FACULTAD Informe de Práctica de Laboratorio

BIOLOGIA Y MICROBIOLOGIA
DE GENREAL
INGENIERÍAS

TINCIONES BACTERIANAS
Juan David Posada Garcés, Kevin Gerald Muñoz Ramírez, Jorge Hernán Cortés Isaza.

Fecha de presentación 25/09/2014

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Resumen
Las tinciones son muy útiles a la hora de diferenciar la variedad de bacterias que hay en un medio de cultivo, durante la práctica
realizada en el laboratorio podemos comprobar que es ahí en donde interviene las tinciones famosas como las Gram positivas y
negativas, tinción Ziehl-Neelsen, y la tinción de esporas cada una de estas usa colorantes de diferente variedad con el fin de teñir y así
poder diferenciar el tipo de bacterias presentes en el medio. A continuación se van a destacar e interpretar los diferentes tipos de
tinciones que pueden ser útiles en la investigación para medios de cultivos.

Palabras Clave: Bacterias; Colorantes; Tinciones; Contraste; Azul de metileno; Cristal violeta;
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1. Introducción
En este informe se muestra algunos conceptos sobre
las tinciones de bacterias, porque el tamaño de la mayoría de las
células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más
simple de aumentar el contrate es la utilización de colorantes.
Gracias a la tinción bacteriana es posible distinguir entre
diferentes tipos de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, como flagelos, esporas,
capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria.
Además se muestran los diferentes tipos de tinciones, se
desarrolla una que es muy importante como lo es la tinción de
Gram.
Figura No 1
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que Pasos para realizar una tinción
tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad
con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos
de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple
violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes que no
celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo
Produce un color tan intenso que oscurezca los detalles
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles;
celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de
los colorantes de este grupo se combinan con los materiales
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del
lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
material no celular no se tiñe.
localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo
de colorante liposoluble es el negro Sudán.
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción
usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células
el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples
las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es
un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes
1
celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta
china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal)
o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La
tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el
contraste de las células en la microscopia óptica, pero su
máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas
alrededor de las células bacterianas.
2. Procedimiento Experimental
2.1 TINCION DE GRAM (Ver figura N°2)
Desarrollada por Cristian Gram en 1884 se usa para cualquier
identificación bacteriana. Sirve para diferenciar dos grandes de
bacterias: Gram Positivas que se tiñen de color azul o morado y
Gram Negativa que se tiñe de color rosado.
Primer colorante: en contacto con las células cargadas
negativamente reacciona con ellas coloreándolas; el más usado
es el cristal violeta
Solución mordiente: fija las tinciones y aumenta la afinidad
entre el colorante y las células, pueden ser sales metálicas,
ácidos o bases, ejemplo; una solución diluida de yodo.
Agente Decolorante: un disolvente orgánico; alcohol acetona
Colorante de Contraste;
Es un colorante básico de distinto color, como la safranina. La
bacterias Gram positivas se tiñeran de azul o morado por el
cristal violeta sin perder su coloración, las bacterias Gram
negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta y se
tiñeran de rosado esto a causa de la safranina.
Proceso:
 Tomar muestra del frotis bacteriano sobre una
placa.
 Aplicar cristal violeta
 Llevar placa a lavado para quitar el exceso
 Cubrir con lugol y luego lavarlo nuevamente
 Aplicar alcohol-cetona y lavar el exceso
 Aplicar safarina a la placa
 Nuevamente llevamos a lavado para quitar
excesos.
 Una vez seco llevar al microscopio para su
observación
2.2 COLORACION ACIDÒFILIA O TINCIÒN-ALCOHOL
RESISTENTE (Ziehl-Neelsen) (Ver figura N°3)
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción
diferencial rápida, usada para la identificación de
microorganismos patógenos. Las paredes celulares de ciertas
bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena
larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido,
después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se
denominan ácido-alcohol resistente. Las microbacterias como
Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por
sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración
clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una
nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el
colorante ya no puede salir de las bacterias.
Colorantes usados:
1. Mezcla de fuscina-fenol
2. Decolorante orgánico mezcla acido-alcohol
3. Colorante de contraste: azul de metileno.
Las bacterias acido-alcohol resistentes, tras la unión de la
fuscina, resisten el tratamiento orgánico y se verán teñidas de
rosa. El resto de las bacterias se decoloran y se contrastan con
el azul de metileno.
Proceso:
 Tomar muestra del frotis bacteriano sobre una
placa
 Se cubre la placa con carbofuscina.
 Llevar al mechero para evaporar( evitando que
hierva), sin que la muestra se seque y dejar
reposar
 Llevar la placa a lavado para quitar el exceso
 Aplicar acido-alcohol hasta obtener un color
rosado.Aplicamos azul de metileno.
 Nuevamente llevamos a lavado para evitar
excesos.
 Una vez seco llevar al microscopio para su
observación.
2.3 TINCION DE ESPORAS (Ver figura N°4)
La envuelta de las endosporas es más compleja e impermeable
que la envuelta de las células vegetativas en las que se forma.
Sólo se puede teñir el contenido de la espora alterando su
envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las
endosporas se decoloren una vez teñidas.
El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene
una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la
bacteria. Penetra en las células vegetativas. Cuando se calienta
la preparación también penetra las endosporas.
2
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las
células vegetativas (decoloradas por el agua

Proceso:

 Tomar muestra del frotis bacteriano sobre una

placa
 Se cubre la placa con verde malaquita
 Llevar al mechero para evaporar( evitando que
hierva), sin que la muestra se seque
 Llevar la placa a lavado para quitar el exceso
 Se cubre con safarina
 Nuevamente llevamos a lavado para quitar
excesos
 Una vez seco llevar al microscopio para su
observación
Las endosporas tras la primera tinción, no perderá el colorante
en el lavado con agua, y si lo harán las formas vegetativas, que
quedaran teñidas con el segundo colorante.

3. Resultados Bacteria EMB

100 x
Figura No 3
Tinción de Ziehl-Neelsen

Nombre bacteria
100 x

Figura No 2
Tinción de gram

Nombre bacteria
100 x

Figura No 2
Tinción de esporas
3
4. Conclusiones
 Para la tinción de Gram y muchas otras clases de
tinciones es importante tener en cuenta el tipo de
colorantes utilizada y el orden en que se deben utilizar, ya
que estos procedimientos o técnicas tienen un orden lógico.
 En la práctica de laboratorio, se le hizo tinción de Gram a
la bacteria bacilos kilebsiella. Donde se obtuvo como
resultado una tinción de Gram negativa contaminada con
cocos Gram positivos.
 La tinción es de gran importancia para el posterior estudio
de los microorganismos en el microscopio y es por ello que
se deben manejar factores como mantener controlado el
tiempo de uso de cada reactivo para la tinción además de
que la fijación respectiva se debe hacer con un calor muy
superficial, ya que el exceso de calor puede provocar que la
muestra se desintegre en el proceso.
 La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más
importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el
estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su
utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo
microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología
las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos,
bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la
tinción de GRAM.
 Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de peptidoglicano así como
algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La
pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene
una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y está embebida en el fosfolípido y el antígeno o polisacárido
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula
Gram-negativa es peptidoglicano.
PREGUNTAS DE CONSULTA
1. Por qué son importantes las coloraciones de
bacterias en el laboratorio?
La coloración se ha convertido en una herramienta
fundamental para la taxonomía e identificación bacteriana.
Estas coloraciones son importantes porque clasifican a las
bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas con base a las diferencias estructurales de sus
paredes celulares. Además, de proveer las características
fenotípicas de la bacteria en cuanto a tamaño, forma,
agrupación y características tintoriales.
2. Existe alguna relación entre el tipo de morfología
y la tinción de Gram?
La morfología se refiere a la estructura, forma y apariencia de
un organismo. Las tinciones de Gram permiten una mejor
visualización de la estructura celular bacteriana.
Si existe relación entre la morfología y la tinción de Gram, ya
que esta última es la que determina la morfología celular
bacteriana. Además de que la tinción de Gram aporta dos
ideas básicas para la definición taxonómica de las bacterias: el
color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las
células bacterianas.
3. Que diferencias estructurales hay entre bacterias
Gram positivas y Gram negativas?
Gram positivas: Estas tienen una capa gruesa de
peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos.
Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la
capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y
ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une
sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el
responsable del determinante antigénico del organismo.
Gram negativas: Tienen una capa delgada de peptidoglicano
(mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y
lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido
está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico,
pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared
de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de
sustancias de peso molecular bajo. Entre la membrana
citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico
con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos
y proteínas de transporte.
Las diferencias estructurales son que:
Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de
peptidoglicano, y las Gram negativas con una delgada capa de
4
peptidoglicano, a la que se le superpone una capa de
lipopolisacárido-lipoproteína, denominada membrana externa.
La presencia de esta membrana, marca la diferencia entre las
bacterias Gram negativas y las Gram positivas carentes de
dicha estructura.
4. Dibuje una pared celular de una bacteria Gram
positiva y una bacteria Gram negativa.
Bacterias Gram positivas
Bacterias Gram Negativas
5. Porque es necesario que la muestra no hierva
durante la tinción con carbofuscina?
Es necesario que la muestra no hierva durante la tinción con
carbofuscina ya que si esto se genera, la pared de los bacilos o
bacterias puede destruirse y colorearse mal.
6. La tinción de Ziehl-Neelsen es específica para que
microorganismos?
La tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción bacteriológica
especial que se utiliza para ver microorganismos
acidorresistentes, principalmente Micobacteria.
La tinción de Ziehl-Neelsen es específica para bacterias ácido-
alcohol resistentes.
7. Cuál es la tinción adecuada para identificar el bacilo
de la tuberculosis? Diga el nombre del bacilo.
La tinción adecuada para identificar el bacilo de tuberculosis
es la tinción de ZiehlNeelsen.
Existen otras como:
Tinción de Adamczyk: método fotofluorométrico con naranja
de acridina para la observación microscópica de bacilos de la
tuberculosis
Tinción de Gabbet: una tinción para los bacilos de la
tuberculosis a base de carbol y fucsina calientes. Se lava con
agua y se cubre con azul de Gabbet (azul de metileno). Los
bacilos se tiñen de rojo, mientras que las demás bacterias se
tiñen de azul
El bacilo causante de la tuberculosis es el Mycobacterium
tuberculosis o también conocido como bacilo de Koch.
8. Cuáles son los compuestos moleculares que
conforman la mureína?
El peptidoglicano o mureína es uncopolímero formado por una
secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el Ácido N-
acetilmurámico unidomediante enlaces β-1,4. A cada residuo
de ácido murámico se halla ligado un tetrapéptido compuesto
de D y L-aminoácidos alternados. Aproximadamente un tercio
de los tetrapéptidos presentes intervienen en la unión lateral
entre cadenas adyacentes de mureína. Algunas de estas
cadenas tetra peptídicas se unen entre sí por medio de otros
péptidos cortos que forman puentes cruzados entre las cadenas
de aminoácidos. Las cadenas de mureína unidas por esos
puentes peptídicosresulta en una súper molécula gigante única
que envuelve a la bacteria y forma la sólida y rígida pared.
5
Bibliografía:
Textos
 [1] D.R. Toro & M.J Botero,El Microscopio,
Prácticas de laboratorio de
Microbiología,Universidad de caldas, 1, 63 págs

 [2] Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L.

Case, Introducción a la microbiología editorial
medica panamericana, 9, 923

Internet
.
 [1] M. de Vizcarrondo, morfología y tinción de los
microorganismos, universidad central de Venezuela ,
fecha de publicación: noviembre de 20001,
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_far
macia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci
%C3%B3n.pdf .

Evaluación (Espacio para el docente)

ítem Máx. Nota

Resumen - Palabras clave 1.0
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Introducción 1.0
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Procedimiento experimental 1.0

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Resultados 1.0

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Conclusiones 1.0
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