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ISOENZIMAS

Dra. María Beatriz Di Carlo


Área Gastroenterología y Enzimología
Bioquímica Clínica II
Dpto. Bioquímica Clínica- FFyB-UBA

Agosto/2013
¿Qué son las isoenzimas?

“Distintas formas de presentación de una enzima”

“Las formas múltiples de una enzima “

ISOENZIMAS

ISOFORMAS

MACROENZIMAS

www.chem.qmw.ac.uk (1976)
ISOENZIMAS

- Cumplen la misma función biológica.


- Actúan sobre el mismo sustrato específico.

Difieren en las propiedades:


1) enzimáticas
2) físicas
3) bioquímicas

Bioch et Bioph Acta (BBA)-Prot and Proteomics 2005 1752(1):26-33


ISOENZIMAS

Difieren en:
1) propiedades enzimáticas:
- Afinidad (kM)

2)propiedades físicas:
- movilidad electroforética

3)propiedades bioquímicas:
- estructural (genética)
- inmunológicas
ISOENZIMAS

Origen de las isoenzimas

~ Diferentes genes estructurales.

~ Híbridos de subunidades distintas.

~ Variantes alélicas.
ISOENZIMAS

Origen de las isoenzimas

~Diferentes genes estructurales:

Proteínas independientes.

Ej: - MDH mitocondrial y MDH citoplasmática

- Amilasa salival y Amilasa pancreática


ISOENZIMAS

Origen de las isoenzimas

~ Híbridos de subunidades
distintas:

Son isoenzimas con diferentes


subunidades que derivan de distintos
genes estructurales o de múltiples alelos.
Heteropolímeros.

Ej: - LDH: LD1,LD2, LD3,LD4,LD5

- CK: MM,MB,BB
ISOENZIMAS

Origen de las isoenzimas

~ Variantes alélicas:

Se originan en genes alélicos. Aleloenzimas.


Los genes alélicos son formas alternativas de un
gen, presentes en un locus particular y que
originan productos con la misma función.

Ej: - G6PDH
ISOFORMAS

Son formas múltiples de las enzimas que se


originan por modificaciones postraduccionales
de la proteína-enzima.
Los cambios pueden ocurrir en espacios intra o
extracelulares, y esas modificaciones no son
vitales para el sitio activo.

M Lis CPN M CPN M


M Lis M Lis M
CK-33 CK-32 CK-31

M Lis
CPN
M
B B
CK-22 CK-21

B
B
CK-1
ISOFORMAS

Origen de las isoformas

- Conjugados o derivados proteicos Ejemplos


a) Conjugada con otros grupos FALo y h
b) Proteólisis Qtp(QTpg)

- Desaminación, Oxidación, Fosforilación CKMM (1-2-3)

- Formas conformacionalmente diferentes Enz.Alostéricas

- Polímeros de única subunidad GlDh (1 a 10)


MACROENZIMAS

Son complejos de enzimas sérica, que tienen un peso


molecular más alto y una vida media plasmática más
larga que la enzima normal.

¿Por qué es importante su estudio?


Ante un aumento persistente de la actividad
de la enzima en circulación, que no se asocia con los
síntomas, se sugiere la presencia de Macroenzimas.
Su presencia puede provocar errores de
diagnóstico y la realización de pruebas innecesarias
o procedimientos invasivos en el paciente.

Biochemica Medica 2007;17(1):52-9.


MACROENZIMAS

Macroenzimas de Tipo I
MACROENZIMAS

Macroenzimas de Tipo II
MACROENZIMAS

Métodos de Identificación

a) Electroforesis

b) Cromatografía

c) Precipitación con polietilenglicol


- Simple.
- No específica.
- Separa proteínas según su solubilidad .
MACROENZIMAS

Métodos de Identificación

Precipitación con PEG 24%


- Dilución al ½ con suero (PEG 12 %)
- Incubar 10 min.- 37ºC
- Centrifugar 5000g – 10 min.
- Medir actividad total en el SN
- Relacionar con Act. Total
- Resultados: Total-SN > 60% (Ej:MacroAmi)
ISOENZIMAS – ISOFORMAS - MACROENZIMAS

Interés Clínico

LDH: hematología

CK: cardiopatías

FAL: osteopatías y neoplasias

Ami: pancreatopatías

Elastasa: infecciones y Pancreopatías

ADA: Trastornos infecciosos (TBC)


ISOENZIMAS – ISOFORMAS - MACROENZIMAS

Métodos de Identificación

1-características físico –
químicas

•Carga eléctrica: EF convencional

•Carga eléctrica y PM: Sephadex

•Carga eléctrica y pI: IEF


ISOENZIMAS – ISOFORMAS - MACROENZIMAS

Métodos de Identificación

2- características catalíticas

•Inhibición química: -lectinas


-L-Homo Arg
•Inhibición física: calor

•Afinidad sustrato: kM
ISOENZIMAS – ISOFORMAS - MACROENZIMAS

Métodos de Identificación

3-características antigénicas

•Inmunoinhibición: Cinético (Actividad)

•Inmunométricos: RIA, Elisa (Masa)


ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)

Distribución Tisular
LD5 LD4 LD3 LD2 LD1

Hígado
Aporte a circulación:

Riñón
LD1 y LD2:corazón, GR, riñón

LD3: páncreas, pulmón, Plaq, GB


Corazón
LD4 y LD5:higado, musc esq, tumores

M.Esquel.

Hematíes
High activities in heart, liver, muscle, kidney,
and RBC
Pulmón
Lesser amounts: Lung, smooth muscle and
brain

Bazo
ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)

LDH-6
LDHc – LDHx
En suero de pacientes
Tercer locus LDH con Aterosclerosis CV.
Tetrámero: c ó x Su presencia es de mal
Testículo humano pronóstico.
postpuberal Se la asocia a la Injuria
Semen hepática secundaria a la
insuficiencia cardíaca.
Fertilidad masculina
ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)

Valores de Referencia en suero

LDH-1: 30 %
LDH-2: 40 %
LDH-3: 20 %
LDH-4: 4 %
LDH-5: 6 %
ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)

Significancia Clínica

LDH está aumentada en una variedad de desórdenes:


-Cardíacos
-Hepáticos
-Músculo esquelético
-Renales
-Hematológicos
-Neoplásicos

Patrón según patología: - I A M: LD1 y LD2 aumentadas: LD1 > LD2.


- no es IAM: LD1 y LD2 aumentadas: LD1 < LD2
(“flipped pattern”)
ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)

Separación electrofóretica:
-Soporte: Acetato de Celulosa
βNAD
-Sustrato: Lactato/β (-) (+)

-Revelado:
-Fluorescencia
LDH – 5 4 3 2 1
-Colorimétrico: NBT/PMS
ISOENZIMAS
de la LACTICODEHIDOGENASA (LDH-E.C.1.1.1.27)
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Distribución Tisular

♦CK-1 (BB): Cerebro (90%), próstata, intestino,


pulmón, vejiga, útero, placenta,
tiroides,tejidos neoplásicos

♦CK-2 (MB): músculo cardíaco, músculo esquelético (<<<)

♦CK-3 (MM): músculo esquelético, músculo cardíaco (<)

♦CK-Mt(MiMi): membrana mitocondrial hepatocito


ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Valores de Referencia en suero

Adulto
CK-MM: 95 %
CK-MB: 5 % En suero en condiciones de
normalidad, CK total se corresponde
aprox. a un 94% de CK-MM .
Neonato
CK-MM CK-MB > 6% de la actividad de CK
total es fuerte indicación de IAM.
CK-MB
CK-BB
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Significancia Clínica
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Macrokinasas

MK-1: •CK-1 (BB) unida a IgG


•Prevalencia: 0,8 – 2,3 %
•Mujeres > 50 años
•Asociada: enfermedades GI, adenoma,
carcinoma, enfermedad miocárdica
MK-2:••CK-Mt oligomérica
•Prevalencia: 0,5 – 2,6%
•Adultos: enf.maligna y hepatopatías severas
•Niños: enfermedad miocárdica.
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

(+) (-)
1
Separación electrofóretica
Soporte: Acetato de Celulosa 2
βNADP/Activadores
Sustrato: CrP/β 3
Revelado: UV 4
5
6
7
CK 1(BB) 2(MB) 3(MM)
8
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

ISOENZIMAS – ISOFORMAS - MACROENZIMAS

CKm CK-3 CK-2 CK-1

−)
(− (+) Tipo I

macro-CK
macro-CK CK-32 tipo 1 CK-21 albúmina Tipo II
tipo 2

CK-31
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Determinación de CK-MB:

CK-MB Actividad: Inmunoinhibición:

Ac anti-M ⇒se cuantifica la actividad residual de la CK-MB

CK-MB masa:

Inmunoensayo enzimático automatizado.


Se mide cc de CK-MB con anticuerpos monoclonales.
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Determinación de CK-MB:
Método de Inmunoinhibición - Actividad
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)

Determinación de CK-MB:

Método de Inmunoinhibición -Interferencias

CK-1 (BB)

MK-1 (BB-Ig)

CK-3 (MM) ⇑

MK-2 (MiMi) ⇑
ISOENZIMAS
de la CREATINFOSFOKINASA (CK-EC 2.7.3.2)
Importancia clínica

Aumentar el conocimiento del origen o


ubicación (órgano-especificidad) frente al
aumento de actividad total de una enzima
úbicua, permitiendo una orientación
diagnóstica más precisa

"Un resultado exacto de


laboratorio será tan bueno sólo si
lo son la interpretación de su
significado y su impacto sobre las
decisiones médicas".
Freedman D. Challenges at the Clinical Interface; 2001.
FORMAS MULTIPLES

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Clasificación

Isoenzimas: Isoformas:
- Tejido inespecífico - Hepática
- Placentaria - Osea
- Intestinal - Renal
- Oncofetal (CG) - Glóbulo Blanco

Macroenzimas:
- Inmunocomplejos
- Biliar
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Valores de Referencia en suero

Adulto Fracción Hepática


Fracción Ósea
Fracción Intestinal
Niño en crecimiento Fracción Hepática
Fracción Ósea
Fracción Intestinal
Embarazada Fracción Hepática
Fracción Ósea
Fracción Placentaria
Fracción Intestinal
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Métodos de Estudio

Inhibición física (térmica)

Inhibición química

RIA / ELISA (inmunológico)

EF Convencional

Isoelectroenfoque
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Métodos de Estudio: EF Convencional


(+) (-)
Separación electrofóretica
Soporte:
Acetato de Celulosa
Sustrato:
Alfa naftil fosfato de sodio
Revelado:
Fast Violet Salt

B HO P I
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Métodos de Estudio: RIA/ELISA


ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Métodos de Estudio: Inhibición química

Inhibidores

Lectinas L-H-Arginina

FAL ósea FAL Intestinal


ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ALCALINA (FAL-EC 3.1.3.1)

Métodos de Estudio: Inhibición Física

Temperatura

56ºC – 5 min. 65ºC-10min.

FAL ósea FAL placentaria


Isoenzimas – Parte Práctica
Caso Bioquímico – Clínico 5:

¿Cual es su interpretación inicial?


Paciente de 32 años con 38 semanas de gestación concurre a la consulta por
cansancio, signos de prurito y malestar generalizado. Del laboratorio solicitado
extraemos los siguientes resultados fuera de los valores de referencia:
FAL = 785 UI/L (VR h/280 UI/L – 37ºC)
LD = 570 UI/L (VR h/480 UI/L – 37ºC)

¿Que otros estudios considera complementarios? Isoenzimas de


LDH?? + -
Isoenzimas de FAL??

Normal
¿Cual es su interpretación final?
Alt. Hepatobiliar

Embarazada
FAL B HOP
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ACIDA (FAc-EC 3.1.3.2)

Separación en PAGE
ISOENZIMAS

de la FOSFATASA ACIDA (FAc-EC 3.1.3.2)

Valores de Referencia en suero

Adultos:
5A y 3
Niños:
5B y vestigios 5A
ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)


Cromosoma 1

Variación Alélica

Ami Pancreática (P-12) Ami Salival (S-6)

Macroamilasa
(con IgA,IgG,gProt y/o pSac)

Formas Múltiples
Macroenzimas
ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)

Valores de Referencia en suero

Isoenzima S = 2/3 Ami total

Isoenzima P = 1/3 Ami total


ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)


Situaciones de Hiperamilasemia sin pancreatitis
♦Parotiditis ♦Cetoacidosis diabética
♦Traumatismo cerebral ♦Insuficiencia renal
♦Cáncer de páncreas ♦Embarazo
♦Salpingitis ♦Rotura embarazo ectópico
♦Neoplasia de ovario ♦Enfermedad biliar
♦Postoperatorios ♦Macroamilasemia
♦Cáncer de mama ♦Cáncer de pulmón
♦Ulcera perforada ♦Apendicitis
♦Isquemia mesentérica ♦Quemaduras y shock traumático
♦Aneurisma aórtico roto ♦Infarto miocardio
♦Opiáceos ♦Fenilbutazona
♦Embolismo pulmonar ♦Hepatitis
ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)

Macroamilasemia-Características

Aumento de la Act.de Ami en suero o plasma

Incidencia:- 0,4% población general


- h/6% pacientes con hiperAmilasemia

PM (150 – 2.000) KDa

Filtra menos por glomérulo renal


ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)

Macroamilasemia-Características

Presencia en:
- Condición normal (Hallazgo de laboratorio)

- Forma aislada sin asociarse a patología

- Enfermedad subclínica o clínica leve

- Enfermedades autoinmune y malabsortivas


ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)

Métodos de estudio

Electroforesis convencional

Inhibición Ami-S: - Germen de trigo


- Anticuerpos (anti-S)m

Precipitación con PEG 24%


ISOENZIMAS

de la Amilasa (Ami-EC 3.2.1.1)

Métodos de estudio

Precipitación con PEG 24%


-PEG 12 % (Dilución al ½ con suero)
-10 min.- 37ºC
- Centrifugar
- Medir actividad de Ami total en el SN
- Relacionar con Act. Total de Ami.
- Resultados: Total-SN > 70%
ISOENZIMAS

de la ELASTASA (Ela-EC 3.4.21.37)

• Degradación de MEC

• PM: 20 y 30 kDa

• Rol fisiológico Benéfico

Perjudicial

• Regulación: Antiproteasas α1AT)


Serpinas (α
α2MG
SLPI
Elafin

• Isoenzimas de la Elastasa: Ela1-Pancreática

Ela2-Neutrofílica
ISOENZIMAS
de la ADENOSINA DEAMINASA (ADA-E.C. 3.5.4.4)

Participa en el metabolismo de las purinas.


ADA
- AMP IMP + NH3+

ADA
- dAMP dIMP + NH3+

Ampliamente distribuida en los tejidos humanos

Contribuiria a la maduración del sistema inmune.

Importante en la proliferación y diferención de cél.linfoides.

Regulada en plasma por los niveles de adenosina.

Isoenzimas: ADA1 y ADA2


ISOENZIMAS
de la ADENOSINA DEAMINASA (ADA-E.C. 3.5.4.4)

ADA 1: presente en todos los tejidos humanos


la mayor act.de ADA deriva de ella.

ADA 2: predomina en suero de sujetos normales


principal fuente: monocitos y macrófagos.

Aumentos de actividad sérica de ADA:


enfermedades →activ.de la inmunidad mediada por células
(AR, LES, TBC)

Linfocitos o el sistema monocito-macrófago →cambios de ADA sérica

“Marcadora no específica de la inmunidad mediada por células”