SISTEMAS CRISPR-CAS, UNA

REVOLUCIÓN
BIOTECNOLÓGICA DE ORIGEN
BACTERIANO.

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

Facultad de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biotecnología
Tópicos Selectos de Biotecnología
Elaborado por: Yael García Serrano
¿Qué son los Sistemas CRISPR-Cas?
En toda la secuencia del cromosoma bacteriano existe la información necesaria
para para llevar a cabo todos los procesos necesarios para el buen desarrollo en la
vida de la bacteria. Dentro de esta secuencia, hay algunas secuencias de
nucleótidos idénticas que parece están distribuidas a lo largo de una determinada
región del cromosoma. A estas repeticiones se les conocen como CRISPR,
acrónimo para Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats, que
en español sería traducido como Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente
Espaciadas y Agrupadas.
Dicho en forma más sencilla, a lo largo del DNA cromosómico, hay secuencias de
nucleótidos que se repiten cada cierto espacio. Las regiones que se encuentran
entre cada repetición se llaman espaciadores, con secuencias diferentes entre sí.
Río arriba de la región donde se encuentran las secuencias CRISPR, existen genes
utilizados para la síntesis de Proteínas Cas (CRISPR Asociated. Esto conforma a
los sistemas CRISPR-Cas.
¿Para qué sirven los Sistemas CRISPR-Cas?
Hacia 2007 se comprobó que esos sistemas corresponden a un sistema de defensa
para combatir y degradar información genética invasora en bacterias. Mediante un
experimento llevado a cabo bajo la premisa de que las secuencias repetidas
(CRISPR) tenían algo que ver con la resistencia a algunos virus.
El experimento de este grupo consistió en infectar bacterias con un virus, y aquellas
que lograron sobrevivir, se encontró que se habían añadido nuevos espaciadores,
y la secuencia de estos espaciadores eran idénticas a fragmentos del material
genético del virus. Si sometía nuevamente a infección a cultivos de estas bacterias,
estas resultaron resistentes al virus. De igual forma, si se transfería el material de
estas bacterias a unas que no habían estado expuestas al virus, adquirían la
resistencia y ninguna moría al ser tratada por primera vez con el virus.

Figura 1: La infección por el bacteriófago causa que un fragmento de su DNA se incorpore al locus CRISPR.

El mecanismo por el cual la bacteria se defiende una vez que adquiere secuencias
de material genético viral aún no está bien definida. No obstante, se sugiere que
una vez que el virus infecta a la bacteria, una proteína Cas genera una copia del
 genoma del virus y la incorpora a la región del
locus CRISPR [Figura 1]. Después, dependiendo
del tipo de sistema, proteínas Cas generan
moléculas de RNA con secuencias guías
provenientes de las secuencias del genoma del
virus. Si vuelve a ocurrir una inyección del
material genético del virus, estas moléculas de
RNA reconocerán por complementariedad a este
material, reclutará a otras proteínas Cas y lo
degradará [Figura 2]. La información
almacenada en la región CRISPR puede ser
heredada a la progenie bacteriana, ya que está
incorporada al material genético
No obstante, se ha encontrado que los sistemas
CRISPR-Cas de las bacterias no solamente
forman parte de esta forma de combatir
DNA/RNA degradado infecciones virales, sino que hay distintas
Figura 2: Distintas proteínas Cas producen maneras en que el sistema responde a diversas
crRNA (CRISPR-RNA), que contiene secuencia situaciones en que la bacteria se encuentre.
complementaria a un fragmento del DNA/RNA
Si se encuentra en asociación con un consorcio
ajeno a la bacteria. Al unirse a otras proteínas
Cas y a la molécula extraña, esta se degrada.
bacteriano, y la bacteria se infecta con un virus,
el sistema se activa de tal manera que la bacteria
se suicide y evitar la replicación del virus que amenace a las demás bacterias del
consorcio.
Otra evidencia de la participación del sistema CRISPR como sistema de defensa es
la formación de esporas cuando un grupo de bacterias se encuentran en un sitio
con pocos nutrientes.
De igual manera, el sistema CRISPR de Francisella
novicida [Figura 3] es capaz de modificar los
componentes de la superficie bacteriana para que el
sistema inmune animal no reconozca dichos
componentes y no pueda eliminar la bacteria.
También, se ha encontrado que existen sistemas
CRISPR-Cas en virus, por ejemplo, en un bacteriófago de
Vibrio cholerae, para combatir distintos mecanismos de
defensa de las bacterias. Esto sugiere la existencia de
una multitud de sistemas CRISPR-Cas, unos muy Figura 3: Micrografía de F. novicida
obtenida mediante MEB.
complejos y otros sencillos.
 ¿Cuáles son los antecedentes históricos referentes a CRISPR-Cas?
Pasaron más de 20 años para que los artículos científicos relacionados con
CRISPR-Cas comenzaran a publicarse de manera masiva debido a la revolucionaria
herramienta que se descubriría para 2010.
En 1987 se descubrió que en E.coli había repeticiones de nucleótidos en su
cromosoma, y en años posteriores también se encontraron en bacterias no
relacionadas entre sí. En 1993 se descubrieron algunas funciones de estas
secuencias, y se comprobó que eliminar estas secuencias tendría consecuencias
terribles para la bacteria. En 2002 se hallaron genes próximos a la región CRISPR,
acrónimo recientemente utilizado para su época.
En 2005 se confirmó que las secuencias entre secuencias CRISPR provenían de
virus que las infectaban para su conseguir su replicación, y se dedujo que era una
manera de transmitir la información acerca del virus a la progenie bacteriana, y que
las nuevas generaciones pudieran defenderse de un ataque del mismo virus, algo
así como un sistema inmune. Esto fue confirmado en 2007 por un grupo de una
empresa alimentaria llamada DANISCO.
¿Por qué CRISPR-Cas representa una revolución Biotecnológica?
Aunque aún no se conocía
el potencial completo de
esta diversidad de sistemas
(Y aún falta mucho más), ya
salían a la luz algunas
aplicaciones interesantes
solamente sabiendo que era
un sistema para la defensa
vírica.
Por ejemplo, en bacterias,
se puede se les puede
inducir la resistencia vírica
para evitar la muerte de
éstas, especialmente en las
Figura 4: La bacteria puede adquirir fragmentos de plásmidos e integrarlos al
locus CRISPR, y producir crRNA para destruirlos. responsables de
fermentación de la industria
alimentaria.
Otra aplicación es forzar la eliminación de plásmidos de resistencia a antibióticos
transferibles entre bacterias. Si se agregan secuencias de estos plásmidos a las
regiones CRISPR, pueden generarse RNA para unirse a estos plásmidos y provocar
su degradación, haciendo que la bacteria no pueda sintetizar proteínas de
resistencia a antibióticos [Fig 4].
Existe la posibilidad de crear agentes antimicrobianos selectivos de tal manera que
eliminen bacterias que podrían provocar una enfermedad, sin matar al resto de la
microbiota que resguarda el cuerpo humano, benéfica para él. La forma en que se
podría hacer esto, es insertar un sistema CRISPR-Cas a un virus en cuyos
espaciadores haya una secuencia que codifica para una toxina que afecta al
humano. Si el virus infecta a una bacteria con esta secuencia, las matará. Las que
no tengan esta secuencia, sobrevivirán.
Posteriormente al conocimiento de la
diversidad de los sistemas CRISPR-
Cas, se planteó la cuestión de trasferir
este sistema a otras células que no las
tienen, como células vegetales o
animales, no obstante, esto sería muy
complejo, por lo que se decidió de
primera mano estudiar los sistemas más
sencillos y simples.
Uno de ellos es CRISPR-Cas9,
estudiado por Jennifer Doudna y
Emmanuelle Charpentier, con el cual
descubrieron que la proteína Cas9
Figura 5: Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna
funciona como una enzima de corte en
sitios específicos de una molécula de
DNA guiados por el RNA guía.
Ellas dedujeron que Cas9 podría abrir las puertas a la edición genética, ya que las
células tienen la capacidad de detectar cortes en la molécula de DNA y repararlos.
La célula puede reparar estos cortes de dos formas, desde simplemente volver a
unir las dos cadenas, aunque se haya perdido un fragmento, hasta re-sintetizar el
fragmento perdido utilizando DNA molde.
En el primer caso, muchas veces esto origina fallos aleatorios en la célula lo que
provoca apoptosis, pero si se realiza una reparación de resíntesis, no se presenta
complicación alguna. Utilizando el segundo mecanismo de reparación, e
introduciendo un molde de DNA no necesariamente idéntico al original, el sistema
de reparación va a usar este molde para reincorporarlo entre los cortes hechos por
Cas9.
Esto quiere decir que el molde puede contener cualquier secuencia deseada y el
sistema de reparación lo va a incorporar a la molécula de DNA de la célula, es decir,
editar la secuencia original a una deseada.
A partir de este descubrimiento, se comenzó una serie de investigaciones por la
proteína Cas9, descubriendo la versatilidad de la proteína para hacer que no
solamente corte, si no que se le pueden añadir marcadores fluorescentes para
visualizar regiones específicas del genoma o se puede regular la expresión génica
mediante modificaciones epigenéticas.
Algunos logros que se han hecho con
CRISPR-Cas9 son:
• Retardar la maduración en
tomates y otras frutas.
• Crear cultivos tolerantes a estrés
ambientales y resistentes a
infecciones virales.
• Aumentar la masa muscular de
cerdos [Fig 6].
• Crear ganado vacuno con
resistencia a tuberculosis.
• Eliminar virus de órganos para
trasplantes. Figura 6: Nota periodística sobre los cerdos con mayor
masa muscular.
• Evitar que mosquitos adquieran el
parásito de la malaria.
• Estudios de un sinnúmero de enfermedades para poder prevenirlas o
curarlas.
No obstante, todos estos campos de aplicación, especialmente la edición genética,
son temas polémicos y discutidos al grado que requieren cientos de regulaciones
globales para evitar un uso indiscriminado de esta técnica, la cual finalmente tiene
tantos puntos positivos como negativos, desde alteraciones a las cadenas tróficas
hasta desaparición de especies no relacionadas y finalmente cambios en los
ecosistemas.