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Replicación del DNA (II) y

PCR
Paula Alejandra Díaz Tatis
PhD( c ) Biología, UNAL
padiazta@unal.edu.co
Textos guía, parte Biología molecular

Alberts et al. 2002. 4th Ed. Molecular Biology of the Cell.


Garland Science.

Nelson & Cox. 2004. 4th Ed. Lehninger Principles of
Biochemistry. W. H. Freeman & Co.

Lodish et al. 2003. 5 Ed. Molecular Cell Biology. W. H.
Freeman & Co.

Griffiths et al. 2005. 8 Ed. Introduction to Genetic
analysis. W. H. Freeman & Co.

El replisoma completo
El replisoma completo: Máquina molecular
-  DNA polimerasa en la cadena líder actúa junto con helicasas para abrir la horquilla.
-  En procariotas, primasa está unida a la helicasa (primosoma). Forman una unidad en
hebra rezagada. Esto facilita la carga de la DNA polimerasa.
-  Todas juntas suman > 106 Daltons.
En E. coli ….
Todo comienza con un ORI

Procariotas: oriC Secuencias ricas en AT


Reconocido por un complejo proteico
Cada 20 a 40 minutos hay un ciclo de
replicación
Helicasa abre las cadenas de ADN.
En E.coli dnaB dnaC. Las SSB estabilizan.
Formación de la horquilla de replicación.

Es el ADN el que se mueve


En E. coli ….
Todo comienza con un ORI

Procariotas: oriC Secuencias ricas en AT a las cuales se úne la helicasa (DnaA)


En eucariotas….
¿Cuánto se demoraría la célula en replicar en DNA con una sola
horquilla de replicación? 0,02 x 150 x 106= 3,0 x 106 segundos (cerca
de 800 horas) PERO NO…
Levaduras: 1,4 horas. Cultivo de células animales: 100 hasta 200 horas.
Eucariotas deben replicar más de un cromosoma (estructura
compleja).
Muy parecidas a oriC Secuencias ricas en AT, más largos.
Levaduras se conocen por lo menos 400 orígenes de replicación en
sus 16 cromosomas.
En eucariotas….
Y…. ¿Qué pasa al final del
cromosoma con la síntesis de
hebra rezagada?
telómeros

Y…. ¿Qué pasa al final


del cromosoma con la
síntesis de hebra
rezagada?
Y…. ¿Qué pasa en los telómeros con la
síntesis de hebra rezagada?

-  Problema del borde del cromosoma: No hay


lugar para producir el primer de RNA para
comenzar la síntesis del fragmento de
Okazaki.

-  Si se sintetizara el primer justo en el borde del


cromosoma, aún así se va a remover y la DNA
polimerasa no podría sintetizar la punta, no
hay 3’ OH libre.

-  ¿Se acorta el cromosoma después de cada


duplicación del DNA? ¿Se pierde información
genética?

-  Bacterias resuelven este problema teniendo


un DNA circular.
En Eucariotas la telomerasa resuelve
ingeniosamente el problema del borde del
cromosoma
En Eucariotas la telomerasa resuelve
ingeniosamente el problema del borde del
cromosoma
En Eucariotas la telomerasa resuelve
ingeniosamente el problema del borde del
cromosoma
-  Secuencias específicas para cada
especie.
-  En el ciliado Tetrahymena se adiciona la
secuencia TTGGGG.
-  En el humanos se adiciona la secuencia
TTAGGG. Se pueden extender hasta
10.000 nts en el extremo 3’ OH.
-  Utiliza un molde de RNA, que hace
parte de la telomerasa. Transcriptasa
reversa.
-  Se crea DNA no codificante que puede
ser “sacrificado” en el proceso de
replicación.
La longitud del telómero es un proceso
regulado por las células y los organismos

-  T-loop al final del cromosoma, evita la


degradación del DNA en esta región.

-  Células que proliferan indefinidamente


(levaduras) tienen mecanismos homeostáticos
para mantener el número de repeticiones.

Los telómeros se acortan : vejez


Replicación en cromosomas
(DNA + proteínas)
Cromosomas

DNA de una célula: 2 metros


Cromosomas

DNA  

Scaffold  
Proteínas de
andamiaje
El ADN es condensado para formar la cromatina.

El ADN en una célula humana mide 2m de longitud, tasa de
compactacion de 105 (compactar 40 km de hilo en una bola de
tenis)

La cromatina = ADN + proteínas histónicas y no histónicas

–  Suelta cuando no en división
–  Empaquetada en cromosomas cuando división

NIVELES DE ORGANIZACIÓN
formada por nucleosomas
(1er nivel de organización, empaquetado por 6)

Genoma humano: 3.2 x 109 nucleótidos : 23


pares de cromosomas
Empaquetamiento del DNA
El nucleosoma o “collar de perlas”

Cuatro clases de Histonas:


H2A, H2B, H3 y H4

Una vuelta son 80pb
ADN en el nucleosoma es siempre 146pb
El ADN linker varía
Histonas
•  Proteínas muy conservadas, función conservada (la
H4 de vaca y arveja solo difieren en 2 de 102 aa!)
•  Extremo N terminal rico en aa básicos
•  H3 y H4 forman un tetrámero, H2A y H2B forman
dímeros
•  (H3-H4)2 (H2B-H2A)2

Casi el 20%
Histonas

Más conservadas
Ensamblaje del nucleosoma

Primero el tetramero H3:H4 se une al


ADN. El ADN unido al tetramero
recruta dos unidades del dimero
H2A:H2B para formar el nucleosoma
completo (H3-H4)2 (H2B-H2A)2
H1 estabiliza el nucleosoma

•  Se une a:
–  DNA linker
–  Parte central de 146bp
•  Estructura más compacta del
nucleosoma

Sin H1 Con H1
Estructuras de orden superior

Fibra de 10 nm

2º nivel de organización: relación de empaquetamiento 40

Solenoide: varios nucleosomas, aprox 6 por vuelta, se requiere de la H1


Estructuras de orden superior
Función de las colas de las histonas

Las colas de las histonas de


nucleosomas adyacentes
interactúan para estabilizar la
estructura de 30 nm

•  Las modificaciones de
las colas las hacen
accesibles a proteínas
reguladoras
•  La acetilación reduce
la carga positiva
general de la histona:
pierde afinidad por el
ADN
Regiones activas e inactivas de cromatina
Sensibilidad a la DNAsaI

Heterocromatina: transcripcionalmente inactiva


Facultativa, cromosoma X. Los dos son activo solamente durante
la embriogénesis temprana
Eucromatina: transcripcionalmente activa
Herencia de histonas
y replicación de ADN
Las viejas histonas estan
presentes en los dos
cromosomas. A medida
que avanza la replicación,
el nucleosoma se
desensambla, el tetramero
H3:H4 permanece unido a
uno de los cromosomas,
pero los dimeros H2A:H2B
son liberados y entran al
pool de histonas libres
(nuevas + viejas) para el
ensamblaje
Herencia de histonas y replicación de ADN
Las viejas histonas estan
presentes en los dos
cromosomas.
A medida que avanza la
replicación, el nucleosoma
el nucleosoma se
se desensambla, el desensambla
tetramero H3:H4 permanece
unido a uno de los
cromosomas, pero los
dimeros H2A:H2B son
liberados y entran al pool de
histonas libres (nuevas +
viejas) para el ensamblaje
Las viejas histonas
estan presentes en los
dos cromosomas
El mantenimiento de la secuencia de DNA
Mutaciones son extremadamente raras
Muchas mutaciones en proteínas son deletéreas y son eliminadas
por selección natural
Bajas tasas de mutación son necesarias para la vida como la
conocemos (variabilidad)
Mutaciones son extremadamente
raras
-  Se estima que una proteína promedio sufre una mutación 1
vez cada 106 generaciones de células bacterianas.

-  La fracción de aa que son diferentes entre dos especies


pueden ser comparados con el número estimado de años
desde que esas especies divergieron de un ancestro común.
-  Se puede calcular el número de años que transcurrieron para
que se fijara en la secuencia de aa de la proteína --->
¿Cuántos años se requiere para producir una mutación
estable en el gen?

-  Familia atípica: fibrinopéptidos, la secuencia


no importa. Se acumulan mutaciones sin ser
seleccionadas negativamente.
-  Función no depende de la secuencia de aa.
-  Coagulación, se producen a partir del
fibrinógeno-à fibrina
Bajas tasas de mutación son necesarias
para la vida como la conocemos

1 cambio cada 109 nt incorporados en la replicación del DNA, tanto en


bacterias como eucariotas.
Si no fuese así, la evolución se abría detenido en un organismo tan simple
como la mosca de la fruta.
En humanos, 3 nt cada vez que se divide la célula.
Células germinales deben protegerse de altas tasas de mutación para
mantener la especie.
Células somáticas deben protegerse de cambios genéticos para preservar
cada individuo, cáncer.

Daño en el DNA, mutaciones.
Ambiente, radiación U.V., radiación ionizante, durante la replicación.
En bajas frecuencias por errores de la DNA polimerasa, si estos errores se
dejaran sin corregir, la célula acumularía tantas mutaciones, que no podría ser
funcional.
Muchas mutaciones en la línea germinal, descendencia no viable.
Reparación del DNA dañando.
La primera línea de defensa es la DNA polimerasa como tal.
Ambiente, radiación U.V., radiación ionizante.
U.V. produce dímeros de timina
Depurinación y deaminación
Mutaciones: motor de la evolución?
Mutaciones puntuales
Tipos de DNA polimerasas
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Obtención de millones de moléculas de DNA a
partir de unas pocas
¿Para qué?

-Amplificación
-Detección
-Caracterización
-Clonación
-Mutación
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Taq polimerasa Brock 1965.
Kary mullis 1987, premio nobel de química 1993, científico?
Posteriormente descubrimiento del
Termociclador. 1976
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
La taq ADN polimerasa, cataliza la formación de enlaces fosfodiéster.
La técnica de la amplificación in vitro se
basa en la repetición de tres procesos:
Ciclo  1   Ciclo  2   Ciclo  3  
• ADN

• Primers

• dNTP

• MgCl2

•  Taq polimerasa

• Diseño primers
• Tamaño
• Especificidad
• Contenido de GC
Manual: ej. word
Programas: ej. OligoAnalyzer, primer3,
Condiciones óptimas: Longitud 18-25nt, contenido de GC 50-60%, Tm 52º-65º

http://www.idtdna.com/site
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Comprobación: Electroforesis
Verificar si hay producto
Verificar el tamaño del
producto
Verificar especificidad
del producto
Su Taq DNA polimerasa, es ampliamente utilizada por sus
propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR.
•  Análisis de DNA de cualquier organismo
•  En busca de especies
•  Caracterización de mutaciones
•  Mutagénesis dirigida
•  Arqueología molecular y ancestralidad genómica
•  Clonación
•  Ecología y comportamiento
•  Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y
C, papiloma virus, HIV, entre otros
•  Pruebas de Paternidad
• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener
una cantidad considerable.

• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar.

• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo.

• Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
• Se pueden reproducir solamente partes del genoma en donde se
conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

• Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al


fragmento que se desea sintetizar.

• La taq polimerasa puede tener errores al sintetizar el ADN.



• Puede contaminarse con otro ADN.
Sanger sequencing
Nuevas tendencias
•  Pirosecuenciación
•  454
•  Solexa – Illumina
•  Nanopore
•  Arreglos de oligonucleótidos
•  MALDI-TOF
•  Helicos
•  Pacific Biosciences
•  Ion Torrent/Ion proton

mayo 29, 2015


1
Tecnologías que usan
secuenciación de
Arreglos Cíclicos

29/05/15
Métodos de arreglos cíclicos
ILLUMINA
•  Fragmentación
•  Ligación de adaptadores
•  PCR en emulsión o se
crean colonias de PCR
por varios métodos
•  Se extiende con
nucleótidos marcados o
emisión de luz por
incorporación
•  Imagen y repetición
Pirosecuenciación
•  Utiliza el pirofosfato liberado en
la polimerización
(h-p://www.pyrosequencing.com/pages/technology.html)  

mayo  29,  2015  


Tendencias modernas
•  Pyrosequencing y 454

mayo  29,  2015  


El proceso de 454….

mayo 29, 2015 www.CD-Genomics.com


454
h-p://www.454.com    

mayo  29,  2015  


Secuenciador 454

mayo  29,  2015  


454 LifeSciences Sequencer

mayo  29,  2015  


Pirosecuenciación
•  PCR en emulsión
•  Secuenciación por síntesis (por
polimerasa) Single Nucleotide
Addition
•  Relativamente largas – 350 bp
•  Problemas con repeticiones
Illumina (Solexa)
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
mayo  29,  2015  
Metzker.  Nature  Rev.  Genet.  11:31.  2010  
Illumina (Solexa)
•  PCR en puente
•  Secuenciación por síntesis (por
polimerasa) usando CRT
•  Muy cortas – max 100bp
•  Muy exactas
2. Secuenciación cíclica, con
amplificación pero basada en
ligación
ABI SOLiD
SOLiD
SOLiD
•  PCR en emulsión
•  Secuenciación por ligación
•  Muy cortas – max 75bp
•  Muy exactas
3
Tecnologías que no
necesitan amplificación:
Single Molecule
Sequencing

29/05/15
Nanopore Sequencing

mayo  29,  2015   h-p://www.mcb.harvard.edu/branton/index.htm  


Nanopore Sequencing—
Ensamblaje

•  Las lecturas serán diferentes a las del método Sanger


–  Largas (10,000pb - 1,000,000pb)
–  Tasa de error (alrededor 10% – 30%)

mayo 29, 2015


h-p://www.nanoporetech.com/  
Pacific  Biosciences  

h-p://www.pacificbiosciences.com/video_lg.html  
Metzker.  Nature  Rev.  Genet.  11:31.  2010  
Pac-Bio
•  No hay amplificación (single
molecule, real time)
•  Secuenciación por síntesis (por
polimerasa) usando nucleótidos
marcados
•  Muy largas – cromosomas enteros???
•  Muy exactas