Ekstrak Daun Manggis Meningkatkan Melanogenesis pada

sel Melanoma B16F1 dengan Menstimulasi Aktivitas

Tyrosinase in vitro dan dengan up-regulasi ekspresi gen
tyrosinase
MARIANI ABDUL HAMID1,2, MOHAMAD ROJI SARMIDI2 and CHANG SEO PARK1

1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Dongguk University, Chung-Gu, Seoul 100-
715, Republic of Korea; 2Chemical Engineering Pilot Plant, University Teknologi Malaysia, 81310
Skudai, Johor, Malaysia

ABSTRAK

Sintesis melanin distimulasi oleh berbagai efektor, termasuk α-melanocyte stimulating

hormone (α-MSH), siklik AMP (cAMP)-agen peningkat (forskolin, isobutylmethylxantine,
glycyrrhizin) dan cahaya ultraviolet. Penelitian kami berfokus pada identifikasi dari efikasi
melanogenik dari esktrak daun mangosteen atau manggis (Garcinia mangostana) berkaitan
dengan efeknya pada melanogenesis pada sel melanoma B16F1, karena ia diketahui memiliki
kemampuan yang berdampak kuat pada aktivitas anti-oksidan. Ekstrak daun manggis
ditemukan menstimulasi sintesis melanin dan aktivitas tyrosinase pada situasi yang
bergantung pada dosis tanpa efek signifikan apapun pada proilferasi sel. Sitotoksisitas dari
esktrak diukur menggunakan sebuah assay 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT); konsentrasi tertinggi dari ekstrak tidak berdampak pada
viabilitas sel yaitu sebesar 32 μg/ml. Pembentukan dari melanin dari melanoma B16F1 yang
dikultur diinduksi dengan pemberian ekstrak diperkirakan menggunakan spektrofotometri.
Dalam artian untuk mengklarifikasi kelanjutan mekanisme dari aktivasi tyrosinsase oleh
ekstrak, tingkat dari ekspresi tyrosinase pada pasien melanoma B16F1 diperiksa
menggunakan sebuah assay tyrosinase intraseluler dan zimografi tyrosinase. Up-regulasi dari
ekspresi tyrosinase intraseluler tampaknya berkorelasi dengan kenaikan nilai protein
microphtalmia-associated transcription factor (MITF) karena MITF merupakan faktor penting
untuk gen yang terlibat didalam melanogenesis. Kedua hasil menunjukkan bahwa aktivitas
tyrosinase secara jelas dipercepat dari sel yang diberikan ekstrak. Hasil keseluruhan
menyatakan bahwa ekstrak daun manggis dapat menjadi kandidat yang menjanjikan untuk
pengobatan gangguan hipopigmentasi dan bermanfaat untuk produk kosmetik penghitaman
kulit.

Kata kunci : Garcinia mangostana, melanogenesis, melanin, tyrosinase, microphtalmia-

berkaitan dengan faktor transkripsi

PENDAHULUAN

Manggis (Garcinia mangostana L.) adalah buah pohon tropis asli Asia Tenggara dan
ditemukan terutama di China, Kamboja, Indonesia, Malaysia, Thailand, Singapura, Taiwan
dan Filipina. Buah manggis dikonsumsi segar dan bisa diolah menjadi selai, manisan dan
permen. Ini adalah buah musiman penting yang dikonsumsi di seluruh Asia Selatan dan
Timur dan dianggap oleh banyak orang sebagai salah satu cita rasa terbaik di dunia. Garcinia,
genus pohon cemara dari keluarga tanaman Clusiaceae berasal dari daerah tropis di dunia; Ini
termasuk manggis ungu sebagai satu dari 300 spesies dalam genus yang dikenal dengan
buah-buahan yang dapat dimakan dan pigmen perikalpal yang kaya. Manggis juga telah
digunakan untuk tujuan nutrisi dan obat-obatan selama berabad-abad oleh negara-negara
yang sama untuk mengurangi demam, diare, sakit kepala dan menyembuhkan luka. Kulit
buah telah digunakan untuk pengobatan infeksi internal dan eksternal, dan tapal obat dapat
digunakan untuk mengobati gangguan kulit; Sebuah ekstrak pulp manggis bahkan telah
digunakan untuk mengendalikan demam (1). Rebusan kulit digunakan untuk meredakan
sistitis, gonore dan gleet dan dioleskan secara eksternal sebagai zat lotion. Masyarakat
Filipina menggunakan ramuan daun dan kulit kayu untuk mengobati sariawan, diare, disentri
dan gangguan kencing. Di Malaysia, pemberian daun, dikombinasikan dengan pisang mentah
dan benzena diaplikasikan pada luka setelah khitan dan racikan dari akar manggis diambil
untuk mengontrol menstruasi. Kulit buah manggis kering digunakan untuk mengobati
disentri, diare dan gonore (1). Dibuat menjadi salep, bedak buah manggis digunakan untuk
mengobati kelainan kulit seperti eczema. Manggis dan kulit buah manggis mengandung
banyak antioksidan, yang mungkin memiliki aktivitas anti-tumor (2).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun manggis memiliki lima senyawa
aktif, yaitu katekin, mangostin, normangostin, xanthone dan gartanin (3). Dalam beberapa
tahun terakhir, manggis telah menarik perhatian khusus untuk xanthone-nya, kelas ekstrak
fitokimia tumbuhan dari manggis, yang sangat aktif secara biologis, memiliki sifat anti-
inflamasi yang menghambat enzim siklooksigenase (COX), dan memiliki efek perlindungan
kardiovaskular (4-8). Studi telah menunjukkan bahwa xanthone terprenilasi mampu
mengobati tuberkulosis (9). Dari xanthones yang diuji, α- dan β-mangostin, dan juga
garcinone B, memiliki efek penghambatan terkuat terhadap mycobacterium, yang diketahui
menyebabkan tuberkulosis (9,10). Namun, belum ada laporan yang secara khusus membahas
efek daun manggis pada melanogenesis.

Melanogenesis adalah jalur biosintesis untuk produksi melanin dari melanosit yang
terletak di lapisan terendah epidermis manusia (9). Penyinaran UV, faktor pemicu
melanogenesis tertentu, menyebabkan sekresi beberapa zat pemberi sinyal melanogenik:
proopiomelanocortin (POMC), pendahulu hormon perangsang α-melanosit (α-MSH),
reseptor α-MSH; reseptor melanokortin-1 (MC1R); enzim melanogenik; tirosinase; protein
terkait tirosinase-1 (TRP1); protein kinase C (PKC) dari melanosit (12,13). Pada epidermis
manusia, sekali α-MSH dan hormon adrenokortikotropik (ACTH) diproduksi dan dilepaskan
oleh keratinosit setelah penyinaran UV (14,15), mereka menggabungkannya dengan MC1R
reseptor spesifik mereka dan mengaktifkan adenil siklase melalui protein G, yang mengubah
adenosin trifosfat (ATP) terhadap adenosin monofosfat siklik (cAMP), yang menyebabkan
peningkatan tingkat cAMP intraselular (16,17). Siklik AMP, yang dihasilkan dari ATP,
berperan sebagai utusan kedua dalam jalur pensinyalan intraselular (18). Ketika peningkatan
cAMP berpengaruh pada PKA, unsur respon protein pengikat CAMP (CREB) dan elemen
respon cAMP (CRE), terletak pada promoter M gen genotipe yang terkait dengan
microphtalmia, saling mengikat (19). Siklik AMP kemudian mengalami melanogenesis,
terutama melalui aktivasi MITF, sehingga menyebabkan induksi ekspresi enzim melanogenik
(16). Peningkatan ekspresi MITF menyebabkan peningkatan ekspresi gen untuk keluarga
enzim melanogenik, tyrosinase, TRP1, TRP2 dan dopachrome tautomerase (DCT), yang
akhirnya merangsang sintesis melanin (20-22). Efek biologis siklik AMP tergantung pada
protein kinase A (PKA) dan sekali PKA phosphorylates CREB, ia berinteraksi dengan CRE
dan meningkatkan ekspresi CRE yang mengandung gen MITF, yang bertanggung jawab atas
urutan DNA di daerah promotornya (18, 23). Bahan yang diyakini menyebabkan peningkatan
cAMP intraselular adalah α-MSH, forskolin (FK), isobutyrylxanthine (IBMX), dan dibutyryl
cAMP (dbc AMP); Zat ini bisa diaplikasikan pada sel pigmen manusia dan tikus (18). Oleh
karena itu, fitokimia dan biomaterial lainnya yang dapat memodulasi tingkat cAMP
intraseluler juga dapat mengatur melanogenesis pada melanosit manusia dan tikus (21).

Proses pigmentasi kulit melibatkan sintesis melanin de novo dalam melanosit dan
perpindahan melanin yang disintesis yang dikemas dalam melanosom ke keratinosit tetangga,
yang akhirnya mengubah kulit menjadi warna gelap (24,25). Melanosom mengandung tiga
jenis enzim: tirosinase; TRP1; DCT (TRP2) (26). Tyrosinase adalah enzim pembatas laju
yang terlibat dalam sintesis melanin yang mengoksidasi tirosin, sejenis fenilalanin, sampai L-
3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) dan mengoksidasi L-DOPA menjadi dopaquinon (2,27).
Penumpukan dopaquinon yang berlebihan yang dihasilkan dari hidroksilasi dan oksidasi
tirosin membentuk dopachrome, yang secara kondisional mengeluarkan sistein, menghasilkan
akumulasi pigmen hitam dan kecoklatan, eumelanin. Jenis melanin lain, pheomelanin,
diproduksi melalui pembentukan 3- atau 5-sisteiniltopa dengan adanya sistein (27-29). Ketiga
enzim ini menentukan jenis melanin pada eumelanin atau pheomelanin (30). Dengan
demikian, warna kulit dapat ditentukan dengan perbandingan antara dua jenis melanin,
jumlah masing-masing jenis melanin, dan tingkat perpindahan melanosom ke keratinosit (22)

Ada beberapa penyakit yang ditandai dengan kurangnya pigmen pada kulit yang
disebut leukoderma; Beberapa disebabkan oleh ketidakmampuan melanosit untuk
menghasilkan melanin, sementara yang lain disebabkan oleh melanosit yang tidak hadir atau
dihancurkan (31). Yang terakhir adalah patologi piebaldisme fenotipik serupa dan penyakit
vitiligo (31,32). Piebaldisme ada saat lahir dan merupakan kekurangan melanosit di kulit,
sementara vitiligo adalah penyakit progresif, dimana melanosit secara bertahap hancur,
menyebabkan daerah yang tidak berpigmen pada kulit (31).

Dalam pencarian kami untuk pengobatan dengan potensi baru untuk gangguan
hipopigmentasi dalam pengobatan herbal, kami menemukan ekstrak daun manggis yang
efektif berkaitan dengan melanogenesis pada sel melanoma B16F1. Ekstrak daun manggis
merangsang melanogenesis dengan mengatur ekspresi tyrosinase dan faktor transkripsi
mikrophtalmia (MITF) pada sel melanoma B16F1. Dalam penelitian ini, efek ekstrak pada
melanogenesis diverifikasi. Penelitian ini juga dirancang untuk mendapatkan pengetahuan
tentang peran ekstrak dalam pensinyalan melanogenik pada sel melanoma B16F1.

BAHAN DAN METODE

BAHAN. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), α-MSH,

dimethyl sulfoxide (DMSO), dan FK dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Dulbecco's modified Εagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), dan penicillin-
streptomycin didapatkan dari Welgene (Daegu, Korea). Antibodi terhadap tyrosinase, MITF,
dan β-actin dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Daun manggis
matang yang segar dibeli dari Toko Tenaga Keluarga Sdn Bhd, Johor, Malaysia. Daun yang
dipilih dari divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, famili Clusiaceae, genu Garcinia L.,
dan spesies Garcinia mangostana. Keseluruhan daun secara hati-hati dicuci pada air dan
segera dikeringkan pada suhu 45-50˚C pada dryer vakum selama 8 jam dan disimpan pada
suhu ruangan sampai penggunaan kedepan. Daun yang dikeringkan kemudian ditumbuk dan
dihaluskan lebih jauh menggunakan sebuah grinder bubuk stainless-steel PG-10 (SUS),
dengan motor penggerak 10 HP dan kehalusan 100 mesh.

Ekstrasi dari ekstrak daun manggis. Ekstraksi ekstrak daun manggis dilakukan sebagai
berikut: 5 kg daun manggis kering diekstraksi dalam 80 liter air mendidih selama 2 jam.
Setelah pengangkatan padatan dengan penyaringan, larutan yang diekstraksi dikeringkan
dengan semprot spray dryer (Niro A / S, GEA Group, Soeborg Denmark). Suhu masuk dan
keluar masing-masing adalah 200 dan 110 ° C, dengan kapasitas umpan 7 l / jam. Hasil
ekstrak diperoleh pada 8% dari total bahan baku. Bubuk yang dihasilkan digunakan untuk
penentuan efek melanogenesis. Larutan kerja dari sampel disiapkan sebagai berikut: bubuk
kering dilarutkan dalam air sampai konsentrasi akhir 1% (b / v) dan disterilkan melalui
penyaringan. Filtrat yang dihasilkan disimpan pada suhu -20˚C.

Kultur Sel. Sel Melanoma B16F1 didapatkan dari Korean Cell Line Bank (KCLB) dan
dipertahankan dalam 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin ditambah DMEM. Inkubasi
dilakukan pada inkubator CO2 5% pada suhu 37 ° C.

α-MSH dan ekstrak daun manggis. Sel melanoma B16F1 diunggulkan pada kepadatan
1.5ⅹ105 sel / sumur di piring 6 sumur yang mengandung DMEM ditambah dengan 10% FBS
dan 1% penisilin-streptomisin. Setelah 24 jam, medium disubstitusi dengan media segar
ditambah 5 nM α-MSH, 10 μM FK, dan konsentrasi ekstrak daun manggis yang berbeda (4,
8, 16 atau 32 μg / ml) dan diinkubasi selama 48 jam . DMEM digunakan sebagai kontrol
negatif, dan 5 nM α-MSH atau 10 μM FK (32) digunakan sebagai kontrol positif.

MTT assay. Uji MTT adalah uji kolimimetri untuk mengukur aktivitas enzim mitokondria
enzim yang mengurangi MTT pada pewarna formazan, memberikan warna ungu. Aplikasi
utama memungkinkan menilai viabilitas (penghitungan sel) dan proliferasi sel (tes kultur sel).
Ini juga dapat digunakan untuk menentukan sitotoksisitas agen obat potensial dan bahan
toksik, karena agen tersebut akan merangsang atau menghambat viabilitas dan pertumbuhan
sel. Setelah 48 jam, media kultur dipindahkan dan diinkubasi dengan larutan MTT pada suhu
37 ° C selama 90 menit. Larutannya diganti dengan larutan HCl-isopropil alkohol 0,04 N,
dengan inkubasi lebih lanjut pada suhu ruangan selama 30 menit. Larutan dipanen
disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Penyerapan supernatan diukur pada 570 nm
dengan menggunakan pembacaan mikroplate (Perkin-Elmer, AS).

Uji 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Scavenging radikal bebas DPPH merupakan

dasar dari uji antioksidan umum. Sejumlah protokol telah diikuti untuk pengujian ini
sehingga menghasilkan variasi hasil dari laboratorium yang berbeda. DPPH adalah singkatan
umum untuk senyawa kimia organik DPPH. Ini adalah bubuk kristal berwarna gelap yang
tersusun dari molekul radikal bebas yang stabil. DPPH memiliki dua aplikasi utama, baik
dalam penelitian laboratorium, satu sebagai monitor reaksi kimia yang melibatkan radikal dan
yang lainnya sebagai standar posisi dan intensitas sinyal resonansi paramagnetik elektron.
Metode yang menggunakan DPPH sebagai radikal bebas yang stabil untuk mengukur
aktivitas scavenging radikal telah banyak digunakan. Antioksidan bereaksi dengan DPPH,
yang merupakan radikal bebas stabil, dan mengubahnya menjadi 1,1-diphenyl-2- (2,4,6-
trinitrofenil) hidrazin. Tingkat perubahan warna menunjukkan potensi scavenging senyawa
antioksidan. DPPH digunakan untuk mengukur kapasitas penghilangan radikal (anti
oksidatif) dari berbagai produk pertanian. Dalam uji ini, DPPH (Sigma) dilarutkan dalam
etanol pada volume 250 μM, dilanjutkan dengan sonikasi selama 5 menit untuk mendapatkan
DPPH radikal bebas yang stabil (33). Senyawa uji terdilusi dalam larutan DPPH dengan
perbandingan 1: 1. Kontrol yang tepat dilakukan pada setiap seri dan larutan DPPH segar
disiapkan setiap hari. Ekstrak daun manggis diuji dalam rangkap tiga pada lima konsentrasi
yang berbeda, sehingga penurunan absorbansi DPPH 50% dapat dihitung. Penyerapan
campuran reaksi diukur setelah 20 menit menggunakan UV / V adalah spektrometer (DU730,
Beckman Coulter, AS). FSC50 (konsentrasi menyebabkan 50% aktivitas pembilasan radikal)
nilai ekstrak daun manggis ditentukan dan dibandingkan dengan asam L-askorbat dan Trolox
(semua dari Sigma).

Uji Melanin. Uji melanin yang disekresikan dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya
dengan sedikit modifikasi (34,35). Setelah 48 jam, media kultur dipanen dan disentrifugasi
pada 10.000 rpm selama 10 menit. Penyerapan diukur pada 405 nm dengan menggunakan
pembaca mikroplate (Perkin-Elmer). Melanin yang disekresi dinyatakan dalam rasio yang
dihitung sebagai berikut: melanin yang disekresikan (%) = (C-A) / B ⅹ 100]

Dalam formula ini, A mewakili nilai absorbansi medium yang dilengkapi dengan masing-
masing sampel (sebelum inkubasi), B, nilai absorbansi media yang tidak diberi ekstrak
(dipanen setelah 48 jam inkubasi), dan C, nilai absorbansi medium ditambah dengan masing-
masing sampel (dipanen setelah 48 jam inkubasi). Semua nilai diperoleh dari pengukuran
pada 405 nm.

Pengukuran kadar melanin. Kandungan melanin dari melanoma kultur dievaluasi sesuai
dengan metode yang dijelaskan sebelumnya, dengan sedikit modifikasi (37). Singkatnya,
pelet sel dilarutkan dalam DMSO 10%, dilarutkan dalam NaOH 1 M (80˚C), dan direbus
selama 2 jam. Konsentrasi melanin dihitung dengan perbandingan OD pada panjang
gelombang 400 nm dan dibandingkan dengan kurva standar yang diperoleh dari melanin
sintetis. Untuk menentukan formasi melanin sebenarnya dari jumlah sel yang sama,
kandungan melanin total setiap pelet dibagi dengan jumlah sel melanoma. Semua pengukuran
dilakukan secara rangkap tiga.

Uji aktivitas tirosinase intraselular. Uji aktivitas tirosinase intraselular dilakukan seperti
yang dijelaskan sebelumnya, dengan sedikit modifikasi (13,27). Setelah 48 jam, sel kultur
dicuci dengan PBS dan dipanen dalam buffer lisis sel RIPA yang dilengkapi dengan protease
inhibitor. Lysate sel diperoleh setelah sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 15 menit. Jumlah
protein dihitung dengan metode Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, AS), menggunakan BSA
sebagai standar (albumin serum sapi, Bio-Rad). Jumlah masing-masing lisat sel disesuaikan
dengan buffer lisis untuk memberikan konsentrasi protein yang sama. L-DOPA (10 μl) dalam
buffer natrium fosfat (10 mM) ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.
Penyerapan diukur pada 475 nm dengan menggunakan pembaca mikroplate (Perkin-Elmer)

Zimografi tirosinase (pewarnaan L-DOPA). Zimografi tirosinase dilakukan seperti yang

telah dijelaskan sebelumnya (36). Setelah 48 jam, sel yang dikultur dicuci dengan PBS dan
dipanen dengan sel RIPA buffer lisis yang disuplementasikan dengan protease uji tirosinase
intraseluler. Setiap sampel dicampur dengan sampel buffer zimogram diisi kedalam gel 8%
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Setelah berjalan,
gel direndam dua kali dalam buffer natrium fosfat 0,1 M selama 30 menit. Pewarnaan
dilakukan dengan 10 mM L-DOPA dalam buffer natrium fosfat 0,1 M selama 1 jam pada
suhu 37 ° C.

Analisis immunoblotting. Setelah lisat sel disiapkan dengan menggunakan protokol standar,
masing-masing sampel dicampur dengan sampel Laemmli dan didenaturasi pada suhu 85 ° C
selama 5 menit. Setelah itu, sampel dimasukkan ke gel 8% SDS-PAGE. Setelah berjalan, gel
dipindahkan ke membran PVDF dan diblokir dengan susu skim 5%. Anti-tirosinase dan anti-
MITF digunakan sebagai antibodi primer dan anti-goat IgG-HRP dan anti-mouse IgG-HRP
(semua dari Bioteknologi Santa Cruz) sebagai antibodi sekunder. Reaksi antibodi antigen
terdeteksi dengan menggunakan sistem larutan ECL (Perkin-Elmer).

Analisis Statistik. Signifikansi statistik diperiksa menggunakan test-t Student. Seluruh hasil
dipresentasikan sebagai mean ± SD dari data yang dikombinasi dari replikasi eksperimen.

Tabel 1: Aktivitas scavenging radikal bebas dari sejumlah konten massa dari antioksidan
Gambar 1. Ekstrak daun Mangosteen tidak memiliki dampak yang terdeteksi pada aktivitas
mitokondrial seluler melanoma B16F1. Aktivitas mitokondrial seluler melanoma B16F1
divalidasi melalui metode assay MTT. (A) Seperti yang ditunjukkan pada gambar, viabilitas
sel melanoma B16F1 meningkat dengan pengobatan ekstrak daun mangosteen dengan dosis
yang bervariasi pada konsentrasi 4 dan 8 μg/ml. Pada konsentrasi dari 32 μg/ml, viabilitas sel
menunjukkan 90% dan penurunan nilai dari viabilitas sel tumbuh berdasarkan konsentrasi
yang tinggi (data tidak ditunjukkan) (B) Angka relatif dari sel melanoma B16F1 setelah
pengobatan dua hari dengan ekstrak daun mangosteen. Nilai dari sel melanoma menurun
bergantung pada dosis sampai dengan 32 μg/ml dari pengobatan ekstrak ML. Hasil rata-rata
dari ketiga eksperimen independen ± SD. *P<0.05, **P<0.01 dibandingkan dengan (+)
kontrol α-MSH.
Hasil Penelitian

Esktrak daun manggis memiliki aktivias scavenging radikal yang kuat.

Untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari ekstrak daun manggis, dilakukan assay DPPH.
Penyerapan dari DPPH radikal bebas menurun ketika diukur pada nilai 517 nm untuk lima
konsentrasi yang berbeda dan memproduksi perubahan warna, dengan pewarnaan dari
keunguan menuju kekuningan. Nilai FSC50 dipastikan untuk esktrak adalah sebesar 34.30
μg/ml (Tabel I). Nilai FSC50 dari asam L-askorbik dan Trolox adalah sebesar 27.62 dan
29.57 μg/ml, masing-masingnya. Data mengindikasikan bahwa ekstrak memiliki sebuah
kapasistas antioksidan yang kuat, sebanding dengan asam L-askorbik dan Trolox.

Efek dari ekstrak daun manggis pada aktivitas sel mitokondria dan sejumlah sel ynag
berhubungan, menggunakan sel melanoma B16F1 yang dikultur.

Aktivitas seluler mitokondrial dari sel melanoma B16F1 yang dikultur diukur menggunakan
sebuah assay MT. Setelah dua hari pengobatan, esktrak daun manggis (ML) tidak
menunjukkan efek samping yang terdeteksi pada aktivitas sel mitokondria pada konsentrasi
diantara sebesar 4-32 μg/ml (w/v) (Gambar. 1A). Aktivitas sel mitokondria sedikit menurun
ketika konsentrasi dari ML dinaikkan, akan tetapi, pola yang berbeda diobservasi untuk α-
MSH, dimana aktivitas sel mitokondria dari sel melanoma meningkat dalam
perbandingannya dengan kontrol negatif. Berdasarkan dengan observasi ini, eksperimen
dilakukan pada jarak konsentrasi ini.

Untuk jumlah relatif sel melanoma B16F1, penulis memeriksa apakah ML dapat
meningkatkan jumlah sel melanoma B16F1 hingga 2 hari pengobatan. Berdasarkan hasil dari
Gambar 1B, jumlah relatif sel melanoma B16F1 tidak meningkat, namun menurun setelah 2
hari pengobatan dengan ML.
Gambar 2. Sintesis melanin meningkat dengan perlakuan ekstrak daun manggis. (A) Hasil uji
melanin yang disekresikan menunjukkan bahwa ekstrak daun manggis (ML) sangat
meningkatkan melanogenesis pada sel melanoma B16F1. Efek dari 16 μg/ml ML sebanding
dengan kontrol yang diterapi α-MSH dan 3 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan
kontrol negatif. Hasil 32 μg/ml lebih efisien daripada kontrol yang diterapi dengan α-MSH
dan 3,5 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif. Peningkatan efikasi ini
ternyata lebih efektif daripada 5 nM α-MSH atau 10 μM forskolin (FK). Setelah pemberian
ML, kandungan melanin meningkat tergantung peningkatan dosis sampai 32 μg/ml. (B)
Jumlah relatif melanin yang disekresi meningkat tergantung dosis dengan meningkatnya
konsentrasi ekstrak ML. Sesuai dengan hasil dari melanin yang disekresikan, jumlah melanin
relatif dari sel melanoma individu meningkat hingga 5,2 kali lipat bila diterapi dengan 32
μg/ml ekstrak dibandingkan dengan kontrol negatif. (C) Jumlah relatif kandungan melanin
menunjukkan pola yang sama, dengan kecenderungan kenaikan tergantung dosis dari hasil
yang diperoleh dari melanin yang disekresikan. Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak
tertinggi (32 μg/ml), kandungan melanin untuk setiap sel ditemukan ~ 2 kali lipat lebih tinggi
daripada kontrol negatif. (D) Melanin total yang disekresikan ke media kultur dan disajikan
di dalam sel masing-masing melanoma B16F1 individu, mengungkapkan bahwa FK
menunjukkan efek melanogenik yang sangat kuat dengan menginduksi aktivitas
melanogenesis hingga 2,1 kali lipat dan α-MSH juga menunjukkan efek yang signifikan
mempengaruhi aktivitas seperti itu hampir 2 kali lipat. ML menunjukkan aktivitas
melanogenik yang lebih kuat terhadap kandungan dan sekresi melanin total, lebih baik dari
pada α-MSH dan FK. Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak maksimum (32 μg/ml),
kandungan melanin total dan sekresi untuk masing-masing sel secara signifikan meningkat
hingga 2,7 kali lipat dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. Hasil rata-rata tiga
percobaan independen ± SD. *P<0,05; ** P<0,01 dibandingkan dengan kontrol α-MSH
positif.

Untuk jumlah relatif sel melanoma B16F1, penulis memeriksa apakah ML dapat
meningkatkan jumlah sel melanoma B16F1 hingga 2 hari pengobatan. Berdasarkan hasil dari
Gambar 1B, jumlah relatif sel melanoma B16F1 tidak meningkat, namun menurun setelah 2
hari pengobatan dengan ML.

Efek ekstrak daun manggis pada sekresi melanin sel melanoma B16F1.

Untuk mengamati apakah ekstrak daun manggis menginduksi melanogenesis, jumlah

melanin yang disekresikan ke dalam medium kultur dan ada di dalam sel ditentukan.
Kandungan melanin sel B16F1 yang diobati dengan konsentrasi ekstrak ML yang berbeda
diukur. Baik α-MSH dan FK telah terbukti menjadi agen melanogenik yang efektif, dan
karenanya digunakan sebagai kontrol positif. Baik α-MSH dan FK juga dikenal sebagai agen
yang meningkatkan cAMP (18), karena jalur cAMP adalah salah satu jalur sinyal yang paling
penting dalam melanogenesis. Dalam percobaan ini, sel diobati dengan ML (4, 8, 16 atau 32
μg/ml), α-MSH (5 nM), dan FK (10 μM) selama 2 hari, dan kemudian jumlah melanin
disekresikan ke dalam medium kultur dan terdapat di dalam sel dianalisis.

Kandungan melanin yang disekresikan secara bertahap meningkat setelah pengobatan

dengan ML 4-16 μg/ml, mencapai nilai maksimum pada dosis tertinggi (32 μg/ml) ML
(Gambar 2A). FK dengan jelas menunjukkan aktivitas melanogeniknya yang kuat dengan
meningkatkan melanin yang disekresi ke tingkat 3,5 kali lipat dari kontrol yang tidak diobati,
sementara α-MSH juga menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam sekresi melanin (3
kali lipat). Ekstrak daun manggis menunjukkan efek melanogenik yang lebih kuat lagi pada
sekresi melanin daripada FK dan α-MSH di bawah kondisi eksperimental ini. Peningkatan
dosis tergantung dari kandungan melanin yang disekresi diamati saat diobati dengan jumlah
ekstrak ML yang meningkat. Pada 16 μg/ml, efek melanogenik ekstrak ML pada melanin
yang disekresikan sangat mirip dengan α-MSH dan FK. Sekresi melanin secara maksimal
meningkat ketika sel melanoma B16F1 diobati dengan 32 μg/ml ekstrak (Gambar 2A),
menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mungkin telah mendorong sintesis melanin di dalam
sel. Untuk lebih memastikan apakah sekresi melanin yang diinduksi ekstrak pada sel
melanoma B16F1, nilai aktual melanin dari sekresi melanin untuk setiap melanoma diperiksa.
Sesuai dengan hasil melanin yang disekresikan, nilai relatif melanin sel melanoma meningkat
hingga 5,2 kali lipat bila diobati dengan 32 μg/ml ekstrak bila dibandingkan dengan kontrol
negatif (Gambar 2B). Pengobatan dengan 16 μg/ml ML, menghasilkan nilai aktual dari
melanin relatif yang serupa dan sebanding dengan pengobatan FK, dan bahkan lebih baik dari
itu dengan α-MSH. Sebaliknya, nilai relatif melanin pada sel melanoma B16F1 meningkat
sampai 3,5 dan 4,0 kali lipat.

Gambar 3. Ekstrak daun manggis meningkatkan melanogenesis pada sel melanoma B16F1.
(A) Up-regulasi ekspresi tirosinase menghasilkan peningkatan dosis dependen pada warna
media sel melanoma B16F1 dari warna merah muda menjadi coklat sangat gelap. (B) Warna
hitam gelap pada pelet sel melanoma B16F1 menunjukkan bahwa α-MSH, forskolin, dan
ekstrak daun manggis (ML) merangsang aktivitas tirosinase. Pengobatan dengan 5 nM α-
MSH menghasilkan warna yang lebih hitam dan lebih gelap dari pelet sel melanoma B16F1.
Warna pelet sel secara signifikan lebih hitam dan lebih gelap setelah perawatan dengan 10
μM forskolin, dibandingkan dengan kontrol negatif dan α-MSH. Pengobatan dengan 32
μg/ml ML menghasilkan warna paling hitam dan paling gelap untuk pelet sel B16F1
dibandingkan dengan sel perlakuan lainnya, yang menunjukkan bahwa dosis dependen ML
meningkatkan aktivitas melanogenesis.

Efek ekstrak daun manggis pada kandungan melanin sel melanoma B16F1.

Untuk lebih memperjelas efek ekstrak ML pada melanogenesis, jumlah melanin di

dalam sel diuji dan hasilnya diperoleh bahwa kandungan melanin untuk masing-masing dosis
sel melanoma secara individu meningkat dengan ML. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2C,
perlakuan dengan konsentrasi ekstrak tertinggi (32 μg/ml), menghasilkan peningkatan 2 kali
lipat kandungan melanin dibandingkan dengan kontrol negatif. Tidak ada efek yang
signifikan yang diamati pada pengobatan dengan α-MSH, yang mengindikasikan bahwa α-
MSH secara signifikan meningkatkan melanin yang disekresikan, namun tidak meningkatkan
kandungan melanin pada sel melanoma B16F1; Namun, FK menunjukkan peningkatan
kandungan melanin per sel, hingga 1,6 kali lipat dibandingkan kontrol yang tidak diobati,
efeknya sama dengan pada sel yang diobati dengan 8 μg/ml ML. Dari hasil ini, sekali lagi,
ekstrak daun manggis dengan jelas menunjukkan aktivitas melanogenik yang kuat dengan
meningkatkan kandungan melanin secara signifikan dibandingkan perlakuan dengan α-MSH
dan FK.

Melanin total yang disekresikan ke media kultur dan muncul di dalam sel masing-
masing sel melanoma individu B16F1 menunjukkan bahwa FK menunjukkan efek
melanogenik yang sangat kuat dengan merangsang aktivitas melanogenesis hingga 2,1 kali
lipat (Gambar 2D); α-MSH juga menunjukkan efek signifikan pada stimulasi aktivitas ini
dengan 2 kali lipat, walaupun hasil yang diperoleh dari pengujian kandungan melanin tidak
signifikan seperti yang diperoleh dengan uji melanin yang disekresikan. Ekstrak daun
manggis menunjukkan aktivitas melanogenik yang lebih kuat terhadap kandungan melanin
total dan sekresi daripada α-MSH dan FK. Seperti yang diperkirakan, dengan mengobati
dengan konsentrasi ekstrak maksimum (32 μg/ml), kandungan melanin total dan sekresi
untuk setiap sel individual meningkat secara signifikan, sampai 2,7 kali lipat dibandingkan
kontrol yang tidak diobati. Dengan mengobati dengan 8 dan 16 μg/ml ekstrak, kandungan
melanin total dan sekresi per sel sebanding dan lebih baik daripada yang diobati dengan α-
MSH dan FK. Dari temuan ini, dikonfirmasi bahwa peningkatan biosintesis dan sekresi
melanin juga menghasilkan warna yang berbeda dan gelap dari media melanoma B16F1 dan
warna hitam pelet sel (Gambar 3A dan B). Pengamatan ini menunjukkan bahwa ekstrak daun
manggis meningkatkan aktivitas melanogenesis sel melanoma B16F1.

Gambar 4. Aktivasi dan peningkatan aktivitas tirosinase intraselular sel melanoma B16F1
dengan ekstrak daun manggis. (A) Pengobatan ekstrak daun manggis (ML) secara efektif
meningkatkan aktivitas tirosinase intraselular. Setelah diobati dengan α-MSH, aktivitas
tirosinase intraselular sel melanoma B16F1 meningkat 2 kali lipat, meningkat secara
signifikan dibandingkan kelompok kontrol negatif, sementara pengobatan dengan forskolin
meningkatkan aktivitas tirosinase intraseluler sebanyak 2,3 kali lipat. Perlakuan lebih lanjut
dengan 32 μg/ml ML meningkatkan aktivitas tirosinase intraselular sebanyak 2,8 kali lipat.
(B) Peningkatan aktivitas tirosinase oleh ML dikonfirmasi melalui zimografi tirosinase untuk
mengidentifikasi bentuk aktif tirosinase. Peran ML dalam stimulasi tirosinase aktif pada sel
melanoma B16F1 diperiksa. Hasil zymografi tirosinase menunjukkan pita tirosinase berwarna
gelap setelah diobati dengan α-MSH. Pita ini menjadi lebih gelap pada perlakuan forskolin;
Perlakuan dengan ML pada konsentrasi 32 μg/ml mengakibatkan peningkatan intensitas pita.
Hasil ini menegaskan bahwa ada peningkatan aktivitas tirosinase pada sel yang diobati
dengan ML. Hasil rata-rata tiga percobaan independen ± SD. *P<0,05, **P<0,01
dibandingkan dengan (+) kontrol α-MSH.

Efek melanogenik ekstrak daun manggis pada aktivitas tirosinase intraselular sel
melanoma B16F1.

Melanogenesis diatur oleh aktivitas tirosinase, enzim pembatas laju dalam biosintesis
melanin (13). Karena melanin berasal dari dopaquinone prekursor yang dibentuk oleh
tirosinase oksidasi L-tirosin, tirosinase berperan penting dalam sintesis melanin. Peningkatan
aktivitas tirosinase pada melanosit dapat dicapai baik dengan penghambatan langsung
tirosinase sendiri atau stimulasi ekspresi gen tirosinase, yang menyebabkan peningkatan
jumlah tingkat protein dalam sel. Dengan demikian, dalam penelitian ini, penulis meneliti
efek ekstrak daun manggis pada aktivitas tirosinase. Untuk menjelaskan mekanisme
melanogenesis yang distimulasi oleh ekstrak, sel melanoma B16F1 diobati dengan ekstrak
pada konsentrasi yang sama, dengan uji melanin. Setiap persentase nilai aktivitas tirosinase
pada sel yang diobati dihitung berkenaan dengan kelompok kontrol. Jumlah sel lysate yang
sama dikalibrasi berkenaan dengan konsentrasi protein yang diaplikasikan pada reaksi
oksidasi dengan L-DOPA. Setelah diobati dengan α-MSH, aktivitas tirosinase intraseluler sel
B16F1 meningkat 2,5 kali lipat seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A. Pengobatan
dengan FK secara signifikan meningkatkan aktivitas tirosinase intraselular lebih dari 3 kali
lipat, sementara pengobatan dengan 32 μg/ml ekstrak dengan jelas menunjukkan peningkatan
aktivitas tirosinase intraselular 4 kali lipat. Pengamatan ini konsisten dengan fakta bahwa
mereka diketahui sebagai stimulator tyrosinase langsung dan sebagai hasilnya, dikonfirmasi
bahwa peningkatan sintesis melanin disertai dengan peningkatan aktivitas tirosinase. Sejajar
dengan kadar melanin yang disekresikan, aktivitas tirosinase intraseluler juga meningkat
tergantung dosis ekstrak.

Ekstrak daun manggis menginduksi ekspresi gen tirosinase oleh zymography tirosinase.

Untuk memperjelas mekanisme pengaktifan tirosinase lebih lanjut dengan ekstrak

daun manggis, tingkat ekspresi tirosinase pada sel melanoma B16F1 diperiksa dengan
zimografi tirosinase. Aktivitas tirosinase juga dapat dianalisis setelah pemisahan dengan
SDS-PAGE. Pemisahan tirosinase berdasarkan berat molekul pada gel menunjukkan aktivitas
enzimatiknya dengan mengamati oksidasi larutan L-DOPA yang diaplikasikan pada gel untuk
membentuk dopaquinone berwarna gelap (38). Pengobatan α-MSH menciptakan pita hitam-
gelap dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. Pengobatan FK menciptakan pita
hitam yang lebih gelap dari pada α-MSH atau kontrol yang diobati (Gambar 4B). Sementara
itu, pengobatan dengan 32 μg/ml ekstrak ML menghasilkan pita hitam yang sangat berbeda
dan paling gelap. Perlakuan dengan 8 μg/ml ekstrak ML menghasilkan pita hitam yang
serupa dan sebanding dengan perlakuan α-MSH, sedangkan perlakuan dengan 16 μg/ml
ekstrak memberi warna hitam lebih gelap dari pada yang diperoleh dengan pengobatan
dengan FK. Dari pengamatan ini, hasilnya membuktikan bahwa zymography tirosinase
nampaknya berkorelasi baik dengan pengukuran aktivitas tirosinase intraselular.

Immunoblotting menunjukkan pengaturan ekspresi MITF dan tirosinase.

Melanin disintesis dalam melanosom, yang menyimpan enzim spesifik yang

diperlukan untuk produksi melanin. Diantaranya, keluarga gen tirosinase telah ditentukan
untuk melakukan peran penting dalam regulasi melanogenesis (39). Tyrosinase, enzim
spesifik yang mengkatalisis langkah pembatas laju biosintesis melanin, adalah penanda
diferensiasi yang baik pada sel melanosit dan melanoma. MITF memiliki motif ritsleting
dasar helix-loop-helix (b-HLH) dan b-HLH-leusin, faktor transkripsi dominan yang penting
untuk ekspresi melanogenik, dan memainkan peran penting untuk regulasi pada tingkat
transkripsi dalam melanogenesis tirosinase, tirosinase protein terkait 1 (TRP-1), dan protein
terkait tirosinase 2 (TRP-2) (16). Dengan demikian, aktivasi MITF dikenal sebagai peristiwa
kritis dalam melanogenesis (17). Pengaturan ulang komponen terkait sintesis melanin seperti
tirosinase dan MITF menghasilkan peningkatan sintesis melanin. Dengan demikian, untuk
menyelidiki mekanisme ekstrak daun manggis mempengaruhi melanogenesis, kami
memeriksa efek ekstrak pada ekspresi protein melanogenik seperti tirosinase dan MITF,
melalui penentuan gen tirosinase dan MITF yang menggunakan analisis imunoblot. Dalam
percobaan ini, ekspresi β-actin serupa yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah protein
yang sama dimuat selama SDS-PAGE (Gambar 5). Peningkatan tyrosinase 75-kDa yang
ditandai pada pengobatan dengan α-MSH dan FK berkorelasi baik dengan peningkatan
aktivitas tirosinase intraselular pada kondisi yang sama. Tingkat ekspresi tirosinase dan MITF
meningkat secara nyata setelah pengobatan dengan ekstrak (Gambar 5A). Ekspresi protein
MITF dan tirosinase secara bertahap meningkat dengan cara tergantung dosis, menunjukkan
bahwa kedua ekspresi protein berkorelasi dengan baik dan sesuai dengan peningkatan sintesis
melanin (Gambar 2A-C) dan aktivitas tirosinase (Gambar 3). Ekspresi MITF dan tirosinase
untuk sel yang diobati dengan ekstrak daun manggis nampaknya sangat berbeda dan lebih
gelap dibandingkan sel yang hanya diobati dengan 5 nM α-MSH dan 10 μM FK. Hasilnya
menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen tyrosinase oleh ekstrak ML bisa jadi
disebabkan oleh peningkatan kadar MITF. Namun, apakah penambahan protein MITF ini
disebabkan oleh ekspresi gen MITF yang diinduksi tidak ditentukan dalam percobaan ini.

Penelitian telah menemukan bahwa efektor hulu mengatur MITF, termasuk. (ERK),
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), dan glikogen sintase kinase 3β (GSK3β) (16,40,41).

Gambar 5. Ekspresi Tyrosinase dan MITF yang terdeteksi oleh immunoblotting. (A) Ekspresi
tirosinase terbukti meningkat. β-ekspresi aktin digunakan untuk menunjukkan pemuatan
protein yang sama di semua jalur. Ekspresi protein tirosinase dan MITF meningkat dengan
pengobatan ekstrak daun manggis (ML). ML meniru stimulator melanogenesis,
meningkatkan tirosinase dan ekspresi MITF, yang secara langsung mengatur sintesis melanin.
(B) Western blotting menunjukkan bahwa ekspresi MITF meningkat dengan pengobatan ML.
Ekspresi β-aktin digunakan untuk memverifikasi bahwa jumlah protein yang sama dimuat di
semua jalur. MITF adalah regulator transkripsi kunci, yang terkait dengan aktivasi protein
melanogenik seperti tirosinase. ML meningkatkan melanogenesis dengan mengatur ekspresi
MITF.
Diskusi

Penelitian sebelumnya dari kelompok lain menunjukkan bahwa racun lebah

meningkatkan melanogenesis pada melanosit manusia (42). Selanjutnya, telah ditunjukkan
bahwa ekstrak dari beberapa ramuan, termasuk ekstrak rimpang kava (43), glycyrrhizin (44),
bunga teratai (45), cubebin (46), quercetin (47) dan naringenin (17) meningkatkan
melanogenesis pada melanoma B16 sel dan melanosit manusia, sehingga menunjukkan
bahwa sumber daya alam harus diskrining secara ekstensif untuk pengembangan agen
pencegahan gray hair atau obat terapeutik untuk menginduksi repigmentasi pada kulit pasien
vitiligo.

Sesuai dengan kecenderungan meningkatnya permintaan untuk mengatasi masalah

mengenai hipopigmentasi dan vitiligo, ekstrak daun manggis dievaluasi untuk kemungkinan
merangsang efikasi melanogenik dengan menggunakan sel melanoma B16F1 berbudaya.
Dalam penelitian ini, efek ekstrak daun manggis dievaluasi dengan induksi pigmentasi kulit
dan uji melanin, dengan uji tirosinase intraseluler, zimografi tirosinase, dan dengan
imunoblotting untuk membuktikan bahwa ML menginduksi sintesis melanin dalam sel
melanoma B16F1 yang dikultur dan terkendali. pada konsentrasi 32 μg/ml, efek yang lebih
poten dari yang dihasilkan oleh 5 nM α-MSH atau 10 μM FK.

Ekstrak ML ditunjukkan untuk meningkatkan sintesis melanin pada sel melanoma

B16F1 dengan cara yang tergantung dosis. Sel melanoma B16F1, setelah diobati dengan
ekstrak daun manggis, menunjukkan peningkatan melanin dan aktivitas tirosinase intraseluler
sekresi lebih dari 2 kali lipat, menunjukkan bahwa ekstrak ini dapat menjadi salah satu agen
stimulasi melanogenik. Selanjutnya, aktivitas tirosinase intraselular dihasilkan dari ekstrak
ML yang bertindak sebagai stimulator oksidasi tirosinase. Zimografi tirosinase, metode untuk
mengidentifikasi tirosinase intraselular, membuktikan bahwa tirosinase intraselular
dirangsang oleh ekstrak ML lebih efisien daripada dengan α-MSH atau FK. Ekstrak ML
meningkatkan tingkat ekspresi tirosinase dan menghasilkan pita yang sangat gelap dan
berbeda melalui zimografi tirosinase. Selain itu, tingkat ekspresi tirosinase dan MITF melalui
analisis imunoblot menunjukkan bahwa ekstrak daun manggis dapat menjadi kandidat yang
menjanjikan yang mampu merangsang melanogenesis dengan pengaturan aktivitas tirosinase
seluler dan proses katalitik langsung. Pilih konsentrasi ekstrak daun manggis (16 dan 32
μg/ml) ternyata lebih poten daripada 5 nM α-MSH atau 10 μM FK dalam menginduksi efek
melanogenik sel melanoma B16F1. Dengan demikian, hasil yang disajikan menunjukkan
bahwa ekstrak daun manggis dapat bermanfaat untuk pengobatan gangguan hipopigmentasi,
dalam pengembangan agen pencegahan gray hair, dan berguna untuk produk kosmetik self-
tanning. Penelitian selanjutnya akan berfokus pada identifikasi senyawa aktif yang
bertanggung jawab atas aktivitas melanogenik dan studi mekanis jalur melanogenesis ekstrak
daun manggis ini.