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ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

UN ÁREA ESPECIAL
DENTRO DE LA QUÍMICA CLÍNICA

Prof.Dr.Gustavo A.Negri
Dpto.Bioq.Clinica-FFyB-UBA

.
Enzimas
Función

 Catalizadores biológicos

Estructura proteica

Procesos metabólicos

Salud / Enfermedad
Enzimas
Estructura

Secundaria
Terciaria

Cuaternaria Primaria
Enzimas
Formas moleculares
Resultado de:
•Diferentes genes estructurales
•Híbrido de subunidades distintas Isoenzimas
•Variantes alélicas de genes
•Diferentes agregado de carbohidratos
•Desamidación Formas Múltiples
•Proteólisis Isoformas
•Oxidación
•Fosforilación
•Asociación a otras moléculas Macroenzimas
Enzimas
Clasificación

 Sistemática = Función catalítica

 Clínica = Clasificación de Bücher


Enzimas
Clasificación Sistemática

Clases

1 – Oxidorreductasas
2 – Transferasas
3 – Hidrolasas
4 – Liasas
5 – Isomerasas
6 - Ligasas
Enzimas
Clasificación Sistemática

Ejemplos
Enzimas
Clasificación Clínica de Bücher

1) Plasma específicas (Che)


2) Exocitoenzimas (Ami)

3) Endocitoenzimas
a - Ubicuas (LD total)
b - Órgano específicas (SDH, isoenzimas)
Enzimas
Enzimología Clínica

Estudia el valor diagnóstico y pronóstico


de las determinaciones enzimáticas
en distintos materiales biológicos

Historia:
(1908) Amilasa en orina Wohlgemuth.
(1920) FAL en suero Kay,King,Bodansky y Roberts.
(1943) Enzimas glicolíticas séricas Warburg, Christian.
(1955) AST en suero LaDue, Wroblewski y Karmen.
Enzimas
Endocitoenzimas – Liberación y eliminación
Enzimas

 Localización

(tisular-celular-subcelular)
Vías de llegada a la circulación
(tamaño y PM – permeabilidad capilar)
Vías de Eliminación
(vida media – peso molecuar)
Enzimas
Enzimemia

Causas de Variación

 por daño Tisular (metabólico y/o estructural)

 por el número de células productoras

 por una síntesis alterada

 por activación o inhibición de la actividad catalítica


Enzimas
Modelo de Friedel
Enzimas
Preguntas y Respuestas

¿Con que fin las determinamos?


Conocimientos Fisiopatológicos

¿De qué manera lo hacemos?


Proceso de Estandarización
Enzimas
Determinaciones enzimáticas

Dos propiedades cuantitativas (magnitudes) :

 La concentración de masa

 La concentración catalítica
Materiales y Métodos

un aspecto crucial en
estandarización de
Enzimología Clínica
Estandarización de resultados numéricamente
dependientes del Método

• Objetivo en Química Clínica

• Especialmente en Enzimología Clínica


Lograr un acuerdo interlaboratorio en las
medidas de actividad enzimática

• Control de calidad Externo

•Interpretación clínica por parte del Médico

•Valores de referencia
En Enzimología Clínica
la heterogeneidad de los resultados

• Variedad de metodologías (incrementada


por el desarrollo tecnológico)
• La actividad enzimática depende no sólo
de la [E] presente en la muestra:

 pH y naturaleza de los buffers


 Temperatura
 Activadores e inhibidores
 Naturaleza y concentración de sustrato
 Concentración de coenzima
Acepciones del término
Estandarización

• Ejecutar normas de uso uniforme en la práctica

uso de una metodología uniforme y aprobada

• Comparar con un estándar de propiedades conocidas


y definidas

uso de un mismo calibrador común para métodos diferentes


Estandarización del método analítico *

Enzima estandarizada como material de referencia **

** Estándar secundario

* Aparatos de lectura: deben responder a


especificaciones precisas y estricto control
Estandarización de Métodos Enzimáticos
(según Bergmeyer)
Cantidades y unidades Condiciones del ensayo:
Selección de métodos Temperatura del ensayo Estandarización
Optimización

Condiciones
estandarizadas para el
ensayo

Muestras (muestreo, Estándares de referencia


estabilidad, sustancias (definición, estabilidad)
interferentes)

Método enzimático
estandarizado
IFCC: 2 aproximaciones

• 1ª aproximación (década del ’70):


- Definir condiciones de método de referencia
- Instar a usar el mismo método

• Problemas:
- Adaptación a rutina, automatización, desarrollo
tecnológico
- Recomendaciones de las sociedades nacionales

* Resultados EQA demuestran altos CV interlaboratorio


Procedimiento único: objetivo de los cuerpos
nacionales e internacionales.
Ej: en el control de calidad externo (Reino Unido) 80%
de los participantes determina CK por método IFCC con C.V.
< 10%.
La determinación de Fosfatasa alcalina está igualmente
dividida: IFCC (AMP) y DGKC (DEA). Los valores
intergrupo difieren en un factor aprox. = 2. Hay una excelente
performance intragrupo sin ventaja demostrada de uno sobre
otro.

Recomendaciones  limitaciones impuestas por el


instrumental automatizado. Requerimientos de producción de
los kits de reactivos.
IFCC: 2 aproximaciones

• 2ª aproximación (actualidad):
Grupo de trabajo “Calibration in Clinical Enzymology”
- Sistema de referencia
- Métodos de referencia (a 37 ºC)
- Materiales de referencia
- Laboratorios de referencia

Concepto básico de esta aproximación es calibrar los métodos de


rutina
Calibración y Trazabilidad
Calibración exitosa de un método de rutina a
partir de un método de referencia

•Relación entre ambos debe ser constante para todas las muestras

•Se demuestra cuanto más extenso es el muestreo

El concepto de una relación constante intermétodo para


todas las muestras ha sido descripto por el término
conmutabilidad
La cadena de trazabilidad será válida:

A- El método de referencia y los métodos de rutina deben


tener igual especificidad para la enzima

B- Los distintos materiales involucrados deben tener


conmutabilidad con el material humano
Conmutabilidad
La conmutabilidad de los materiales de referencia
con las muestras de pacientes debe ser testeada por
uno o varios métodos (con especificidad analítica
igual a la del método de referencia).
Ésta depende de:

• Fuente

• Proceso de purificación

• Matriz (cofactores, efectores, aditivos, estabilizantes)

• Procesamiento del producto final


Cuestión esencial: las propiedades del
calibrador enzimático deben ser tan similares
como sea posible a aquellas de la enzima en su
matriz natural.

• Heterogeneidad molecular

En la práctica la relación encontrada entre los métodos


de rutina y de referencia para el calibrador debe ser la
misma que la relación promedio encontrada para un
gran número de muestras (normales y patológicas)
IFCC Working Group “Calibrators in Clinical Enzimology”

1. Revisar los métodos recomendados IFCC a 37 ºC

2. Los CRMs serán recertificados a 37 ºC con dichos métodos


en varios laboratorios

3. Dos materiales monoenzimáticos (ALP y AST) serán


preparados y certificados a 37 ºC

4. Programa colaborativo con el IRMM: MECRM (amilasa,


ALT, AST, ALP, CK, GGT, LDH y lipasa)
En Enzimología Clínica los resultados y los valores de referencia
son numéricamente dependientes del método

Un resultado individual puede compararse a valores de referencia si se


ha determinado por el mismo proceso analítico

Valores Valores de
observados referencia

Los diferentes tipos de error modifican la distribución de los valores


verdaderos

Como criterios esenciales


A: debe existir compatibilidad del sistema analítico usado por los
laboratorios original y receptor
B: debe haber similitud entre la población de referencia y los
pacientes del laboratorio receptor