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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BUCARAMANGA

Facultad de Ingeniería – Ingeniería Biomédica
Asignatura Bioquímica

Guía de la práctica de laboratorio: Metabolismo de Proteínas, Urea.

Profesores: Gloría Arenas Luna y Rafael Zamora

1. OBJETIVOS

1. Evaluar la concentración plasmática de urea y cierto grupo de proteínas: albúmina y globulina.

2. Resaltar la importancia fisiológica de las proteínas plasmáticas.
3. Reforzar los conocimientos referentes al metabolismo proteico.
4. Estudiar el comportamiento de las proteínas en un campo eléctrico.

2. INTRODUCCIÓN

Muchas de las proteínas localizadas en el plasma, que ascienden a más de doscientas, no son proteínas plasmáticas en
el sentido estricto, si no que su presencia en este medio es transitoria, bien por ser transportadas desde el tejido de
síntesis hasta las células donde ejercen su función o porque experimentan en el plasma parte del catabolismo. De todas
ellas solo una cincuenta encajan en este término. Por lo tanto, se plantea la necesidad de establecer criterios que
permitan decidir si una proteína es intrínsecamente plasmática. En general, se trata de moléculas secretadas
activamente a la sangre, y cuya presencia no se debe a una lesión tisular o a la alteración de la permeabilidad capilar.
Salvo las inmunoglobulinas y algunas γ-globulinas, se sintetizan en el retículo endoplasmatico de las células hepáticas.
Suelen ejercer una función primaria en el sistema vascular y por ello su concentración es mayor en el plasma que en los
tejidos o en otros fluidos corporales.

3. IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES

La sangre está constituida por formas celulares en suspensión en un líquido que es el plasma, mezcla muy compleja de
sustancias inorgánicas y orgánicas simples y complejas disueltas en agua. Al recoger sangre usando un anticoagulante se
obtiene un plasma que ligeramente difiere del natural por estar modificado por las sustancias agregadas y pérdida parcial
del calcio que se une al anticoagulante, y si no se usa anticoagulante al coagular la sangre el líquido que se separa se
llama suero; éste carece de fibrinógeno presente en el plasma, el cual se ha transformado en fibrina durante el proceso
de coagulación. Del 92 al 93% de plasma o suero es el agua disolvente, del 7 al 8% del total de solutos presentes las
proteínas son las que están en máxima concentración aproximadamente de 6.5 a 8.5 gramos/dl de agua del plasma o
suero.

Las proteínas en el sistema vascular ejercen una presión osmótica coloidal la cual sirve para mantener un volumen
normal de sangre y un contenido normal de agua en el líquido intersticial y los tejidos. La fracción de albúmina es la
principal en el mantenimiento de la presión oncótica en la sangre; si la concentración de albúmina desciende deja
escapar agua de los vasos capilares y entrará el líquido extracelular a los tejidos originando edema. Las proteínas del
plasma no tienen un origen común; el hígado es el órgano principal para la producción del albúmina y globulinas alfa y
beta como las proteínas de la coagulación y transporte de la sangre; las células del sistema retículo-endotelial son la
fuente de gama-globulinas y de algunas globulinas beta.
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El nivel total de proteínas hallado en el suero de jóvenes y adultos de edad media es 6,0 a 8,2 g/dl de suero. En plasma la
presencia de Fibrinógeno aumenta este valor en 0,2 a 0,4 gramos/dl. En estado de deshidratación el total de proteínas
puede aumentar en un 10 a 15%. La cantidad absoluta de proteínas no varía, pero su concentración aumenta a causa de
la disminución del agua como disolvente.

La hipoproteinemia ocurre cuando los niveles del total de proteínas están por debajo de 6 gramos/dl, se encuentra en
muchos estados patológicos no relacionados entre sí como son: síndrome nefrótico, síndrome de retención de sal,
quemaduras, hemorragias y heridas abiertas; período largo de baja ingestión o absorción deficiente de proteínas ejemplo
Kwashiorkor. El hígado en estas condiciones no tiene materia prima suficiente para sintetizar proteínas del suero para
reemplazar las que se pierden en recambio normal. En general pueden ocurrir cambios en la concentración total, en una,
varias o en todas las fracciones. También pueden ocurrir cambios en diferentes fracciones sin cambio en la concentración
total de proteínas.

3.1. Fundamento del método de determinación de proteínas totales: Método de Biuret: Los grupos –CO-NH- unidos entre
si dan una reacción con formación de color violeta con las sales cúpricas en medio alcalino, siendo la más representativa
y simple la que da con el Biuret-NH2-CO-NH-CO-NH2. Es en la actualidad el método colorimétrico más exacto y simple
para la determinación de Proteínas Totales.

• Composición del reactivo: Tartrato K-Na (15 mmol/), Ioduro de Na (100 mmol/), Ioduro de (15 mmol/l) y Sulfato de
cobre (5mmol/l).
• Patrón: Sol. Proteínas 7 g/dL
• Muestra: Suero, plasma

Pipetear en tubos de ensayo:

Tubos de ensayo Blanco Patrón Desconocido

Reactivo de proteínas 1ml 1ml 1ml
Patrón - 25µl -
Muestra (suero, Plasma) - - 25µl

Mezclar e Incubar los 3 tubos a 37 °C por 15 minutos; mantener 5 minutos a temperatura ambiente.
Leer, frente a blanco de reactivo, a 540 nm en el espectrofotómetro. Coloración estable por 30 minutos.

Haga los cálculos y exprese sus resultados en grs/100 ml de plasma.

Concentración Muestra = Absorbancia Muestra x concentración patrón (7 g/dL)

Absorbancia Patrón

Valores de referencia en suero o plasma: Recién nacidos: 5.2-9.1 g/dl

Adultos: 6,7-8,7 g/dl

Reporte su resultado:
 4. ALBUMINA: IMPORTANCIA BIOLÓGICA Y DETERMINACIÓN. 11

4.1. Importancia biológica: La albúmina es la proteína más abundante en el plasma humano. Tiene tres funciones
principales: contribuye en el mantenimiento de la presión oncótica del plasma, actúa como transportador no
específico para muchos componentes apolares y es una fuente endógena de aminoácidos. La hiperalbuminemia
tiene poco significado diagnóstico excepto en la deshidratación. La hipoalbuminemia se encuentra como resultado
de diversos factores: síntesis reducida causada por enfermedades hepáticas; absorción reducida de aminoácidos
debida a síndromes de malabsorción o malnutrición; aumento del catabolismo como consecuencia de inflamación o
daño tisular; distribución alterada entre el espacio intravascular y extravascular, sobrehidratación o ascitis; pérdidas
anormales debidas a enfermedades renales, enfermedades del tubo digestivo o alteraciones de la piel ; ausencia
congénita de albúmina o analbuminemia.

4.2. Fundamento del método (Método BCG): la albúmina presente en la muestra reacciona con el verde de bromocresol
en medio ácido, originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

• Composición del reactivo: Tampón acetato (100 mmol/l), verde de bromocresol (0,27 mmol/l), detergente y
pH 4,1.
• Patrón de albúmina: 4,55 g/dl.
• Muestra: Suero, plasma

Pipetear en tubos de ensayo

Tubos de ensayo Blanco Patrón Desconocido

Reactivo de albúmina 1ml 1ml 1ml
Patrón (4,55 g/dl) - 15ul -
Muestra (suero, Plasma) - - 15ul

Agitar bien y dejar los tubos durante un minuto a temperatura ambiente. Leer la absorbancia del patrón y de
la muestra a 630nm frente a blanco de reactivo. El color es estable durante al menos 30 minutos.

Realizar los cálculos de la muestra según la fórmula y exprese sus resultados en grs/100 ml de plasma:

Concentración Muestra = Absorbancia Muestra x C patrón (4,55 g/dl)

Absorbancia Patrón

Valor de referencia en suero o plasma: 3,5 – 5gr/dl.

Reporte su resultado:

5. UREA: IMPORTANCIA BIOLÓGICA Y DETERMINACIÓN.

5.1. Importancia biológica: La urea se sintetiza en el hígado como un producto de la desaminación de los aminoácidos.
Su eliminación en la orina representa la principal vía de excreción del nitrógeno. Se encuentran concentraciones
elevadas de urea en plasma como consecuencia de una dieta hiperproteica, aumento del catabolismo proteico,
después de una hemorragia gastrointestinal, ligera deshidratación o shock e insuficiencia cardiaca. La uremia post-
renal está causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o hipertrofia prostática.
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4.2. Fundamento del método (método de la Ureasa): La urea se hidroliza por acción de la ureasa en presencia de agua
para producir amoníaco y dióxido de carbono. En una reacción de Berthelot modificada, los iones amonio reaccionan
con hipoclorito y salicilato para formar un complejo verde. El aumento de la absorbancia a 578nm es proporcional a
la concentración de urea en la muestra.

• Muestra: Suero o plasma

Pipetear en tubos de ensayo

Paso 1.

Tubos de ensayo Blanco Patrón Desconocido

Reactivo de urea (Solución 1) 1ml 1ml 1ml
Patrón (80 mg/dl) - 10ul -
Muestra (suero ó Plasma) - - 10ul
Mezclar e incubar por 3 minutos a 37 grados centígrados
Paso 2.

Reactivo de urea (Solución 2) 1ml 1ml 1ml

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C. Leer la absorbancia del patrón y de la muestra contra el blanco de
reactivo a 578nm antes de 60 minutos. Analizar los cálculos de la muestra según la fórmula:

Concentración Muestra = Absorbancia Muestra x factor

Absorbancia Patrón

factor para c(UREA) c(BUN)

Suero o plasma 80 mg/dl 37,28 mg/dl
13,3 mmol/l 6,2 mmol/l

Factor de conversión de bun, urea: C (BUN) = 0,466 x C (Urea); C (Urea) = 2,14 x (BUN)

Valor de referencia: Suero (urea): 10 - 50mg/dl ó 1,7 - 8,3mmol/l

Reporte su resultado:

6. ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS

En la actualidad esta técnica se emplea para separar las diversas proteínas de una mezcla, lo cual ha permitido por
ejemplo, poder separar las proteínas del plasma humano y correlacionar su presencia y concentración con numerosas
enfermedades.

Las proteínas son compuestos anfóteros como los aminoácidos, y unas y otros tienen cargas positivas y negativas en la
misma molécula cuyo número depende del pH de la solución. Ya vimos que el punto isoelectrico (PI), es el pH en el cual
el número de cargas positivas es igual al número de cargas negativas y, por tanto, la proteína no se desplaza ni al ánodo
ni al cátodo. Para la mayoría de las proteínas este pH está en el lado ácido y varía desde 4,6 para las albúminas hasta 5,1
a 6,2 para las globulinas. A pH por debajo de PI las cargas positivas exceden en número a las cargas negativas y la proteína
se comporta como un ión positivo o catión. A valores de pH fisiológico las cargas negativas estarán en mayoría y la
proteína se comportaría como un anión (prot-), análogo al Cl- o al HCO3-.

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Las proteínas se mueven en un campo eléctrico como consecuencia de su carga eléctrica. En este proceso que 13 se llama
electroforesis, las proteínas se separan unas de otras debido a las diferencias de su carga neta. Por ejemplo, las
moléculas con carga neta negativa migran hacia el electrodo con carga positiva (ánodo), mientras las moléculas con
carga neta positiva migran hacia el electrodo con carga negativa (cátodo). Las moléculas sin carga neta no se mueven.

La electroforesis, es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica se realiza siempre utilizando como soporte geles
de agarosa o poliacrilamida. Existen variantes en las técnicas de electroforesis que permiten separar, visualizar y
cuantificar las proteínas; en estas técnicas de separación de proteínas se acostumbra a trabajar con tampón a pH de 8,6
con el fin de que las proteínas con las respectivas cargas que presentan tiendan a migrar al polo positivo (ánodo), o
negativo (cátodo), dependiendo entre otras cosas de su contenido de aminoácidos.

La electroforesis de zona sobre acetato de agarosa permite la identificación de cinco bandas (albumina, alfa-1-
globulinas, alfa-2-globulinas, beta y gammaglobulinas). Después de la electroforesis, las proteínas en el gel se
inmovilizan en una solución fijadora. A continuación se seca el gel, formando una placa. El modelo proteico se visualiza
tiñendo la placa con un colorante especifico (azul de Coomassie) en bandas (figura 1) y luego traducidas esas bandas en
perfiles (picos) del respectivo patrón electroforético (proteinograma), con un densitómetro, el cual permite la
cuantificación de las diferentes fracciones. La proteína (fracción) que más migra desde el punto de aplicación es la
albúmina.

El proteinograma sérico se utiliza para determinar las distintas concentraciones proteicas normalmente presentes
en el suero. No se puede emplear plasma, pues contiene fibrinógeno que es detectable. La relación porcentual
entre estos componentes (albúmina, alfa-1-globulinas, alfa-2-globulinas, beta y gammaglobulinas) se mantiene
constante, dentro de unos límites, en condiciones normales de salud (figura 2, proteinograma normal).
Valores esperados: Fracción Porcentaje relativo
Albúmina 58.8 - 69.9 %
Alfa 1 1.8 - 3.8 %
Alfa 2 3.7 – 13.1 %
Beta 8.9 – 13.6 %
Gamma 8.4 – 18.3 %

Figura 1. Acetato de agarosa observe las bandas

Figura 2. Proteinograma normal

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7. CUESTIONARIO (Debe traerlo resuelto):

1. ¿Qué es lo que determina la función de una proteína?

2. ¿Qué entiende usted por una estructura primaria y estructura tridimensional de una proteína?
3. Las proteínas pueden clasificarse de diversas maneras atendiendo a su forma, función y composición.
Explique esto.
4. ¿Qué es fuerzas iónicas de una proteína y que efecto tiene sobre su solubilidad?
5. Los cuatro factores principales que afectan la solubilidad de las proteínas se relacionan todos con las estructuras
primaria, secundaria y terciaria de las proteínas, y son; fuerza iónica, pH, temperatura y constante dieléctrica
del solvente. Explicar cómo afectan la solubilidad proteica. ¿Qué entiende usted por “salting in” y “salting out”?
¿Cuál es la importancia de estos conceptos?
6. ¿Qué es la vida media de una proteína y que factores la afectan?
7. ¿Cuáles son las principales funciones que cumplen las proteínas plasmáticas?
8. ¿Desde el punto de vista experimental como diferencia usted las albúminas de las globulinas?
9. ¿Qué es un patrón electroforético?
10. ¿Cuáles son las principales proteínas plasmáticas?
11. A través de un esquema conector y lo más ilustrativo posible, explique el catabolismo proteico.
12. ¿Cuál es valor de proteinuria que se considera normal?

8. BIBLIOGRAFÍA:

1. LAGUNA José. PIÑA Enrique. Bioquímica de laguna. Editorial Manual Moderno. 5 Edición. México 2002.
2. BHAGAVAN N.V. Medical Biochemistry. Ed. Harcourt. Fourth Edition. San Diego 2001.
3. BURTIS Carl A. ASHWOOD Edward R. TIEZT Fundamentales of Chemistry. Fith Edition. Ed. Saunders. Philadelphia
2001.
4. KAPLAN, Lawrence, A. Pesce Amades L.. Clinical Chemistry. Editorial Mosby Third Edition. New York, . 1986.
5. LEHNINGER A.