Prof. Dr.

Marcelo Galindo Lahoud 1

• CROMATOGRAFIA é um poderoso método (grupo
de métodos) de SEPARAÇÃO e IDENTIFICAÇÃO –
possibilita aos cientistas separar componentes muito
semelhantes de misturas complexas.

Até meados do século XX: precipitação, destilação e

extração.

Componentes de uma amostra podem ser analisados

QUALITATIVA e/ou QUANTITATIVAMENTE.

Atualmente: diversas linhas de pesquisa e vários

prêmios Nobel.
2
 O que é ?
• Técnica para separação ou/e identificação de uma mistura de componentes por
meio de migração diferencial - devido a diferentes interações entre duas fases
imiscíveis.
 Uma das fases permanece
estacionária (FE) (com grande
área superficial).
 Enquanto a outra fase se move
através da fase estacionaria,
denominada então de fase móvel
(FM).
A cromatografia (do grego
χρώμα:chroma, cor e
γραφειν:"grafein", grafia)

3
 ANÁLISE QUÍMICA DE MISTURAS COMPLEXAS

Cromatografia é um método físico-químico de separação

dos componentes de uma mistura, através da distribuíção
destes componentes entre duas fases.

4
Uma fase permanece estacionária e a outra move-se sobre
a ela (fase móvel).

Durante este processo, os componentes da mistura se

distribui entre as duas fases.

5
 HISTÓRICO
Prêmio Nobel de Química

Época moderna,
CaCO3 e éter de
6
petróleo
 HISTÓRICO

A cromatografia (do grego

χρώμα:chroma, cor e
γραφειν:"grafein", grafia)

Época moderna,
CaCO3 e éter de
7
petróleo
 HISTÓRICO

Separa e identifica as xantofilas da gema do ovo!!

‘’Época moderna’’, repete Experimento de Tswett

com CaCO3 pulverizado (FE) e éter de petróleo 8
(FM).
 HISTÓRICO
Prêmio Nobel de Química

Publicaram a teoria
da cromatografia por
partição.

Época moderna,
CaCO3 e éter de
9
petróleo
 HISTÓRICO

Publicaram a teoria
da cromatografia por
partição.

Época moderna,
CaCO3 e éter de
10
petróleo
 Desenvolvimento do método

sensibilidade, velocidade, exatidão e
simplicidade para separação, identificação
e determinação de substâncias

11
ELUIÇÃO = migração dos analitos através do leito de fase
estacionária, pela passagem da fase móvel
↓
Quanto mais fortemente um componente é preso pela fase
estacionária, mais alta é a porcentagem das moléculas daquele
componente que nela ficam retidas provocando um
retardamento na migração das mesmas.
Um segundo componente menos retido na fase móvel terá uma
porcentagem mais alta de moléculas na fase móvel em relação
ao primeiro componente.

ELUENTE = fluído que passa através da fase estacionária (↔

fase móvel).
Eluato = fluído que sai após atravessar a fase estacionária. 12
Uma amostra pode ser sólida, líquida, gasosa ou uma
mistura de estados físicos.

 Analito – substâncias ou espécies químicas que se deseja

caracterizar ou determinar quantitativamente.
 Interferentes – substâncias que afetam diretamente o
resultado da análise dos analitos.
 Solvente ou diluente – fluido adicionado ao sistema para
dissolver o analito, auxiliando na sua separação do
restante da amostra ou na mobilização em etapas do
processo para sua caracterização.

13
 ELUIÇÃO

O conjunto das moléculas do componente que está menos
fortemente preso se moverá através do sistema (direção do
fluxo) a uma velocidade mais alta que o outro, resultando em
uma migração dos componentes em regiões separadas da fase
estacionária.

CROMATOGRAFIA =
SEPARAÇÃO de componentes de uma mistura

14
15
CLASSIFICAÇÃO

As técnicas cromatográficas podem ser classificadas de

diferentes formas:

-Suporte da fase estacionária

- Natureza das fases

-Fluxo da fase móvel

-Tipo de interação

-Pressão 16
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

 Suporte da fase estacionária

Planar:
em camada delgada (CCD)
em papel (CP)
Coluna:
 Diâmetro da Coluna → Preparativas (6 – 50 mm)
Analíticas (2 – 6 mm)
Microdiâmetros (1 – 2 mm)
Capilares (< 1 mm)

17
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

 Natureza das fases

CROMATOGRAFIA Fase móvel Fase estacionária TIPO

líquido gás-líquido
Gasosa (CG) gás
sólido gás-sólido
líquido líquido-líquido
Líquida (CL) líquido
sólido líquido-sólido
Fluído líquido
Supercrítica (CS)
supercrítico sólido

18
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

 Fluxo da fase móvel

unidimensional
bidimensional
radial (equipamento: cromatroton)

19
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

 Natureza da fase móvel (CL)

fase Normal →
A FE é polar e a FM é apolar

fase Reversa → A FE é apolar e a FM é polar.

20
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

Tipo de interação (fenômeno responsável pela

separação)
 adsorção
 partição
 exclusão (filtração e permeação em gel)
 complexação (troca íons)
 afinidade
 imunoafinidade (CIA)
 bioafinidade

21
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

Pressão (CC – necessária para o deslocamento da

fase móvel)
 Normal (gravidade)
 alta pressão (CLAE)

22
CLASSIFICAÇÃO – Processos cromatográficos

Objetivo da separação
 analítica (identificação)
 preparativa (isolar uma parte da amostra ou componente
puro)
 extrativa ou pré-tratamento de amostra (extração por fase
sólida – EFS)

23
 Tipo de
Cromato-
grafia
Técnica

FM
24
FE
 Atração por Van der Waals ou Coulôbicas,
incluindo formação de Lig. de H.
ADSORÇÃO:

Soluto retido na
superfície da FE (devido
grupos ativos).

A dessorção do soluto pode ocorrer por volatilidade (CG) ou solubilidade na fase

móvel (CL)

Ex: CCD e CG

25
ABSORÇÃO (ou PARTIÇÃO):
• Os solutos são separados com base na partição entre a FM líquida e uma FE
revestida em um suporte sólido  FE é líquida e imiscível a FM

• Antigamente usava-se coluna com a FE adsorvida ao suporte, no entanto, colunas

mais modernas a FE estão ligadas quimicamente ao suporte (geralmente sílica).

FM separa devido
solubilidade (líquida) ou as Ex: Cromatografia em Papel ou HPLC
vezes volatilidade (gasosa)

Grupo silanol organoclorossilano siloxano

26
TROCA IÔNICA:
Solutos são separados por sua adsorção a um suporte contendo cargas
fixas na superfície.

Trocador de cátions - grupo com carga

negativa  separa íons positivos.
FE
Trocador de ânions - grupo com carga
positiva  separa íons negativos.
27
BIOAFINIDADE:
Grupos com especificidade biológica, quimicamente ligados a um suporte
(FE), podem retirar da FM apenas compostos com bioafinidade (Ex:
Substrato-Enzima).

28
POR EXCLUSÃO:
• A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

• Coluna: matéria inerte  poros com tamanho controlado  moléculas menores

penetram a maioria dos poros.

Aplicação: Estimar massa

molecular de proteínas,
separação de biomoléculas,
remover solutos pequenos de
grandes agentes, como proteínas. Processo puramente mecânico! 29
 dm = distância percorrida pela fase
móvel.
dr = distância percorrida pelo
componente.

Normalmente é interrompida antes

da FM atingir o outro lado da
superfície planar.

RF = dr / dm, onde RF é o fator de

dr1
retenção

dr2 Comparações do valor de RF da

amostra com o de um padrão é o
método qualitativo mais usado na
cromatografia planar.

30
 Cromatograma típico por cromatografia em coluna.

Pode ser dado em unidade de tempo ou volume

tR ou VR= Tempo ou volume percorrida desde o instante da injeção da amostra no
sistema cromatográfico até o máximo do pico traçado.
tM ou vM= desde o instante da injeção até a eluição (ou chegada no detector) de
um componente que não interagem com a fase estacionária (um composto 31
chamado de ‘’não-retirado’’).
 Cromatograma típico por cromatografia em coluna.

A partir do Cromatograma pode-se calcular o VR ou VM uma vez que eu tenha F.

VR = tR . F V M = tM . F

Onde F é o fluxo ou vazão da FM em unidades de mL min-1. 32

 Praticando.....
VR = tR . F V M = tM . F

Suponha que uma molécula saia de uma coluna com um tempo de retenção de
12,3 min e a um fluxo de 1,25 mL/min. O tempo morto nessas mesmas condições
será de 0,840 min. Qual será o volume de retenção e o volume morto nessas
condições?

VR = 15,4 mL VM = 1,05 mL.

33
 t’R = tR - tM

O t’R, tempo que o soluto fica retido na FE,

é chamado ‘’tempo de retenção ajustado’’.

Similarmente temos o volume de retenção

ajustado.
V’R = VR - VM

Logo,

VR’ = tR ’ . F

34
 Na cromatografia em coluna, o fator de
retenção, k, de um componente é
determinado pela razão das quantidades
das suas moléculas que ficam retidas na
FE, nS, ou percorrendo a coluna
na FM, nM.
O fator de retenção também é relacionado
à razão dos tempos que as moléculas
ficam na FE e na FM.

Esse termo é calculado por:

k = nS / nM = (tR - tM )/ tM = t’R / tM

Similarmente temos que

k = VR’ / VM 35
36
Quando se envolve mais de um componente na amostra, também se calcula
termos de separação.

Na Cromatografia Planar, o fator de separação, ap, é representado pela razão

entre os fatores de retardamento de manchas adjacentes:

ap = RF1 / RF2 = dr1 / dr2

e o fator de retardamento relativo é a razão entre os fatores de retardamento do

composto em estudo (i) e um padrão (st):

Rrel = RF(i) /RF(st) = dr(i) / dr(st)

37
Quando se envolve mais de um componente na amostra, também se calcula
termos de separação.

Na Cromatografia coluna, o fator de separação, a, é calculado pela razão entre

os respectivos fatores de retenção que, por sua vez, são relacionados aos tR’:

a = k2 / k1 = tR2’ / tR1’

38
A resolução em cromatografia planar é determinada pela separação entre as
manchas:

RS (planar) = 2 ( dr1 – dr2 ) / ( Ws1 + Ws2 ),

Onde WS é a largura longitudinal da mancha.

39
A resolução em cromatografia em coluna é calculada a partir das distâncias que
separa os pontos máximos dos picos e da média das larguras de suas respectivas
bases (Wb ou W):
Quando RS = 1, os dois
picos são razoavelmente
separados, com somente
2% de supereposição se as
quantidades dos dois
componentes forem iguais.

Valores maiores indicam

melhor separação.

RS = 1,25 é suficiente para

fins quantitativos e RS > 1,5
indica separação completa.
40
Separação em função da resolução de dois componentes presentes em diferentes
Concentrações . 41
42
43
0,15 min

44
Uma maneira óbvia de melhorar a
resolução é aumentar o numero
de pratos teóricos (N).

Outra forma por exemplo uma

separação pode ser melhorada
significativamente manipulando
fator de retenção .
o aumento o fator de retenção
(mas à custa do tempo de
eluição) aumenta a resolução.

45
46
47
Má eficiência e má seletividade
= má resolução

Boa seletividade e má eficiência

Pode compensar a má eficiência
E obter boa resolução.

O ideal é boa resolução

conquistada com boa
seletividade e boa eficiência .

48
 Exercícios
• A eficiência de uma mova coluna de CG com comprimento de 30 m é avaliada
por meio da injeção de uma amostra-padrão de pentadecano. O tempo de
retenção medido para essa substância é de 10,05 min, e sua largura a meia-
altura é 0,064 min. Determine o número de pratos teóricos da coluna supondo
que o pentadecano tem um pico em forma de uma gaussiana. Expresse a
resposta em termo de números total de pratos teóricos e também do número de
pratos teóricos por metro de comprimento da coluna.

49
 Exercícios
• Determine a altura do prato teórico para o sistema cromatográfico do exercício
anterior.
• Como a altura do prato e o número do prato dessa sistema se alterariam caso o
comprimento da coluna fosse multiplicado por dois?

50
 Exercícios
• Uma empresa que supervisiona a limpeza de uma fábrica de explosivos pretende
determinar as quantidades de vários explosivos (por exemplo, TNT) presentes no
solo retirado de uma antiga área de deposição de resíduos da fábrica. A análise
deve ser feita pela extração dessas substâncias a partir de amostras de solo,
seguida por sua separação e medição por meio de cromatografia líquida. Isso
fornece o seguintes dados a uma taxa de fluxo de 1,50 mL/min.

• (a) Determine o tempo de retenção ajustado e o volume de retenção ajustado de

cada composto.

• (b) Quais os fatores de retenção de TNT, RDX, Tetril e HMX?

• (c) Como o tempo de retenção total e o

tempo de retenção ajustado para o TNT,
RDX, Tetril e HMX seriam afetados caso
a vazão utilizada no método de
cromatografia líquida (CL) fosse
acidentamente reduzida de 1,50 para
1,00 mL/min? Como os fatores de
retenção desses mesmos compostos
seriam afetados?
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 Exercícios
• Um cientista que trabalha para a U.S. Foods and Drug administration deseja
determinar o grau de separação que ocorre e, uma amostra patrão na Fig. 20.18.
Calcule o fator de separação obtido para cada conjunto de picos vizinhos nesse
Cromatograma.

• Calcule a resolução de cada conjunto de picos vizinhos na Fig. 20.18.

52
Fim por hoje

53