Anda di halaman 1dari 12

Laporan Praktikum KI3161

STUKTUR FUNGSI BIOMOLEKUL


Percobaan 1
REAKSI UJI TERHADAP PROTEIN DAN PEMISAHAN PROTEIN
DENGAN CARA FRAKSINASI AMMONIUM SULFAT

Nama : Mohamad Ridwan


NIM : 10516040
Kelompok / Shift : 4/ Jumat Siang
Tanggal Percobaan : 21 September 2018
Tanggal Pengumpulan : 28 September 2018
Asisten : Jessica Cellyana (20518010)

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2018
PERCOBAAN 1
REAKSI UJI TERHADAP PROTEIN DAN PEMISAHAN PROTEIN DENGAN CARA
FRAKSINASI AMMONIUM SULFAT

I. Tujuan Percobaan
1. Menentukan uji kualitatif ikatan peptida pada albumin telur dengan uji biuret
2. Menentukan kelarutan hasil reaksi protein dengan Pb2+ dan Hg2+
3. Menentukan kelarutan endapan protein hasil proses salting out di dalam air
4. Menentukan uji kualitatif gugus hidroksil fenil dalam protein dengan uji millon
5. Menentukan kelarutan protein pada berbagai pH
6. Memisahkan protein dengan menggunakan fraksinasi ammonium

II. Prinsip Percobaan


Protein merupakan senyawa organic kompleks yang memiliki berat molekul yang
relatif besar. Protein merupakan polimer dari asam asam amino yang dihubungkan dengan
ikatan peptide. Molekul protein terdiri dari unsur karbon, nitrogen, hydrogen oksigen dan
sedikit sulfur serta fosfor. Dalam molekul protein terdapat interaksi hidrofobik, interaksi
ionic dan interaksi kovalen. Interaksi tersebut menghasilkan berbagai struktur primer,
sekunder, tersier dan kuarterner,. Struktur primer merupakan struktur rantai lurus protein
yang dibentuk oleh monomer monomer asam amino yang dihubungkan oleh ikatan
peptide. Struktur sekunder ialah merupakan struktur yang dibentuk oelh adanya ikatan
hydrogen pada rantai lurus protein, contoh struktur sekunder adalah alfa helix dan beta
sheet. Struktur tersier yaitu struktur yang terbentuk akibat pengemasan struktur sekunder
yang terdapat ikatan hydrogen, dipol, van der walss dan lainnya. Struktur kuarterner yaitu
gabungan dari struktur tersier yang membentuk struktur tertentu dengan fungsi tertentu.
Dari struktur protein tersebut dapat diindentifkasi menggunakan reagen biuret, millon,
ikatan logam dan lain sebagainya, masing masing reagen tersebut akan menghasilkan suatu
produk spesifik seperti ikatan reagen biuret dengan protein membentuk warna ungu/ violet
kemudian reagen Pb2+ dan Hg2+ membentuk endapan keruh dan lainnya.
Penambahan garam pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan kelarutan protein
(salting in) tetapi protein akan mengalami prepitasi pada konsentrasi garam yang tinggi
(salting out). Garam yang biasa digunakan adalah amonium sulfat, sodium sulfat, dan
sodium klorida. Endapan yang terbentuk dapat dilarutkan kembali, protein tidak
mengalami denaturasi. Mekanisme salting out terjadi melalui dehidrasi protein akibat
penambahan garam. Ion garam dapat menarik molekul air yang melarutkan protein,
sehingga protein menjadi tidak larut. Pemisahan protein putih telur dapat dilakukan dengan
fraksinasi.
SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik
elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang
bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan
deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif
pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat
interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Metode SDS-PAGE digunakan untuk
memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler

III. Data Pengamatan

1. Uji Biuret
Sebelum di tetesi reagen
Setelah di tetesi reagen
biuret
biuret Hasil
(tetapi telah ditetesi
(ditetesi CuSO4)
NaOH)
Larutan albumin sebelum
diberi NaOH masih
berwarna putih keruh
setelah ditetesi NaOH
menjadi bening dan
setelah diberi larutan
CuSO4 larutan berwarna
violet/ ungu
Uji : + (positif)
2. Pengendapan dengan Logam Berat
Uji Perubahan saat Pengujian Hasil
Pb2+ Albumin yang
awalnya tak berwarna
menjadi keruh dan
terbentuk endapan,
dengan kepekatan
endapan lebih besar
dari Hg2+
Uji : + (positif)
Hg2+ Albumin yang
awalnya tak berwarna
menjadi keruh dan
terbentuk endapan,
Sebelum Setelah
kepekatan lebih kecil
dari Pb2+
Uji : + (positif)

3. Pengendapan dengan Garam


Uji Hasil fisik Perubahan Pengujian Hasil
setelah
penambahan
reagen Uji
Millo Endapan Pemanasan Endapan +
n reagen millon
terbentuk
endapan
berwarna merah
bata

Endapan + air,
endapan menjadi
Sebelum Setelah
larut

Endapan +
buffer tris +
reagen millon,
terbentuk
endapan dan
berwarna merah
bata
Biuret Larutan Berubah warna
(supernatant menjadi biru
)

Sebelum Setelah

4. Pengaruh pH
Larutan Hasil pengamatan Hasil
Albumin Keruh
Albumin + HCl Keruh gelap terdapat
endapan yang lebih
banyak disbanding
sebelum ditetersi HCl
Albumin + NaOH Dari keruh menjadi bening
atau tak berwarna
Albumin + Buffer asetat Keruh akan tetapi tidak
pH 4,7 sekeruh ditetesi dengan
HCl
5. Fraksinasi
Fraksi Hasil Pengamatan Jumlah Endapan
Terdapat endapan dibawah Belum dapat dilakukan
tabung kerja karena belum dilakukan
SDS PAGE

IV. Pembahasan
Albumin merupakan bagian dari protein plasma darah yang memiliki banyak peran
seperti mengatur tekanan osmotic darah, menjaga keseimbangan cairan di dalam tubuh,
sebagai pengangkut nutrisi di dalam tubuh, dan membantu memperbaiki kerusakan
jaringan sel di dalam tubuh. Albumin diproduksi di dalam hati melalui proses
penyaringan dan penghancuran protein dalam darah menjadi molekul yang lebih kecil
sehingga terbentuklah albumin. Kadar normal albumin dalam darah antara 3,4 – 5,4 g /
dL. Komposisi normalnya mencapai 60% dari seluruh bagian plasma darah. Albumin
yang beredar dalam aliran darah kita lebih lanjut disebut sebagai serum albumin. Gejala
yang disebabkan oleh kadar albumin yang tinggi adalah dehidrasi, karena dalam kondisi
seperti ini sel akan mengonsumsi lebih banyak air untuk menyeimbangkan jumlah
albumin yang lebih tinggi dalam darah. Pemakaian obat-obatan steroid anabolik, hormon
androgen, hormon pertumbuhan atau insulin, menjadi salah satu penyebab terjadinya
peningkatan kadar albumin. Kekurangan albumin ditandai dengan gejala adanya
pembengkakan (endema) pada tubuh, misalnya pada tungkai, pergelangan kaki, perut
(asites), bahkan menimbulkan sesak nafas akibat penumpukan cairan di paru-par. Kondisi
tertentu seperti penyakit hati dapat menyebabkan kadar albumin rendah karena penyakit
hati mengganggu kemampuan tubuh untuk memproduksi protein (albumin).
Pada percobaan ini dilakukan identifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan
yang khas pada protein, yaitu ikatan peptide. Uji yang dilakukan pada protein yaitu uji
biuret, pengendapan logam, pengendapan dengan garam dan pengaruh pH. Selain itu,
pada percobaan ini juga dilakukan salah satu cara memisahkan protein dengan
menggunakan fraksinasi ammonium sulfat.
Uji biuret merupakan salah satu cara uji yang digunakan untuk mengetahui adanya
ikatan peptide pada suatu zat dalam suasana basa. Biuret sendiri dapat dibuat dengan
penggabungan/ mereaksikan dua senyawa urea yang menghasilkan reagen biuret dan
amoniak. Uii biuret dapat terjadi pada suasana basa karena pada uji biuret terdapat ion
Cu2+ yang berasal dari pereaksi biuret (CuSO 4) akan bereaksi dengan gugus C=O dan N-
H dari rantai peptide yang akan membentuk kompleks berwarna violet atau ungu.
Penambahan NaOH pada uji ini digunakan untuk penstabil kompleks.

Gambar 1. Pembuatan reagen biuret dan kompleks Cu2+ dengan protein


Penambahan CuSO4 tidak boleh berlebih hal ini dikarenakan dapat menyebabkan
albumin terdenaturasi membentuk koagulan. Pada percobaan albumin menunjukkan hasil
positif terhadap ujui biuret (berwarna ungu). Dalam uji biuret, garam ammonium dapat
menjadi pengganggu karena ion-ion garam ammonium mudah mengikat air sehingga
dapat menyebabkan kelarutan protein menurun atau berkurang. Selain protein uji biuret
juga mampu menghasilkan uji positif terhadap asam amino.
Pada penambahan logam berat pada protein akan membuat protein terdenaturasi.
Senyawa logam akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein
membentuk endapan logam proteinat. Gugus yang bermuatan negative pada protein akan
bereaksi dengan ion-ion logam tersebut sehingga protein menjadi terdenaturasi. Hasil
percobaan menunjukkan hasil yang positif dengan terbentuknya endapan putih. Logam
berat yang digunakan yaitu Pb2+ dan Hg2+. Berikut skema yang dihasilkan :
Gambar 2. Reaksi logam berat dengan protein
Putih telur dapat digunakan sebagai penawar keracunan Pb dan Hg. Hal ini
disebabkan karena putih telur mengandung albumin sehingga ion logam berat tersebut
akan akan bereaksi dengan albumin membentuk koagulan dengan begitu logam berat
tersebut tidak akan mengganggu atau merusak ‘aktivitas enzim lain yang ada dalam
tubuh’. contoh lain logam berat yang berbahaya bagi kesehatan manusia yaitu Cu, logam
tersebut banyak digunakan dalam industry pupuk dan bangunan, jika Cu terkontaminasi
dalam bahan pangan Cu dapat bersifat toksik dalam tubuh, selain itu ada juga Arsen (As)
yang sangat berbahaya karena logam ini penyebab kanker dan kerusakan ginjal untuk
manusia.
Apabila protein mengandung garam anorganik dalam konsentrasi yang rendah,
maka kelarutan protein akan meningkat (salting in). sedangkan apabila protein
mengandung garam anorganik dengan konsentrasi tinggi maka kelarutan protein akan
menurun sehingga mengakibatkan protein akan mengendap. Pengendapan protein terjadi
karena ion garam lebih menyukai untuk berikatan dengan air sehingga jumlah air yang
terikat dalam protein menurun.berikut skema reaksinya

Gambar 3. Reaksi pengendapan garam


Pada percobaan larutan albumin telur yang ditambahkan ammonium sulfat hingga
terbentuk endapan. Endapan yang terbentuk diuji kelarutan didalam air dan diuji dengan
reagen millon. Endapan yang terbentuk larut dalam air pengujian dengan reagen millon
menghasilkan warna larutan berwarna merah bata. Uji millon berfungsi untuk menguji
atau menunjukkan adanya asam amino tirosin pada suatu zat. Berdasarkan hasil
percobaan hasil positif menunjukkan bahwa endapan mengandung asam amino
tirosin9berwarna merah). Larutan yang dipisahkan dari endapan (supernatant) diuji
dengan reagen biuret dan menunjukkan hasil yang positif berwarna biru, itu artinya masih
ada protein yang lolos pada penyaringan endapan dan supernatant nya, warna biru
tersebut berindikasi bahwa masih ada protein yang terdapat dalam larutan tersebut/ belum
terpisah dengan baik. Berikut reaksi yang terjadi pada uji tersebut :

Gambar 4. Reaksi Uji Millon


Kelarutan protein dipengaruhi oleh adanya pH. Pada saat albumin ditambahkan
buffer asetat pada pH 4,7, larutan albumin terbentuk endaoan. Hal ini terjadi karena pada
pH 4,7 muatan total protein mendekati atau sama dengan titik isoelektriknya sehingga
terbentuk endapan. Saat larutan albumin ditambahkan dengan HCl maka akan terbentuk
endapan pula hal ini terjadi karena dengan penambahan HCl membuat pH larutan berada
dibawah pH isoelektrik yang artinya protein mengendap karena efek denaturasi protein.
Sedangkan dengan penambahan NaOH tidak terbentuk endapan karena pH larutan
menjadi basa atau jauh dari titik isoelektriknya sehingga akan larut, pada kondisi ini
protein akan bermuatan negative dan mampu berinteraksi dengan air. Denaturasi protein
merupakan terjadinya perubahan struktur terhadap struktur protein baik sekunder tersier
ataupun kuarterner, denaturasi ini terjadi biasanya karena pengaruh lingkungan yang
ekstrem yang artinya lngkungan yang tidak disukai sel ataupun protein seperti pada pH
yang sangat asam, suhu yang sangat tinggi , adanya logam berat dan sebagainya. Suhu
yang sangat tinggi mampu membuat moleku sel mati karena terdeaktivasi kerjanya
sedangakan pada penyisipan logam berat pada protein akan membuat protein menjadi
terganggu struktur kerjanya. Akan tetapi berbeda dengan mahkluk hidup pada umumnya,
beberapa spesies mikroorganisme justru memanfaatkan suhu, pH, logam berat yang
sangat ekstrem sebagai tempat hidupnya, dan protein yang ada tidak terdenaturasi
contohnya mikroorganisme sulfur pada belerang. Berikut skemad reaksi yang
digambarkan pada denaturasi protein
Gambar 5. Denaturasi protein
Pada percobaan kali ini, dilakukan pemurnian senyawa protein dari putih telur
dengan metode fraksinasi ammonium sulfat. Fraksinasi adalah proses pemisahaan
senyawa tertentu dari campurannya. Dimana untuk percobaan ini metode fraksinasi
yang digunakan adalah dengan memanfaatkan prinsip salting out. Salting out adalah
proses berkurangnya kelarutan protein atau proses pengendapan protein yang
disebabkan adanya konsentrasi garam dalam larutan yang terlalu tinggi. Proses ini
terjadi karena garam akan lebih mudah terhidrasi oleh air dibandingkan protein
dikarenakan entropi dari hidrasi garam lebih tinggi (luas permukaan ion garam total
akan lebih besar). Sesuai hukum termodinamika, suatu proses akan mengarah kepada
penambahan entropi sistem sehingga protein kurang terhidrasi dan akhirnya
menggumpal satu sama lain dan mengendap. Pada percobaan ini digunakan garam
amonium sulfat, karena garam ini memiliki kelarutan yang sangat tinggi dalam air, juga
tidak berbahaya dan dijual dengan harga yang relatif murah dipasaran.
SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah
teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein
yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil Sulfat (SDS)
merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan
muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah
dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Metode SDS-
PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika
forensik, dan biologi molekuler
Endapan yang dihasilkan pada proses fraksinasi tersebut kemudian dianalisis
dengan menggunakan teknik SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis), SDS-PAGE adalah metode pemisahan elektroforesis berdasarkan
berat dari senyawa-senyawa yang akan dipisahkan dengan bantuan medan listrik yang
mengalir melalui perantaraan fasa diam gel. Untuk pemisahan senyawa protein, gel
yang digunakan adalah gel yang dibuat dari poliacrylamida. Protein akan bergerak
dengan kecepatan migrasi yang berbeda sesuai dengan berat dan ukurannya. Protein
yang lebih besar, akan memiliki kecepatan migrasi yang lebih lambat dan akhirnya
akan memilki jarak migrasi yang paling kecil begitu juga sebaliknya. Data jarak
migrasi ini kemudian dibandingkan dengan marker SDS-PAGE melalui kurva kalibrasi
sehingga akan diperoleh data massa molekul protein dalam masing-masing fraksi.

V. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, pada pengujian biuret menggunakan
reagen biuret didapatkan bahwa, uji menghasilkan positif apabila albumin tersebut
2+
membentuk kompleks dengan Cu yang menghasilkan warna violet pada larutannya.
Sedangkan saat penambahan Pb2+ dan Hg2+ terbentuk endapan protein pada larutan
albumin yang ditandai dengan mengendapnya protein didasar tabung karena logam
akan menurunkan kelarutan protein dalam larutan dengan berikatan dengan logam
berat. Pada penambahan garam akan terjadi proses salting out dimana garam akan lbih
menarik air disekitar protein sehingga terjadi kekurangan air di sekitar protein yang
menyebabkan kelarutan protein akan menurun. Pada uji millon, percobaan ini
dihasilkan positif terhadap millon hal tersebut ditandai dengan munculnya warna
endapan merah bata yang artinya terdapat protein yang memiliki gugus hidroksi fenil.
Untuk pengujian pH sendiri didapatkan kelarutan protein dalam pH asam (HCl) dan pH
isoelektri (buffer) terjadi endapan pada protein, saat direaksikan asam endapan berupa
endapan putih keruh hasil denaturasi protein sedangakan saat pH isoelektrik terjadi
endapan lebih sedikit karena efek muatan positif dan negative yang seimbang (0).
Sedangkan saat diberi pH basa protein terlarut sempurna dengan kata lain protein
memiliki kecenderungan bereaksi baik dengan kondisi basa tanpa merusak strukturnya.
Untuk pemisahan fraksinasi dengan ammonium sulfat memanfaatkan proses salting out
yaitu menggumpalkan protein dalam larutan. Pemisahan dilakukan menggunakan SDS
PAGE dengan prinsip molekul protein akan bergerak pada kesesuaian muatan pada
protein ( plus menuju minus dan sebaliknya) sehingga akan diperoleh pita – pita yang
menggambnarkan berat molekul dalam masing-masing fraksi.

VI. Daftar Pustaka


Boyer, Rodney F. 1993. Model Experimental Biochemistry, 2nd ed. Michigan: The
Benjamine/ Cummings Publishing Company, Inc. Page: 248-249
Muchtadi, D., Nurheni Sri Palupi, dan Made Astawan. 1992. Metode kimia biokimia dan
biologi dalam evaluasi nilai gizi pangan olahan. Hal.: 5-28, 82-92, dan 119-121.
Bollog.OM, Rofky, M.D and Edelstein, S.J, 1996, Protein Metods, 2nd Ed, Jhon and Sons,
Inc,Pub.New York
Styer, L.1998, Biochemistry, 4th Ed, W, H , Freeman and Company, New York
Matthew , C.K, Hode, K. E (1990). Biochemistry, the Benjamin/Comunings Publishing
Co, Redwood City, USA.