mengubah p K Sebuah nilai-nilai
kelompok situs aktif dan dengan demikian k kucing pro fi le.
mengubah pK Sebuah nilai-nilai
p K Sebuah Nilai residu tergantung pada perbedaan energi bebas antara netral dan
negara-negara dibebankan dari residu dalam protein. Perbedaan energi bebas
antara kedua negara adalah dipengaruhi baik oleh efek desolvation dan
dengan biaya dan dipol dalam protein dan substrat. efek desolvation dan
interaksi dengan dipol yang pendek berkisar dan karena itu menghasilkan
residu terutama frominteractionswith di ment.Mutations environ- langsung yang
aimat mengubah p K Sebuah nilai dari kelompok titratable dengan mengubah
energi ini karenanya harus ditempatkan di sekitar kelompok titratable.
Mutasi yang memperkenalkan atau menghapus biaya unit dapat ditempatkan
jauh dari kelompok titratable, karena energi interaksi antara kelompok titratable
dan biaya satuan (yang mungkin sendiri menjadi bagian dari kelompok titratable
lain) kurang bergantung pada jarak.
Arah p diharapkan K Sebuah bergeser ketika perturbing lingkungan kelompok
titratable uncoupled diringkas dalam Gambar 2. Menggunakan angka ini, karena itu
kita dapat dengan mudah memprediksi arah dari α- amilase pH-aktivitas pro fi le
pergeseran, jika kita menganggap bahwa residu situs aktif dari α- amilase relatif
uncoupled atau jika residu dibebankan ditempatkan jauh dari situs aktif. Dengan
demikian, menempatkan muatan negatif dekat donor hidrogen akan meningkatkan p K
Sebuah dari donor hidrogen dan memberikan pergeseran mendasar dalam
ekstremitas-pH tinggi pH-aktivitas pro fi le. Menempatkan muatan positif dekat
dengan donor hidrogen akan menggeser dahan dasar pH-aktivitas pro fi le untuk
nilai lebih asam.
Mengidentifikasi faktor-faktor penentu α- amilase pH-aktivitas pro fi les
Sebelumnya (Nielsen et al., 1999a), kami membangun 15 mutan di dalam dan
sekitar lokasi aktif Bacillus licheniformis α- amilase (BLA), dalam upaya untuk
mengubah nya pH-aktivitas pro fi le. 506
mutasi pada situs aktif yang konservatif di alam andwere upaya untuk
mengubah enzim pH-aktivitas pro fi le dengan mengubah interaksi ikatan
hidrogen dan aksesibilitas pelarut dari residu situs aktif. Mutasi di luar situs
aktif yang ditujukan untuk mengubah pH-aktivitas pro fi le dengan
memperkenalkan atau menghapus biaya dan dengan cara ini perturbing p K Sebuah
nilai-nilai asam situs aktif.
Mutasi di situs aktif yang ditemukan sangat merusak terhadap aktivitas
enzim, sedangkan sebagian besar themutations lebih jauh dari dana situs aktif
tidak bicara mengubah aktivitas enzim secara signifikan, namun demikian
mereka teknya beberapa perubahan dalam pH-aktivitas pro fi le. Sayangnya,
perubahan pH-aktivitas pro fi les tidak berkorelasi dengan prediksi dari
perhitungan potensi elektrostatik, mendorong kita untuk menunjukkan bahwa
efek selain elektrostatik yang penting untuk menentukan pH-aktivitas pro fi le.
Dalam tulisan ini, kami menjelaskan bagaimana 'efek lain' memang penting
untuk menentukan pH-aktivitas pro fi le. Kami merancang mutasi di posisi empat
di sekitar lokasi aktif dari chimeric
Basil α- amilase (Ba2). enzim ini dipilih sebagai model sistem karena struktur
resolusi tinggi yang tersedia untuk kedua apo dan holo bentuk enzim ini
(Brzozowski
et al., 2000). Kami bermutasi residu netral asli pada empat posisi ke residu baik
netral dan diisi dan meneliti efek pada pH-aktivitas pro fi le.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa mutasi titik yang mungkin untuk
mengubah dinamika situs aktif dapat mengubah aktivitas pH- pro fi le. Efek
pada pH-aktivitas pro fi le dari netral → mutasi netral begitu besar bahwa efek
yang disebabkan oleh netral → mutasi dibebankan dalam penelitian ini juga
kemungkinan akan didominasi oleh perbedaan terkait dalam dinamika situs
aktif.
Bahan dan metode
mutagenesis situs-diarahkan
Metode 'MegaPrimer' untuk situs-diarahkan mutagenesis (Sarkar dan Sommer,
1990) digunakan untuk membangun sebuah fragmen DNA yang membawa
mutasi. primer mutagenik dirancang sehingga untuk memperkenalkan atau
menghapus situs yang unik pada gen yang mengkode hibrida α- amilase (Ba2).
Fragmen DNA mutan dimasukkan ke dalam Basil Ekspresi plasmid dalam
konteks Bacillus licheniformis α- amilase promotor, urutan sinyal dan terminator
transkripsi. Yang dihasilkan plasmid mutan diubah menjadi Bacillus subtilis.
koloni mutan yang diidentifikasi oleh mencerna endonuklease reaksi koloni
polymerase chain (PCR) fragmen dan fi con rmed oleh sekuensing DNA di
seluruh wilayah yang dicakup oleh primer mutagenik.
Fermentasi
Fermentasi dilakukan pada suhu 37 ° C selama 5 hari di kocok fl meminta
mengandung media kompleks terutama terdiri dari kentang fl kami, barley fl dan
makanan kedelai sukrosa (Bang et al.,
1999; Beier et al., 2000).
Protein pemurnian
Supernatan dari campuran fermentasi diisolasi oleh fl occulation dan
sentrifugasi. Selama ultra-filtrasi buffer diubah menjadi 20 mM natrium asetat,
pH 5,5. Protein kemudian diterapkan ke SP-Sepharose Hi-beban kolom
(Pharmacia). Sebuah langkah dialisis digunakan untuk mengubah buffer untuk
20 mM H 3 BO 3
5 mM KCl, pH 9,6. Fi nal langkah
puri prosedur fi kasi terdiri dari anion-exchange graphy chromatograph pada Mono-Q
Hi-beban kolom (Pharmacia). Semua persiapan protein setidaknya 95% murni seperti
yang ditunjukkan oleh SDS-PAGE.

Gambar. 2. dampak lingkungan pada p K Sebuah residu dari titratable. Pengaruh menempatkan kelompok titratable dalam lingkungan yang negatif, positif dan hidrofobik diringkas.
tes aktivitas
Kegiatan sebagai fungsi pH diukur selama rentang pH 4,0-10,5, menggunakan
Phadebas α- uji amilase kit (Pharmacia). Pengukuran dilakukan dalam rangkap
dua di 30 ° C dalam 50 mM Britton-Robinson penyangga (50 mM H 3 PO 4
50 mM CH 3 COOH 50 mM H 3 BO 3) mengandung 0,1 mM CaCl 2. The Phadebas α- uji air, karena masuknya molekul air ditemukan untuk mengurangi akurasi p K Sebuah
amilase kit didasarkan pada rilis warna biru dari substrat (pati berwarna biru) perhitungan untuk satu set tes sembilan protein (Nielsen dan Vriend, 2001).
pada belahan dada. Hidrolisis dihentikan dengan menambahkan 1/6 volume 1
M NaOH ke dalam campuran reaksi. Setelah penghapusan unhydro- pati biru
segaris dengan filtrasi, jumlah substrat terhidrolisis sebanding dengan
absorbansi pada 620 nm.
Karena substrat tidak larut (dan ditambahkan dalam ies quantit- besar),
pengukuran aktivitas diperoleh dengan metode ini dapat dianggap sebagai k kucing untuk
pati tidak larut.
tes stabilitas
Stabilitas diukur sebagai aktivitas sisa setelah inkubasi pada 30 ° C selama 15
menit. Pengukuran dilakukan pada pH 4,5,
7.0 dan 9.0 dan dilakukan dalam rangkap dua. Tak satu pun dari mutan
menunjukkan perbedaan yang terdeteksi dari stabilitas jenis Wild-.
pK Sebuah perhitungan
p K Sebuah perhitungan dilakukan dengan BAGAIMANA JIKA p K Sebuah
Perhitungan rutinitas (Nielsen dan Vriend, 2001). Rutinitas menerapkan
prosedur optimasi hidrogen-ikatan Hooft
et al. ( Hooft et al., 1996) dalam rangka untuk model masing-masing dari protonasi protein
menyatakan secara akurat. Delphi II (Nicholls dan Honig,
1991) digunakan untuk menghitung energi elektrostatik. Meter para- untuk Delphi II
ditetapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Nielsen
penentu α- amilase pH-aktivitas pro fi les
dan Vriend, 2001), yaitu protein konstanta dielektrik, 16 (untuk residu yang
berpartisipasi dalam kontak kristal, memiliki rotamer diakses alternatif atau
rata-rata B- faktor 20) atau 8 (semua
residu lainnya); kekuatan ion, 0.160 M; radius penyelidikan pelarut,
1,4 Å; dan pelarut dielektrik konstan, 80. Perhitungan dilakukan tanpa molekul
Sebuah model Ba2 di kompleks dengan Malto-nonaose dibangun dari Ba2 α-
struktur X-ray amilase-acarbose (Brzozowski et al., 2000). Beberapa perubahan
yang diperlukan untuk mengkonversi inhibitor untuk substrat dibuat
menggunakan Quanta. The CHARMm 22 parameter set digunakan sebagai
sumber biaya dan jari-jari untuk substrat dalam p K Sebuah
perhitungan.
Persiapan struktur mutan
struktur mutan untuk digunakan dalam p K Sebuah perhitungan dirancang menggunakan
BAGAIMANA JIKA posisi-spesifik perpustakaan fi c rotamer (Chinea
et al., 1995). struktur mutan diperiksa secara visual.
hasil
Kami membangun 12 mutasi titik untuk memeriksa faktor-faktor penentu
pH-aktivitas pro fi le untuk Ba2. Kegiatan semua amilase mutan dalam satu
urutan besarnya dari aktivitas-tipe liar pada pH 7,0, dengan tiga varian yang
memiliki aktivitas lebih tinggi dari tipe liar. Alat tes stabilitas menunjukkan
bahwa stabilitas pH-tergantung dari mutan tidak bisa dibedakan dari yang dari
tipe liar. Hasilnya dirangkum dalam Tabel I.
507
JENielsen, TVBorchert dan G.Vriend

tidak membentuk ikatan hidrogen untuk setiap residu lainnya, kecuali bahwa yang NH 2 Kelompok
Tabel I. Kegiatan yang spesifik dari mutasi titik Ba2 pada pH 7,0 yang diukur dengan alat tes
menunjuk ke Tyr193 dan kemungkinan besar berinteraksi dengan
Phadebas
π- elektron dari cincin aromatik. Distribusi rotamer untuk Asp dan Lys di posisi ini
Mutan aktivitas relatif (%) mengungkapkan bahwa Asp dan Lys rantai samping akan kemungkinan besar titik dalam
arah yang sama dengan rantai samping Asn, sehingga menyebabkan hampir tidak ada
N190D 35,72
perubahan dalam struktur lokal. Interaksi yang tidak menguntungkan dari rantai samping
N190K 38.0
Asp dengan π- elektron dari Tyr193, bagaimanapun, mungkin menyebabkan beberapa
N190G 38.0
F290E 125 penyusunan ulang.
F290K 75,3
F290A 152 PH-aktivitas pro fi les dari N190D, N190K dan N190G tidak menunjukkan perubahan
N326D 43,4
tidak bisa fi signifikan dibandingkan dengan tipe liar aktivitas pH- pro fi le (Gambar 4a).
N326A 49.0
N326L 20,0
Q360E 242 F290K / A / E
Q360K 61,0
Q360A 70.0 F290 terletak di α- helix yang terletak di antara β- untai 6 dan α- helix 6 dari
TIM-barel. Ini 'di antara' α- helix bukan merupakan bagian dari klasik TIM-barel.
Phe290 duduk di sebelah His289, yang ikatan hidrogen untuk Ser337. Ser337
diposisikan dalam lingkaran yang mencakup situs aktif dan mutasi untuk hasil
glisin protein dengan 2% dari kegiatan-tipe liar pada pH 7,0, sehingga
mengisyaratkan pada peran penting yang dimainkan oleh ikatan hidrogen
antara Ser337 dan His289.

PH-aktivitas pro fi les untuk F290K, F290E dan F290A ditunjukkan pada
Gambar 4b. Kedua F290E dan F290A lebih aktif daripada tipe liar dan kedua
enzim jauh lebih aktif pada pH dasar daripada mereka seandainya mereka
punya aktivitas pH- pro fi le berbentuk sebagai protein tipe liar. F290K sedikit
kurang aktif daripada tipe liar, namun pH-aktivitas pro fi le juga telah bergeser
sedikit ke nilai-nilai pH yang lebih mendasar.

N326L / A / D
Gambar. 3. Posisi mutasi titik di Ba2. Domain A, hijau; domain B, cyan; domain C, abu-abu terang.
Ion-ion kalsium ditampilkan sebagai bola merah dan ion natrium ditunjukkan sebagai suatu lingkup
Asn326 duduk dalam lingkaran yang mencakup situs aktif dan cukup dekat
oranye. nonaose substrat yang digunakan dalam p K Sebuah perhitungan ditunjukkan dengan warna dengan Asp328 (Tabel I). Berdasarkan distribusi rotamer fi c posisi-spesifik
kuning. Asam situs aktif Asp231, Glu261 dan Asp328 ditampilkan dalam warna merah. dan analisis benjolan, itu menilai bahwa bukan sebuah lisin atau arginin dapat
ditampung pada posisi ini. Selanjutnya, distribusi rotamer untuk leusin memberi
hanya dua hit pada posisi ini, meskipun inspeksi visual menyarankan bahwa
penyesuaian hanya kecil dalam struktur lokal yang diperlukan untuk
Tabel II. Jarak dari residu bermutasi ke asam situs aktif
mengakomodasi mutasi ini.
Residu / atom jarak jarak jarak
Asp231 C γ ( SEBUAH) Glu261 C δ ( SEBUAH) Asp328 C γ ( SEBUAH) PH-aktivitas pro fi le dari N326A hampir identik dengan tipe liar (Gambar 4c),
meskipun mutan hanya memiliki ~ 60% dari aktivitas-tipe liar pada pH 7,0.
Asn190 C γ 17,5 15,6 17.2
Phe290 C γ 18.3 13.0 12.4
N326D memiliki aktivitas yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan tipe liar
Asn326 C γ 13.1 12,6 7.1 pada pH dasar, yang sesuai dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya oleh
Gln360 C δ 13.2 11.0 11.3 Takase (1993).

PH-aktivitas pro fi le dari N326L telah kehilangan puncak karakteristik sekitar pH

5,5 dan telah menjadi hampir sepenuhnya fl di. Selanjutnya, anggota tubuh dasar dari
Mutasi berkerumun di posisi empat, yaitu N190, F290, N326 dan Q360
pH-aktivitas pro fi le digeser sedikit ke arah nilai-nilai pH yang lebih mendasar.
(Gambar 3). Situs untuk mutasi dipilih cukup dekat dengan situs aktif agar
mutasi memiliki efek yang signifikan pada p K Sebuah nilai-nilai asam situs aktif
(Tabel II). Juga, kita diperlukan bahwa residu jenis Wild- pada posisi harus Q360K / A / E

netral. Hal ini diperlukan agar mampu membangun netral → mutasi netral.
Visual inspeksi dan BAGAIMANA JIKA ini (Vriend, 1990) struktur modul
analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa mutasi bisa dilakukan di posisi ini
tanpa perturbing struktur lokal secara signifikan. The jelas k kucing pro fi les untuk
jenis Wild- dan mutan diukur dengan uji Phadebas. Ini k kucing pro fi les akan
disebut sebagai 'pH-aktivitas pro fi les' berikut ini.
Mutan Q360A dan Q360K (Gambar 4d) memiliki ~ 50% dari aktivitas-jenis liar
dan mereka pH-aktivitas pro fi les yang sangat mirip dengan yang ada pada
tipe liar. Q360E, di sisi lain, lebih dari dua kali aktif sebagai tipe liar pada pH
6.0 dan memiliki pH-aktivitas pro fi le yang jauh lebih berbentuk lonceng dari
tipe liar pro fi le.
pK Sebuah perhitungan

p K Sebuah perhitungan dilakukan seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan

metode bagian. Kurva titrasi untuk residu situs aktif sebagian besar tidak teratur
dan tidak mengikuti klasik Henderson-Hasselbalch bentuk (Gambar 5). Oleh
N190D / K / G karena itu tidak mungkin untuk menentukan ap K Sebuah nilai untuk salah satu
N190 diposisikan di domain B di giliran yang menunjuk ke tepi substrat residu situs aktif. Sebaliknya, kami telah memberikan penjelasan kualitatif

mengikat sumbing (Gambar 3). Residu 508


Gambar. 4. pH-aktivitas pro fi les untuk wt Ba2 dan mutan. ( Sebuah) wt, N190K, N190G dan N190D; ( b) wt, F290E, F290K dan F290A; ( c) wt, N326L, N326A dan N326D; ( d) wt, Q360K, Q360A dan Q360E.
perbedaan dalam kurva titrasi. Kurva titrasi rinci untuk residu situs aktif dalam
semua struktur mutan dapat ditemukan di
http://www.cmbi.kun.nl/gv/nielsen/amylase/pKa/.
Wild-jenis pK Sebuah perhitungan p K Sebuah perhitungan dilakukan untuk kedua apo
dan holo bentuk enzim. Dalam bentuk apo, Glu261 dan Asp328 membentuk
sistem ketat ditambah yang menitrasinya kira-kira satu kelompok (maka osilasi
besar di kurva titrasi untuk dua residu ini) dengan ap K Sebuah nilai ~ 10,
sedangkan menitrasinya Asp231 dengan p jelas K Sebuah dari ~ 2. Hal ini terkait
cukup baik dengan mendirikan pandangan α- amilase katalitik mechanismwith
Glu261 menjadi donor hidrogen dan Asp231 menjadi nukleofil. Dalam
perhitungan dengan substrat, bagaimanapun, kurva titrasi untuk Asp231
menjadi biphasic dengan jelas p K Sebuah nilai-nilai ~ 4 dan 7, sedangkan Glu261
tetap bermuatan negatif atas seluruh rentang pH. Asp328 diperkirakan memiliki
ap K Sebuah nilai ~ 8. Perhitungan untuk bentuk holo sehingga menunjukkan
bahwa Asp328 adalah donor hidrogen. Hal ini, bagaimanapun, tidak jelas
bagaimana diandalkan perhitungan untuk bentuk holo adalah sebagai
koordinat untuk bentuk holo kompleks yang berasal dari enzim-inhibitor
kompleks daripada dari kompleks enzim-substrat.
pK Sebuah perhitungan untuk mutan
p K Sebuah perhitungan untuk mutan dilakukan dengan struktur holo enzim untuk
memberikan p K Sebuah pergeseran untuk
penentu α- amilase pH-aktivitas pro fi les
Asam situs aktif ketika substrat terikat. The gangguan dalam kurva titrasi untuk
residu situs aktif yang cukup kecil untuk semua mutasi dari Asn190 dan
Phe290. Hal ini sesuai sempurna dengan hasil eksperimen untuk mutasi pada
posisi 190, tetapi tidak berkorelasi dengan hasil untuk mutasi pada posisi 290.
Perubahan diamati untuk mutasi dari Asn326 dan Gln360. Perubahan ini
dijelaskan lebih rinci di bawah.
N326D / A / L
Perhitungan untuk N326A menunjukkan pergeseran ke atas dalam p K Sebuah
nilai His327 dan pergeseran ke bawah dalam p K Sebuah nilai Asp328. Perhitungan
untuk N326L menunjukkan pergeseran ke atas sedikit dalam p K Sebuah nilai Asp328
dan pergeseran ke atas lebih kecil dalam p K Sebuah nilai Glu261. The N326D p K Sebuah perhitungan
memprediksi bahwa p K Sebuah nilai-nilai Asp231, His327, Asp328 dan peningkatan
Glu261.
Q306A / E / K
p K Sebuah perhitungan untuk mutan di posisi 360 memprediksi bahwa p K Sebuah nilai
Asp231 menjadi meningkat pada semua tiga mutasi. Dalam kasus Q360A dan
Q360K, pergeseran yang sangat besar, sedangkan pergeseran yang lebih kecil
terlihat untuk Q360E. p K Sebuah
nilai-nilai His327 dan Asp328 diperkirakan menjadi sedikit lebih rendah untuk Q360A.
Perhitungan untuk Q360K memprediksi bahwa p K Sebuah nilai untuk His327 dan Asp328
peningkatan.
509
JENielsen, TVBorchert dan G.Vriend
Gambar. 5. kurva titrasi dihitung dari tiga asam situs aktif Asp231, Glu261 dan Asp328 dalam apo-bentuk dan dalam holo-bentuk enzim. Asp231, merah; Glu261, magenta; Asp328, hijau.
Korelasi dari pK dihitung Sebuah bergeser dengan eksperimen
diamati pH-aktivitas pro fi le pergeseran
Besar dan arah dari pH-aktivitas pro fi le pergeseran untuk mutan Ba2 tidak
direproduksi oleh p K Sebuah perhitungan. Hal ini paling jelas terlihat ketika
membandingkan perhitungan dengan hasil eksperimen untuk F290A dan
N326A. F290A memberikan pergeseran terbesar di pH-aktivitas pro fi le, tapi p K
Sebuah
perhitungan menghasilkan perubahan fi kan insigni di situs aktif p K Sebuah nilai
untuk mutasi ini. Dalam kasus N326A, p K Sebuah
perhitungan menunjukkan fi kan gangguan signifikan dari p K Sebuah nilai-nilai
Asp328 dan His327, tetapi pH-aktivitas pro fi le untuk mutan ini hampir identik
dengan tipe liar.
Perhitungan untuk mutasi yang memperkenalkan biaya juga tidak berkorelasi
dengan baik dengan eksperimental pro fi le pergeseran pH-aktivitas dan ini
sangat menunjukkan bahwa jarak elektrostatik yang kurang penting untuk
pH-aktivitas pro fi le dari α- amilase dari yang diperkirakan sebelumnya.
Diskusi
Efek yang paling menonjol pada pH-aktivitas pro fi le untuk netral → mutasi
netral terlihat untuk F290A. Fenilalanin dan alanin memiliki ukuran yang
berbeda dan karena itu efek yang besar terlihat untuk mutasi ini tidak
mengejutkan. Cincin imidazol dari His289 kemasan terhadap cincin aromatik
dari Phe290 dalam struktur tipe liar dan menghapus cincin aromatik dari Phe
290 (dengan mutasi F290A) membuat His289 lebih pelarut diakses.
Aksesibilitas pelarut tinggi perubahan p K Sebuah
dari His289 sedikit (0,1 satuan dalam p K Sebuah perhitungan) dan dengan cara ini
F290A mutasi mengubah elektrostatik lapangan dalam protein. Perubahan di
bidang listrik ini tidak bisa, bagaimanapun, bertanggung jawab untuk perubahan
yang diamati pada pH-aktivitas pro fi le, karena kedua F290E dan mutasi F290K
harus mengubah fi elektrostatik lapangan bahkan lebih dari F290A. sehingga
mereka harus menghasilkan pH-aktivitas pro fi les yang bahkan lebih 510
berbeda dengan tipe liar pro fi le daripada pH-aktivitas pro fi le dari F290A. Hal
ini, bagaimanapun, jelas tidak terjadi dan perubahan pH-aktivitas pro fi le yang
disebabkan oleh F290A karena itu harus berasal efek selain elektrostatika
seperti diuraikan di bawah.
The His289-Ser337 ikatan hidrogen
ikatan hidrogen His289 untuk Ser337 dan perubahan dalam p K Sebuah,
dan mungkin dalam dinamika His289, kemungkinan akan mempengaruhi
kekuatan ini membentuk ikatan hidrogen. Ser337 terletak di sebuah loop yang
mencakup situs aktif dan karena itu kemungkinan bahwa perubahan dalam
ikatan hidrogen Ser337-His289 dapat mempengaruhi dinamika situs aktif.
Ikatan hidrogen antara His289 dan Ser337 dikenal menjadi penting, karena
mutasi Ser337 untuk glisin menghasilkan enzim dengan aktivitas pengurangan
50 kali lipat (JENielsen, G.Vriend dan
TVBorchert, hasil tidak dipublikasikan). Alasan untuk perbedaan antara p K Sebuah
perhitungan dan percobaan untuk mutan F290K dan F290E sekarang menjadi
jelas, karena mutasi ini juga cenderung untuk mengubah pelarut aksesibilitas
dan dinamika His289. Kegiatan pH- pro fi le karena pergeseran yang
dihasilkan dari dua mutasi ini adalah efek gabungan dari biaya dan perubahan
mobilitas His289 yang disebabkan oleh mutasi. p K Sebuah perhitungan tidak
berusaha untuk model efek tersebut dan karena itu tidak dapat mereproduksi
pH-aktivitas pro fi le shift.
Asn326
Takase dibangun N326D mutasi (Takase, 1993) di
Bacillus stearothermophilus α- amilase dan melaporkan pergeseran ke bawah
sama di pH-aktivitas pro fi le seperti yang kita. Pergeseran ini tidak mudah
dijelaskan dan mungkin karena perubahan mobilitas. netral → mutasi netral dalam
posisi ini (N326A dan N326L) keduanya cenderung di memengaruhi dinamika
situs aktif, tetapi hanya N326L menunjukkan perubahan yang signifikan dalam
pH-aktivitas pro fi le.
 penentu α- amilase pH-aktivitas pro fi les

Gambar. 6. Sebuah contoh dari efek mutasi titik dibebankan pada sistem Glu-Asp hipotetis. Hal ini terlihat bahwa aturan prediksi sederhana pada Gambar 2 istirahat turun ketika sistem kelompok titratable
Sangat digabungkan. Energi interaksi elektrostatik antara kelompok titratable sesuai kira-kira dengan energi interaksi dihitung antara Glu261, Asp328 dan Lys 234 di Ba2. ( Sebuah) Skema representasi dari
sistem Glu-Asp. p K Sebuah masing-masing residu tanpa adanya yang lain adalah 3,5 (intrinsik p K Sebuah Gambar tersebut). Energi interaksi antara kedua kelompok adalah 3,0 ln (10) kT ( 298,15 K). ( b)

Skema representasi dari sistem Glu-Asp-Lys. Energi interaksi antara Asp dan Glu adalah sama seperti pada (a). Energi interaksi dengan Lys dua kali lebih besar untuk Asp seperti untuk Glu. ( c) Kurva titrasi
untuk sistem Asp-Glu menunjukkan bahwa Asp dan Glu memiliki kurva titrasi identik. ( d) Kurva titrasi untuk sistem Asp-Glu-Lys menunjukkan bahwa kurva titrasi dari Asp digeser ke nilai pH lebih asam (
p lebih rendah K Sebuah),

sedangkan kurva titrasi dari Glu digeser ke lebih nilai pH dasar (p lebih tinggi K Sebuah), dengan demikian menentang aturan ditentukan dalam Gambar 2.

Gln360
Mutasi pada posisi 360 yang luar biasa dalam bahwa Q360E memiliki dampak
besar pada pH-aktivitas pro fi le, sedangkan mutasi Q360K dan Q360A, yang
diharapkan untuk mengubah dinamika enzim lebih dari Q360E, memiliki jenis
Wild- pH-aktivitas pro fi les . Hal ini menunjukkan bahwa efek dari Q360E
adalah murni elektrostatik, meskipun sulit untuk bawah- berdiri mengapa
Q360K tidak memiliki efek yang sama besar pada pH-aktivitas pro fi le.
menunjukkan bahwa efek berlawanan memang bisa dicapai bila sistem
kelompok titratable ketat ditambah adalah terganggu. Fenomena ini
diilustrasikan pada Gambar 6, di mana aturan Gambar 2 ditunjukkan untuk
memecah untuk sistem Asp-Glu seperti dua asam katalitik di α- amilase. Oleh
karena itu penting dalam banyak kasus untuk menggunakan p K Sebuah perhitungan
untuk memprediksi efek mutasi titik dikenakan pada p K Sebuah nilai dalam situs
aktif.

Pengaruh memperkenalkan mutasi titik pada sistem ketat ditambah
kelompok titratable
Dalam membangun mutasi titik dalam BLA dan BA2 kami telah diam-diam
mengasumsikan bahwa efek dari memasukkan kelompok titratable dekat lokasi aktif
dapat diprediksi dengan menggunakan aturan mapan yang dirangkum dalam Gambar 2.
p The K Sebuah perhitungan untuk Q360K menunjukkan bahwa hal ini tidak selalu terjadi,
seperti p K Sebuah
dari Asp328 dihitung meningkat ketika Gln360 bermutasi ke lisin a. Ini jelas
bukan apa yang diharapkan dan
Kesimpulan
Kami telah menunjukkan bahwa perubahan yang signifikan dalam aktivitas kegiatan
pH- pro fi les dari Basil α- amilase memang bisa dicapai dengan menggunakan
mutagenesis situs-diarahkan. Pergeseran dalam pH-aktivitas pro fi les untuk mutan
tidak setuju dengan perubahan dihitung dalam elektrostatika situs aktif.
Kami berspekulasi bahwa perubahan dalam dinamika residu situs aktif
setidaknya sama penting bagi pH-aktivitas pro fi le sebagai perubahan dalam
elektrostatika situs aktif yang disebabkan oleh pengenalan residu dibebankan.
Hal ini dikuatkan oleh

511
JENielsen, TVBorchert dan G.Vriend
mutasi F290A dan N326L, yang mengubah aktivitas pH- pro fi le tanpa
mengubah muatan bersih pada themolecule. Ini berarti bahwa p K Sebuah nilai-nilai
residu aktif dapat diubah secara signifikan dengan mengubah dinamika situs
aktif dan dengan demikian menyarankan pendekatan alternatif untuk rekayasa
pH-kegiatan pro fi les.
Penjelasan rinci tentang efek netral → mutasi netral sulit, karena kita tidak
tahu gerakan yang penting untuk aktivitas katalitik dari α- amilase. Sangat
mungkin bahwa sangat akurat dan panjang dinamika molekul (MD) simulasi
dapat memberikan wawasan ke dalam ini, tetapi dalam pandangan dari hari ini
MD memaksa medan dan kecepatan komputer, ini bukan solusi yang layak. p K Sebuah
metode perhitungan yang kita gunakan tidak model mobilitas atom berat dan p K Sebuah
pergeseran yang disebabkan oleh perubahan mobilitas dapat karena itu tidak
direproduksi dalam perhitungan. Selain itu, kami mungkin telah meremehkan
nilai dari konstanta dielektrik dalam situs aktif dalam perhitungan kami.
Mempekerjakan konstanta dielektrik yang lebih tinggi dalam p K Sebuah
perhitungan akan mengurangi besarnya pergeseran dihitung dalam kurva titrasi,
tetapi tidak mungkin bahwa hal itu akan memberikan perjanjian kualitatif yang
lebih baik dengan data eksperimen.
p K Sebuah perhitungan juga menunjukkan bahwa α- amilase situs aktif adalah
sistem sangat terhubung dari kelompok titratable. Contoh dengan sistem Asp-Glu
kuat ditambah diberikan pada Gambar 6 menunjukkan bahwa efek dari
memasukkan kelompok titratable tidak selalu dapat diprediksi dengan
menggunakan skema sederhana dari Gambar 2. Jika situasinya tepat, seseorang
dapat mengamati kebalikan dari apa yang diperkirakan. Kami berspekulasi
bahwa pergeseran ke arah 'salah' terlihat untuk beberapa mutan dalam hal ini
dan dalam studi sebelumnya (Nielsen et al.,
1999a) bisa sebagian karena efek seperti itu. Tampaknya lebih mungkin,
meskipun, bahwa perubahan pH-aktivitas pro fi les hasil terutama dari
perubahan dalam dinamika situs aktif.
Temuan-temuan dari stres penelitian ini titik yang dinamika adalah bagian
penting dari setiap enzim dan rekayasa rasional aktivitas enzim lebih mungkin
berhasil jika penjelasan rinci tentang mobilitas enzim tersedia ketika
merancang mutasi titik.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis terima Vibeke Holbo bantuan dengan konstruksi dan pemurnian protein mutan, Jytte piil
untuk menyediakan dimurnikan tipe liar protein dan Rebecca Wade, Barry Honig dan Lawrence
McIntosh untuk merangsang diskusi.
Referensi
Bang, ML, Villadsen, aku. dan Sandal, T. (1999) Kloning dan karakterisasi
dari endo-beta-1,3 (4) glukanase dan protease aspartat dari Phaf fi rhodozyma sebuah CBS 6938.
Appl. Microbiol Biotechnol., 51, 215-222. Beier, L., Svendsen, A., Andersen, C., Frandsen, TP,
Borchert, TV dan
Cherry, JR (2000) Konversi dari maltogenic alpha-amilase Novamyl menjadi CGTase. Protein
Eng., 13, 509-513.
Brzozowski, AM, Lawson, DM, Turkenburg, JP, Bisgaard-Frantzen, H.,
Svendsen, A., Borchert, TV, Dauter, Z., Wilson, KS dan Davies, GJ (2000) analisis struktural dari
bakteri chimeric α- amilase. analisis resolusi tinggi asli dan ligan kompleks. Biokimia, 39, 9099-9107.
Chinea, G., Padron, G., Hooft, RWW, Sander, C. dan Vriend, G. (1995) Penggunaan
posisi-spesifik rotamers fi c di model bangunan oleh homologi. protein, 23,
415-421.
Davies, GJ dan Henrissat, H. (1995) Struktur dan mekanisme glikosil
hidrolase. Struktur, 3, 853-859.
Davies, GJ, Wilson, KS dan Henrissat, B. (1997) Nomenklatur untuk gula-
mengikat subsites di hidrolase glikosil. Biochem. J., 321, 557-559. Fang, TY dan Ford, C. (1998)
rekayasa Protein dari Aspergillus Awamori
glukoamilase untuk meningkatkan optimum pH-nya. Protein Eng., 11, 383-388.
512
Guzman-Maldano, H. dan Paredes-Lopez, O. (1995) enzim amilolitik dan
produk yang berasal dari pati; review. Crit. Rev. Food. Nutr., 36, 373-403. Hooft, RW, Sander, C.
dan Vriend, G. (1996). atom posisi hidrogen dengan
mengoptimalkan jaringan ikatan hidrogen dalam struktur protein. protein, 26,
363-376.
Keating, L., Kelly, C. dan Fogarty, W. (1998). Mekanisme aksi dan
perubahan pH maksimum substrat tergantung dari α- amilase dari Bacillus coagulans. Carbohydr.
Res., 309, 311-318. Klein, C., Hollender, J., Bender, H. dan Schulz, GE (1992) pusat Catalytic dari
Glycosyltransferase siklodekstrin berasal dari analisis struktur X-ray dikombinasikan dengan
mutagenesis situs-diarahkan. Biokimia, 31, 8740-8746. Knegtel, RM, Strokopytov, B., Penninga, D.,
Faber, OG, Rozeboom, HJ,
Kalk, KH, Dijkhuizen, L. dan Dijkstra, BW (1995) studi Kristalografi dari interaksi siklodekstrin
Glycosyltransferase dari circulans Bacillus
saring 251 dengan substrat alami dan produk. J. Biol. Chem., 270,
29.256-29.264. Kyte, J. (1995) Mekanisme Protein Kimia. Garland Publishing, New
York, pp. 258-283.
McCarter, JD dan Withers, SG (1994) Mekanisme glikosida enzimatik
hidrolisis. Curr. Opin. Struct. Biol., 4, 885-892. McCarter, JD dan Withers, SG (1996) Tegas
identifikasi dari Asp-214
sebagai nukleofil katalitik Saccharomyces cerevisiae α- glukosidase menggunakan 5-fl uoro glikosil
fl uorides. J. Biol. Chem., 271, 6889-6894. McIntosh, LP, Tangan, G., Johnson, PE, Joshi, MD,
Korner, M., Plesniak, LA,
Ziser, L., Wakarchuk, WW dan Withers, SG (1996) p K Sebuah asam / basa gugus karboksil umum
dari siklus glikosidase selama katalisis: a 13CNMR studi circulans Bacillus xilanase. Biokimia, 35, 9958-9966.
Nicholls, A. dan Honig, B. (1991) Sebuah algoritma yang cepat fi nite perbedaan, memanfaatkan
berturut-turut selama-relaksasi untuk memecahkan persamaan Poisson-Boltzmann. J. Comput. Chem., 12,
435-445.
Nielsen, JE dan Borchert, TV (2000) rekayasa Protein dari bakteri α-
amilase. Biochim. Biophys. Acta, 1543, 253-274. Nielsen, JE dan Vriend, G. (2001)
Mengoptimalkan jaringan hidrogen obligasi di
persamaan Poisson-Boltzmann berdasarkan p K Sebuah perhitungan. protein, 43, 403-412. Nielsen, JE,
Beier, L., Otzen, D., Borchert, TV, Frantzen, HB, Andersen, KV
dan Svendsen, A. (1999a) Elektrostatik di situs aktif dari α- amilase.
Eur. J. Biochem., 264, 816-824.
Qian, M., Haser, R., Buisson, G., Duee, E. dan Payan, F. (1994) Pusat aktif
dari mamalia sebuah α- amilase. Struktur kompleks pankreas sebuah
α- amilase dengan karbohidrat inhibitor ulang didefinisikan resolusi 2.2-Å.
Biokimia, 33, 6284-6294.
Sarkar, G. dan Sommer, SS (1990). The 'megaprimer' metode situs-diarahkan
mutagenesis. Biotechniques, 8, 404-407. Shaw, A., Bott, R. dan Hari, AG rekayasa (1999) Protein
dari α- amilase untuk
kinerja pH rendah. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 349-352. Sinnot, ML (1990) mekanisme Catalytic
transfer glikosil enzimatik. Chem.
Putaran., 90, 1171-1202.
Strokopytov, B., Penninga, D., Rozeboom, HJ, Kalk, KH, Dijkhuizen, L. dan
Dijkstra, BW (1995) struktur X-ray dari siklodekstrin Glycosyltransferase kompleks dengan
acarbose. Implikasi untuk mekanisme katalitik dari glycosidases. Biokimia, 34, 2234-2240. Takase, K.
(1993) Pengaruh mutasi dari residu asam amino dekat katalitik yang
situs pada aktivitas Bacillus stearothermophilus alpha-amilase. Eur. J. Biochem., 211, 899-902.
Uitdehaag, JC, Mosi, R., Kalk, KH, van der Veen, BA, Dijkhuizen, L.,
Withers, SG dan Dijkstra, BW (1999) struktur X-ray di sepanjang jalur reaksi siklodekstrin
Glycosyltransferase menjelaskan katalisis di
α- amilase keluarga. Nature Struct. Biol., 6, 432-436. Vriend, G. (1990) BAGAIMANA JIKA: a
pemodelan molekul dan program desain obat.
J. Mol. grafis, 8, 52-56.
Angin, RD, Uitdehaag, JC, Buitelaar, RM, Dijkstra, BW dan Dijkhuizen, L.
(1998) Teknik produk siklodekstrin spesifik kota fi dan optima pH
termostabil siklodekstrin Glycosyltransferase dari Thermo-
anaerobacterium thermosulfurigenes EM1. J. Biol. Chem., 273, 5771-5779.
Menerima September 25, 2000; direvisi April 24, 2001; diterima 14 Mei 2001