Anda di halaman 1dari 48

TUGAS ANALISA PANGAN

“HPLC
High Perfomance liquid cromatoghraphy”

Kelompok :

1. Noviya Dwi A.R [1533010051]


2. Elissa Fatma Sari [1533010057]
3. Eunike Kristina [1533010063]
4. Fadlur Rohmawati [1533010077]
5. Kevin attala putra [1533010090]
6. Febrian Andika [1533010097]

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN


FAKULTAS TEKNIK
UPN “VETERAN” JAWA TIMUR
2017
KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmatNYA sehingga
makalah ini dapat tersusun hingga selesai . Tidak lupa kami juga mengucapkan banyak
terimakasih atas bantuan dari pihak yang telah berkontribusi dengan memberikan
sumbangan baik materi maupun pikirannya.

Dan harapan kami semoga makalah ini dapat menambah pengetahuan dan
pengalaman bagi para pembaca, Untuk ke depannya dapat memperbaiki bentuk maupun
menambah isi makalah agar menjadi lebih baik lagi.

Karena keterbatasan pengetahuan maupun pengalaman kami, Kami yakin masih


banyak kekurangan dalam makalah ini, Oleh karena itu kami sangat mengharapkan
saran dan kritik yang membangun dari pembaca demi kesempurnaan makalah ini.

Surabaya, April 2016

Penyusun
BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan


partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa
diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai
penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai
pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’
dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian
bawah kolom

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan


terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang
merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mungkin suatu zat
padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas.
Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan:
cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi


cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur
pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir
lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh
efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira
tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat
menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber,
yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini
digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya
dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini
dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi
cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal,
HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik
1.2 Rumusan Masalah

1. Pengertian HPLC

2. Jenis- jenis HPLC

3. Instrument HPLC

4. Prinsip kerja HPLC

5. Aplikasi HPLC

1.3 Tujuan

a. Mengetahui Pengertian HPLC

b. Mengetahui Jenis- jenis HPLC

c. Mengetahui Instrument HPLC

d. Mengetahui Prinsip kerja HPLC

e. Mengetahui Aplikasi HPLC


BAB II PEMBAHASAN

2.1. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara
mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC
didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.
Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini,
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain :
farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa
perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan
HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan
analisis senyawa-senyawa kiral.

2.2 Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua
pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan
HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut,
dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi


kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Terjadinya
pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner (fasa diam) yang kuat terhadap
komponen– komponen yang harus dipisahkan.

2. Kromatografi Fase Terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan
pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.

3. Kromatografi Penukar Ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan Ion


Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi
lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar
tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian,
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut
dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang


sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim)
dari campuran yang sangat kompleks.

2.3 Instrument HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) ,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
2.3.1 Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

 Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran
menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu,
fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses
pemisahan.

 Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.

2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.

3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).

6. Sesuai dengan detector.

 Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a. HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang
digunakan adalah heksana atau i-propileter.

b. HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril. Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang
yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

2.3.2 Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan
batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

 Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

a) Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan
berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah
terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup
saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke
dalam kolom.

Gambar 2.3.2.1. Reciprocating Pump

b) Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang
cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
Gambar 2.3.2.2. Displacement Pump

c) Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini
murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan
yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan
tekanan balik kolom.
Gambar 2.3.2.3. Cylinder Pneumatic

2.3.3 Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke
dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat
karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).

 Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem


tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.

c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada
posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

 Syarat- syarat injektor yang baik :

 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin


 Mudah digunakan
 Keberulangan tinggi
 Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
2.3.4 Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

 Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol
(Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi
akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan.

2.3.5 Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:


Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

2.4 Prinsip Kerja HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan


kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <


senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan
alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif
cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time
(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai
peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D
dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga
sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang


dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC
adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya
kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu,
seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat
dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah


proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai


kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari
impuritis.

Gambar 2.4.1. Skema HPLC

2.5 Aplikasi HPLC

Aplikasi HPLC sangat luas terutama dalam dunia pangan dan farmasi. HPLC
dalam dunia pangan digunakan untuk menganalisa suatu komponen yang terdapat
dalam bahan pangan baik secara kualitatif ataupun kuantitatif. Berikut beberapa
jurnal yang menggunakan metode HPLC.

 Analisis Beta- Karoten

Jurnal 1. Analisis Komposisi dan Kandungan Total dan Vitamin A Fraksi Cair dan Padat
Minyak Sawit Kasar (CPO) Menggunakan KCKT Detektor PDA (Syahputra dkk, 2008)

Metode:

Persiapan Fraksi Cair dan Padat CPO. Sampel CPO pada suhu ruang disaring
menggunakan kertas saring whatman 42 dengan bantuan pompa vakum sehingga fraksi
padat (stearin) dan fraksi cair (olein) terpisah.

Metode Langsung. Sebanyak 0,1 g CPO (fraksipadat/cair) dilarutkan dalam


pelarut heksan dalam labu ukur 25 ml hingga tanda batas. Larutan tersebut selanjutnya
dianalisis menggunakan KCKT Shimadzu LC-20A.
Identifikasi Komposisi Karotenoid dengan KCKT (Bonnie & Choo 2000).
Sampel hasil kedua metoda, saponifikasi dan metoda langsung dari masing-masing
fraksi CPO disaring menggunakan filter polytetrafluoroethylene (PTFE) 0,20 m.
Kemudian larutan hasil filtrasi dianalisis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) Shimadzu LC- 20AB yang dilengkapi dengan detektor Photodiode
Array (PDA) pada panjang gelombang 190-800 nm,

dengan sistem gradien menggunakan kolom VP ODS C18 RP (4.6 mm i.d. •~ 250 mm,
5 m) dan campuran pelarut asetonitril : diklorometan (89 : 11, v/v) dengan laju alir 1,0
ml menit-1.

Hasil dan Pembahasan:

Kromatogram ditampilkan pada panjang gelombang 444 nm, karena hasil yang
diperoleh dari beberapa kromatogram menunjukkan karotenoid CPO memiliki
penyerapan maksimum pada panjang gelombang tersebut.

Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan tidak semua puncak dapat diidentifikasi.


Komponen dengan konsentrasi rendah, pola spektra tidak dapat teramati dengan baik,
sehingga masih diperlukan marker sebagai pembanding. Untuk mendapatkan pola
spektra dari komponen minor, dapat dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi
sampel sebelum dianalisis dengan KCKT, dengan konsekuensi tersaturasinya
komponen-komponen dominan.

Penggunaan detektor PDA memberikan beberapa kemudahan. Dengan hanya sekali


analisis dapat diperoleh kromatogram pada berbagai panjang gelombang sesuai interval
yang dipilih (200-800 nm), sehingga diperoleh pola spektra dari tiap-tiap puncak. Pola
spektra ini membantu dalam mengidentifikasi secara kualitatif jenis karotenoid dari tiap
puncak tanpa harus menganalisis marker. Jika dibandingkan dengan detektor
UV-Tampak konvensional, sekali analisis memerlukan analisis marker sebagai
pembanding dan hanya dapat diamati pada satu panjang gelombang. Dapat dibayangkan
jika suatu sampel terdiri atas 10 komponen, maka diperlukan 10 marker untuk
mengidentifikasinya. Puncak-puncak yang dihasilkan pada 10 menit pertama tidak
terpisah dengan baik. Penggunaan kolom fasa terbalik (reverse-phase) dengan fasa
gerak bersifat cenderung polar, memungkinkan komponen-komponen awal tersebut
merupakan senyawa-senyawa yang bersifat polar. Metoda tersebut kurang cocok untuk
memisahkan komponen-komponen polar, sehingga perlu modifikasi untuk memperoleh
pemisahan yang baik, misalnya dengan menggunakan gradien pelarut.

Gambar 2.5.1. Hasil kromatogram analisis Beta Karoten pada fraksi padat dan fraksi cair
Gambar 2.5.2 Kromatogram dan pola spektra marker β-karoten hasil pengukuran
menggunakan Spektrofotometer Varian Carry (%) KCKT dengan detektor PDA (…)

Spektra yang dihasilkan membentuk pola yang hampir sama dengan marker, dengan
sedikit perbedaan yaitu munculnya puncak baru pada panjang gelombang 335 nm yang
merupakan β-karoten bentuk cis.

Perbedaan Detektor PDA dan UV-Vis

Gambar 2.5.3 Diagram ilustrasi sistem detektor UV-Vis


Pada KCKT dengan detektor UV-tampak konvensional pengukuran hanya dapat
dilakukan pada satu panjang gelombang, sehingga untuk menentukan komposisi suatu
sampel pada banyak panjang gelombang harus dilakukan pengukuran berulang-ulang.

Gambar 2.5.4 Diagram ilustrasi sistem detektor PDA

KCKT dengan detektor PDA. Perkembangan KCKT merupakan suatu terobosan


untuk analisis karotenoid, salah satunya adalah paduan dengan detektor PDA. Dengan
KCKT detektor PDA, pengukuran dapat dilakukan pada banyak panjang gelombang
secara simultan, sehingga dapat diperoleh komposisi suatu sampel pada rentang panjang
gelombang yang diinginkan. Keunggulan lain, rentang panjang gelombang dapat
menghasilkan pola spektra dari puncak-puncak yang diperoleh sehingga secara
kualitatif dapat ditentukan tanpa harus menganalisis marker.

Jurnal 2. VALIDASI METODE ANALISIS BETA KAROTEN DENGAN


HPLC-MWD PADA MATRIKS SAM PEL MINYAK SAWIT. (Hanifah dkk, 2013)
Metode:

Ekstraksi Beta Karoten

Ditimbang sebanyak 1-2 gram sampel minyak goreng, dimasukkan ke dalam tabung
reaksi tertutup, ditambahkan 10 mL KOH 10% metanol, divorteks, dihembuskan gas Nz
selama 30 detik. Lalu dipanaskan di dalam penangas air 65°C selama 60 menit,
didinginkan (± 40°C). Dimasukkan ke dalam corong pemisah, diekstrak dengan
petroleum eter sebanyak 3 x 15 mL, fraksi petroleum eter ditampung, dicuci dengan air
suling, jika terdapat emulsi ditambahkan NaCI jenuh. Fraksi petroleum eter yang telah
bersih disaring dengan Na2S04 anhidrat, dikeringkan dengan gas Nz, dilarutkan kembali
dengan fase gerak sebanyak 1 mL, disaring dengan membran 0,45 J.lm, sampel siap
dianalisis dengan HPLC dengan kondisi seperti pada Tabel 1. Untuk spiked sample, sam
pel minyak goreng sawit ditambahkan masing-masing 150, 300, 500, 750, dan 900 J.lL
larutan stok standar beta karoten 1000 J.lg/mL.

Uji Spesifisitas

Uji spesifisitas dilakukan untuk mengetahui beta karoten dapat dianalisis atau tidak
dengan metode analisis pada penelitian ini. Uji spesifisitas terlebih dahulu adalah
melalukan scanning untuk mengetahui panjang gelombang yang menghasilkan serapan
maksimum yang digunakan sebagai dasar analisis beta karoten dengan HPLC UV-vis,
yaitu larutan standar beta karoten 100 J.lg/mL discanning pada spektrofotometer UV-vis
pada panjang gelombang 400-500 nm. Kemudian dilakukan analisis standar beta
karoten murni dan standar beta karoten yang dispike dalam sam pel minyak goreng
dengan menggunakan instrumen HPLC pada panjang gelombang maksimumnya.
Tabel 2.5.1. Kondisi operasi beta karoten dengan HPLC MWD

Gambar 2.5.5

Gambar 2.5.6
Rata-rata 'waktu retensi beta karoten adalah 12,463 menit dengan presisi (RSD) sebesar
1 , 82%, ~sedangkan rata-rata luas area peak beta karoten adalah 17,01517 dengan
presisi (RSD) sebesar 1,70%. Hasil RSD ini masuk ke dalam standar keberterimaan
yaitu ~ 2,0%

Tabel 2.5.2 Hasil uji presisi instrumen HPLC pad a anal isis beta karoten menggunakan
larutan standar beta karoten 10,0 IJg/mL

Jurnal 2. PENETAPAN KADAR β-KAROTEN DALAM BUAH PAPRIKA


MERAH, KUNING DAN HIJAU (Capsicum annuum var. annuum L.) SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (Diana dkk)

Kondisi operasi penetapan kadar β-karoten dalam buah paprika merah, kuning dan hijau
secara kromatografi cair kinerja tinggi

Pelarut = Methanol, petroleum eter p.a, Aquabides, Acetonitril


Fase gerak = Klorofom: Tetrahidroform : Methanol (70:25:5)
Nama alat = KCKT Agilent 1100 series
Detektor = -
Panjang gelombang = 420-600 nm
Metode :
Pemilihan fase gerak dengan cara sejumlah 10 mg β-karoten dimasukkan kedalam labu
tentukur 50 ml. Melarutkan dan mengencerkan dengan kloroform hingga tanda.
Kemudian dipipet sejumlah 2,5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml diencerkan
dengan kloroform sampai tanda. Menyuntikkan sejumlah 20 µl ke alat KCKT
menggunakan fase gerak methanol : kloroform (94 : 6) ; methanol : tetrahidrofuran : air
(67:27:6) ; kloroform : tetrahidrofuran : air (67:27:6) ; asetonitril : kloroform (92:8) ;
kloroform : tetrahidrofuran : methanol (970: 25:5) dengan laju alir 0,5 ml/menit dan 1
ml/menit. Pembuatan ekstrak dengan cara paprika segar yang telah dipotong potong
dan dihaluskan, ditimbang sejumlah 10 gram (paprika merah), 50 gram (paprika kuning),
dan 100 gram (paprika hijau), diekstraksi menggunakan petroleum eter, kemudian
disaring. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotavapor pada suhu 40°C .
Kemudian dilarutkan dengan 10,0 ml kloroform. Masing-masing larutan uji disuntikkan
sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT,kemudian dibandingkan waktu retensinya dengan
waktu retensi baku β-karoten.
 Analisis Akrilamida

Jurnal 1. ANALISIS KANDUNGAN AKRILAMIDA DALAM UBI GORENG YANG


DIJUAL DI KOTA MANADO MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI (KCKT) (Sengke dkk 2013)

Metode:
Pembuatan Larutan Sampel
Ditimbang 10 g sampel ditambahkan 60 ml diklormetan dan 3 ml etanol kemudian
dikocok dengan menggunakan laboratory shaker selama ±120 menit dan disaring
sehingga diperoleh residu dan filtrat. Residu kemudian dibilas 2x dengan menggunakan
diklormetan sebanyak 5 ml dan hasilnya digabungkan dengan filtrat kemudian
ditambahkan diklormetan sebanyak 25 ml kemudian didestilasi hingga diklormetan
hilang sehingga menghasilkan larutan destilat. Selanjutnya larutan destilat
disentrifugasi selama ±30 menit menghasilkan larutan destilat tanpa minyak yang
kemudian dibekukan dalam freezer selama 3 jam untuk mendapatkan larutan sampel.
a. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif akrilamida dapat dilakukan dengan membandingkan waktu
tambat yang sama (identik) dari kromatogram pada penyuntikkan larutan
sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding
akrilamida pada kondisi KCKT yang sama.
b. Analisis Kuantitatif
Larutan induk baku pembanding sebanyak 0,625 ml, 2,5 ml, 3,75 ml, 8
ml,13 ml dan 15 ml dimasukkan kedalam labu ukur 25 ml, lalu ditambahkan pelarut
hingga batas tanda sehingga menghasilkan larutan induk baku pembanding 0,25 ppm,
1 ppm, 1,5 ppm, 3,2 ppm, 5,2 ppm, dan 6 ppm. Larutan ini kemudian disaring
dengan menggunakan kertas saring Whatman 0,45 μm dan dihilangkan udara
dengan pengaduk ultrasonik selama ±20 menit sehingga menghasilkan filtrat dan
residu. Filtrat dimasukkan sebanyak 100 μl kedalam sistem KCKT kemudian direkam
kromatogram dan dibuat kurva kalibrasi antara luas puncak dan konsentrasi.

PEMBAHASAN
Optimasi Kondisi Alat Kromatografi
Panjang gelombang untuk analisis ditentukan berdasarkan kurva serapan
akrilamida baku menggunakanSpektofotometer UV. Menurut Brown dkk,
(1982) akrilamida memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang
sekitar 196-198 nm. Penelitian yang dilakukan oleh Dewi (2010) diperoleh
serapan akrilamida baku pada panjang gelombang 199 nm.
Pada penelitian ini digunakan fase gerak asam fosfat : asetonitril (80:20) pada
panjang gelombang 210 nm seperti yang dilakukan oleh Tandi (2012). Pada panjang
gelombang ini diperoleh hasil yang lebih baik dibandingkan dengan menggunakkan
panjang gelombang 230 nm, seperti yang terlihat pada Gambar 1.

Panjang gelombang yang digunakkan pada penelitian ini yaitu 210 nm. Panjang
gelombang ini digunakan karena memberikan hasil analisa yang baik. Kondisi optimal
ini digunakan untuk menganalisis kandungan akrilamida dalam ubi goreng karena
memberikan hasil kromatogram yang baik. Fase gerak yang digunakan meminimalkan
intervensi dari zat-zat lain dalam sampel.

Analisis Kualitatif Akrilamida


Identifikasi kandungan akrilamida diperoleh dari larutan sampel yang disuntikkan.
Alat : KCKT
Kolom : Shim-pack VP-ODS (4,6 x 250 mm),
fase gerak asam fosfat 11,45mM : asetonitril (80 : 20),
volume penyuntikan 100 μL,
laju alir (flow rate) 1,0ml/menit,
detector UV-Vis pada panjang gelombang 210 nm ini
menghasilkan waktu tambat sampel seperti
terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Waktu tambat yang diperoleh pada analisa akrilamida

Tabel di atas menunjukkan waktu tambat yang dihasilkan oleh setiap larutan
sampel. Waktu tambat yang diperoleh tidak berselisih jauh satu dengan yang
lainnya. Waktu tambat yang dihasilkan oleh larutan baku akrilamida dengan
konsentrasi 6 μg/ml yaitu 3,220 menit (Lampiran 2). Waktu tambat yang
diperoleh setiap larutan sampel berdekatan dengan waktu tambat larutan baku
akrilamida. Meskipun waktu tambat yang dihasilkan tidak sama persis namun
puncak yang diamati dalam kromatogram sampel dapat diterima sebagai puncak
akrilamida. Hasil ini menunjukkan bahwa jenis sampel ubi goreng teridentifikasi
dengan kadar akrilamida.
Analisis Kuantitatif Akrilamida
Analisis kadar akrilamida secara kuantitatif ditentukan menggunakan kurva
kalibrasi akrilamida baku berdasarkan luas puncak. Kurva kalibrasi akrilamida
bakudibuat dengan konsentrasi meningkatdimulai dari 0,25; 1,0; 1,5; 3,2; 5,2 dan
6μg/ml. Luas puncak akrilamida baku dapatdilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Luas Area Akrilamida Baku
Gambar 2. Kurva Kalibrasi Akrilamida Baku
Kurva kalibrasi diatas memiliki nilai koefisien korelasi, r = 0,999. Dari perhitungan,
diperoleh persamaan garis regresi Y = 87289x - 84324. Persamaan ini digunakan untuk
menentukan kadar akrilamida dalam sampel ubi goreng. Kadar akrilamida dalam ubi
goreng dapat dilihat pada Tabel 4 di bawah ini.
Tabel 3. Kadar Akrilamida dalam Ubi Goreng
Keterangan : Data merupakan hasil rata-rata dari dua kali ulangan pengujian dengan
dilengkapi Standar Deviasi

Tabel 3 di atas menunjukkan kadar akrilamida tertinggi terdapat pada sampel


no 3 sebesar 147,96 μg/ 10g sampel. Selanjutnya, kadar akrilamida terendah
terdapat pada sampel no 6 sebesar 9,24 μg/ 10g sampel sampel. Dari hasil penelitian
semua sampel mengandung akrilamida. Kadar akrilamida yang bervariasi
disebabkan oleh beberapa faktor, seperti lama pemanasan dan suhu. Pemanasan
sangat mempengaruhi pembentukan akrilamida dalam sampel.
Pengamatan secara visual tidak dapat menunjukkan ubi goreng mengandung akrilamida.
Semua sampel ubi goreng dalam pengolahannya menggunakan minyak jelantah
(minyak yang berwarna hitam karena pemakaian berulang kali) ini dapat mengganggu
kesehatan. Pengamatan secara visual juga dilakukan setelah perlakuan terhadap sampel.
Sampel yang tidak mengandung akrilamida memiliki warna bening
kekuning-kuningan. Warna ini juga merupakan warna dari semua sampel yang
mengandung akrilamida. Tujuh sampel yang memiliki warna yang sangat kuning
adalah sampel 3, sampel ini mengandung akrilamida, tetapi kadarnya tidak melewati
batas yang ditentukan. Kadar akrilamida dalam sampel ubi goreng yang dianalisis masih
berada pada kadar yang diperbolehkan yaitu 50-500mg/kg. Umumnya seseorang makan
ubi goreng sekitar 200 gram, jadi kadar akrilamida yang dikonsumsi sesseorang tiap
harinya yaitu 24.116,01 μg/200 gram. Perhitungan tersebut diperoleh dari sampel 1.1
sebesar 120,580062 μg/10 gram sampel dikalikan 20.
Meskipun kadar akrilamida dalam ubi goreng masih jauh dari nilai ambang batas yang
diperbolehkan, akan tetapi asupan akrilamida dalam makanan yang dikonsumsi dapat
terakumulasi di dalam tubuh dan dikhawatirkan dapat berdamppak negatif terhadap
kesehatan manusia. Akrilamida yang terakumulasi akan memicu terjadinya proses
karsinogen.
JURNAL 2,

Sandra Hermanto,Robiatul Adawiyah.2010. Analisis Kadar Akrilamida Dalam


Sediaan Roti Kering Secara KCKT. Valensi. Vol. 2 No. 1, Nop 2010 (354-361)

 HLCP : Analisis Kadar Akrilamida Dalam Sediaan Roti Kering Secara KCKT
 PELARUT : asetonitril
asetonitril
asam fosfat
diklormetan
etanoL

 Metode :

Pembuatan fase gerak

50 mL asetonitril dan 950 mL aquabidest dimasukkan kedalam labu ukur 1000


mL. Kemudian 0,2 mL asam fosfat 85% ditambahkan, dikocok hingga
homogen, lalu disaring dengan filter eluen, selanjutnya dihilangkan udara
dalam fase gerak dengan pengaduk ultrasonik.

Validasi metode (OSW EPA Method, 316)

Kondisi optimum analisa ditentukan berdasarkan hasil uji kesesuian sistem,


dengan parameter sebagai berikut:

Tahapan validasi metode meliputi :

a. Pembutan kurva kalibrasi dengan larutan standar akrilamida 0,1; 0,2; 0,4; 0,8
dan 1,6 μg/mL.
b. Pengujian batas deteksi dan batas kuantitasi. Batas deteksi dan batas kuantitasi
dihitung secara statistik melalui persamaan regresi linier dari kurva kalibrasi
yang dihasilkan.
c. Uji keterulangan (presisi). Larutan standar 0,1; 0,2; dan 0,4 μg/mL disuntikkan
sebanyak 10 μL kedalam kolom terpilih, diulang sebanyak 5 kali, kemudian
dicatat luas puncaknya dan dihitung koefisien variasinya.
d. Uji perolehan kembali (akurasi)
20 mg standar akrilamida ditimbang, dan ditambahkan sampel roti kering 15
gram. Kemudian dilarutkan dalam 45 mL diklormetan dan ditambahkan 3 mL
etanol, dikocok dengan shaker incubator pada kecepatan 250 rpm selama 60
menit. Lalu sampel dicuci dengan diklormetan 3 mL sebanyak 2 kali pencucian
dan disaring, kemudian filtrat ditambahkan 20 mL fase gerak yang digunakan.
Diklormeten dan etanol diuapkan diatas penangas air pada temperature 70ºC.
Lalu disetrifugase dengan kecepatan 16000 rpm selama 15 menit. Larutan
sampel disaring dengan kertas saring whatman. 10 μL analit disuntikkan
kedalam kolom HPLC. Perlakuan yang sama dilakukan terhadap sampel tanpa
akrilamida. Persen perolehan kembali ditentukan berdasarkan metode standar
adisi.

Penetapan kadar akrilamida dalam produk roti kering

Sampel roti kering yang sudah dihaluskan ditimbang sebanyak 15 gram


kemudian dilarutkan dalam 45 mL diklormetan dan ditambahkan 3 mL etanol,
dikocok dengan incubator shaker pada kecepatan 250 rpm selama 60 menit.
Larutan sampel dicuci dengan diklormetan 3 mL sebanyak 2 kali pencucian dan
disaring, ke dalam filtrat ditambahkan 20 mL fase gerak yang digunakan.
Diklormetan dan etanol diuapkan diatas penangas air pada temperature 70ºC.
Lalu disetrifugase dengan kecepatan 16000 rpm selama 15 menit. Sampel
disuntikkan sebanyak 10 μL kedalam kolom HPLC, kemudian dicatat luas
puncaknya. Percobaan diulang sebanyak 2 kali. Kadar akrilamida dihitung
dengan menggunakan persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi.

 PANJANG GELOMBANG, 210 nm

Kromatogram standar akrilamida 1,6 μg/mL (Fase gerak asetonitril-air (5:95);


kolom Supelcosil C18; volume injeksi 10μL; laju alir 0,5mL/menit; panjang
gelombang 210 nm.
 Analisis Tetrasiklin

JURNAL 1.

Anastasia, Yessy.2011. TEKNIK ANALISIS RESIDU GOLONGAN


TETRASIKLIN DALAM DAGING AYAM SECARA KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI. Buletin Teknik Pertanian Vol. 16, No. 2, 2011: 68-73.

HPLC = Residu antibiotic golongan tetrasiklin


Pelarut = trikloroasetat 20%, buffer Mc Ilvaine-EDTA, methanol
Panjang gelombang

Oksitetrasiklin, 355,04 nm

Tetraskilin, 355,22 nm
Klortetrasiklin, 368,10 nm

Metode :
Pembuatan Larutan Baku
Larutan baku merupakan stok larutan baku yang nantinya akan diencerkan menjadi
larutan baku campuran, kemudian digunakan sebagai larutan baku kerja. Untuk
membuat larutan baku, ditimbang 10 mg standar tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan
klortetrasiklin, kemudian masing-masing dilarutkan dengan metanol lalu dimasukkan ke
dalam labu takar dan ditepatkan hingga 10 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan
standar 1.000 mg/l. Sebanyak 500 μl larutan standar tetrasiklin, 500 μl larutan standar
oksitetrasiklin, 1.000 μl larutan standar klortetrasiklin konsentrasi 1.000 mg/l
dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml, kemudian ditepatkan dengan metanol sehingga
didapat konsentrasi larutan standar campuran antibiotik tetrasiklin (1:1:2) 100:100:200
mg/l.
Pembuatan Larutan Baku Campuran
Larutan baku campuran merupakan larutan baku yang nantinya akan digunakan sebagai
larutan baku kerja, yang diinjeksi setiap akan melakukan analisis dengan menggunakan
alat KCKT. Untuk membuat larutan baku campuran OTC 10 ppm, TC 10 ppm, dan CTC
20 ppm, dipipet 200 μl, larutan baku pembanding oksitetrasiklin 100 ppm, 200 μl,
larutan baku pembanding tetrasiklin 100 ppm, dan 400 μl, larutan baku pembanding
klortetrasiklin, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 2 ml dan dilarutkan dengan
fase gerak hingga tanda dan dikocok hingga homogen. Pembuatan larutan baku
campuran OTC 1 ppm, TC 1 ppm, dan CTC 2 ppm dilakukan dengan memipet 200 μl
larutan baku campuran OTC 10 ppm, TC 10 ppm, dan CTC 20 ppm kemudian
dimasukkan ke dalam labu ukur 2 ml dan dilarutkan dengan fase gerak hingga tanda tera
dan dikocok sampai homogen.
Pembuatan Larutan Trikloroasetat 20%
Larutan trikloroasetat 20% merupakan larutan yang digunakan untuk melarutkan sampel
daging ayam. Pembuatan larutan trikloroasetat dilakukan dengan menimbang 20 g asam
trikloroasetat kemudian dilarutkan dengan akuabides, setelah itu dimasukkan ke dalam
labu takar 100 ml dan ditera dengan akuabides.
Pembuatan Larutan Bufer Mc Illvaine
Larutan bufer Mc Illvaine merupakan larutan yang digunakan untuk mengekstrak
sampel daging ayam. Pembuatan larutan bufer Mc Illvaine dilakukan dengan cara
menimbang masing-masing 11,8 g asam sitrat monohidrat, 13,72 g dinatrium
hidrogenfosfat dihidrat, dan 33,62 g garam dinatrium EDTA, lalu dimasukkan ke dalam
labu takar 1.000 ml, diencerkan, dan ditera dengan akuabides.
Pembuatan Larutan Metanol Oksalat
Larutan metanol oksalat merupakan pelarut untuk elusi kolom SPE, yang di dalamnya
sudah dilewatkan ekstrak sampel daging ayam. Larutan metanol oksalat dibuat dengan
cara menimbang 1.297 g asam oksalat dan dilarutkan dengan metanol p.a, kemudian
dituang ke dalam labu takar 100 ml serta ditera dengan metanol p.a.
Pembuatan Larutan Fase Gerak
Larutan fase gerak merupakan larutan campuran dari berbagai bahan kimia, air, dan
pelarut organik dan digunakan sebagai fase gerak pada alat KCKT. Pembuatan fase
gerak dilakukan dengan cara mencampur 200 ml asam oksalat 0,0025 M dengan 50 ml
asetonitril. Setelah itu, campuran disaring dengan menggunakan penyaring vakum
dengan kertas saring 0,45 μm sehingga diperoleh perbandingan metanol dan asam
oksalat 4:1 (v/v).
Pembuatan Larutan Metanol 5%
Larutan metanol 5% merupakan larutan yang digunakanuntuk mencuci kolom SPE
setelah ekstrak sampel dilewatkan. Pembuatan larutan metanol 5% dilakukan dengan
cara menuang metanol 5 ml ke dalam labu takar 100 ml, kemudian ditera dengan
akuabides.
Proses Ekstraksi Sampel
Sebanyak 5 g daging ayam yang telah digiling, ditempatkandalam tabung sentrifus.
Setelah itu, ditambahkan 2 ml larutan asam trikloroasetat 20% kemudian diaduk.
Sampel ditambahkan 18 ml larutan bufer Mc Ilvaine-EDTA kemudian diputar pada
kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatan hasil sentrifus dipisahkan
dari residunya kemudian dimasukkan ke dalam kolom SPE. Sebelumnya, kolom SPE
diaktifkan terlebih dahulu dengan 20 ml metanol dan 20 ml air. Setelah sampel
dimasukkan, kolom SPE dicuci dengan 20 ml metanol 5%, kemudian kolom SPE
tersebut dielusi dengan 6 ml metanol oksalat. Setelah proses ekstraksi selesai, filtrat
dipindahkan ke dalam aliran gas nitrogen sampai kering, kemudian dilarutkan dengan
250 μl larutan fase gerak. Sebanyak 40 μl sampel dianalisis dengan KCKT Shimadzu
LC-20 AD dengan kondisi alat sebagai berikut:
Kolom : varian Polaris 5 μ C18-A 150 x 4,6 mm
Sistem : fase terbalik
Fase gerak : asam oksalat 0,0025 M - asetonitril (4:1, v/v)
Laju alir : 1 ml/menit
Detektor : Photodiode array (UV), 355 nm dan 368 nm

Perhitungan kadar residu antibiotik golongan tetrasiklin dalam zat uji dilakukan dengan
menggunakan rumus:
As
—— x Cbp x V
Abp
Kadar (μg/g) = ———————
B

di mana:
As = luas puncak zat uji
Abp = luas puncak baku
Cbp = konsentrasi larutan baku (μg/ml)
V = volume akhir (μl)
B = bobot sampel (gram)
 Hasil :
 Analisis Kafein

Jurnal 1. PERBEDAAN KADAR KAFEIN DAUN TEH (Camellia sinensis (L.)


Kuntze) BERDASARKAN STATUS KETINGGIAN TEMPAT TANAM
DENGAN METODE HPLC (Anif dkk, 2016)

Metode:

Preparasi Sampel

Sampel daun teh segar disortasi basah, pencucian, penirisan, pelayuan pada suhu 90oC
selama 8 menit. Setelah itu dilakukan proses penggulungan. Tahap pengeringan ada 2,
tahap I yaitu pada suhu 130oC selama 30 menit dilanjutkan dengan proses pengeringan
tahap II pada suhu 80oC selama 80 menit.

Daun teh yang sudah kering selanjutnya dijadikan serbuk dengan cara digerus
menggunakan mortir kemudian diayak menggunakan ayakan ukuran 40 mesh sehingga
diperoleh serbuk daun teh 39 ukuran 40 mesh. Sampel selanjutnya dilarutkan kemudian
disaring dengan saringan millex 0,45 μm dan diambil sebanyak 20μl kemudian
diinjeksikan ke instrumen KCKT.

Instrumen dioptimasi panjang gelombang UV 275 nm, tekanan pompa 4000 psi, waktu
retensi 5 menit dengan komposisi fase gerak methanol:air dengan perbandingan 30:70,
dan kecepatan elusi 1ml/menit.
2.3. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Masing-masing seri konsentrasi larutan kafein standar yaitu 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm,
300 ppm, dan 400 ppm disaring dengan saringan millex 0,45 μm dan diinjeksikan ke
instrument KCKT. Instrumen dioptimasi panjang gelombang 275 nm, tekanan pompa
4000 psi, dan waktu retensi 5 menit dengan komposisi fase gerak methanol:air dengan
perbandingan 30:70 dan 1ml/menit.

2.4. Analisis Data

Data kadar kafein yang diperoleh dianalisis dengan statistik menggunakan program
SPSS17 menggunakan uji Shapiro-Willk, jika data terdistribusi normal diuji
menggunakan ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%. Besarnya pengaruh ketinggian
tempat tanam terhadap kadar kafein dianalisis menggunakan regresi linier.

Hasil dan Pembahasan:


Adanya perbedaan kadar dalam ketinggian tempat tanam yang berbeda dapat
disebabkan oleh berbagai faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan
tanaman. Lokasi tanam akan berpengaruh pada suhu udara, sinar matahari, kelembaban
udara, dan angin. Unsur-unsur ini sangat berpengaruh terhadap proses pertumbuhan
tanaman. Semakin tinggi suatu tempat semakin rendah suhu udaranya, dan sebaliknya
semakin rendah suatu tempat atau lokasi tanam maka suhu yang terdapat dilokasi
tersebut semakin tinggi.

Jumlah kafein yang terkandung di dalam teh tergantung pada berbagai faktor seperti
jenis daun teh, tempat tumbuhnya tanaman teh, ukuran partikel teh, serta metode dan
lamanya waktu penyeduhan. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa lokasi
perkebunan teh mempengaruhi kadar kafein pada daun teh tersebut
 Analisis Rhodamin B

JURNAL : IDENTIFIKASI RHODAMIN B PADA PRODUK PANGAN DAN


KOSMETIK YANG BEREDAR DI BANDUNG
ALIYA NUR HASANAH , IDA MUSFIROH , NYI MEKAR SAPTARINI,
DRIYANTI RAHAYU(2014)

Pelarut = Etanol
Fase gerak = Metanol : air : Dapar pospat ph 3,05 (70:23:7)
Nama alat = KCKT (Ultimate 3000)
Detektor = UV-Vis
Panjang gelombang = 546 nm dan 544 nm

Metode :
Masing-masing bahan ditimbang (untuk sampel kerupuk dan terasi sebanyak ±
25 gram serta sampel lipstik, eye shadow dan rouge sebanyak ± 10 gram) kemudian
digerus hingga halus dan diekstrak dengan menggunakan etanol (untuk sampel
kerupuk sebanyak ± 50 mL, sampel terasi sebanyak ± 30 mL dan sampel lipstik, eye
shadow serta rouge sebanyak ± 20 mL) selama ± 2 jam. Hasil ekstraksi kemudian
diperiksa dengan spektrofotometer UV-Vis pada rentang l 400-800 nm. Puncak
maksimum pada l 543,355 nm(10) menunjukkan adanya senyawa rhodamin B.
Sampel juga dianalisis menggunakan metode KCKT yang telah divalidasi
sebelumnya untuk pembandingan hasil. Konfirmasi terhadap puncak maksimum
dilakukan melalui spiking larutan baku rhodamin terhadap satu sampel terasi.
 Analisis Formalin dan Methanil Yellow

Jurnal 1. KADAR FORMALIN DAN METANIL YELLOW DALAM MI BASAH YANG


BEREDAR DI PASARAN SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (Ayuningtyas
dkk,2009)

 HPLC = Kadar Formalin dan Metanil Yellow dalam Mie Basah yang Beredar di Pasaran Secara
HPLC

 Pelarut = (NH4)2HPO4 Ph 8.8


NH4OH
Methanol LC grade
Metanil yellow

 Fase gerak = Fase A : (NH4)2HPO4 Fase B : (NH4)2HPO4 : Asetonitril (50:50)

 Nama alat = KCKT (Quatemary Pump)

 Detektor = UV-Vis dan PDA

 Panjang gelombang = 419 nm

 Metode :

Metode analisis HPLC dengan fase gerak A yaitu (NH4)2HPO4 Ph 8.8 dan fase B yaitu
(NH4)2HPO4 ph 8.8 berbanding asetonitril (50:50). Volume injeksi sebesar 10 mikroliter,
detektor PDA UV-VIS pada panjang gelombang 419 nm, menggunakan kolom C-18 Gemini
NX-5mikrometer dengan panjang 250nm dan diameter 4.60 nm.Pembuatan Fase Gerak :
Melarutkan 2.64 gr (NH4)2HPO4 dengan aquabidest sampai 500ml, dihomogenkan, ditambah
NH4OH hingga pH 8.8 dihomogenkan, ditepatkan 1L, kocok. (Fase A).Mencampurkan
asetonitril kualitas kromatografi dengan (NH4)2HPO4 Ph 8.8 dengan perbandingan 50:50
(Fase B).

Menimbang 25 mg standar pewarna metanil yellow, lalu dilarutkan dengan methanol,


lalu dihomogenkan. Dipipet larutan induk ke masing-masing labu ukur, diencerkan dengan
methanol, dihomogenkan, lalu disaring dengan membran filter, dimasukkan dalam vial,
diinjeksikan ke alat HPLC. Menimbang sampel yang telah dihomogenkan sebanyak 2 gram.
Dimasukkan dalam labu ukur, dilarutkan dengan aquadibest, di ultrasonik, kemudian
dihimpitkan dengan methanol. Lalu dikocok hingga homogen, disaring dengan kertas saring,
filtrat disaring dengan membran filter dan dimasukkan dalam vial, diinjeksikan ke alat HPLC.

Hasil Kromatogram
 Analisis Kolesterol

JURNAL : VALIDASI METODE ANALISIS KOLESTROL DALAM TELUR


DENGAN HPLC-ELSD (Lioe, 2013)

Persiapan larutan standar kolesterol

Sejumlah 50 dan 150 mg standar kolesterol powder masing-masing dilarutkan dalam 50 mL fase gerak
HPLC (heksan:isopropanol = 90:10) yang terpisah. Larutan standar stok ini mempunyai konsentrasi 1000
dan 3000 μg/mL. Selanjutnya serial pengenceran larutan stok menggunakan fase gerak sebagai pelarut
dibuat untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 10, 25, 50, 100, 150, 250, 300, 500, 750, 1500, 3000,
dan 7500 μg/mL.
Penyiapan larutan sampel telur (AOAC 976.26. dalam Sullivan dan Carpenter 1993)

Sekitar 3 g sampel telur (sampel telur telah dihomogenkan) ditimbang dalam tabung reaksi bertutup,
selanjutnya ditambahkan 10 mL larutan HCl (4:1) lalu divorteks hingga tercampur. Untuk uji linearitas
metode dengan sampel spiking, sebelum ditambahkan HCl, sampel diberi tambahan kolesterol standar
sebanyak 1 mL dari setiap konsentrasi di atas. Tahap ini dilanjutkan dengan mengembusan gas N 2
selama 30 detik lalu ditutup dengan segera untuk menghindari oksidasi kolesterol. Kemudian
campuran dipanaskan pada penangas air mendidih selama 30 menit, sambil dikocok setiap 5 menit.
Setelah selesai, isi dalam tabung reaksi tersebut didinginkan dengan cara ujung tabung dikenakan air
mengalir. Isi tabung dipindahkan ke dalam labu pemisah (250 mL), tabung reaksi dibilas dengan 2 x 10
mL air bebas ion, lalu air bilasan tersebut digabungkan ke dalam labu pemisah. Kolesterol dalam
sampel yang terdapat dalam tabung diekstraksi dengan heksana 3 x 10 mL sambil dikocok. Fraksi
heksana diambil lalu heksana yang terkandung diuapkan dengan gas N2. Setelah kering, padatan yang
diperoleh ditambahkan 10 mL KOH 2% dalam metanol lalu dipanaskan 80 ºC selama 30 menit.
Komponen kolesterol kemudian diekstraksi dengan heksana 3 x 10 mL dalam labu pemisah dan fraksi
heksana disaring dengan menggunakan kertas saring yang diberi tambahan Na 2SO4 anhidrat 1 2 g.
Heksana yang terkandung dalam fraksi itu diuapkan dengan gas N 2. Setelah kering, padatan dilarutkan
dengan fase gerak pada volume tertentu (1,0 mL) secara tepat. Kemudian larutan tersebut diencerkan
sebanyak 10 kali tingkat pengenceran. Larutan sampel ini siap diinjeksikan ke HPLC.

Penentuan kolesterol dengan HPLC-ELSD

Analisis dengan HPLC-ELSD merupakan hasil pengembangan di laboratorium LDITP milik Departemen
Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dengan kondisi
isokratik menggunakan:

Fase gerak : Heksan: 2-propanol (90:10)

Kolom : silika (25 cm x i.d. 4,6 cm, ukuran partikel 8 μm)

Laju alir : 2 mL/menit

Suhu : 50 ºC

Detektor : ELSD (Sedex 55) dengan tekanan gas N2 sebesar 2,2 bar, Gain 7.

Volume injeksi : 20 μL

Sampel diinjeksikan secara terpisah dari injeksi standar dengan menggunakan kondisi HPLC di atas,
kemudian luas respons dicatat. Kurva standar yang merupakan hubungan linear antara area dan
konsentrasi kolesterol standar dibuat. Selanjutnya luas puncak kolesterol dari kromatogram sampel dibaca
dan dihubungkan dengan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi kolesterol standar dari kurva
(μg/mL). Konsentrasi kolesterol dalam sampel dihitung dengan rumus:
Keterangan:

Fp = faktor pengenceran dari larutan sampel akhir apabila dilakukan pengenceran sebelum larutan
diinjeksikan ke HPLC.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Presisi Instrumen HPLC

Hasil uji presisi instrumen HPLC dengan meng-gunakan larutan kolesterol standar 50 μg/mL dapat dilihat
pada Tabel 1. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa presisi luas puncak maupun waktu retensi dari
puncak kolesterol masing-masing sebesar 2,23 dan 0,59%. Waktu retensi puncak kolesterol rata-rata 1,52
menit. Apabila merujuk JECFA (2006), batas keberterimaan presisi instrumen adalah 2,0%, maka hasil
presisi waktu retensi dapat diterima, sedangkan presisi luas puncak sedikit lebih tinggi daripada batas
tersebut.

Uji Spesifisitas

Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan puncak kolesterol yang diperoleh dari hasil injeksi
larutan standar kolesterol, injeksi larutan hasil per-siapan sampel telur saja, dan injeksi larutan hasil
persiapan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 1 3.
Dalam gambar, kolesterol terdeteksi pada waktu retensi 1,51−1,53 menit. Dalam Gambar 2 terlihat bahwa
sampel telur mempunyai puncak kolesterol yang sama dengan standar kolesterol dalam Gambar 1. Tinggi
puncak kolesterol tersebut meningkat apabila ke dalam sampel yang sama ditambahkan standar kolesterol
(Gambar 3). Dengan demikian, kolesterol dapat terdeteksi dalam matriks sampel telur dengan baik.

Linearitas Metode

Pengujian linearitas motede analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC – ELSD dan matriks
sampel telur menunjukkan linearitas yang baik, yaitu peningkatan respons instrumen yang proporsional
dengan peningkatan konsentrasi kolesterol dalam sampel telur. Ini berarti semakin tinggi konsentrasi
kolesterol standar yang ditambahkan semakin tinggi dan luas puncak kolesterol yang diperoleh, meskipun
tahap persiapan sampel yang dilakukan cukup panjang dan menentukan keakuratan hasil sesuai dengan
hasil review.

Konsentrasi kolesterol standar yang ditambahkan pada pengukuran linearitas ini 50 3000 μg/g sampel.
Hasil pengukuran linearitas metode dapat dilihat pada Gambar 4. Kurva liniearitas metode yang diperoleh
mempunyai nilai R² sebesar 0,997. Nilai ini masuk m m ²≥ 0,990 (EMA 1995). Dengan mengetahui nilai
R² tersebut, disimpulkan bahwa metode analisis kolesterol menggunakan HPLC-ELSD ini memiliki
linearitas yang baik.

Hasil uji linearitas metode yang dilakukan menggunakan HPLC-ELSD ini menunjukkan nilai R2 yang lebih
baik apabila dibandingkan dengan hasil yang diperoleh oleh Osman dan Chin (2006) menggunakan
HPLC-UV/Vis. Penelitian mereka membandingkan metode ekstraksi Bohac yang mempunyai nilai R2
0,993, metode Beyer & Jensen
dengan nilai R2 0,990, dan metode Queensland Health Science Institute mencapai nilai R2 0,941. Ketiga
metode diuji menggunakan instrumen HPLC-UV/VIS detector sebanyak 8 kali ulangan. Fakta ini sejalan
dengan penelitian yang dilakukan oleh Avalli dan Contarini (2005), yang menyatakan bahwa
HPLC-ELSD dapat menghasilkan respons yang linear untuk mengukur fosfolipid di dalam produk susu.

Limit Deteksi Instrumen

Limit deteksi instrumen (LDI) adalah batas konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh instrumen.
Pengujian ini pertama-tama dilakukan dengan menginjeksikan larutan kolesterol standar dari konsentrasi
10,14 1014 μg/mL. H g ini kemudian diplotkan ke dalam sebuah kurva hubungan antara konsentrasi
kolesterol standar dan luas puncaknya. Hasil pengujian ditunjukkan pada Gambar 5. Kurva memiliki
persamaan y = 3,20x – 107 dengan R2 = 0,998. Diketahui bahwa konsentrasi 10,14 dan 25,35 μg/mL, tidak
dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Kolesterol dapat dideteksi mulai pada konsentrasi 50,7 1014 μg/mL.
Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi kolesterol terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah
50,7 μg/mL. Pengujian LDI dilanjutkan dengan 7 kali penginjeksian standar kolesterol pada konsentrasi
50 μg/mL g hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2. LDI dari hasil penelitian ini adalah 1,07 μg/mL.

Limit Kuantitasi (LOQhitung) merupakan batas terendah konsentrasi kolesterol yang dapat di-laporkan, di
bawah konsentrasi ini disebut sebagai ‘ ’ (H m 2004). N LOQ hitung dapat diperoleh dari nilai LDI, yaitu
sebesar 10/3 kali LDI, sehingga diperoleh nilai LOQhitung sebesar 3,57 μg/mL. Nilai ini bila dibandingkan
dengan penelitian Osman dan Chin (2006) jauh lebih baik (Tabel 3).
DAFTAR PUSTAKA

Artanti, Anif Nur., Nikmah, Wahyu Rohmatin., Setiawan, Discus Hendra., dan Prihapsara, Fea. 2016.

“Perbedaan Kadar Kafein Daun Teh (Camelia Sinensis L. Kuntze) Berdasarkan Status Ketinggian
Tempat Tanam dengan Metode .” Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research 37-44

Ayuningtyas, Shenna., Nasharianto, Hussain., dan Herlina, Eka. 2009. “Kadar Formalin dan Metanil

Yellow dalam Mie Basah yang Beredar di Pasaran Seccara HPLC”. Universitas Pakuan Bogor .
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Hasanah, Aliya Nur., Musfiroh, Ida., Saptarini, Nyi Mekar., dan Rahayu, Driyanti. 2014. “Identifikasi

Rhodamin B pada Produk Pangan dan Kosmetik yang Beredar di Bandung”. Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia Vol. 12 No. 1 hlm. 104-109

Hermanto, Sandra., dan Adawiyah, Robiatul. 2010. “Analisis Kadar Akrilamida dalam Sediaan Roti

Kering Secara HPLC”. Valensi Vol.2 No.1 (354-361)

Sengke, Clara A., Citraningtyas, Gaytri., dan Wehantouw,Frenly. 2013. “Analisis Kandungan

Akrilamida Dalam Ubi Goreng yang Dijual Di Kota Manado Menggunakan Kromatografi
CairKinerja Tinggi (KCKT)”. Jurnal Ilmiah Farmasi-Unsrat Vol.2 No. 03

Lioe,Hanifah Nuryani., Setianingrum, Tika., dan Anggraeni,Ririn. 2013. “Validasi Metode Analisis

Kolestrol dalam Telur dengan HPLC-ELSD”. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia (JIPI) Vol. 18 (3)

Lioe, Hanifah Nuryani., Warnasih, Siti., dan Sutanto. 2013. “Validasi Analisis Beta Karoten dengan

HPLC-MWD Pada Matriks Sampel Minyak Sawit”. Penguatan Penelitian dan Pemgembangan
Industri Kelapa Sawit yang Berkelanjutan ISBN :978-602-146689-0-2

Serlahwaty, Diana., Farida, Yunahara., dan Asriyana, Tri. 2009.” Penetapan Kadar B-Karoten dalam

Buah Paprika Merah, Kuning, dan Hijau (Capsicum Annuum Var. Annuum L.) Secara Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi”. Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jagaskara Jakarta

Syahputra, M.Rio.,Karwur, Ferry F., dan Limantara, Leenawaty. 2008.“ Analisis Komposisi dan

Kandungan Karotenoid Total dan Vitamin A Fraksi Cair dan Padat Minyak Sawit Kasar (CPO)
Menggunakan KCKT Detektor PDA”. Jurnal Natur Indonesia 10 (2) 89-97

Yessy, Anastasia. 2011. “Teknik Analisis Residu Golongan Tetrasiklin dalam Daging Ayam Secara

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Buletin Teknik Pertanian Vol.16 No.2 hlm 68-73