IIB-UNSAM
Introducción a los
Bioprocesos
Gastón Ortiz
gas.ortiz@gmail.com
Introducción a los Bioprocesos
Una breve historia
Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y más tarde las
chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
Sin embargo, pasan casi 7000 años para descubrir el
origen microbiano de la fermentación (1856).
Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
químicos industriales (1900).
70 años más para obtener el primer organismo transgénico
(1972).
Y 5 años más para la obtención de la primera proteína
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
Introducción a los Bioprocesos
¿Que es un bioproceso?
Es todo proceso industrial que involucra la manipulación
Biocatalizador
Enzimas,
células
inmovilizadas
Downstream Process
Introducción a los Bioprocesos
Aspectos básicos de un proceso Biotecnológico
Upstream Processing Process Downstream Processing
Antibióticos
Enzimas
Sistemas de expresión heteróloga
Son utilizados para la producción de proteínas
recombinantes
Ventajas
Sistemas preparados para una finalidad determinada
Amplia variedad de hospedadores
Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de selección, etc.)
Desventajas
No siempre el producto final posee las mismas
características que el deseado.
Es por eso que debemos poner énfasis en elegir el mejor
sistema de expresión para nuestro fin
Sistemas de expresión heteróloga
Ventajas
Unicelular eucariota, fácil crecimiento y manipulación
Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilación, acetilación, fosforilación, eliminación del Met-
1, procesamiento proteolítico de precursores)
Fácilmente escalable
Bajo o nulo nivel de endotoxinas
Proteínas extracelulares e intracelulares
Desventajas
Baja eficiencia de transformación
Hiperglicosilación (S. cerevisiae principalmente)
Crecimiento microbiano
En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen
hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)
También puede detenerse el crecimiento por acumulación de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:
Estequiométrico:
Nos permite conocer la concentración final de microorganismos a
obtener a partir de datos de la composición del medio de cultivo,
saber si hay formación de algún producto, etc.
Cinético:
Nos dice con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.
Crecimiento microbiano (Estequiometría)
Rendimientos
Dada la ecuación de crecimiento microbiano
Para poder conocer la Estequiometría del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:
Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energía consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)
Supuestos de Monod
•El proceso difusión del sustrato limitante
es rápido comparado con la cinética de
crecimiento
•El sustrato es metabolizado por una
única E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
•El proceso sigue la cinética de
Michaelis-Menten
Crecimiento microbiano (Cinética)
¿De que factores depende el µ ?
La composición del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al µ
El sustrato limitante
S >> Ks µ = µm
S<< Ks µ = f (S)
Crecimiento microbiano (Cinética)
¿De que factores depende el µ ?
pH
10 g/l FCE
Crecimiento microbiano (Cinética)
Mantenimiento celular
Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como
Fick
JO2 = -DO2 . (dC/dL)
Henry
C* = PO2 / H
Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.
Agitación: si aumenta la agitación aumenta el Kla por que:
Disminuye el espesor de la película (pendiente mas pronunciada)
Tipo Celular
µmax Kla apropiado
Velocidad de Velocidad de
salida consumo
Velocidad de Velocidad de Velocidad de
acumulación ingreso formación
Acumulación de volumen
Como V= cte
Descripción matemática del Batch en fase
exponencial
En estas condiciones el
proceso será mayor ¿Por
microorganismo continua creciendo qué?
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno
Características de un cultivo batch
La duración del cultivo batch depende
esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.
Una vez inoculado el medio, la concentración de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.
Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.
El crecimiento puede cesar también por la
acumulación de algún producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)
Cultivo continuo
Batch Cult. continuo
Se inicia
con un
batch
Ecuación de diseño de un cultivo continuo
Cult. continuo
Despejando V Donde D = F / V y es la
velocidad de dilución.
En el estado estacionario
Balances de materia en continuo
Biomasa
Situación real
cuando tengo
mantenimiento
Velocidad Dc
óptima de Dilución critica
operación 80% cuando el D es
del µmax igual al µmax
Cultivo continuo
Aplicaciones del cultivo continuo
Permite obtener los parámetros de crecimiento µmax, ms,
Ks, Y’x/s, entre otros.
Permite realizar estudios fisiológicos.
Podemos discriminar los efectos de la velocidad de
crecimiento µ, de la composición del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiología celular del
microorganismo.
Permite realizar estudios de ingeniería metabólica.
Inconvenientes del cultivo continuo
Inestabilidad genética de la cepa en cultivos extendidos
(perdida de plásmidos)
Riesgos de contaminación en cultivos extendidos.
Cultivo Batch Alimentado
En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentación esto permite mantener
controlada la concentración “Ci”
dentro del reactor.
unicelulares.
Productos
Productos de bajo peso molecular: alcoholes,
ác. orgánicos, aa, nucleótidos, antibióticos, etc.
Tipo I: Productos finales del catabolismo anaeróbico
Bajo
(la formación de Batch alimentado
III Aerobio producto consume
Bajo
Cultivo continuo
energía)
Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
Biomasa Aerobio Bajo
productos).
Batch alimentado
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae
Productos de alto peso molecular
En este grupo tenemos: polisacáridos, proteínas,
antígenos, enzimas, etc.
Es importante entender la cinética de formación le estos
productos, para ello definimos:
La concentración intrínseca de nuestro producto i (enzima,
antígeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)
Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.proteínas, UE, etc y X son los g.biomasa.
Por otra parte la velocidad neta de formación de nuestro producto será igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.
D (h-1) Ri (UE/mg.biomasa)
0,1 8,25
0,25 18,3
Downstream Processing
1. SEPARACIÓ
SEPARACIÓN CELULAR Intracelular
remoció
remoción del
componente mámás 2. DISRUPCIÓ
DISRUPCIÓN CELULAR
abundante
3. REMOCIÓ
REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES
Es muy importante la elecció
elección del Y DESECHOS
PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayorí
mayoría de los Extracelular
contaminantes. Los pasos 4. CONCENTRACIÓ
CONCENTRACIÓN
subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor
importancia 5. PURIFICACIÓ
PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓ
RESOLUCIÓN
6 ACABADO
Downstream Processing
1. Remoción celular: centrifugación y filtración.
2. Disrupción celular y separación de restos celulares:
• Homogenizadores: La técnica más recomendada para alta escala son los
homogeinizadores (Gaulin homogenizer).
• Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.
• La concentración celular no afecta la eficiencia
• Es necesario refrigerar (4-5ºC)
• Los modelos más grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
• Molinos de perlas
• Las células se rompen mediante la abración generada por pequeñas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm φ)
• concentración de células afecta la eficiencia, la concentración óptima ∼ 30-60% peso
húmedo
• Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h
• Ruptura química o enzimática
• Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
Downstream Processing
3. Separación de restos celulares
• centrifugación (no adecuada)
• Ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor)
• Microfiltración (0.1µ m.)
• Partición en dos fases acuosas
• CDR (cell Debris Remover: Whatman)
4. Concentración
• Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.
• Técnica preferida : Ultrafiltración
• partición líquido-líquido. Extracción con solventes
• Precipitación (sulfato de NH4)
• Evaporación o destilación
Downstream Processing