Anda di halaman 1dari 70

ARETHA MEDIKA UTAMA

Biomolecular and Biomedical Research Center


HASIL UJI ANTIAGING/PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM
ELASTASE (In Vitro)
A. Nama Peneliti :

B. Institusi :
C. Sampel :
 B
 Q (Chengdu..Lt…)

D. Prosedur yang dikerjakan:


 Pengujian inhibisi enzim elastase oleh B, Q

UJI ELASTASE
A. Konsentrasi uji :
 Ekstrak Q (kontrol):
a. working solution : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.3; 3.1 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)
 Ekstrak B :
a. working solution : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.3; 3.1 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)

B. Metode : Inhibisi Enzim Elastase


C. Prinsip :
Elastase merupakan salah satu protease Chymotrypsin yang berperan penting dalam kerusakan
elastin, protein yang biasanya ditemukan dengan ECM.

Elastase
SucAla3-pNA + H2O SucAla3 + pNA

Metode yang digunakan adalah dengan mengukur kadar SucAla3 (N-Succinyl-Ala-Ala-Ala).


Perubahan warna kuning yang dihasilkan menjadi indikator terjadinya reaksi. Semakin tinggi

1
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
kemampuan sampel dalam menghambat aktivitas elastase, maka semakin berkurang SucAla3 yang
terbentuk (Warna kuning sedikit/bening).

D. Sitasi :
1. Sigma Aldrich. Protocol for Elastase.
2. Thring, TSA.,Hili, P., dan Naughton, DC. Anti-collagenase, anti-
elastase and anti-oxidant activities of extracts from 21 plants.BMC
Complementary and Alternative Medicine. 2009. 9:27
3. Widowati W, Rani AP, Hamzah RA, Arumwardana S, Afifah E,
Kusuma HSW, Rihibiha DD, Nufus H and Amalia A, 2017.
Antioxidant and antiaging assays of Hibiscus sabdariffa extract and
its compounds. Nat. Prod. Sci. 23(3): 192-200
4. Widowati W, Fauziah N, Heridman H, Afni M, Afifah E, Kusuma
HSW, Nufus H, Arumwardana S and Rihibiha DD, 2016.
Antioxidant and anti aging assays of Oryza sativa extracts, vanillin
and coumaric acid. J. Nat. Remed. 16(3): 88-99.
5. Widowati W, Janeva WB, Nadya S, Amalia A, Arumwardana S,
Kusuma HSW, Arinta Y. Antioxidant and Antiaging Activities of
Jasminum Sambac Extract, and its Compounds, 2018. J. Reports
Pharmaceutic. Sci. 7(3):270-285

PROSEDUR

Bahan:
 N-Sucanyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, elastase substrate (Sigma 54760)
 Elastase from porcine pancrease (Sigma 45124)
 Tris (Phamacia Biotech 17-1321-01)
 Sodium Chloride (Merck 1064040500)
 Akuades
 Hydrochloric acid solution (Merck 109057)
Alat:
 pH meter (OHAUS, Starter 300 pH Portable)
 Beaker glass
 Multiskan Go Reader (Thermo Fisher Scientific)
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)

2
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)
 Rotator (Thermo Fisher Scientific)

Cara Kerja:
Penghambatan aktivitas enzim elastase diukur berdasarkan metode yang telah dijabarkan
oleh Sigma Aldrich dan Thring et al. (2009) dengan sedikit modifikasi. Campuran larutan yang
terdiri dari 10 µL sampel (0.78 – 50 µg/mL), 5 µL enzim Elastase from porcine pancrease (0.01
mg/mL, Sigma 45124) dan 125 µL buffer tris (100 mM, pH 8, Phamacia Biotech 17-1321-01)
diinkubasi pada suhu 25°C selama 15 menit. Selain itu disiapkan juga untuk kontrol yang hanya
berisi 5 µL enzim dan 135 µL buffer tris serta blanko yang hanya berisi 130 µL buffer tris dan 10
µL sampel. Selanjutnya, campuran larutan tersebut ditambahkan sebanyak 10 µL substrat SucAla3-
pNA dan diinkubasi kembali pada suhu 25°C selama 15 menit. Absorbansi diukur menggunakan
panjang gelombang 410 nm.

Persentasi aktivitas penghambatan dihitung dengan menggunakan rumus :


𝐶−𝑆
% inhibisi = x 100
𝐶
C : absorbansi aktivitas enzim tanpa sample
S : absorbansi aktivitas enzim dengan penambahan sample yang diuji

Inkubasi selama 15
Elastase, buffer Tris-HCl, dan sampel
menit di suhu 25°C
dimasukan dalam 96 well plate

3
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Absorbasi diukur Inkubasi selama 15 Ditambahkan


pada 410 nm menit di suhu 25°C substrat SucAla3-
pNA

4
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI ELASTASE B dan Q

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q Penghambatan Elastase

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Control Control Control
B Q50 Q50 Q50 Blank Blank B50 B50 B50
C Q25 Q25 Q25 Blank Blank B25 B25 B25
D Q12.5 Q12.5 Q12.5 Blank Blank B12.5 B12.5 B12.5
E Q6.25 Q6.25 Q6.25 Blank Blank B6.25 B6.25 B6.25
F Q3.12 Q3.12 Q3.12 Blank Blank B3.12 B3.12 B3.12
G Q1.56 Q1.56 Q1.56 Blank Blank B1.56 B1.56 B1.56
H Q0.75 Q0.75 Q0.75 Blank Blank B0.75 B0.75 B0.75

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Elastase

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0581 0.0540 0.0585
B 0.1281 0.1267 0.1285 0.1365 0.0725 0.0992 0.0997 0.0971
C 0.1165 0.1176 0.1169 0.0986 0.0687 0.1076 0.1077 0.1067
D 0.1235 0.1217 0.1232 0.0944 0.0678 0.1095 0.1091 0.1115
E 0.1075 0.1041 0.1075 0.0710 0.0670 0.1129 0.1113 0.1110
F 0.1004 0.1017 0.1007 0.0663 0.0650 0.1115 0.1105 0.1119
G 0.1008 0.0989 0.0985 0.0622 0.0644 0.1125 0.1131 0.1134
H 0.0917 0.0907 0.0906 0.0549 0.0640 0.1145 0.1137 0.1127

5
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Penghambatan Elastase Oleh B dan Q

Work Fin absorbance absorbance corrected inhibition


Sample Sol Cont. 1 2 3 Blank 1 2 3 average 1 2 3 average Stdev
Control 0.0581 0.0540 0.0585 0.0569
200.0 50.00 0.1281 0.1267 0.1285 0.1365 -0.0084 -0.0098 -0.0080 114.77 117.23 114.07 115.36 1.66
100.0 25.00 0.1165 0.1176 0.1169 0.0986 0.0179 0.0190 0.0183 68.52 66.59 67.82 67.64 0.98
50.0 12.50 0.1235 0.1217 0.1232 0.0944 0.0291 0.0273 0.0288 48.83 51.99 49.36 50.06 1.70
Q 25.0 6.25 0.1075 0.1041 0.1075 0.0710 0.0365 0.0331 0.0365 35.81 41.79 35.81 37.81 3.45
12.5 3.13 0.1004 0.1017 0.1007 0.0663 0.0341 0.0354 0.0344 40.04 37.75 39.51 39.10 1.20
6.3 1.56 0.1008 0.0989 0.0985 0.0622 0.0386 0.0367 0.0363 32.12 35.46 36.17 34.58 2.16
3.1 0.78 0.0917 0.0907 0.0906 0.0549 0.0368 0.0358 0.0357 35.29 37.05 37.22 36.52 1.07
200.0 50.00 0.0992 0.0997 0.0971 0.0725 0.0267 0.0272 0.0246 53.05 52.17 56.74 53.99 2.43
100.0 25.00 0.1076 0.1077 0.1067 0.0687 0.0389 0.0390 0.0380 31.59 31.42 33.18 32.06 0.97
50.0 12.50 0.1095 0.1091 0.1115 0.0678 0.0417 0.0413 0.0437 26.67 27.37 23.15 25.73 2.26
B 25.0 6.25 0.1129 0.1113 0.1110 0.0670 0.0459 0.0443 0.0440 19.28 22.10 22.63 21.34 1.80
12.5 3.13 0.1115 0.1105 0.1119 0.0650 0.0465 0.0455 0.0469 18.23 19.99 17.53 18.58 1.27
6.3 1.56 0.1125 0.1131 0.1134 0.0644 0.0481 0.0487 0.0490 15.42 14.36 13.83 14.54 0.81
3.1 0.78 0.1145 0.1137 0.1127 0.0640 0.0505 0.0497 0.0487 11.20 12.60 14.36 12.72 1.59

6
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
140.00

aktivitas antielastase (%)


120.00 y = 1.6442x + 30.321
R² = 0.9857
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 1. Grafik penghambatan elastase Q (pengulangan 1)

140.00
120.00 y = 1.6308x + 32.295
R² = 0.9871
100.00
aktivitas antielastase (%)

80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
konsentrasi (µg/ml)

Gambar 2. Grafik penghambatan elastase oleh Q (pengulangan 2)

7
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

120.00

aktivitas antielastase (%)


100.00
80.00
y = 1.5898x + 31.745
60.00
R² = 0.9818
40.00
20.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 3. Grafik penghambatan elastase oleh Q (pengulangan 3)

140.00
y = 1.6216x + 31.454
120.00 R² = 0.9873
Aktivitas Antielastase (%)

100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 4. Grafik penghambatan elastase oleh Q (rata-rata)

8
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
60.00
y = 0.7845x + 13.703
50.00
R² = 0.9656

Aktivitas Antielastase (%)


40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 5. Grafik penghambatan elastase oleh B (pengulangan 1)

60.00
50.00 y = 0.7417x + 14.976
R² = 0.9524
40.00
aktivitas antielastase (%)

30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 6. Grafik penghambatan elastase oleh B (pengulangan 2)

9
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
60.00
y = 0.8481x + 13.636
50.00
R² = 0.9825

Aktivitas Antielastase (%)


40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 7. Grafik penghambatan elastase oleh B (pengulangan 3)

60.00

50.00 y = 0.7914x + 14.105


R² = 0.975
Aktivitas Antielastase (%)

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 8. Grafik penghambatan elastase oleh B (rata-rata)

10
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Nilai IC50 aktivitas penghambatan enzim elastase oleh B dan Q

Sampel Persamaan R² IC50 Rata-Rata IC50


(µg/ml) (µg/ml)
Q1 y = 1,6442x + 30,321 0.9857 11.97
Q2 y = 1,6308x + 32,295 0.9871 10.86
Q3 y = 1,6621x + 29,941 0.9566 12.07
Rata-rata y = 1,6457x + 30,852 0.9925 11.64 11,64±0,67
B1 y = 0,7845x + 13,703 0.9656 46.27
B2 y = 0,7417x + 14,976 0.9524 47.22
B3 y = 0,8481x + 13,636 0.9825 42.88
Rata-rata y = 0,7914x + 14,105 0.975 45.35 45,35 ±2,2

11
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL UJI ANTIAGING/PENGAHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM
HYALURONIDASE (In Vitro)
A. Nama Peneliti :
B. Institusi :
C. Sampel :
 B
 Q

D. Prosedur yang dikerjakan:


 Pengujian inhibisi enzim hyaluronidase oleh B, Q

UJI HYALURONIDASE
E. Konsentrasi uji :
 Q (kontrol):
a. working solution : 300.0; 150.0; 75.0; 37.5; 18.8; 9.4; 4.7 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)
 Ekstrak B :
a. working solution : 300.0; 150.0; 75.0; 37.5; 18.8; 9.4; 4.7 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)

F. Metode : Inhibisi Enzim Hyaluronidase


G. Prinsip :
Hyaluronidase merupakan salah satu kelompok protease yang berfungsi dalam degradasi
hyaluronic acid (HA), salah satu konstituen matriks ekstraseluler (ECM), dengan mengkatalisis
reaksi hidrolisi hyaluronan. Hyaluronidase menurunkan viskositas hyaluronan sehingga
meningkatkan permeabilitas ECM dan jaringan.

Hyaluronidase β-D-(1-3) glucuronic acid + β-D-(1-4)-N-


Hyaluronic acid (HA) Acetyleglucosamine

Aktivitas enzim hyaluronidase pada metode ini dapat dideteksi dengan mengukur kadar HA. HA
dapat diukur karena kemampuannya dapat membentuk turbiditas (kekeruhan) saat bereaksi dengan

12
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
larutan albumin acid. Turbiditas yang dapat ditangkap mulai dari panjang gelombang 540 nm ini
proporsional terhadap konsentrasi HA yang secara langsung berkaitan dengan aktivitas enzim
hyaluronidase. Aktivitas penghamabtan enzim hyaluronidase ditandai dengan semakin tinggi
konsentrasi HA yang tersisa setelah reaksi dihentikan.

H. Sitasi :
1. Sigma Aldrich. Enzymatic Assay of Hyaluronidase.
2. Tu P.T., Tawata S. Anti-Oxidant, Anti-Aging, and Anti-
Melanogenic Properties of the Essential Oils from Two Varieties of
Alpinia zerumbet. Molecules. 20(9): 16.723 – 16.740.
3. Widowati W, Rani AP, Hamzah RA, Arumwardana S, Afifah E,
Kusuma HSW, Rihibiha DD, Nufus H and Amalia A, 2017.
Antioxidant and antiaging assays of Hibiscus sabdariffa extract and
its compounds. Nat. Prod. Sci. 23(3): 192-200
4. Widowati W, Fauziah N, Heridman H, Afni M, Afifah E, Kusuma
HSW, Nufus H, Arumwardana S and Rihibiha DD, 2016.
Antioxidant and anti aging assays of Oryza sativa extracts, vanillin
and coumaric acid. J. Nat. Remed. 16(3): 88-99.
5. Widowati W, Janeva WB, Nadya S, Amalia A, Arumwardana S,
Kusuma HSW, Arinta Y. Antioxidant and Antiaging Activities of
Jasminum Sambac Extract, and its Compounds, 2018. J. Reports
Pharmaceutic. Sci. 7(3):270-285

PROSEDUR

Bahan:
 Sodium phosphate monobasic (Merck 567545)
 Hyaluronic acid, (Sigma H5542)
 Hyaluronidase from bovine testes type I-S (Sigma H3506)
 Sodium chloride (Merck 1064040500)
 Akuades
 Bovine Serum Albumin (Sigma A4503)
 Sodium Acetate (Merck 1062681000)
 Acetic Acid (Merck 100063)

13
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
 Hydrochloride acid solution (Merck 109057)
 Sodium hydroxide (Merck 106498)

Alat:
 pH meter (OHAUS Starter300 portable)
 Tabung Erlenmeyer
 Spatula
 Magnetic stirrer and hot plate (Thermo Fisher Scientific)
 Multiskan Go Reader (Thermo Fisher Scientific 1510)
 Incubator (ESCO IFA-32-8)
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

Cara Kerja :
Penghambatan aktivitas enzim hyaluronidase diukur berdasarkan metode yang telah
dijabarkan oleh Sigma Aldrich dan Tu & Tawata (2015) dengan sedikit modifikasi. Campuran
larutan yang terdiri dari 25 µL sampel (0.78 – 50 µg/mL), 3 µL enzim hyaluronidase from bovine
testes type I-S (0.02 mg/mL, Sigma H3506), dan 12 µL buffer fosfat (300 mM, pH5.35, Sigma
0751) diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. Selain itu disiapkan juga untuk kontrol yang
hanya berisi 3 µL enzim dan 37 µL buffer fosfat serta blanko yang hanya berisi 15 µL buffer fosfat
dan 25 µL sampel. Selanjutnya, campuran larutan tersebut ditambahkan sebanyak 10 µL substrat
hyaluronic acid dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 45 menit. Larutan STOP berupa
acidic albumin ditambahkan sebanyak 100 µL ke dalam larutan dan diamkan di suhu ruang selama
10 menit. Absorbansi diukur menggunakan panjang gelombang 600 nm.

14
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Persentasi aktivitas penghambatan dihitung dengan menggunakan rumus :
𝐶−𝑆
% inhibisi = x 100
𝐶
C : absorbansi aktivitas enzim tanpa sample
S : absorbansi aktivitas enzim dengan penambahan sample yang diuji

Inkubasi selama 10
Hyaluronidase, buffer fosfat, dan
menit di suhu 37°C
sampel dimasukan dalam 96 well
plate

Absorbasi diukur Inkubasi selama 45 Ditambahkan


pada 600 nm menit di suhu substrat hyaluronic
setelah inkubasi 37°C, ditambahkan acid
10 menit pada larutan STOP
suhu ruang (acidic albumin)

15
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI HYALURONIDASE B dan Q

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Hyaluronidase

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Control Control Control
B Q50 Q50 Q50 Blank B50 B50 B50 Blank
C Q25 Q25 Q25 Blank B25 B25 B25 Blank
D Q12.5 Q12.5 Q12.5 Blank B12.5 B12.5 B12.5 Blank
E Q6.25 Q6.25 Q6.25 Blank B6.25 B6.25 B6.25 Blank
F Q3.12 Q3.12 Q3.12 Blank B3.12 B3.12 B3.12 Blank
G Q1.56 Q1.56 Q1.56 Blank B1.56 B1.56 B1.56 Blank
H Q0.75 Q0.75 Q0.75 Blank B0.75 B0.75 B0.75 Blank

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Hyaluronidase

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.0508 0.0471 0.0478
B 0.0756 0.0722 0.0753 0.0659 0.0735 0.0728 0.0739 0.0464
C 0.0710 0.0722 0.0732 0.0461 0.0832 0.0841 0.0819 0.0459
D 0.0790 0.0783 0.0786 0.0447 0.0881 0.0896 0.0892 0.0449
E 0.0835 0.0829 0.0811 0.0441 0.0897 0.0896 0.0899 0.0439
F 0.0842 0.0836 0.0841 0.0434 0.0907 0.0904 0.0909 0.0435
G 0.0861 0.0827 0.0872 0.0427 0.0914 0.0912 0.0916 0.0420
H 0.0836 0.0822 0.0849 0.0400 0.0918 0.0915 0.0917 0.0418

16
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Penghambatan Hyaluronidase Oleh B dan Q

Work Sol Fin Absorbance Absorbance Corrected Inhibition


Sampel Blank Average Average STDEV
(ug/ml) Cont.(ug/ml) 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Control 0.0508 0.0471 0.0478 0.0486
300 50.00 0.0756 0.0722 0.0753 0.0659 0.0097 0.0063 0.0094 80.03 87.03 80.65 82.57 3.88
150 25.00 0.0710 0.0722 0.0732 0.0461 0.0249 0.0261 0.0271 48.73 46.26 44.20 46.40 2.27
75 12.50 0.0790 0.0783 0.0786 0.0447 0.0343 0.0336 0.0339 29.38 30.82 30.20 30.13 0.72
Q 37.5 6.25 0.0835 0.0829 0.0811 0.0441 0.0394 0.0388 0.0370 18.87 20.11 23.82 20.93 2.57
18.8 3.13 0.0842 0.0836 0.0841 0.0434 0.0408 0.0402 0.0407 15.99 17.23 16.20 16.47 0.66
9.4 1.56 0.0861 0.0827 0.0872 0.0427 0.0434 0.0400 0.0445 10.64 17.64 8.37 12.22 4.83
4.7 0.78 0.0836 0.0822 0.0849 0.0400 0.0436 0.0422 0.0449 10.23 13.11 7.55 10.30 2.78
300 50.00 0.0735 0.0728 0.0739 0.0464 0.0271 0.0264 0.0275 44.20 45.64 43.38 44.41 1.15
150 25.00 0.0832 0.0841 0.0819 0.0459 0.0373 0.0382 0.0360 23.20 21.35 25.88 23.47 2.28
75 12.50 0.0881 0.0896 0.0892 0.0449 0.0432 0.0447 0.0443 11.05 7.96 8.79 9.27 1.60
B 37.5 6.25 0.0897 0.0896 0.0899 0.0439 0.0458 0.0457 0.0460 5.70 5.90 5.28 5.63 0.31
18.8 3.13 0.0907 0.0904 0.0909 0.0435 0.0472 0.0469 0.0474 2.81 3.43 2.40 2.88 0.52
9.4 1.56 0.0914 0.0912 0.0916 0.0420 0.0494 0.0492 0.0496 -1.72 -1.30 -2.13 -1.72 0.41
4.7 0.78 0.0918 0.0915 0.0917 0.0418 0.0500 0.0497 0.0499 -2.95 -2.33 -2.75 -2.68 0.31

17
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

100.00

Aktivitas Antihyaluronidase
y = 1.4262x + 10.337
80.00 R² = 0.9953
60.00
(%) 40.00

20.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 1. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh Q (pengulangan 1)

100.00
Aktivitas Antikolagenase

y = 1.4902x + 11.46
80.00 R² = 0.9977
60.00
(%)

40.00

20.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsenrasi (µg/mL)

Gambar 2. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh Q (pengulangan 2)

90.00
80.00
Aktivitas Antihyaluronidase

70.00 y = 1.3696x + 11.904


R² = 0.9857
60.00
50.00
40.00
(%)

30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 3. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh Q (pengulangan 3)

18
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

90.00

Aktivitas Antihyaluronidase (%)


80.00
70.00
60.00 y = 1.4376x + 10.91
R² = 0.998
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 4. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh Q (rata-rata)

50.00
Aktivitas Antihyaluronidase

y = 0.9348x - 1.4934
40.00 R² = 0.9912

30.00
(%)

20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-10.00
Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 5. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh B (pengulangan 1)

19
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
50.00

Aktivitas Antihyaluronidase
y = 0.9425x - 1.8377
40.00 R² = 0.9911
30.00

(%)
20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-10.00
Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 6. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh B (pengulangan 2)

50.00
Aktivitas Antihyaluronidase (%)

y = 0.9418x - 1.7987
40.00
R² = 0.9821
30.00

20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-10.00
Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 7. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh B (pengulangan 3)

50.00
Aktivitas Antihyaluronidase

40.00

30.00 y = 0.9397x - 1.7099


R² = 0.9917
(%

20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-10.00
Konsentrasi (µg/ml)

20
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Gambar 8. Grafik penghambatan hyaluronidase oleh B (rata-rata)

Nilai IC50 aktivitas penghambatan enzim hyaluronidase oleh B dan Q

Sampel Persamaan R2 IC50 Rata-rata IC50


(µg/ml) (µg/ml)
Q1 1,4262x + 10,337 0.9953 27.81
Q2 1,4902X + 11,46 0.9977 25.86 27.16±1.13
Q3 1,3696x + 11,904 0.9857 27.82
Rata-rata Q 1,4287x + 11,234 0.9983 27.13
B1 0,9348x - 1,4934 0.9912 55.08
B2 0,9425x - 1,8377 0.9911 55.00 55.03±0.05
B3 0,9418x - 1,7987 0.9821 55.00
Rata-rata B 0,9397x - 1,7099 0.9917 55.03

21
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

HASIL UJI ANTIAGING/PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM


KOLAGENASE (In Vitro)
A. Nama Peneliti :
B. Institusi : Universitas Jendral Ahmad Yani
C. Sampel :
 B
 Q

D. Prosedur yang dikerjakan:


 Pengujian inhibisi enzim kolagenase oleh B, Q

UJI KOLAGENASE
I. Konsentrasi uji :
 Q (kontrol):
a. working solution : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.3; 3.1 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)
 Ekstrak B :
a. working solution : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.3; 3.1 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)

J. Metode : Inhibisi Enzim Kolagenase


K. Prinsip :
Kolagenase salah satu enzim yang berada di kelompok metalloproteinase yang berperan penting
dalam mendegradasi kolagen, salah protein struktural yang membentuk ECM dalam jaringan ikat
hewan.

collagenase
FALGPA FAL + Gly – Pro – Ala

Metode yang digunakan adalah dengan mereaksikan enzim kolagenase (dari bakteri Clostridium
histolyticum) dengan suatu substrat yaitu FALGPA (N-(3-[2-Furyl] acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala),
peptida sintetis yang memimik struktur kolagen. Collagenase memotong ikatan X – Gly sehingga

22
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
reaksi pemecahan FALGPA oleh collagenase menjadi FAL (N-(3[2-Furyl] acryloyl)-Leu) dan
sekuens Gly – Pro – Ala. Pengukuran aktivitas enzimatik dari kolagenase dapat dideteksi secara
spektrofotometri pada ±340 nm yaitu melalui penurunan absorbansi dari substrat setelah
direaksikan dengan enzim.

L. Sitasi :
1. Sigma Aldrich. Protocol for Collagenase Activity.
2. Wittenauer J., Mackle S., Submann D., Schweiggert-Weisz U.,
Carle R. Inhibitory effects of polyphenols from grape pomace
extract on collagenase and elastase activity. Fitoterapia. 2015. 101:
179 – 187.
3. Widowati W, Rani AP, Hamzah RA, Arumwardana S, Afifah E,
Kusuma HSW, Rihibiha DD, Nufus H and Amalia A, 2017.
Antioxidant and antiaging assays of Hibiscus sabdariffa extract and
its compounds. Nat. Prod. Sci. 23(3): 192-200
4. Widowati W, Fauziah N, Heridman H, Afni M, Afifah E, Kusuma
HSW, Nufus H, Arumwardana S and Rihibiha DD, 2016.
Antioxidant and anti aging assays of Oryza sativa extracts, vanillin
and coumaric acid. J. Nat. Remed. 16(3): 88-99.
5. Widowati W, Janeva WB, Nadya S, Amalia A, Arumwardana S,
Kusuma HSW, Arinta Y. Antioxidant and Antiaging Activities of
Jasminum Sambac Extract, and its Compounds, 2018. J. Reports
Pharmaceutic. Sci. 7(3):270-285

PROSEDUR

Bahan:
 N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-leu-gly-Pro-Ala (FALGPA) (Sigma F5135)
 Collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma C8051)
 Tricine (Sigma SA10377)
 Calcium Chloride (Merck 1023821000)
 Sodium Chloride (Merck 106406)
 Akuades
 Dymethilsufoxide (Merck 1.02931.1000)
 Hydrochloric acid solution (Merck 109057)

23
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Alat:
 pH meter (OHAUS Starter300 Portable)
 Beaker glass (IWAKI CTE33)
 Spatula
 Multiskan Go Reader (Thermo Fisher Scientific 1510)
 Incubator (ESCO IFA-32-8)
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

Cara Kerja:
Penghambatan aktivitas enzim kolagenase diukur berdasarkan metode yang telah
dijabarkan oleh Sigma Aldrich dan Wittenauer et al. (2015) dengan sedikit modifikasi. Campuran
larutan yang terdiri dari 30 µL sampel (0.78 – 50 µg/mL), 10 µL enzim Collagenase from Clostridium
histolyticum (0.1 mg/mL, Sigma C8051) dan 60 µL buffer tricine (50 mM Tricine, 10 mM calcium
chloride, 400 mM Sodium chloride, pH 7.5) diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Selain itu
disiapkan juga untuk kontrol yang hanya berisi 10 µL enzim dan 90 µL buffer fosfat serta blanko
yang berisi 10 µL enzim, 80 µL buffer fosfat dan 30 µL sampel. Selanjutnya, campuran larutan
tersebut ditambahkan sebanyak 20 µL substrat FALGPA (1 mM, Sigma F5135) kecuali blanko.
Absorbansi diukur menggunakan panjang gelombang 335 nm.
Persentasi aktivitas penghambatan dihitung dengan menggunakan rumus :
𝐶−𝑆
% inhibisi = x 100
𝐶
C : absorbansi aktivitas enzim tanpa sample
S : absorbansi aktivitas enzim dengan penambahan sample yang diuji

24
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

kolagenase, buffer tricine, dan Inkubasi selama 20


sampel dimasukan dalam 96 well menit di suhu 37°C
plate

Absorbasi diukur Ditambahkan


pada 335 nm substrat FALGPA

25
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI KOLAGENASE B dan Q

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Kolagenase

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Kontrol Kontrol Kontrol
B Q50 Q50 Q50 Blank B50 B50 B50 Blank
C Q25 Q25 Q25 Blank B25 B25 B25 Blank
D Q12.5 Q12.5 Q12.5 Blank B12.5 B12.5 B12.5 Blank
E Q6.25 Q6.25 Q6.25 Blank B6.25 B6.25 B6.25 Blank
F Q3.12 Q3.12 Q3.12 Blank B3.125 B3.125 B3.125 Blank
G Q1.56 Q1.56 Q1.56 Blank B1.56 B1.56 B1.56 Blank
H Q0.78 Q0.78 Q0.78 Blank B0.78 B0.78 B0.78 Blank

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Kolagenase

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.1612 0.1725 0.2341
B 0.2525 0.2457 0.2558 0.2319 0.2535 0.2544 0.2561 0.1487
C 0.2816 0.2802 0.2849 0.2115 0.2717 0.2722 0.2755 0.1413
D 0.3178 0.3189 0.3164 0.2122 0.2932 0.2932 0.2928 0.1370
E 0.2975 0.2934 0.2983 0.1670 0.2945 0.2954 0.2964 0.1327
F 0.3087 0.3072 0.3012 0.1567 0.2987 0.2989 0.2989 0.1298
G 0.3122 0.3167 0.3161 0.1365 0.3087 0.3067 0.3088 0.1278
H 0.3278 0.3298 0.3265 0.1125 0.3134 0.3149 0.3155 0.1123

26
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Penghambatan Kolagenase Oleh B dan Q

Work Fin absorbance absorbance corrected inhibition average Stdev


Sampel Sol Cont. 1 2 3 Blank 1 2 3 average 1 2 3
Control 0.1612 0.1725 0.2341 0.1893
200.0 50.00 0.2525 0.2457 0.2558 0.2319 0.0206 0.0138 0.0239 89.12 92.71 87.37 89.73 2.72
100.0 25.00 0.2816 0.2802 0.2849 0.2115 0.0701 0.0687 0.0734 62.96 63.70 61.22 62.63 1.28
50.0 12.50 0.3178 0.3189 0.3164 0.2122 0.1056 0.1067 0.1042 44.21 43.62 44.95 44.26 0.66
Q 25.0 6.25 0.2975 0.2934 0.2983 0.1670 0.1305 0.1264 0.1313 31.05 33.22 30.63 31.63 1.39
12.5 3.13 0.3087 0.3072 0.3012 0.1567 0.1417 0.1402 0.1342 25.13 25.92 29.09 26.72 2.10
6.3 1.56 0.3122 0.3167 0.3161 0.1365 0.1452 0.1497 0.1491 23.28 20.91 21.22 21.80 1.29
3.1 0.78 0.3278 0.3298 0.3265 0.1125 0.1608 0.1628 0.1595 15.04 13.98 15.73 14.92 0.88
200.0 50 0.2535 0.2544 0.2561 0.1487 0.1048 0.1057 0.1074 44.63 44.15 43.25 44.01 0.70
100.0 25 0.2717 0.2722 0.2755 0.1413 0.1304 0.1309 0.1342 31.10 30.84 29.09 30.35 1.09
50.0 12.5 0.2932 0.2932 0.2928 0.1370 0.1562 0.1562 0.1558 17.47 17.47 17.68 17.54 0.12
B 25.0 6.25 0.2945 0.2954 0.2964 0.1327 0.1618 0.1627 0.1637 14.51 14.04 13.51 14.02 0.50
12.5 3.13 0.2987 0.2989 0.2989 0.1298 0.1660 0.1662 0.1662 12.29 12.19 12.19 12.22 0.06
6.3 1.56 0.3087 0.3067 0.3088 0.1278 0.1760 0.1740 0.1761 7.01 8.07 6.96 7.34 0.63
3.1 0.78 0.3134 0.3149 0.3155 0.1123 0.1807 0.1822 0.1828 4.53 3.73 3.42 3.89 0.57

27
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
100.00

Aktivitas Antikolagenase (%)


90.00
80.00
70.00 y = 1.4436x + 21.08
R² = 0.9689
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 1. Grafik penghambatan kolagenase oleh Q (pengulangan 1)

120.00
Aktivitas Antikolagenase (%)

100.00 y = 1.5245x + 20.401


R² = 0.9713
80.00

60.00

40.00

20.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 2. Grafik penghambatan kolagenase oleh Q (pengulangan 2)

28
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
100.00

Aktivitas Antikolagenase (%)


90.00
80.00
70.00
y = 1.3884x + 21.778
60.00 R² = 0.9642
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 3. Grafik penghambatan kolagenase oleh Q (pengulangan 3)

100.00
90.00
Aktivitas Antikolagease (%)

80.00
y = 1.4522x + 21.086
70.00 R² = 0.9696
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 4. Grafik penghambatan kolagenase oleh Q (rata-rata)

29
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
50.00

Aktivitas Antikolagenase (%)


40.00
y = 0.7819x + 7.7097
30.00
R² = 0.9625
20.00

10.00

0.00
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 5. Grafik penghambatan kolagenase oleh B (pengulangan 1)

50.00
Aktivitas Antikolagenase (%)

45.00
40.00
y = 0.7727x + 7.6888
35.00
R² = 0.9603
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 6. Grafik penghambatan kolagenase oleh B (pengulangan 2)

50.00
Aktivitas Antikolagenase

40.00
y = 0.7576x + 7.2755
30.00
R² = 0.9621
(%)

20.00

10.00

0.00
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 7. Grafik penghambatan kolagenase oleh B (pengulangan 3)

30
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

50.00

Aktivitas Antikolagenase (%)


y = 0.7707x + 7.558
45.00
R² = 0.9623
40.00
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 8. Grafik penghambatan kolagenase oleh B (rata-rata)

Nilai IC50 aktivitas penghambatan enzim kolagenase oleh B dan Q

Sampel Persamaan R² IC 50 Rata-rata IC50


(µg/ml) (µg/ml)
Q1 y = 1,4436x + 21,08 0.9689 20.03
Q2 y = 1,5245x + 20,401 0.9713 19.42
Q3 y = 1,3884x + 21,778 0.9642 20.33
Rata-rata y = 1,4522x + 21,086 0.9696 19.91 19,91±0,46
B1 y = 0,7819x + 7,7097 0.9625 54.09
B2 y = 0,7727x + 7,6888 0.9603 54.76
B3 y = 0,7576x + 7,2755 0.9621 56.39
Rata-rata y = 0,7707x + 7,558 0.9623 55.07 55,07±1,1

31
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL UJI ANTIAGING/PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM
TYROSINASE (In Vitro)
A. Nama Peneliti :
B. Institusi : Universitas Jendral Ahmad Yani
C. Sampel :
 B
 Q

D. Prosedur yang dikerjakan:


 Pengujian inhibisi enzim tyrosinase oleh B, Q

UJI TYROSINASE
M. Konsentrasi uji :
 Q (kontrol):
a. working solution : 500.0; 250.0; 125.0; 62.5; 31.3; 15.6; 7.8 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)
 Ekstrak B :
a. working solution : 500.0; 250.0; 125.0; 62.5; 31.3; 15.6; 7.8 (µg/mL)
b. final concentration : 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 (µg/mL)

N. Metode : Inhibisi Enzim Tirosinase


O. Prinsip :
Tirosinase atau polifenol oksidase merupakan oksireduktase yang berpartisipasi dalam biosintesis
melanin, pigmen utama yang terdapat pada rambut, mata dan kulit.

Tyrosinase L-DOPA (3,4-Dihydroxy-L-


L-Tyrosine + O2 phenylalanine)

Tyrosinase
L-DOPA L-DOPA-quinone + H2O

Tyrosinase mengkatalisis reaksi oksidasi tirosin yang memproduksi kromofor dan dapat dideteksi
pada panjang gelombang hingga 510 nm. Reaksi enzim tyrosinase dengan substrat L-DOPA ini

32
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
menghasilkan warna oranye. Penghambatan terhadap aktivitas enzim tyrosinase ditandai dengan
berkurangnya warna oranye yang terbentuk atau hasil reaksi berwarna lebih bening. Hal ini juga
sekaligus menandai adanya aktivitas antioksidan pada reaksi tersebut.

P. Sitasi :
1. Sigma Aldrich. Enzymatic Assay for Tyrosinase.
2. Fais A., Corda M., Era B., Delogu G. L. Tyrosinase Inhibitor
Activity of Coumarin-Resveratrol Hybrids. Molecules. 2009. 14:
2514 – 2520.
3. Tu P.T., Tawata S. Anti-Oxidant, Anti-Aging, and Anti-
Melanogenic Properties of the Essential Oils from Two Varieties of
Alpinia zerumbet. Molecules. 20(9): 16.723 – 16.740.
4. Widowati W, Rani AP, Hamzah RA, Arumwardana S, Afifah E,
Kusuma HSW, Rihibiha DD, Nufus H and Amalia A, 2017.
Antioxidant and antiaging assays of Hibiscus sabdariffa extract and
its compounds. Nat. Prod. Sci. 23(3): 192-200
5. Widowati W, Fauziah N, Heridman H, Afni M, Afifah E, Kusuma
HSW, Nufus H, Arumwardana S and Rihibiha DD, 2016.
Antioxidant and anti aging assays of Oryza sativa extracts, vanillin
and coumaric acid. J. Nat. Remed. 16(3): 88-99.

PROSEDUR

Bahan:
 Potasium dihydrogen phosphate (Merck 104873)
 Dipotassium hydrogen phosphate (Merck 105104)
 Tyrosinase from Mushroom (Sigma T3824)
 L-DOPA (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine) (Sigma D9628)
 Potassium Hydroxyl (Sigma P5958)
 Akuades
Alat:
 pH meter (OHAUS Starter300 Portable)
 Tabung Erlenmeyer
 Spatula
 Multiskan Go Reader (Thermo Fisher Scientific 1510)
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)

33
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

Cara Kerja:
Penghambatan aktivitas enzim tirosinase diukur berdasarkan metode yang telah dijabarkan
oleh Sigma Aldrich, Fais et al. (2009), serta Tu & Tawata (2015) dengan sedikit modifikasi.
Campuran larutan yang terdiri dari 20 µL sampel (0.78 – 50 µg/mL), 20 µL enzim Tyrosinase from
Mushroom (125 U/mL, Sigma T3824), dan 140 µL buffer kalium fosfat (20 mM, pH 6.8, Merck
104873, Merck 105104) diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Selain itu disiapkan juga
untuk kontrol yang hanya berisi 20 µL enzim dan 160 µL buffer fosfat serta blanko yang hanya
berisi 160 µL buffer fosfat dan 20 µL sampel. Selanjutnya, campuran larutan tersebut ditambahkan
sebanyak 20 µL substrat L-DOPA (1.5 mM, Sigma D9628) dan diinkubasi kembali pada suhu
ruang selama 10 menit. Absorbansi diukur menggunakan panjang gelombang 470 nm.
Persentase aktivitas penghambatan dihitung dengan menggunakan rumus :

𝐶−𝑆
% inhibisi = x 100
𝐶
C : absorbansi aktivitas enzim tanpa sample
S : absorbansi aktivitas enzim dengan penambahan sample yang diuji

Tirosinase, buffer kalium fosfat, dan Inkubasi selama 15


sampel dimasukan dalam 96 well menit di suhu ruang
plate

34
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Absorbasi diukur Inkubasi selama 10 Ditambahkan


pada 470 nm menit di suhu ruang substrat L-DOPA

35
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI PENGHMABTAN TYROSINASE B dan Q

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Tirosinase

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Control Control Control
B Q50 Q50 Q50 Blank B50 B50 B50 Blank
C Q25 Q25 Q25 Blank B25 B25 B25 Blank
D Q12.5 Q12.5 Q12.5 Blank B12.5 B12.5 B12.5 Blank
E Q6.25 Q6.25 Q6.25 Blank B6.25 B6.25 B6.25 Blank
F Q3.12 Q3.12 Q3.12 Blank B3.12 B3.12 B3.12 Blank
G Q1.56 Q1.56 Q1.56 Blank B1.56 B1.56 B1.56 Blank
H Q0.75 Q0.75 Q0.75 Blank B0.75 B0.75 B0.75 Blank

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Penghambatan Tirosinase

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.2351 0.2418 0.2608
B 0.1281 0.1472 0.1445 0.0517 0.2105 0.2196 0.2173 0.0458
C 0.1585 0.1592 0.1595 0.0497 0.2424 0.2423 0.2415 0.0450
D 0.1796 0.1785 0.1773 0.0491 0.2532 0.2531 0.2523 0.0426
E 0.1826 0.1853 0.1823 0.0475 0.2615 0.2596 0.2625 0.0425
F 0.1847 0.1921 0.1934 0.0448 0.2632 0.2651 0.2662 0.0419
G 0.1904 0.1918 0.1945 0.0435 0.2682 0.2707 0.2703 0.0416
H 0.1955 0.1941 0.1956 0.0420 0.2739 0.2728 0.2764 0.0407

36
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Penghambatan Tirosinase Oleh B dan Q


Work absorbance absorbance corrected inhibition
Sampel Sol Fin
(ug/ml) Cont.(ug/ml) 1 2 3 Blank 1 2 3 average 1 2 3 average Stdev
Control 0.2351 0.2418 0.2608 0.2459
500 50.00 0.1281 0.1472 0.1445 0.0517 0.0764 0.0955 0.0928 68.93 61.16 62.26 64.12 4.20
250 25.00 0.1585 0.1592 0.1595 0.0497 0.1088 0.1095 0.1098 55.75 55.47 55.35 55.52 0.21
125 12.50 0.1796 0.1785 0.1773 0.0491 0.1305 0.1294 0.1282 46.93 47.38 47.86 47.39 0.47
Q 62.5 6.25 0.1826 0.1853 0.1823 0.0475 0.1351 0.1378 0.1348 45.06 43.96 45.18 44.73 0.67
31.3 3.13 0.1847 0.1921 0.1934 0.0448 0.1399 0.1473 0.1486 43.11 40.10 39.57 40.92 1.91
15.6 1.56 0.1904 0.1918 0.1945 0.0435 0.1469 0.1483 0.1510 40.26 39.69 38.59 39.51 0.85
7.8 0.78 0.1955 0.1941 0.1956 0.0420 0.1535 0.1521 0.1536 37.58 38.15 37.54 37.75 0.34
500 50.00 0.2105 0.2196 0.2173 0.0458 0.1647 0.1738 0.1715 33.02 29.32 30.26 30.87 1.92
250 25.00 0.2424 0.2423 0.2415 0.0450 0.1974 0.1973 0.1965 19.72 19.76 20.09 19.86 0.20
125 12.50 0.2532 0.2531 0.2523 0.0426 0.2106 0.2105 0.2097 14.36 14.40 14.72 14.49 0.20
B 62.5 6.25 0.2615 0.2596 0.2625 0.0425 0.2190 0.2171 0.2200 10.94 11.71 10.53 11.06 0.60
31.3 3.13 0.2632 0.2651 0.2662 0.0419 0.2213 0.2232 0.2243 10.00 9.23 8.78 9.34 0.62
15.6 1.56 0.2682 0.2707 0.2703 0.0416 0.2266 0.2291 0.2287 7.85 6.83 6.99 7.23 0.55
7.8 0.78 0.2739 0.2728 0.2764 0.0407 0.2332 0.2321 0.2357 5.16 5.61 4.15 4.97 0.75

37
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

80.00

Aktifitas Anti Tirosinase (%)


70.00
60.00
y = 0.5969x + 39.77
50.00 R² = 0.9806
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml)

Gambar 1. Grafik penghambatan tirosinase oleh Q (pengulangan 1)

70.00
Aktivitas Anti Tirosinase (%)

60.00
50.00 y = 0.4721x + 39.867
40.00 R² = 0.9338

30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml)

Gambar 2. Grafik penghambatan tirosinase oleh Q (pengulangan 2)

38
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
70.00

Aktivitas Anti Tirosinase (%)


60.00
50.00 y = 0.5008x + 39.523
40.00 R² = 0.9274

30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml)

Gambar 3. Grafik penghambatan tirosinase oleh Q (pengulangan 3)

70.00
Aktivitas Antitirosinase (%)

60.00

50.00
y = 0.5233x + 39.72
40.00 R² = 0.9605

30.00

20.00

10.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 4. Grafik penghambatan tirosinase oleh Q (rata-rata)

39
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
35.00

Aktivitas Anti Tirosinase (%)


30.00
25.00
y = 0.5227x + 7.0279
20.00 R² = 0.9847
15.00
10.00
5.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml)

Gambar 5. Grafik penghambatan tirosinase oleh B (pengulangan 1)

35.00
Aktivitas Anti Tirosinase (%)

30.00
25.00
y = 0.4589x + 7.3341
20.00 R² = 0.9715
15.00
10.00
5.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml

Gambar 6. Grafik penghambatan tirosinase oleh B (pengulangan 2)


35.00
Aktivitas Anti Tirosinase (%)

y = 0.4943x + 6.6397
30.00
R² = 0.9682
25.00

20.00

15.00

10.00

5.00

0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (ug/ml)

Gambar 7. Grafik penghambatan tirosinase oleh B (pengulangan 3)

40
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

35.00
30.00

Aktivitas Antitirosinase (%)


25.00
20.00
y = 0.492x + 7.0006
15.00 R² = 0.9783
10.00
5.00
0.00
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Konsentrasi (µg/ml)

Gambar 8. Grafik penghambatan tirosinase oleh B (rata-rata)


Nilai IC50 ekstrak daun tanaman

Sampel Persamaan R² IC 50 Rata-Rata IC50


(µg/ml) (µg/ml)
Q1 y = 0,5969x + 39,77 0.9806 17.14
Q2 y = 0,4721x + 39,867 0.9338 21.46
Q3 y = 0,5008x + 39,523 0.9274 20.92
Rata-rata y = 0,5233x + 39,72 0.9605 19.64 19,64±2,36
B1 y = 0,5227x + 7,0279 0.9847 82.21
B2 y = 0,4589x + 7,3341 0.9715 92.97
B3 y = 0,4943x + 6,6397 0.9682 87.72
Rata-rata y = 0,492x + 7,0006 0.9783 87.39 87,39±5,38

41
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL UJI PEMERANGKAPAN RADIKAL OH (In Vitro)
A. Nama Peneliti :
B. Institusi : Universitas Jendral Ahmad Yani
C. Sampel :
 B
 Q

D. Prosedur yang dikerjakan:


 Pengujian pemerangkapan aktivitas radikal OH oleh B, Q

UJI RADIKAL OH
Q. Konsentrasi uji :
 Q (kontrol):
a. working solution : 1000.0; 500.0; 250.0; 125.0; 62.5; 31.3; 15.6 (µg/mL)
b. final concentration : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.125 (µg/mL)
 B:
a. working solution : 1000.0; 500.0; 250.0; 125.0; 62.5; 31.3; 15.6 (µg/mL)
b. final concentration : 200.0; 100.0; 50.0; 25.0; 12.5; 6.25; 3.125 (µg/mL)

R. Metode : Pemerangkapan radikal OH


S. Prinsip :
Radikal OH (hidroksil) merupakan salah satu spesi yang bersifat reaktif dan dapat merusak
DNA serta berperan dalam mutagenik dan karsinogenik. Spesi radikal tersebut merupakan
bentuk reaktif dari senyawa non radikal turunan oksigen yang biasa disebut dengan
Reactive Oxygen Species (ROS).
Uji pemerangkapan aktivitas radikal OH dilakukan dengan metode deoksiribosa, dimana
deoksiribosa ini merupakan gula pentosa yaitu ribose yang menjadi salah satu penyusun
DNA. Prinsip dari uji ini yaitu degradasi deoksiribosa oleh radikal OH yang dapat
membentuk malondialdehid (MDA) dan dideteksi oleh asam tiobarbiturat (TBA) dengan
munculnya warna merah-muda. Proses perusakan deoksiribosa oleh radikal OH melalui 2
tahap reaksi yaitu pembentukan radikal OH dan degradasi deoksiribosa itu sendiri.

42
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Pembentukan radikal OH terjadi melalui reaksi fenton (FeCl3, EDTA, H2O2, dan vitamin
C/L-ascorbic acid) seperti berikut.

Fe3+EDTA + Asam Askorbat Fe2+EDTA + Asam Dehidro Askorbat

Fe2+EDTA + H2O2 Fe3+EDTA + -OH + •OH

T. Sitasi :
1. Halliwel, B. and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology
and Medicine, Third Edition, 368-369, 839, Oxford University
Press, New York.

PROSEDUR

Bahan:
a. Ferrous Ammonium Sulfate (Merck 1.03792.1000)
b. Hydrogen peroxide (Merck 1.08597.1000)
c. Buffer fosfat
d. L-Ascorbic Acid (Sigma A5960)
e. Deoxyribose (Sigma 121649)
f. Asam trikloroasetat (TCA) (Merck 100807)
g. Asam tiobarbiturat (TBA) (Merck 108180)
h. Akuades

Alat:
 Multiskan GO Reader (Thermo Scientific 1510)
 Spatula
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Rotator (Thermo Fisher Scientific)
 Alumunium foil

43
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

Cara Kerja:
Pemerangkapan aktivitas radikal OH diukur berdasarkan metode yang telah dijabarkan
oleh Halliwell dan Gutteridge (1999) dengan sedikit modifikasi. Campuran larutan dibuat sesuai
tabel yang terdapat di bawah ini:
Reagen Kontrol Sampel tes Blank
Sampel/standar - 30 µL 30 µL
FeCl3 – EDTA (25 – 1,04 mM, Merck 1.03792.1000) 10 µL 10 µL -
H2O2 (20 mM, Merck 1.08597.1000) 5 µL 5 µL -
L-Ascorbic Acid (1mM, Sigma A5960) 5 µL 5 µL -
Deoxyribose (2,8 mM, Sigma 121649) 10 µL 10 µL -
Buffer fosfat (20 mM, pH 7,4) 70 µL 40 µL 120 µL

Kemudian campuran larutan kontrol, sampel, dan blank yang telah dimasukkan ke dalam
96-well plate diinkubasi selama 30 menit pada 37°C. Selanjutnya masing-masing kontrol dan
sampel ditambahkan sebanyak 25 µL 5% TCA dan 25 µL 1% TBA. Plate diinkubasi kembali
selama 30 menit pada 80°C. Selanjutnya, plate didinginkan pada suhu ruang dan absorbansi diukur
menggunakan panjang gelombang 532 nm.
Persentase aktivitas pemerangkapan dihitung dengan menggunakan rumus :

𝐶−𝑆
% pemerangkapan = x 100
𝐶
C : absorbansi aktivitas penangkapan radikal tanpa sample
S : absorbansi aktivitas penangkapan radikal dengan penambahan sample yang diuji

FeCl3 – EDTA, H2O2, L-Ascorbic Acid, Inkubasi selama 30 44


buffer fosfat, Deoxyribose dan sampel menit di suhu 37°C
dimasukan dalam 96 well plate
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Absorbasi diukur Inkubasi selama 30 Ditambahkan


pada 532 nm menit di suhu 80°C substrat 5% TCA dan
1% TBA

45
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI PEMERANGKAPAN OH B dan Q

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan OH

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Kontrol Kontrol Kontrol
B Q1 Q1 Q1 Blank B1 B1 B1 Blank
C Q2 Q2 Q2 Blank B2 B2 B2 Blank
D Q3 Q3 Q3 Blank B3 B3 B3 Blank
E Q4 Q4 Q4 Blank B4 B4 B4 Blank
F Q5 Q5 Q5 Blank B5 B5 B5 Blank
G Q6 Q6 Q6 Blank B6 B6 B6 Blank
H Q7 Q7 Q7 Blank B7 B7 B7 Blank

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan OH

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.0611 0.0671 0.0613
B 0.0601 0.0619 0.0621 0.0554 0.0896 0.0891 0.0888 0.0670
C 0.0661 0.0676 0.0664 0.0511 0.0984 0.0987 0.0972 0.0638
D 0.0787 0.0778 0.0793 0.0505 0.0959 0.0945 0.0953 0.0529
E 0.0824 0.0813 0.0809 0.0497 0.0948 0.0953 0.0968 0.0527
F 0.0823 0.0828 0.0825 0.0490 0.0986 0.0986 0.0991 0.0524
G 0.0837 0.0827 0.0823 0.0515 0.1002 0.1007 0.1025 0.0518
H 0.0803 0.0809 0.0803 0.0453 0.1039 0.1028 0.1039 0.0511

46
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Pemerangkapan OH oleh B dan Q

Work Fin Absorbance Blank Absorbance Corrected Average Inhibition Average Stdev
Sampel Sol Cont. 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Control 0.0611 0.0671 0.0613 0.0611 0.0671 0.0613 0.0632 0.003
1000.0 200.00 0.0601 0.0619 0.0621 0.0554 0.0047 0.0065 0.0067 0.0060 92.56 89.71 89.39 90.55 1.74
500.0 100.00 0.0661 0.0676 0.0664 0.0511 0.0150 0.0165 0.0153 0.0156 76.25 73.88 75.78 75.30 1.26
250.0 50.00 0.0787 0.0778 0.0793 0.0505 0.0282 0.0273 0.0288 0.0281 55.36 56.78 54.41 55.51 1.20
Q 125.0 25.00 0.0824 0.0813 0.0809 0.0497 0.0327 0.0316 0.0312 0.0318 48.23 49.97 50.61 49.60 1.23
62.5 12.50 0.0823 0.0828 0.0825 0.0490 0.0333 0.0338 0.0335 0.0335 47.28 46.49 46.97 46.91 0.40
31.3 6.25 0.0837 0.0827 0.0823 0.0515 0.0322 0.0312 0.0308 0.0314 49.02 50.61 51.24 50.29 1.14
15.6 3.13 0.0803 0.0809 0.0803 0.0453 0.0350 0.0356 0.0350 0.0352 44.59 43.64 44.59 44.27 0.55
1000.0 200 0.0896 0.0891 0.0888 0.0670 0.0226 0.0221 0.0218 0.0222 64.22 65.01 65.49 64.91 0.64
500.0 100 0.0984 0.0987 0.0972 0.0638 0.0346 0.0349 0.0334 0.0343 45.22 44.75 47.12 45.70 1.26
250.0 50 0.0959 0.0945 0.0953 0.0529 0.0430 0.0416 0.0424 0.0423 31.93 34.14 32.88 32.98 1.11
B 125.0 25 0.0948 0.0953 0.0968 0.0527 0.0421 0.0426 0.0441 0.0429 33.35 32.56 30.18 32.03 1.65
62.5 12.5 0.0986 0.0986 0.0991 0.0524 0.0459 0.0459 0.0464 0.0461 27.34 27.34 26.54 27.07 0.46
31.3 6.25 0.1002 0.1007 0.1025 0.0518 0.0475 0.0480 0.0498 0.0484 24.80 24.01 21.16 23.32 1.92
15.6 3.125 0.1039 0.1028 0.1039 0.0511 0.0528 0.0517 0.0528 0.0524 16.41 18.15 16.41 16.99 1.01

47
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

100.00
90.00

% Pemerangkapan OH
80.00
70.00 y = 0.2503x + 44.854
R² = 0.9665
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00
concentration µg/mL

Gambar 1. Grafik pemerangkapan OH oleh Q (pengulangan 1)

100.00
% Pemerangkapan OH

90.00
80.00
70.00 y = 0.2318x + 45.585
60.00 R² = 0.9667
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00
concentration µg/mL

Gambar 2. Grafik pemerangkapan OH oleh Q (pengulangan 2)


100.00
90.00
% Pemerangkapan OH

80.00
y = 0.2295x + 45.988
70.00 R² = 0.9496
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00
concentration µg/mL

Gambar 3. Grafik pemerangkapan OH oleh Q (pengulangan 3)

48
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

100.00
90.00

concentration µg/mL
80.00
y = 0.2372x + 45.476
70.00
R² = 0.963
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00
concentration µg/mL

Gambar 4. Grafik pemerangkapan OH oleh Q (rata-rata)

70.00
%Pemerangkapan OH

60.00
50.00 y = 0.2125x + 22.703
R² = 0.9419
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0 50 100 150 200 250
Concentration µg/mL

Gambar 5. Grafik pemerangkapan OH oleh B (pengulangan 1)

70.00
%Pemerangkapan OH

60.00
50.00 y = 0.2141x + 22.996
R² = 0.9646
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0 50 100 150 200 250
Concentration µg/mL

49
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Gambar 6. Grafik pemerangkapan OH oleh B (pengulangan 2)

80.00

% Pemerangkapan OH
70.00
60.00
50.00 y = 0.2312x + 21.145
R² = 0.9646
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0 50 100 150 200 250
Concentration µg/mL

Gambar 7. Grafik pemerangkapan OH oleh B (pengulangan 3)


70.00
%Pemerangkapan OH

60.00
50.00 y = 0.2193x + 22.282
R² = 0.9599
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0 50 100 150 200 250
Concentration µg/mL

Gambar 8. Grafik pemerangkapan OH oleh B (rata-rata)


Nilai IC50 B dan Q

Sampel Persamaan R2 IC50 Rata-rata IC50


(µg/ml) (µg/ml)
Q1 y = 0,2503x + 44,854 0.9665 20.56
Q2 y = 0,2318x + 45,585 0.9667 19.05 19.03 ± 1,5
Q3 y = 0,2295x + 45,988 0.9496 17.48
Rata-rata Q y = 0,2372x + 45,476 0.963 19.07
B1 y = 0,2125x + 22,703 0.9419 128.46
B2 y = 0,2141x + 22,996 0.9646 126.13 126,39 ± 1,84
B3 y = 0,2312x + 21,145 0.9646 124.81
Rata-rata B y = 0,2193x + 22,282 0.9599 126.39

50
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL UJI PEMERANGKAPAN H2O2 (In Vitro)

A. Nama Peneliti :
B. Institusi :
C. Sampel :
 B
 Q
D. Prosedur yang dikerjakan :
 Pengujian pemerangkapan aktivitas radikal H2O2 oleh S, X

Uji Radikal H2O2

A. Konsentrasi Uji
 B:
a. working solution : 10000.0; 5000.0; 2500.0; 2000.0; 1250.0; 1000.0; 625.0; 500.0;
312.5; 250.0; 125.0; 62.5 (µg/mL)
b. final concentration : 4000.0; 2000.0; 1000.0; 800.0; 500.0; 400.0; 250.0; 200.0;
125.0; 100.0; 50.0; 25.0 (µg/mL)
 Q:
a. working solution : 10000.0; 5000.0; 2500.0; 2000.0; 1250.0; 1000.0; 625.0; 500.0;
312.5; 250.0; 125.0; 62.5 (µg/mL)
b. final concentration : 4000.0; 2000.0; 1000.0; 800.0; 500.0; 400.0; 250.0; 200.0;
125.0; 100.0; 50.0; 25.0 (µg/mL)

B. Metode : Pemerangkapan radikal H2O2


C. Prinsip :

Aktivitas pemerangkapan hidrogen peroksida (H2O2) diukur dengan metode reaksi ferrous

ammonium sulphate dan phenanthroline dengan sedikit modifikasi. Apabila ferrous

ammonium sulphate bereaksi dengan phenanthroline akan terbentuk Fe2+-tri-

phenanthroline complex yang berwarna orange, namun bila ada H2O2 pada reaksi tersebut

51
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
tidak terbentuk complex, sehingga bila ada antioksidan yang memerangkap H2O2, maka

akan terbentuk kembali Fe2+-tri-phenanthroline complex yang berwarna orange tersebut.

D. Sitasi
1. Mukhopadhyay, D., Dasgupta, P., Roy, D. S., Palchoudhuri, S., Chatterjee, I., Ali, S.,
& Dastidar, S. G. (2016). A Sensitive In vitro Spectrophotometric Hydrogen Peroxide
Scavenging Assay using 1, 10-Phenanthroline. Free Radicals & Antioxidants, 6(1).

PROSEDUR

Bahan:
a. Ferrous Ammonium Sulfate (Sigma 7783859)
b. Hydrogen peroxide (Merck 1.08597.1000)
c. Asam sulfat (Merck 109981)
d. 1,10-phenanthroline (Sigma 131377)
e. Akuades

Alat:
 Multiskan GO Reader (Thermo Scientific 1510)
 Spatula
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Rotator (Thermo Fisher Scientific)
 Alumunium foil
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

52
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Cara Kerja:
Pemerangkapan aktivitas radikal H2O2 diukur berdasarkan metode yang telah dijabarkan
oleh Mukhopadhyay et al (2016) dengan sedikit modifikasi. Campuran larutan dibuat sesuai tabel
yang terdapat di bawah ini:
Reagen Kontrol Sampel tes Blank
Sampel - 60 µL 60 µL
Ferrous Ammonium Sulfate (1 mM, Sigma 7783859) 12 µL 12 µL -
DMSO 63 µL - 90 µL
H2O2 (5 mM, Merck 1.08597.1000) - 3 µL -
1,10-phenanthroline (1 Mm, Sigma 131377) - 75 µL 75 µL

Kemudian setelah ditambahkan H2O2 campuran larutan kontrol, sampel, dan blank yang
dimasukkan ke dalam 96-well plate diinkubasi selama 5 menit pada ruang gelap dengan suhu
ruang. Selanjutnya masing-masing campuran sampel dan blank ditambahkan 1,10-phenanthroline
sebanyak 75 µL, kemudian diinkubasi kembali selama 10 menit pada ruang gelap dengan suhu
ruang. Absorbansi diukur menggunakan panjang gelombang 510 nm.
Persentase aktivitas pemerangkapan dihitung dengan menggunakan rumus :

𝐴 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒
% pemerangkapan = x 100
𝐴 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
A : Absorbansi

Ditambahkan 12 µL Kemudian Diinkubasi pada suhu


ferrous ammonium ditambahkan sampel ruang dalam keadaan
sulphate gelap selama 5 menit
dan 3 µL H2O2

53
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Absorbansi diukur Diinkubasi pada suhu


menggunakan panjang ruang dalam keadaan Kemudian
gelombang 510 nm gelap selama 10menit ditambahkan 75 µL
1,10-phenanthroline

54
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI PEMERANGKAPAN H2O2

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan H2O2

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Ctrl Ctrl Ctrl Blank Blank Blank
B S1 S1 S1 S7 S7 S7 X1 X1
C S2 S2 S2 S8 S8 S8 X2 X2
D S3 S3 S3 S9 S9 S9 X3 X3
E S4 S4 S4 S10 S10 S10 X4 X4
F S5 S5 S5 S11 S11 S11 X5 X5
G S6 S6 S6 S12 S12 S12 X6 X6
H

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan H2O2

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0,3214 0,2963 0,3410 0,0464 0,0478 0,0495
B 0,4766 0,4654 0,4847 0,1225 0,1236 0,1305 0,1383 0,1269
C 0,2966 0,3052 0,2985 0,1086 0,1059 0,1081 0,1007 0,0980
D 0,2015 0,1873 0,1982 0,1025 0,0973 0,1060 0,0881 0,0942
E 0,1714 0,1723 0,1711 0,0763 0,0914 0,0877 0,0866 0,0876
F 0,1510 0,1564 0,1442 0,0798 0,0846 0,0734 0,0657 0,0653
G 0,1344 0,1300 0,1261 0,0722 0,0651 0,0642 0,0619 0,0571
H

55
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Pemerangkapan H2O2 oleh B dan Q

Working Final Absorbance Corrected Inhibition


Sampel Solution Conc. Average Average SD
1 2 3 1 2 3
(µg/ml) (µg/ml)
Control 0,2735 0,2484 0,2931 0,2717
10000 4000 0,4287 0,4175 0,4368 0,4277 157,80 153,68 160,79 157,42 3,57
5000 2000 0,2487 0,2573 0,2506 0,2522 91,55 94,71 92,25 92,83 1,66
2500 1000 0,1536 0,1394 0,1503 0,1478 56,54 51,31 55,33 54,39 2,74
2000 800 0,1235 0,1244 0,1232 0,1237 45,46 45,79 45,35 45,53 0,23
1250 500 0,1031 0,1085 0,0963 0,1026 37,95 39,94 35,45 37,78 2,25
1000 400 0,0865 0,0821 0,0782 0,0823 31,84 30,22 28,79 30,28 1,53
B
625 250 0,0746 0,0757 0,0826 0,0776 27,46 27,87 30,40 28,58 1,60
500 200 0,0607 0,0580 0,0602 0,0596 22,34 21,35 22,16 21,95 0,53
312,5 125 0,0546 0,0494 0,0581 0,0540 20,10 18,18 21,39 19,89 1,61
250 100 0,0284 0,0435 0,0398 0,0372 10,45 16,01 14,65 13,71 2,90
125 50 0,0319 0,0367 0,0255 0,0314 11,74 13,51 9,39 11,55 2,07
62,5 25 0,0243 0,0172 0,0163 0,0193 8,94 6,33 6,00 7,09 1,61
10000 4000 0,0904 0,0790 0,0807 0,0834 33,28 29,08 29,71 30,69 2,26
5000 2000 0,0528 0,0501 0,0516 0,0515 19,44 18,44 18,99 18,96 0,50
2500 1000 0,0402 0,0463 0,0374 0,0413 14,80 17,04 13,77 15,20 1,68
2000 800 0,0387 0,0397 0,0391 0,0392 14,25 14,61 14,39 14,42 0,19
1250 500 0,0178 0,0174 0,0186 0,0179 6,55 6,40 6,85 6,60 0,22
1000 400 0,0140 0,0092 0,0092 0,0108 5,15 3,39 3,39 3,98 1,02
Q
625 250 0,0091 0,0092 0,0093 0,0092 3,35 3,39 3,42 3,39 0,04
500 200 0,0072 0,0070 0,0088 0,0077 2,65 2,58 3,24 2,82 0,36
312,5 125 0,0066 0,0064 0,0061 0,0064 2,43 2,36 2,25 2,34 0,09
250 100 0,0047 0,0033 0,0042 0,0041 1,73 1,21 1,55 1,50 0,26
125 50 0,0024 0,0030 0,0023 0,0026 0,88 1,10 0,85 0,94 0,14
62,5 25 -0,0010 0,0013 0,0040 0,0014 -0,37 0,48 1,47 0,53 0,92

56
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Gambar 1. Grafik pemerangkapan H2O2 oleh B

Gambar 2. Grafik pemerangkapan H2O2 oleh Q

Nilai IC50 B dan Q

Sampel Persamaan R2 IC50 IC50


(µM) (µg/ml)
B y = 0,0368x + 14,404 0,99 - 967,28
Q y = 0,0078x + 2,3356 0,91 6110,82 1198,95

57
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL UJI PEMERANGKAPAN NO (In Vitro)
E. Nama Peneliti :
F. Institusi :
G. Sampel :
 B
 Q
H. Prosedur yang dikerjakan :
 Pengujian pemerangkapan aktivitas radikal NO oleh S, X

Uji Radikal H2O2

E. Konsentrasi Uji
 B:
a. working solution : 10000.0; 5000.0; 2500.0; 1250.0; 625.0; 312.5 (µg/mL)
b. final concentration : 666.67; 333.33; 166.67; 83.33; 41.67; 20.83 (µg/mL)
 Q:
a. working solution : 10000.0; 5000.0; 2500.0; 1250.0; 625.0; 312.5 (µg/mL)
b. final concentration : 666.67; 333.33; 166.67; 83.33; 41.67; 20.83 (µg/mL)

F. Metode : Pemerangkapan radikal NO


G. Prinsip :
Aktivitas pemerangkapan NO, yaitu mengukur kadar natrium nitriprusida menggunakan
larutan reaksi Greiss sesuai dengan metode yang telah Parul et al. (2013) kerjakan dengan
sedikit modifikasi. Sodium Nitropruside akan mengurai dalam larutan fisiologis (pH 7.2)
menjadi NO- dalam kondisi aerobik. NO- bereaksi dengan oksigen untuk menghasilkan
senyawa yang lebih stabil (seperti nitrat dan nitrit). Pemerangkapan nitric oxide bersaing
dengan oksigen untuk memicu penurunan produksi ion nitrit.
H. Sitasi
1. Parul, R., Kundu, S. K., & Saha, P. (2013). In vitro nitric oxide scavenging activity of
methanol extracts of three Bangladeshi medicinal plants. The pharma innovation, 1(12,
Part A), 83.

58
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
PROSEDUR

Bahan:
a. Sodium nitroprusside (Sigma 71780)
b. Sulphanilamide (Sigma S9251)
c. Asam fosfat (Merck 480939)
d. N-(1-naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride (Sigma N9125)
e. Ethanol (Merck 100983)
f. PBS
g. Akuades

Alat:
 Multiskan GO Reader (Thermo Scientific 1510)
 Spatula
 Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
 Tips (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (NEPTUNE)
 96 well-plate (TPP 92096)
 Falcon tube 15 ml (SPL 50015)
 Falcon tube 50 ml (SPL 50050)
 Analytical Balance (AXIS)
 Rotator (Thermo Fisher Scientific)
 Alumunium foil
 Tube Effendorf 1,5 ml (SPL 60015-1)
 Vortex (WiseMix VM-10)

Cara Kerja:
Pemerangkapan aktivitas radikal NO diukur berdasarkan metode yang telah dijabarkan
oleh Muk Parul et al. (2013) dengan sedikit modifikasi. Campuran larutan dibuat sesuai tabel yang
terdapat di bawah ini:
Reagen Kontrol Sampel tes Blank
Sampel - 10 µL 10 µL
Sodium nitroprusside (10 mM, Sigma 71780) 40 µL 40 µL -
Ethanol (70%, Merck 100983) 10 µL - 140 µL

59
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Reagen Kontrol Sampel tes Blank
Greiss Reagent (1% Sulphanilamide, 2% asam fosfat, 100 µL 100 µL -
0.1% NEDD)

Sodium nitroprusida (10 mM dalam Phosphate Buffer Saline/PBS) dicampurkan dengan


10 µL sampel dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi selama 120 menit pada suhu 25°
C. Kemudian campuran larutan sebelumnya direaksikan dengan larutan Greiss (1% sulfanilamida,

2% H3PO4, dan 0,1% naftiletilena diamin dihidroklorida) kemudian diukur dengan menggunakan

absorbansi 546 nm.


Persentase aktivitas pemerangkapan dihitung dengan menggunakan rumus :

𝐴 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
% pemerangkapan = x 100
𝐴 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
A : Absorbansi

Sodium nitropruside (10


Ditambahkan 100 µL larutan Greiss
mM) dicampurkan dengan 10
µL sampel lalu diinkubasi (1% Sulfanilamide, 2% H2PO4, dan
selama 120 menit pada suhu 0,1% Naftiletilena diamin
ruang langsung terkena dihidroklorida)
cahaya

Absorbansi diukur menggunakan


Panjang gelombang 546 nm

60
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL ANALISIS UJI PEMERANGKAPAN NO

Tabel 1. Plate Mapping (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan NO

Sample 1 2 3 4 5 6 7 8
A Ctrl Ctrl Ctrl
B Blank Blank Blank
C S1 S1 S1 X1 X1 X1
D S2 S2 S2 X2 X2 X2
E S3 S3 S3 X3 X3 X3
F S4 S4 S4 X4 X4 X4
G S5 S5 S5 X5 X5 X5
H S6 S6 S6 X6 X6 X6

Tabel 2. Data Absorbansi (1) Kemampuan B dan Q dalam Pemerangkapan NO

Abs 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0,2278 0,2367 0,2196
B 0,0574 0,0537 0,0563
C 0,1937 0,1935 0,1922 0,1191 0,1187 0,1188
D 0,2059 0,2058 0,2055 0,1410 0,1441 0,1428
E 0,2188 0,2185 0,2187 0,1696 0,1662 0,1689
F 0,2254 0,2256 0,2252 0,1890 0,1857 0,1864
G 0,2266 0,2269 0,2260 0,2049 0,2040 0,1987
H 0,2280 0,2299 0,2303 0,2135 0,2162 0,2149

61
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Tabel 3. Analisis Data Aktivitas Pemerangkapan NO oleh B dan Q

Working Final Absorbance Corrected Scavenging NO (%)


Sample Solution Conc. Average Average SD
1 2 3 1 2 3
(µg/ml) (µg/ml)
Control 0,1720 0,1809 0,1638 0,1722
10000 666,67 0,1379 0,1377 0,1364 0,1373 19,93 20,05 20,81 20,26 0,47
5000 333,33 0,1501 0,1500 0,1497 0,1499 12,85 12,91 13,08 12,95 0,12
2500 166,67 0,1630 0,1627 0,1629 0,1629 5,36 5,54 5,42 5,44 0,09
B
1250 83,33 0,1696 0,1698 0,1694 0,1696 1,53 1,41 1,65 1,53 0,12
625 41,67 0,1708 0,1711 0,1702 0,1707 0,83 0,66 1,18 0,89 0,27
312,5 20,83 0,1722 0,1741 0,1745 0,1736 0,02 -1,08 -1,32 -0,79 0,71
10000 666,67 0,0633 0,0629 0,0630 0,0631 63,25 63,48 63,42 63,38 0,12
5000 333,33 0,0852 0,0883 0,0870 0,0868 50,53 48,73 49,49 49,58 0,90
2500 166,67 0,1138 0,1104 0,1131 0,1124 33,93 35,90 34,33 34,72 1,04
Q
1250 83,33 0,1332 0,1299 0,1306 0,1312 22,66 24,58 24,17 23,80 1,01
625 41,67 0,1491 0,1482 0,1429 0,1467 13,43 13,95 17,03 14,81 1,95
312,5 20,83 0,1577 0,1604 0,1591 0,1591 8,44 6,87 7,63 7,64 0,78

62
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Gambar 1. Grafik pemerangkapan NO oleh B

Gambar 2. Grafik pemerangkapan NO oleh Q

Nilai IC50 S dan X

Sampel Persamaan R2 IC50 IC50


(µM) (µg/ml)
B y = 0,033x – 0,5011 0,97 - 1530,34
Q y = 0,0816x + 14,481 0,90 435,28 85,40

63
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Uji Fitokimia Ekstrak Etanol 70% Kulit Manggis

A. Nama Peneliti :
B. Institusi Peneliti : Universitas Udayana
C. Penanggung Jawab Penelitian : Annisa Amalia
D. Sampel : Ekstrak X
E. Prosedur yang Dikerjakan : 1. Uji kualitatif kandungan Flavonoid
2. Uji kualitatif kandungan Saponin
3. Uji kualitatif kandungan Fenol
4. Uji kualitatif kandungan Tanin
5. Uji kualitatif kandungan Steroid/Triterpenoid
6. Uji kualitatif kandungan Alkaloid
F. Prinsip :
X diketahui memiliki kandungan metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas seperti
antioksidan, antikanker, antiinflamasi, antibakteri dan antifungi (Chaverri et al., 2008;
Widowati et al., 2014). Namun demikian, pemilihan pelarut dalam proses maserasi dan
ekstraksi akan memengaruhi kandungan senyawa kimia yang terlarut untuk selanjutnya
digunakan dalam berbagai pengujian.
Penelitian yang dilakukan oleh Poeloengan dan Praptiwi (2010) menunjukkan bahwa
ekstrak etanol 70% mengandungan komponen kimia alkaloid, saponin, tanin, fenol, flavonoid,
triterpenoid dan streoid.

PREPARASI SAMPEL
A. Bahan :
1. ddH2O

B. Alat :
1. Waterbath (Hanyang)
2. Tabung Reaksi
3. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)

64
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
4. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Preparasi Sampel:


1. Sebanyak 100 mg sampel dilarutkan dalam 10 ml ddH2O, kemudian didihkan selama 5
menit hingga larut.
2. Sebanyak 5 ml larutan ekstrak dimasukkan ke dalam tabung berbeda dan ditambahkan 5
ml ddH2O, selanjutnya disebut larutan A.

1. PEMERIKSAAN FLAVONOID
A. Bahan :
1. Magnesium Powder (Mg) (Merck 105865)
2. HCl 37% (Merck 109057)
3. Etanol teknis 50%
5. Isoamil Alkohol (Merck 100979)

4. Alat :
1. Waterbath (Hanyang)
2. Tabung Reaksi
3. Mikropipet ukuran (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
4. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Pemeriksaan Flavonoid :


1. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah serbuk Mg, diteteskan
campuran etanol 50% : HCl (1:1). Setelah itu ditambah amil alkohol kemudian dikocok. Jika
terbentuk warna merah, jingga, kuning, maka flavonoid positif.

65
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
2. PEMERIKSAAN SAPONIN
A. Bahan :
1. HCl 37%

B. Alat :
1. Tabung Reaksi
2. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
3. Tips 1000µl (NEPTUNE)
C. Prosedur Pemeriksaan Saponin:
10 ml larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian dikocok secara vertikal selama
10 detik. Jika terbentuk busa yang stabil selama 10 menit, tambahkan HCl. Jika busa tidak
hilang maka saponin positif.

3. PEMERIKSAAN FENOL
A. Bahan :
1. FeCl3 (1% dalam ddH2O) (Merck 103943)

B. Alat :
1. Tabung Reaksi
2. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
3. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Preparasi Fenol:


1. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah 500µl FeCl3 1%. Jika
terbentuk warna hijau, merah, ungu, biru/hitam makan sampel positif fenol.

4. PEMERIKSAAN TANIN
A. Bahan :
1. FeCl3 (1% dalam ddH2O) (Merck 103943)
2. Gelatin (Sigma G1393)

66
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

B. Alat :
1. Waterbath (Hanyang)
2. Tabung Reaksi
3. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
4. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Pemeriksaan Tanin:


1. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah FeCl3 1% beberapa
tetes. Jika terbentuk warna hijau, biru, hitam maka tannin positif.
2. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah larutan gelatin, jika
terbentuk endapan, maka tannin positif.

5. PEMERIKSAAN STEROID/TRITERPENOID
A. Bahan :
1. FeCl3 (1% dalam ddH2O) (Merck 103943)
2. Gelatin (Sigma G1393)

B. Alat :
1. Waterbath (Hanyang)
2. Tabung Reaksi
3. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
4. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Pemeriksaan Tanin:


1. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah FeCl3 1% beberapa
tetes. Jika terbentuk warna hijau, biru, hitam maka tannin positif.
2. 5 ml larutan A dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah larutan gelatin, jika
terbentuk endapan, maka tannin positif.

67
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
6. PEMERIKSAAN ALKALOID
A. Bahan :
1. HCl 2N
2. Pereaksi Dragendorff

B. Alat :
1. Waterbath (Hanyang)
2. Tabung reaksi
3. Plat tetes
4. Mikropipet (1-10 µl, 50- 200 µl, 100-1000 µl) (Eppendorf)
5. Tips 1000µl (NEPTUNE)

C. Prosedur Pemeriksaan Alkaloid:


1. Larutan A sebanyak 5 ml diuapkan dalam waterbath. Residu yang dihasilkan kemudian
dilarutkan dengan 5 ml HCl 2N. Larutan yang diperoleh dibagi ke dalam 2 tabung reaksi.
Tabung pertama ditambahkan 3 tetes HCl 2N yang berfungsi sebagai blanko. Tabung
kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorff. Endapan jingga yang terbentuk pada
tabung kedua menunjukkan adanya alkaloid (Farsnworth, 1966; Windarini et al., 2013).

Daftar Pustaka:
Chaverri, J. P., N. C. Rodriguez, M. O. Ibarra, and J. M. P. Rojas. 2008. Medicinal properties of
mangosteen (Garcinia mangostana). Food and Chemical Toxicology, 46: 3227 – 3239.
Farnworth, N. R. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plant. Journal of
Pharmacetical Sciences, 55: 59.
Jones, W. P. and Kinghorn, A. D. 2006. Extraction of plant secondary metabolites. In: Sharker, S.
D. Latif Z., Gray A. L., eds. Natural Product Isolation, 2nd Edition. New Jersey : Humana
Press. Pp. 341 – 342.
Praptiwi dan Poeloengan, M. 2010. Uji aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah manggis. Media
Litbang Kesehatan, 2(XX)
Robinson, T. 1991. Kandungan organik tumbuhan tingkat tinggi. Bandung: ITB. P. 152 – 196.
Widowati, W., Darsono, L., Suherman, J., Yelliantty, Y., and Maesaroh, M. 2014. High
performance liquid chromatography (HPLC) analysis, antioxidant, antiaggregation of
mangosteen peel extract (Garcinia mangostana L.). International Journal of Bioscience,
Biochemistry and Bioinformatics, 4(6): 458 – 466.
Windarini, L. G. E., Astuti, K. W., Warditiani, N. K. 2013. Skrining fitokimia ekstrak metanol
kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Jurnal Farmasi Udayana, p. 1-8.

68
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Hasil Pemeriksaan Fitokimia:

Pemeriksaan Flavonoid Pemeriksaan Saponin Pemeriksaan Fenol

Pemeriksaan Tanin Pemeriksaan Pemeriksaan Alkaloid


Steroid/Tirterpenoid

69
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
Hasil Pemeriksaan Fitokimia:
Hasil Uji
Pemeriksaan Ekstrak X
No Pustaka
Fitokimia Pengamatan Kesimpulan
1. Flavonoid Terbentuk warna merah, jingga, Terbentuk warna (+)
kuning kuning
2. Saponin Ada busa yang bertahan ± 10 Terbentuk busa (+)
menit setinggi 1-10 cm dan setinggi ± 1 cm.
busa tidak hilang setelah Penambahan 1 tetes
penambahan 1 tetes HCl HCl tidak
(Depkes, 1989) menghilangkan busa
3. Fenol Terbentuk warna biru tua atau Terbentuk warna (+)
hijau kehitaman (Robinson, hijau kehitaman
1991)
4. Tanin Terbentuk wana biru tua atau Terbentuk warna (+)
hijau kehitaman (Robinson, hijau kehitaman dan
1991) dan terbentuk endapan terdapat endapan
setelah ditambahkan gelatin setelah ditambahkan
gelatin
5. Steroid/Triterpenoid Jika terbentuk warna hijau biru Terbentuk warna (+)
maka steroid positif, jika jingga
terbentuk warna
ungu/merah/jingga maka
triterpenoid positif
6. Alkaloid Terbentuk warna oranye pada Terbentuk warna (+)
pereaksi dragendorff (Jones and oranye
Kinghorn, 2006)
Keterangan : (+) = Mengandung senyawa yang dimaksud; (-) = Tidak mengandung senyawa yang dimaksud

70