INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOÁCIDOS POR

CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIADOR IÓNICO

ALUMNO

PROFESOR
 SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOÁCIDOS POR
CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIADOR IÓNICO

FUNDAMENTO

La cromatografía de intercambio iónico es un método de separación de iones y compuestos polares, basándose

en la diferencia de carga eléctrica. Se compone de 1fase estacionaria (resina de intercambio iónico), que contiene
sitios iónicos que crean interacciones dipolares con los analitos presentes en la muestra; lleva en su superficie
cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones que pueden intercambiarse por iones de la 2 fase móvil, que
es generalmente una disolución acuosa (con metanol o algún disolvente orgánico miscible en agua) que contiene
especies iónicas, las cuales están en competencia con los analitos por ocupar los sitos activos de la fase
estacionaria. Si un compuesto tiene una alta densidad de carga, será retenida más tiempo por la fase estacionaria.

La cromatografía por intercambio iónico es logísticamente similar a la cromatografía por afinidad. En ambos casos
se usa una columna con resina que se une a la proteína de interés. Sin embargo, en la cromatografía por
intercambio iónico la interacción es menos específica y se basa en la carga neta. Una resina de intercambio iónico
tiene un ligando con carga positiva o negativa. Si tiene carga negativa, es un intercambiador de cationes.

La columna se equilibra al inicio con un amortiguador de pH y fuerza iónica apropiados. La resina de intercambio
se une a contraiones. Las proteínas cuya carga neta sea opuesta a la del intercambiador se quedarán en la
columna, intercambiándose por los contraiones unidos. Las proteínas que no tengan carga neta o que posean la
misma carga que el intercambiador saldrá con el eluyente.

OBJETIVOS

 Emplear la técnica de intercambio iónico para la separación de dos aminoácidos.

 Comprobar la separación mediante una reacción colorida y el perfil de elución.

RESULTADOS

Tabla 1. Resultados en la separación de una mezcla de Prolina e Hisitidina mediante cromatografía de intercambio
iónico, en el tubo número 20 se llevó a cabo el cambio de regulador de citratos 0.1 M de pH 5.25 a regulador de
citratos 0.1 M pH 2.0. El símbolo * denota el extravío de dicho volumen de elución.

Volumen de Volumen de
A400 A570 A400 A570
elución (mL) elución (mL)
3 0.000 63 0.310
6 0.048 66 0.591
9 0.046 69 1.163
12 0.061 72 0.147
15 0.085 75 2.149
18 0.091 78 3.000
21 2.525 81 3.000
24 3.000 84 3.000
27 1.874 87 2.849
30 1.500 90 1.050
33 1.255 93 2.323

2
 36 0.672 96 1.652
39 0.516 99 *
42 0.469 102 0.801
45 0.351 105 0.280
48 0.228 108 0.130
51 0.198 111 0.139
54 0.046 114 0.048
57 0.087 117 0.010
60 0.003 120 0.015

Figura 1. Perfil de elución, en el cual se observa, en el eje de las abscisas el volumen de elución y en un eje de
ordenadas, a la izquierda el valor correspondiente de A400 La línea verde representa la elución de la prolina y la
línea roja representa la elución de la histidina.

DISCUSIÓN

Como se sabe este tipo de cromatografía por intercambio iónico se basa en la separación de las moléculas en
base a la carga con la que cuentan. Para la esta práctica de separación de una mezcla de dos aminoácidos los
cuales fueron prolina e histidina se utilizó un intercambiador catiónico débil (amberlita IRC-50) que tiene como ión
fijo al COO- y como ión móvil al H+, que al ser previamente hinchada en buffer de citrato de sodio pH 5.25 se
intercambió el H+ por el ion Na+, ya que este se encuentra en alta concentración. Después de esto se realizó el
empaquetamiento de la columna con el intercambiador y se aplicó la muestra que contenía la mezcla de los
aminoácidos y se eluyó primero con regulador de citratos pH 5.25, a este pH ambos aminoácidos tienen carga
positiva con la diferencia de que la histidina tendrá 2 grupos cargados positivamente uno es el grupo amino y otro
es el de su cadena lateral imidazol, ya que el pka de la histidina para el grupo amino es de 6.0 y para el grupo
imidazol es de 9.17, estos valores nos indican que a pH por debajo de 9 .17 tendrá el grupo imidazol con carga

3
positiva y a pH por debajo de 6 tendrá al grupo imidazol y al amino cargado positivamente, mientras que la prolina
solo tiene uno que es el grupo amino del esqueleto del aminoácido cuyo pka es de aproximadamente 10.60, esta
diferencia hace que la histidina sea más positiva por lo que quedara unida al ion fijo del intercambiador liberando
al Na+ que ocupaba ese lugar, posteriormente al cambiar el pH a 2 significara que habrá mayor cantidad de
protones aumentando así la concentración de iones H+ que desplazaran a la histidina del intercambiador
permitiendo su elución.

Una vez obtenidas las fracciones en tubos de ensaye, se realizo una reacción colorida con ninhidrina para
comprobar si se había llevado a cabo la separación de los aminoácidos empleados, el color que se obtiene al
reaccionar la ninhidrina con la prolina resulta de una tonalidad amarilla mientras que la reacción con la histidina da
un color violeta, aplicando un método espectrofotométrico esto nos permite realizar un perfil de elución midiendo
su absorbancia a distintas longitudes de onda 400 nm para el tono violeta y 570 nm para el amarillo.

Cabe mencionar que durante el proceso de la separación y en vista de los resultados obtenidos, una separación
aceptable pero con ciertas inconsistencias, lo cual se puede deber a que el momento de empaquetar la columna
se observó la formación de burbujas de tamaño casi despreciable, que además de ser una muestra de un mal
empaquetamiento nos interfieren con la elución de los aminoácidos ya que en estas pueden quedarse “atrapados”
y provocar distorsiones del cromatograma al salir después. Este tipo de factores, así como la incubación, la cual
pudo llevarse por más del tiempo necesario con lo cual se evaporo el diluyente de la ninhidrina que era etanol,
produciendo la disminución del volumen con lo que se podría obtener una absorbancia diferente al estar hasta
cierto punto más concentrada la muestra por la evaporación.

Todos estos factores son los que pudiesen explicar el cromatograma que se mostró anteriormente. Resultado en
la presencia de varios picos, valles y una meseta en histidina lo que nos indica tanto una mala resolución, como
una mala separación.

CUESTIONARIO

a) ¿Cuál de los aminoácidos eluyó primero? Explique por qué.

El primero en eluir fue la prolina ya que este solo tendrá un grupo cargado positivamente y la histidina contara con
dos por lo cual será mas afín a ser intercambiado por el ion móvil del intercambiador permitiendo que la prolina
eluya primero.

b) ¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución, qué pasa a altas y a bajas velocidades?
Esto es importante para que a la velocidad en que se eluya no sea demasiado alta para así permitir que el ion
pueda ser sustituido en su totalidad y no solo un parte de este, quedando retenido en el intercambiador y a una
velocidad baja el tiempo de la separación sería demasiado. Asi que el regular la velocidad nos permitirá obtener
una buena separación.

c) Mencione los pka de los aminoácidos utilizados en la práctica.

Histidina

pK 1=6.0
pK 2 = 9.17
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (6.0+9.17)/2= 7.585

4
 Prolina

pK C / pK 1 =1.99
pK N / pK 2=10.60
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (1.99+10.60)/2= 6.295

d) Nombre algunas características de la resina utilizada en el practica (amberlita IRC-50).

CONCLUSIONES

 Empleando la técnica de intercambio iónico se separaron dos aminoácidos de acuerdo a la carga con la
que cuentan y a sus grupos ionizable.
 Mediante una reacción con ninhidrina se realizó el perfil de elución ya que estos absorben a diferentes
longitudes de onda.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell. Bioquímica (2003) Editorial Thomson, 4ta edición. México. Pág. 118-
123
 Donald Voet,Judith G. Voet. Bioquímica (2004) Editorial medica Panamericana, 3ra edición. Montevideo,
Uruguay. Pág. 142-143

 M. Valcárcel Cases, A. Gómez Hens. Técnicas Analíticas de Separación (1988) Editorial Reverté, Edición
en español Barcelona, España. Pag. 258.