Elektroforesis dan Blot

Prinsip

Asam nukleat (DNA, RNA) bergerak dari negatif ke kutub positif selama elektroforesis gel.
Hambatan gerakan adalah karena efek pengayakan dari matriks gel. Tingkat migrasi terkait
dengan ukuran asam nukleat

Acrylamide adalah polimer sintetik silang yang berguna dalam memisahkan molekul DNA
dari beberapa ratus basa panjang. Reaksi pengikatan silang dilakukan dalam peralatan cetak.
Gel akhir transparan dan biasanya digunakan dalam alat vertikal

Agarose adalah polisakarida yang mirip dengan pati berguna dalam memisahkan molekul
DNA dan RNA dari beberapa ratus hingga puluhan ribu pada basis panjang. Gel dibuat
dengan mendidihkan agarose menjadi larutan dan memungkinkannya mendingin dalam alat
cetak. Gel akhir bersifat tembus cahaya dan biasanya digunakan dalam alat horizontal

Agarose Gel Elektroforesis

Elektroforesis gel adalah teknik yang banyak digunakan untuk analisis asam nukleat dan
protein. Agarose gel elektroforesis secara rutin digunakan untuk persiapan dan analisis DNA..
Elektroforesis gel adalah prosedur yang memisahkan molekul berdasarkan tingkat
pergerakannya melalui gel di bawah pengaruh medan listrik.. Kami akan menggunakan
elektroforesis gel agarose untuk menentukan keberadaan dan ukuran produk PCR. Produk
PCR menunjukkan keberadaan Wolbachia.

Elektroforesis Gel Virtual

• DNA bermuatan negatif.

• Ketika ditempatkan di medan listrik, DNA akan bermigrasi ke arah positif
 kutub (anoda).
• Gel agarose digunakan untuk memperlambat pergerakan DNA dan terpisah
berdasarkan ukuran.
• Agarose berpolimerisasi berpori,
 memungkinkan untuk pergerakan DNA

Seberapa cepat DNA akan bermigrasi?

kekuatan medan listrik, penyangga, densitas gel agarose ...

Ukuran DNA!

* DNA kecil bergerak lebih cepat dari DNA besar

... elektroforesis gel memisahkan DNA menurut ukuran

Dalam gel agarosa, DNA linear bermigrasi terbalik berbanding terbalik dengan log10 berat
molekul mereka. Agarose adalah polimer linear yang diekstrak dari rumput laut.
Gel agarose manis telah dimakan di Timur Jauh sejak abad ke-17. Agarose pertama kali
digunakan dalam biologi ketika Robert Koch * menggunakannya sebagai media budaya
untuk bakteri Tuberkulosis pada tahun 1882

Membuat Agarose Gel

• Gel agarose disiapkan dengan menggabungkan bubuk agarose dan larutan buffer.
• Peralatan elektroforesis
• Gel casting tray & sisir
• Menyiapkan Baki Casting: Segarkan tepi baki casting dan masukkan sisir. Tempatkan
baki casting pada permukaan yang rata. Tak satu pun dari gel sisir harus menyentuh
permukaan baki casting. Campurkan bubuk agarose dan larutan buffer. Gunakan labu
yang beberapa kali lebih besar dari volume buffer.
• Melting Agarose: Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri). Larutan agarose direbus
sampai bersih (kanan). Geser perlahan larutan secara berkala saat pemanasan untuk
memungkinkan semua butiran agarose larut.(*** Hati-hati saat merebus - larutan
agarose menjadi terlalu panas dan bisa mendidih hebat jika dipanaskan terlalu lama
dalam oven microwave.)
• Menuangkan gel : Biarkan larutan agarose menjadi agak dingin (~ 60ºC) dan
kemudian dengan hati-hati tuangkan larutan agarose cair ke dalam baki casting.
Hindari gelembung udara. Masing-masing gel sisir harus terendam dalam larutan
agarose cair. Ketika didinginkan, agarosa berpolimerisasi, membentuk gel fleksibel.
Seharusnya terlihat lebih terang dalam warna ketika benar-benar didinginkan (30-45
menit). Hati-hati lepaskan sisir dan selotip. Tempatkan gel di ruang elektroforesis.
Tambahkan buffer elektroforesis yang cukup untuk menutupi gel hingga kedalaman
minimal 1 mm. Pastikan setiap sumur diisi dengan buffer.
• Preparasi Sampel : Campurkan sampel DNA dengan buffer pemuatan 6X sampel (w /
pewarna pelacak). Hal ini memungkinkan sampel untuk terlihat ketika memuat ke gel,
dan meningkatkan kepadatan sampel, menyebabkan mereka tenggelam ke dalam
sumur gel.

6X Memuat Buffer:

Bromophenol Blue (untuk warna)

Gliserol (untuk berat)

• Memuat Gel: Dengan hati-hati letakkan ujung pipet di atas sumur dan dengan
perlahan buang sampel. Sampel harus tenggelam ke dalam sumur. Berhati-hatilah
agar tidak melubangi gel dengan ujung pipet.
• Menjalankan Gel: Tempatkan penutup pada ruang elektroforesis, menyambung kabel
listrik. Hubungkan kabel listrik ke catu daya. Pastikan petunjuknya terpasang dengan
benar - DNA berpindah ke anoda (merah). Ketika listrik dihidupkan, gelembung harus
terbentuk pada elektroda di ruang elektroforesis. Setelah arus diterapkan, pastikan Gel
berjalan ke arah yang benar. Bromophenol blue akan berjalan searah dengan DNA.
 • Standar Tangga DNA: Penyertaan tangga DNA (DNA ukuran tahu) pada gel
membuatnya mudah untuk menentukan ukuran DNA yang tidak diketahui. Catatan:
bromophenol blue bermigrasi pada tingkat yang kira-kira sama dengan molekul DNA
300 bp. Sebagai alternatif untuk membeli tangga DNA yang mahal, seseorang dapat
dibuat menggunakan cacing makan (Tenebrio molitor) DNA dan enzim restriksi.
Sebagai alternatif untuk membeli tangga DNA yang mahal, seseorang dapat dibuat
menggunakan cacing makan (Tenebrio molitor) DNA dan enzim restriksi.
• Pewarnaan Gel: • Ethidium bromide mengikat DNA dan berfluoresensi di bawah sinar
UV, memungkinkan visualisasi DNA pada Gel.

• Ethidium bromide dapat ditambahkan ke gel dan / atau menjalankan buffer sebelum gel
dijalankan atau gel dapat diwarnai setelah dijalankan.

***PERINGATAN! Ethidium bromide adalah mutagen kuat dan cukup beracun. Sarung
tangan harus dipakai setiap saat.

Alternatif yang lebih aman untuk Ethidium Bromide

 Metilena Biru
 BioRAD - Stain DNA Bio-Safe
 Ward's - QUIKView DNA Stain
 Carolina BLU Stain

Keuntungan

 Murah
 Kurang beracun
 Tidak diperlukan sinar UV
 Tidak ada pembuangan limbah berbahaya

kerugian

 Kurang sensitif
 Lebih banyak DNA dibutuhkan pada gel
 Waktu pewarnaan / waktu yang lebih lama

Pewarnaan Gel: • Tempatkan gel di nampan pewarnaan yang mengandung noda encer hangat.

• Diamkan gel selama 25-30 menit.

• Untuk menghilangkan noda berlebih, biarkan gel tersebut jatuh ke dalam air.
• Ganti air beberapa kali untuk mencapai tujuan yang efisien.

Ethidium Bromide membutuhkan sumber cahaya ultraviolet untuk memvisualisasikan.

Sampel protein, sering baru diisolasi dan tidak diurai, direbus dalam deterjen natrium dodesil
sulfat dan beta-mercaptoethanol Mercaptoethanol mengurangi ikatan disulfida. Detergen
mengganggu struktur sekunder dan tersier
Pada tingkat molekuler, protein direntangkan dan dilapisi dengan deterjen (yang memiliki
muatan negatif) oleh perlakuan ini

Mereka kemudian akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif pada tingkat sebanding
dengan ukuran liniernya. Bobot molekul dengan memperhatikan penanda ukuran dapat
ditentukan

Blot lain II Western

Western blots mengukur jumlah protein spesifik dalam sel. Ini adalah noda gel SDS-
polyacrylamide di mana protein seluler diterapkan. Protein didenaturasi sehingga akan
memasuki gel sebagai kumparan acak terentang. Protein terpisah berdasarkan ukuran. Mereka
dihapuskan ke membran.Western blots diperiksa menggunakan antibodi. Antibodi diberi
label. Mereka yang tetap terikat pada target spesifik mereka mengidentifikasi protein tertentu
di dalam sel. Intensitas sinyal mencerminkan tingkat ekspresi. Itu juga dapat mengungkapkan
mutasi oleh anomali migrasi. Penghapusan dapat menyebabkan protein yang lebih pendek
misalnya