Anda di halaman 1dari 50

11.

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tempe Bongkrek

Tempe bongkrek merupakan makanan khas masyarakat daerah


Banyumas, biasanya dipergunakan sebagai lauk penghantar nasi
atau dibuat makanan jajan (Hardjohutonio, 1970; Ekosapto,
1975; Winarno, 1986). Tempe ini sangat disukai oleh masya-
rakat daerah tersebut.
Selain tempe bongkrek, di daerah Banyumas juga ada
jenis makanan lain yang mirip dengan tempe bongkrek, yaitu
yang disebut semayi (Kuswanto, 1988). Bahan dasar semayi
adalah kelapa parut, ampas kelapa atau campurannya. Pada
pembuatan semayi proses fermentasi terjadi secara alami,
artinya tidak ditambahkan mikrobe tertentu secara sengaja,
sedangkan pada pembuatan tempe bongkrek ditambahkan laru
tempe yang berisi kapang R. oligosporus (Nugteren dan
Berends, 1957; Budijono, 1976/1977; KO dan Kelholt, 1981;
KO, 1985) atau Mucor sp. (Hardjohutomo, 1958; Balai Peneli-
tian Kimia Semarang, 1979/1980).
Garis besar pembuatan tempe bongkrek adalah sebagai
berikut : ampas kelapa atau bungkil kelapa direndam selama
semalam, kemudian dicuci dan diperas. Kemudian ampas kelapa
tersebut dikukus selama 30 sampai 60 menit. Setelah dingin
ampas kelapa dicampur dengan laru dan dibungkus dengan daun
pisang, kantung plastik atau dihamparkan di atas nyiru
dengan ketebalan sekitar 3 cm, kemudian ditutup dengan daun
pisang dan karung goni. Setelah itu ampas kelapa dibiarkan
selama dua hari pada suhu kamar, sehingga kapang tempenya
tumbuh. Tempe bongkrek yang baik, mempunyai tekstur yang
padat dan kompak, berwarna putih seperti kapas karena ditu-
tupi secara sempurna oleh miselia kapang tempe (KO et al.,
1979; KO, 1985; Ridwan, 1986). Setiap 100 g tempe bongkrek,
kandungan zat gizinya sebagai berikut : nilai kalori

119 Kal, protein 4.4 g, lemak 3.5 g, karbohidrat 18.3 g,kal-


sium 27.0 mg, fosfor 100.0 mg, zat besi 2.6 mg, vitamin B1
0.08 mg, dan air 72.5 g (Ekosapto, 1975).
Bahan dasar yang dipergunakan untuk membuat tempe bong-
krek dapat berupa bungkil kelapa pabrik, bungkil kelapa
botokan yang diperoleh dari hasil samping pembuatan minyak
kelapa dengan menggunakan yuyu (Cancer), ampas kelapa yang
merupakan bahan sisa pembuatan minyak kelapa secara tradi-
sional (klentik) atau sisa dari industri dodol. Umumnya
tempe bongkrek yang dibuat dari bungkil kelapa pabrik jarang
ditumbuhi oleh bakteri P. cocovenenans karena kadar lemaknya
rendah. Akan tetapi bungkil kelapa botokan dan ampas kela-
pa, karena masih mengandung minyak yang cukup tinggi maka
sering ditumbuhi oleh bakteri P. cocovenenans (van Veen dan
Mertens, 1933; Soedigdo, 1977; KO, 1985).
Memurut van Veen dan Mertens (1933); Soedigdo (1977);
dan KO (1985) bakteri P. cocovenenans dapat membentuk toksin
pada ampas kelapa yang disimpan. Mengingat kemungkinan
tersebut di atas maka keracunan tempe bongkrek dapat juga
disebabkan karena bahan dasar yang telah tercemar oleh tok-
sin yang dihasilkan bakteri P. cocovenenans selama bahan
dasar tersebut disimpan. Menurut Lie et al. (1985) untuk
mencegah tumbuhnya bakteri selama penyimpanan, sebaiknya
ampas kelapa dikeringkan.

1 B. Keracunan Tempe Bongkrek dan Usaha Pencegahannya

Sudah banyak terjadi korban keracunan akibat mengkon-


sumsi tempe bongkrek. Data tentang korban keracunan tempe
bongkrek dapat dilihat pada Tabel 1.
.
Tabel 1. Data korban keracunan tempe bongkrek di beberapa
daerah di Jawa Tengah (1951-1988)

Penderita keracunan bongkrek

Tahun M a t i H i d u p Jumlah

Sumber : Roedhijanto (1988)

Musim terjadinya keracunan tempe bongkrek pada umumnya


tidak tertentu. Ada indikasi bahwa keracunan tempe bongkrek
terjadi bila musim paceklik dan harga bahan dasar bungkil
kelapa meningkat, sehingga produsen tempe bongkrek sengaja
mengganti atau mencampuri bungkil kelapa dengan ampas kela-

Pa
Berat ringannya keracunan tempe bongkrek ditentukan
oleh beberapa faktor, diantaranya jumlah tempe bongkrek yang
dikonsumsi, ketahanan tubuh si penderita, dan kecepatan
untuk mendapatkan perawatan dokter. Menurut ~urmandali
(1979) cukup dengan mengkonsumsi sebanyak 5 g sampai 25 g
tempe bongkrek yang beracun kematian sudah dapat terjadi.
Ciri-ciri atau gejala-gejala keracunan tempe bongkrek dapat
dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Ciri-ciri keracunan tempe bongkrek

Tingkat Keracunan Ciri-ciri Keracunan

Ringan Pusing, mual, muntah


Sedang Pusing, mual, muntah, sakit perut
Berat Diare, kejang, keluar buih dari mulut
Meninggal Koma, ada bercak-bercak darah beku
di bawah kulit

Sumber : Suhardjo et al. (1988/1989)

Kasus keracunan tempe bongkrek, sebenarnya tidak hanya


terjadi di daerah Banyumas saja, tetapi terjadi juga di dae-
rah lainnya. Akan tetapi karena korban keracunan paling
banyak terjadi di daerah Banyumas dan dapat dikatakan hampir
terjadi setiap tahun, maka yang paling terkenal adalah kasus
keracunan tempe bongkrek di daerah Banyumas.
Pada tahun 1928 di daerah Kediri terjadi kasus keracun-
an tempe bongkrek. Pada saat itu masyarakat daerah Kediri
menggunakan minyak kelapa sebagai bahan bakar untuk pene-
rangan. Ampas kelapa yang dihasilkan dari hasil samping
pembuatan minyak kelapa digunakan sebagai bahan dasar untuk
membuat tempe bongkrek. Kasus keracunan tempe bongkrek di
daerah Kediri tidak timbul lagi setelah daerah Kediri meng-
gunakan minyak tanah sebagai bahan bakar untuk penerangan.
Pada tahun 1956 di Kabupaten Kulonprogo dan di Malang juga
terjadi kasus keracunan tempe bongkrek. Demikian juga di
daerah Brebes dan Lampung juga pernah terjadi kasus keracun-
an tempe bongkrek.
Dahulu diduga penyebab terjadinya keracunan tempe bong-
krek di daerah Banyumas adalah alat tembaga yang digunakan
untuk merendam dan memasak ampas kelapa atau bungkil kelapa.
Namun setelah alat tersebut diganti dengan alat yang tidak
terbuat dari tembaga, kasus keracunan tempe bongkrek masih
saja terjadi. Selain itu diduga juga penyebab keracunan
tempe bongkrek karena penggunaan yuyu (Cancer) untuk membuat
minyak kelapa (Soeryopranoto, 1975; Balai Penelitian Kimia
Semarang, 1976/1977 dan 1979/1980; Budijono, 1976/1977;
Winarno, 1986) .
Sudah banyak usaha dilakukan untuk menemukan dan mence-
gah penyebab keracunan tempe bongkrek. Penelitian telah
diawali oleh Vorderman pada tahun 1902 (Hardjohutomo, 1970;
Soewad j i et al., 1975; Balai Penelitian Kimia Semarang,
1976/1977), kemudian dilanjutkan pada tahun 1928 oleh
Jansen (Suklan, 1984). Namun baru pada tahun 1932 van Veen
dan Mertens berhasil mengungkap penyebab terjadinya keracun-
an pada tempe bongkrek dan menemukan bahwa penyebab keracun-
an adalah suatu bakteri kontaminan yang disebut Pseudomonas
cocovenenans (Nugteren dan Berends, 1957; Hardjohutomo, 1958
dan 1970). Ternyata jika bakteri ini tumbuh, maka kapang
Rhizopus sp. yang diharapkan menjadi tidak dapat tumbuh
sehingga fermentasi tempe bongkrek mengalami kegagalan.
Bakteri P. cocovenenans bila ditumbuhkan pada medium
ampas kelapa akan memproduksi toksin yang dikenal dengan na-
ma asam bongkrek dan toksoflavin. Asam bongkrek merupakan
toksin yang tidak berwarna yang mempunyai daya toksisitas
yang lebih potensial daripada toksoflavin, sedangkan tokso-
flavin merupakan toksin yang berwarna kuning yang dapat
dilihat jelas jika ampas kelapa tercemar oleh toksin terse-
but.
Van Veen (Hardjohutomo,l958) juga telah melakukan usaha
untuk mencegah terbentuknya toksin pada tempe bongkrek sela-
ma fermentasi dengan menggunakan kapang Monillia sitophila
sebagai pengganti kapang Rhizopus sp.. Kapang ini sanggup
memanfaatkan sisa minyak kelapa yang masih terdapat pada
ampas kelapa dalam waktu sehari semalam sehingga apabila
tempe bongkrek terkontaminasi bakteri P. cocovenenans maka
bakteri tersebut tidak mampu untuk memproduksi toksin.
Meskipun kapang ini berhasil mencegah pembentukan toksin da-
lam tempe bongkrek namun ada masalah karena yang dihasilkan
bukan tempe.bongkrek melainkan oncom. Dilain pihak masyara-
kat daerah Banyumas sangat menyukai tempe bongkrek dan bukan
oncom, sehingga usaha penerapannya mengalami kegagalan.
Pada tahun 1956 Hardjohutomo juga melakukan penelitian
untuk mencegah terbentuknya toksin pada tempe bongkrek.
Pada awal penelitiannya digunakan antibiotik aureomisin dan
teramisin yang ternyata dapat mencegah pertumbuhan bakteri
P. cocovenenans. Namun dalam penerapannya senyawa antibio-
tik ini susah dicari dan harganyapun mahal, sehingga hasil
penelitian ini tidak dapat diterapkan oleh masyarakat Banyu-
mas (Hardjohutomo, 1958) .
Hardjohutomo kemudian beralih menggunakan daun-daun
tanaman yang mengandung senyawa yang bersifat antibiotik.
Ternyata dari beberapa jenis daun yang digunakan untuk pene-
litian, ada satu jenis daun yang dapat menghambat pertumbuh-
an bakteri P. cocovenenans. Daun tanaman tersebut berasal
dari tanaman calincing (Oxalis sepium). Daun tanaman terse-
but rasanya asam dan sering digunakan untuk membuat sayur
asam. Rasp asam daun calincing disebabkan adanya senyawa
asam, seperti asam oksalat 0.06 persen, asam sitrat 0.05
persen dan asam-asam tartarat, malat dalam jumlah sedikit
(Hardjohutomo, 1958) .
Penggunaan daun calincing dapat menghambat bakteri
P. cocovenenans atau merupakan antidotum dari toksin yang
diproduksinya. Menurut penelitian Hardjohutomo (1958) daun
calincing merupakan penghambat bagi pertumbuhan bakteri, se-
dangkan .menurut Subardjo (1983) daun calincing bukan merupa-
kan suatu antibiotik, tetapi merupakan antidotum terhadap
asam bongkrek. Namun Ekosapto (1975) menyatakan bahwa daun
calincing bersifat bakteriostatik dan merupakan antidotum.
Dosis yang efektif untuk mencegah pertumbuhan bakteri
P. cocovenenans adalah 6 sampai 10 g daun calincing per
250 g ampas kelapa. Penggunaan daun calincing segar menim-
I

bulkan masalah karena timbulnya warna hijau pada tempe bong-


krek yang dihasilkan. Timbulnya warna hijau ini dapat.di-
atasi dengan menggunakan ekstrak daun calincing kering.
Penggunaan daun calincing pada mulanya berjalan baik, namun
karena susah penyediaannya maka akhirnya upaya ini terhenti.
KO et al. (1979) juga telah melakukan penelitian untuk
mencegah terbentuknya toksin pada tempe bongkrek. Ternyata
penambahan garam NaCl sebanyak 1.5 - 2.0 persen pada ampas

kelapa dapat mencegah tumbuhnya bakteri P. cocovenenans


tanpa mempengaruhi rasa tempanya. KO dan Kelholt (1981)
menyatakan bahwa apabila bakteri P. cocovenenans yang tumbuh
pada starter jumlahnya kurang dari 10 kali jumlah spora ka-
pang R. o l i g o s p o r u s maka toksin bongkrek tidak dapat dipro-
duksi pada medium ampas kelapa. Hasil penelitian KO et al.
(1979); KO dan Kelholt (1981) ternyata tidak mudah diterap-
kan di masyarakat.
Pemerintah dari dulu juga sudah melakukan upaya untuk
menanggulangi masalah keracunan tempe bongkrek. Upaya yang
dilakukan umumnya bersifat preventif, seperti dikeluarkannya
larangan untuk memproduksi dan menjual tempe bongkrek,
pembinaan teknologi dan sanitasi pembuatan tempe bongkrek,
penyuluhan yang berkaitan dengan tempe bongkrek yang beracun
dan lain-lainnya.
Larangan untuk memproduksi tempe bongkrek dapat menu-
runkan jumlah produsen, namun hanya bersifat sementara. Hal
ini terjadi karena biasanya larangan yang diberlakukan tidak
diikuti dengan cara pemecahan masalah yang tuntas. Penda-
patan yang diperoleh dari pekerjaan lain umumnya lebih kecil
dari pendapatan yang diperoleh dari usaha tempe bongkrek.
Berdasarkan hal-ha1 tersebut maka'meskipun produsen tahu
bahwa tempe bongkrek dapat menimbulkan bahaya keracunan dan
ada larangan dari pemerintah untuk memproduksinya, mereka
tetap saja membuatnya.
Pada umumnya para konsumen tempe bongkrek meskipun me-
reka tahu bahwa memakan tempe bongkrek mempunyai resiko ke-
racunan, namun masih tetap mengkonsumsinya. Hal ini terjadi
karena beberapa alasan, seperti tingkat sosial ekonominya
yang rendah, harganya murah, rasanya enak dan rasa kecan-
duannya .
Akhir-akhir ini usaha yang dilakukan oleh pemerintah
untuk menanggulangi masalah keracunan tempe bongkrek adalah
mengalihkan usaha t e m p bangkrek ke usaha tempe jamur merang
atau menjadi.petani jamur merang. Pembuatan tempe jamur
merang diharapkan tidak mengalami kesulitan, kareng mereka
sudah mempunyai pengalaman menbuat tempe bongkrek.

C. Bakteri P. cocovenezmns

1. B i f a t Bakteri

Pada mulanya bakteri yang dicurigai tumbuh pada tempe


bongkrek adalah Bacillus, kemudian diberi nama Bacillus
cocovenenans. Setelah diteliti kembali di Mikrobiologisch
Institut pada Technische Hogenschool, Delft, Nederland, di-
ajukan nama genus Pseudomonas, sehingga namanya menjadi
P. cocovenenans (Nugteren dan Berends, 1957 ; Hard johutomo,
1958 dan 1970).
Nama P. cocovenenans, berasal dari kata venenum yang
berarti toksin di dalaa bahasa Latin dan coco dari kata
coconut yang berarti kelapa. Jadi nama P. cocovenenans ber-
arti toksin dari kelapa yang diproduksi oleh bakteri genus
~seudonoias (Baluel, 1978 ; Anggraeni , 1990) .
Menurut Bergeyls Manual of Determinative Bacteriology
bakteri P. cocovenenans ternasuk famili Bacteriaceae karena
bakteri ini bersifat heterotrof dan tidak membentuk spora
(Robert et al., 1957). Pada tahun 1936 Kluyver dan van Niel
menggolongkan bakteri P. cocovenenans ke dalam famili
Pseudomonadaceae karena mempunyai flagela polar dan mampu
mengubah sakarida menjadi asam (van Damme et al., 1960).
Genus Pseudomonas dapat mengubah glukosa dan jenis gula
lainnya baik'secara oksidatif maupun secara fermentatif.
Bakteri ini juga mempunyai sifat-sifat lainnya sebagai ber-
ikut : saprofitik, tidak membentuk spora, aerob atau anaerob
fakultatif dan bentuknya berubah-ubah tergantung medium
pertumbuhannya (van Veen dan Mertens, 1933; Arbianto, 1963,
1975; Hardjohutomo, 1970; Winarno, 1986; Lie et al., 1988;
~ n g g r a e n i , 1990), berukuran pan jang 0.75 sampai 2.98 j~

dengan lebar 0.30 sampai 0.5 j~ (Arbianto, 1971).


Beberapa jenis bakteri bersifat motil, yaitu dapat
bergerak karena mempunyai suatu organ yang disebut flagela
yang terdapat pada permukaan self termasuk bakteri genus
Pseudomonas (Fardiaz, 1989) . Bakter i P. cocovenenans dapat
bergerak karena mempunyai flagela polar (Hardjohutomo,
1970). Flagela P. cocovenenans bersifat lopotrikat dan
berjumlah 3 sampai 4 buah (van Veen dan Mertens, 1933).
Selain flagela bakteri ini juga mempunyai 4 silia pada salah
satu ujungnya (Arbianto, 1975) .
Bakteri ~.cocovenenansterdapat di alam sebagai orga-
nisme bebas (van Veen dan Mertens, 1933). Bakteri ini di-
anggap sebagai suatu rnikrobe kontaminan tempe bongkrek atau
lainnya yang dapat terjadi secara insidental (Arbianto,
1979). Trihadiningrum dan Arbianto (1983) berhasil mengi-
solasi P. c o c o v e n e n a n s yang menghasilkan toksoflavin dan
asam bongkrek dari tiga sampel air, yang berasal dari salur-
an irigasi sekunder, kolam penduduk dan sungai yang semuanya
berada di desa Arjawinangun, Kecamatan Purwokerto, daerah
Banyumas .
Identifikasi bakteri P. cocovenenans secara morfologis
dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan pewarnaan Gram
dan pengujian dalam medium Kelman yang mengandung zat warna
2,3,5-trifenil tetrazolium khlorida. Identifikasi dengan
pewarnaan Gram sesungguhnya tidak bersifat spesifik terhadap
P. c o c o v e n e n a n s . Oleh karena itu uji pertumbuhan dalam
medium Kelman dilakukan untuk identifikasi P. cocovenenans
karena keselektifannya terhadap bakteri tersebut. Medium
yang ditemukan oleh Kelman pada tahun 1954, terdiri dari
pepton 1 persen, glukosa 1 persen, bakto agar 1.7 persen dan
2,3,5-trifenil tetrazolium khlorida 50 ppm (Trihadiningrum
dan Arbianto, - 1983) .
Sifat-sifat koloni bakteri P. cocovenenans dalam medium
Kelman adalah berbentuk bundar, bertepi rata (tidak berge-
lombang) yang berwarna putih, mempunyai pusat dengan warna
merah muda dan mempunyai kesan lembab (Arbianto, 1980;
Trihadiningrum dan Arbianto, 1983). Trifenil tetrazolium
khlorida selain berfungsi sebagai pemberi warna pada koloni,
juga berfungsi sebagai penghambat pertumbuhan bakteri lain
terutama golongan bakteri Gram positif. Kadang-kadang ke
dalam medium Kelman ditambahkan juga penisilin untuk mene-
kan pertumbuhan bakteri kontaminan.
Menurut penelitian Trihadiningrum dan Arbianto (1983)
bakteri P. cocovenenans mempunyai sifat-sifat khas sebagai
berikut : mampu mensintesis semua basa asam nukleat yang
dibutuhkan dan membutuhkan senyawa organik sebagai sumber
enersi. Pada umumnya asam amino mempercepat pertumbuhan
karena dapat memperpendek periode lag (fase adaptasi) dengan
efektivitas yang berbeda. Glukosa merupakan sumber karbon
yang baik untuk pertumbuhan bakteri.
Seperti halnya mikrobe yang lain, pertumbuhan bakteri
P. cocovenenans dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Sifat
yang tirnbul karena pengaruh lingkungan ini disebut fenotip
(Anggraeni, 1990). Fenotip atau penampakan luar dari bak-
teri terjadi karena adanya interaksi antara genotip dan
lingkungannya. Biasanya perubahan fenotip dapat disebabkan
oleh karena adanya perubahan kondisi lingkungan yang bersi-
fat tidak menetap. Fenotip akan kembali normal seperti
semula apabila kondisi lingkungan dikembalikan pada keadaan
normalnya yang optimum.
Koloni bakteri P. c o c o v e n e n a n s berwarna kuning pada
medium yang mengandung gliserol, namun tidak selalu demiki-
an. Pada medium yang mengandung glukosa dan pada medium
yang mengandung asam-asam lemak dari minyak kelapa pemben-
tukan warnanya jauh berkurang (van Veen, 1967).
2. Produksi Toksin oleh P. cocovenenans

Dalam pertumbuhan dan perkembangbiakannya, mikrobe mem-


butuhkan zat-zat gizi untuk mensintesis komponen sel, meng-
hasilkan metabolit sekunder dan enersi. Metabolit sekunder
adalah suatu hasil metabolisme yang bukan merupakan kebutuh-
an pokok sel mikrobe untuk hidup dan tumbuh, seperti misal-
nya toksin, antibiotik, pigmen, vitamin dan lain sebagainya.
Bakteri P. cocovenenans memproduksi toksin pada medium ampas
kelapa dan toksin yang dihasilkan ini merupakan suatu meta-
bolit sekunder.
Semenjak pertengahan tahun 1890 telah ditemukan bebe-
rapa jenis toksin yang dihasilkan oleh bakteri. ~ebagian
besar bakteri penghasil toksin merupakan bakteri kontaminan
pada beberapq bahan pangan, seperti halnya bakteri bongkrek
P. cocovenenans yang merupakan bakteri kontaminan pada tempe
bongkrek. Hampir semua toksin yang dihasilkan oleh bakteri
.. < .
L

merupakan protein atau polipeptida, namun ada juga yang


bukan merupakan protein, seperti asam bongkrek dan toksofla-
vin yang diproduksi oleh bakteri P. cocovenenans. Asam
bongkrek merupakan asam trikarboksilat dan toksoflavin me-
rupakan senyawa basa.
Alouf dan Reynoud (1970) yang dikutip oleh Kuswanto
dan Sudarmadji (1988) menggolongkan toksin bakteri atas tiga
kelompok, yaitu : (1) toksin intraseluler, toksin yang
dibentuk di dalam sitoplasma yang dapat ke luar dari sel
apabila sel inengalami otolisis atau apabila dilakukan eks-
traksi; (2) toksin ekstraseluler, toksin yang diproduksi di
luar sel; dan (3) toksin yang terdapat diantara sel. Menu-
rut Lie et al. (1988) toksin yang diproduksi oleh bakteri
P. cocovenenans merupakan suatu eksotoksin, sedangkan menu-
rut Arbianto (1971) asam bongkrek di produksi di dalam sel
dan dibebaskan ke dalam medium ketika beberapa sel mulai
mengalami lisis pada fase stasioner.
Produksi toksin dan metabolit sekunder lainnya sangat
dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya jenis mikro-
be, pH, suhu, ketersediaan zat gizi, dan terdapatnya mikrobe
lain yang tumbuh dalam medium. Pada umumnya bahan dasar yang
digunakan untuk fermentasi sudah mengandung zat gizi sebagai
sumber enersi, sumber nitrogen, air, vitamin, mineral, dan
faktor-faktor lain yang dapat digunakan untuk pertumbuhan
mikrobe (Kuswanto dan Sudarmadji, 1988).
Bakteri P. cocovenenans hanya memproduksi toksin apa-
bila tumbuh pada medium yang mengandung ampas kelapa. Pada
medium lainnya meskipun juga mengandung minyak, seperti
kedelai, bungkil kedelai, bungkil kacang tanah, ampas tahu,
bi ji kapok, biji munggur, biji lamtoro, dan biji koro be-
nguk asal tidak tercampur dengan ampas kelapa, bakteri
P. cocovenenans tidak akan memproduksi toksin (van Veen
dan Mertens, 1933; Soepadi, 1953; Hardjohutomo, 1958, 1970;
Ekosapto, 1975; Balai Penelitian Kimia Semarang, 1979/1980).
Pertumbuhan bakteri P. cocovenenans tidak terpengaruh
oleh perbedaan kandungan lemak pada kisaran 2 sampai 25 per-
sen, sedangkan penurunan produksi toksoflavin nyata terjadi
hanya jika kandungan lemak ampas kelapa kurang dari 5 per-
sen. Randungan lemak sebesar 7 sampai 14 persen dalam medi-
um ampas kelapa (Coconut Culture Medium) merupakan kondisi
yang paling sesuai untuk produksi toksin (KO, 1985).
Selain.dipengaruhi oleh kadar lemak ampas kelapa, bak-
teri P. cocovenenans dalam pertumbuhan dan produksi toksin-
nya dipengaruhi pula oleh kadar air ampas kelapanya. Pada
kisaran kadar air ampas kelapa antara 35 sampai 75 persen
pertumbuhan dan produksi toksin tidak dipengaruhi oleh per-
bedaan kadar air (KO, 1985) . Namun pada kadar air rendah
seperti pada ampas kelapa yang telah dikeringkan bakteri
P. cocovenenans tidak dapat tumbuh (Lie et al., 1985).
Pada medium ampas kelapa, bakteri P. cocovenenans akan
menggunakan asam-asam lemak terutama asam oleat dan gliserol
sebagai sumber karbon dan sumber enersi (van Veen dan
Mertens, 19.33, dan 1934; Nugteren dan Berends, 1957;
Hardjohutomo, 1958; van Damme et al., 1960; van Veen, 1967).
Asam-asam lemak, terutama asam oleat akan digunakan sebagai
substrat untuk pembentukan asam bongkrek sedangkan gliserol
digunakan sebagai substrat untuk pembentukan toksoflavin.
Adanya asam-asam amino tambahan pada medium pertumbuhan
akan menstimulasi produksi asam bongkrek. Vitamin dan basa-
basa purin dan pirimidin tidak diperlukan untuk produksi
asam bongkrek (Arbianto, 1979). Menurut Levenberg dan Linton
(1966) basa-basa purin tertentu yang ditambahkan ke dalam
medium pertumbuhan bakteri P. cocovenenans akan menyebabkan
toksoflavin yang dihasilkan bertambah banyak. Basa-basa pu-
rin tersebut antara lain adalah xantina, xantosina, guanina,
isoguaniana, hipoksantina dan adenina.
Penelitian lebih lanjut oleh Levenberg dan Linton
(1966) menunjukkan bahwa konversi basa-basa purin menjadi
toksoflavin distimulasi oleh adanya glisin di dalam medium
pertumbuhan bakteri P. cocovenenans, Nurmandali (1979)
telah mencoba melakukan biosintesis toksoflavin dengan
menggunakan prekursor xantina, glisina dan metionina dengan
bantuan enzim dari bakteri P. cocovenenans, tetapi hasil-
nya masih belum seperti yang diharapkan. Gliserol dan asam-
asam organik cocok untuk pertumbuhan dan produksi asam
bongkrek (Arbianto, 1979) .
Toksoflavin relatif lebih mudah diproduksi di dalam
medium cair daripada di dalam medium padat (van Veen, 1967).
Pada medium cair yang mengandung gliserol, pepton dan garam
serta dibiarkan berhubungan dengan udara pada suhu 30°C,
bakteri P. cocovenenans mudah memproduksi toksoflavin.
Selama fermentasi tempe bongkrek, P, cocovenenans tum-
buh bersama dengan kapang tempe dan bersaing untuk mendapat-
kan substrat. Menurut penelitian KO et al. (1979) jumlah
spora R. oligosporus untuk inokulasi sebanyak lo4- lo7 untuk
setiap gram bahan akan dapat menghambat produksi toksin,
karena pertumbuhan kapang lebih cepat daripada bakteri,
sedangkan apabila spora R . o l i g o s p o r u s yang ditambahkan tidak
lebih dari 1 500 per gram bahan, diduga produksi asam bong-
krek akan meningkat.
Menurut KO dan Kelholt (1981) interaksi pertumbuhan an-
tara kapang dan bakteri kontaminan pada tempe bongkrek dapat
menghambat pembentukan atau terjadinya penurunan jumlah tok-
sin. Kapang R. o l i g o s p o r u s kemungkinan dapat menghasilkan
ekstrak metabolit yang dapat menghambat pembentukan toksin
oleh P. c o c o v e n e n a n s atau bila toksin sudah terbentuk maka
terjadi dekomposisi, perubahan atau digunakan untuk metabo-
lisme kapang, sehingga jumlahnya berkurang. Mekanisme peng-
hambatan dan degradasi senyawa toksin tersebut masih belum
jelas.
Keasaman medium pertumbuhan bakteri P. c o c o v e n e n a n s
mempengaruhi produksi toksin. Menurut penelitian Arbidnto
.(1975) bakteri P. cocovenenans tidak membentuk toksin apabi-
la pH ampas kelapa 4.2 dan produksi toksin'optimum pada pH
8.0, sedangkan menurut penelitian KO (1985) pH awal medium
6.5 sampai 7.0 merupakan kondisi yang optimum untuk produksi
toksoflavin. Apabila pH awal rendah maka produksi toksofla-
vin juga rendah. Pada pH lebih besar dari 7.0 produksi tok-
soflavin akan menurun dengan kenaikan pH.
Suhu inkubasi juga mempengaruhi produksi toksin dari
bakteri P. c o c o v e n e n a n s . Produksi asam bongkrek optimum
bila suhu inkubasi 30°c, sedangkan produksi toksoflavin
23
optimum bila suhu inkubasi antara 30°c - 37O~. Secara nyata
suhu yang tinggi menghambat produksi asam bongkrek, tetapi
tidak menghambat perbanyakan sel. Pada suhu 4 3 O ~ ,meskipun
sel bertambah jumlahnya namun asam bongkrek dan toksoflavin
tidak diproduksi (KO, 1985).
Produksi toksin dipengaruhi oleh kondisi aerasi pada
medium pertumbuhan bakteri P. cocovenenans. Menurut van
Damme et a1 . (1960) produksi toksof lavin terhambat bila
jumlah oksigen terbatas.

D. Toksin Bongkrek

Bakteri P. cocovenenans pada medium ampas kelapa akan


memproduksi dua macam toksin, yaitu toksoflavin dan asam
bongkrek. Kedua toksin ini disebut juga toksin bongkrek,
karena sering terdapat secara bersamaan pada tempe bongkrek
yang beracun .
1. Toksoflavin

Toksoflavin adalah toksin yang berwarna kuning, ber-


sifat sedikit basa dan sangat polar. Toksoflavin larut
dalam air, kloroform, etanol dan aseton serta hampir tidak
larut dalam eter, benzena dan petroleum eter (van Veen dan
Mertens, 1933; Hardjohutomo, 1958; van Veen, 1967; Arbianto,
1975).

Meskipun toksisitasnya lebih rendah daripada asam


bongkrek, tetapi toksoflavin bersifat toksik terhadap sel,
sehingga merupakan senyawa yang penting juga. Di samping
itu strukturnya lebih sederhana dan lebih stabil sifatnya
(Soedigdo, 1977). Toksoflavin pertama kali diisolasi oleh
van Veen pada tahun 1932 dari tempe bongkrek yang beracun
yang berasal dari daerah Banyumas.
Menuruk penelitian van Veen dan Baars (1938) rumus
empiris toksoflavin adalah C6H6N4O2 dan rumus bangunnya
seperti terlihat pada Gambar 1A. Menurut rumus van Veen dan
Baars struktur toksoflavin serupa dengan metilsantin, hanya
berbeda posisi ikatan rangkapnya, sehingga mudah dilakukan
isomerisasi tetapi kenyataannya tidak mudah diisomerisasi
. menjadi metilsantin. Sifat fisik dan kimiawi 1-metilsantin
sangat berbeda dengan toksoflavin, sehingga rumus toksofla-
vin menurut van Veen dan Baars ditolak. Toksoflavin dengan
o-fenilenediamin dalam larutan sedikit asam akan menghasil-
kan senyawa C11H8N402, yang berarti menjadi N-metilalloksa-
zin, dan berarti bahwa toksoflavin mengandung N-metilallok-
san.
Setelah dilakukan penelitian lebih lanjut van Damme
et al. (1960) menemukan bahwa rumus empiris toksoflav.in
adalah C7H7N502 dan mempunyai struktur seperti terlihat pada
Gambar 1B. Struktur ini didukung oleh penelitian yang dila-
kukan oleh Daves et al. (1962).
Latuasan dan Berends (1961) melaporkan bahwa toksofla-
vin identik dengan senyawa antibiotik xantotrisin yang
diproduksi oleh bakteri Streptococcus albus. Toksisitas
toksoflavin dan xantotrisin sama kuatnya. P. glumae dan
P. farinofermentus menghasilkan toksin yang serupa dengan
toksoflavin. De Boer et a1.(1960) serta Elbe et a1.(1960)
yang dikutip oleh Anggraeni (1990) mengisolasi suatu anti-
biotik ferfenulin dari Streptomyces ferfenulens yang ter-
nyata merupakan isomer dari toksoflavin.

Gambar 1. Struktur toksoflavin. (A) menurut van Veen dan


Baars, 1938; (B) menurut van Damme et al., 1960.

Toksoflavin diberi nama akhiran flavin karena sifat


fisiko-kimiawinya serupa dengan riboflavin, yaitu rnempunyai
warna kuning, menunjukkan fluoresensi hijau walaupun lemah,
stabil terhadap panas dan mempunyai spektrum absorpsi yang
serupa dengan riboflavin (van Veen, 1967), Toksof lavin yang
murni berbentuk seperti jarum. Toksoflavin dengan SO2
menjadi tidak berwarna, tetapi bila dikocok di udara menjadi
berwarna lagi.
Apabila toksoflavin direaksikan dengan HC1 6N pada suhu
kamar dan dibiarkan selama 24 jam maka akan diperoleh suatu
larutan tak berwarna dan tidak melakukan absorpsi pada
daerah ultra violet. Pemekatan larutan ini akan menghasil-
kan senyawa tidak berwarna yang mempunyai dua puncak absorp-
si pada daerah ultra violet, yaitu pada panjang gelombang
223 nm dan 328 nm. Senyawa ini diberi nama toksoflavin B.
Toksoflavin sendiri mempunyai absorpsi maksimum pada daerah
ultra violet dengan panjang gelombang 258 nm dan 395 nm (van
D a m e et al., 1960).
Toksoflavin biasanya diukur pada panjang gelombang
258 nm dengan nilai koefisien penyerapan sebesar 16 400.
Toksoflavin bila direaksikan dengan asam mineral dihasilkan
senyawa yang mempunyai rumus C6H8N4o3, senyawa ini dianggap
sebagai suatu hidrat dari toksoflavin (van Veen, 1967).
Slamet (1985) telah melakukan ekstraksi toksoflavin dan
ternyata toksoflavin yang dihasilkan mempunyai dua puncak
absorpsi, yaitu pada panjang gelombang 260 nm dan 216 nm.
Tantie (1985) juga telah melakukan ekstraksi toksoflavin
ternyata daerah absorpsi maksimumnya pada panjang gelombang
260 nm dan 208 nm, sedangkan Windarmaya (1987) menemukan
bahwa absorpsi maksimum dari toksoflavin yang diperoleh
adalah pada panjang gelombang 253.5 nm dan 205.5 nm.
KO (1985) telah melakukan ekstraksi toksoflavin dan
mendapatkan hasil maksimum sebesar 0.3 sampai 0.5 mg tokso-
flavin untuk setiap g ampas kelapa kering, yang dihasilkan
setelah 3 sampai 6 hari fermentasi. Nilai pH awal pertum-
buhan 6.5 sampai 7.0 dan suhu pertumbuhannya antara 30°c
sampai 3 7 O ~ .
~ e n u r u tvan Veen (1967) dan Lijmbach et al. (1970)
titik cair toksoflavin adalah 171°c, sedangkan menurut
Hardjohutomo (1958) titik cair toksoflavin adalah 1 5 0 ~ ~ .
Toksoflavin tahan terhadap pemanasan sampai suhu 1 5 0 dan
~ ~
baru mulai rusak bila suhu pemanasan lebih besar dari 1 5 0 ~ ~
(Winarno, 1986) .
Anggraeni (1990) telah melakukan pemurnian toksin bong-
krek selain asam bongkrek, yang dihasilkan oleh bakteri
P. cocovenenans. Berdasarkan penelitiannya diperoleh tiga
buah senyawa toksin. Karakteristik dari ketiga senyawa
toksin tersebut adalah sebagai berikut : senyawa pertama
mempunyai faktor retensi (Rf) pada kromatograf i lapis tipis
dengan eluen kloroform dan metanol ( 11 , v/v) sebesar 0.75,
berfluoresensi putih dan membentuk kristal putih, mempu-
nyai titik cair 216Oc dan mempunyai absorpsi maksimum pada
panjang gelombang 360 nm dan 268 nm. Senyawa toksin yang
kedua mempunyai nilai Rf sebesar 0.65, berfluoresensi biru
hitam dan membentuk kristal kuning berbentuk jarum dengan
28

t i t i k cair 2 0 5 ~
serta
~ mempunyai puncak absorpsi pada
panjang gelombang 258 nm dan 2 0 2 nm. Senyawa toksin yang
ketiga mempunyai nilai Rf sebesar 0 . 6 0 , berfluoresensi biru
hitam dan membentuk kristal krem dengan titik cair 181°c dan
mempunyai puncak absorpsi pada panjang gelombang 328 nm dan
202 nm.

2. Asam Bongkrek

Asam bongkrek merupakan toksin yang tidak berwarna yang


diproduksi oleh bakteri P I cocovenenans. Toksin ini merupa-
kan asam lemak tidak jenuh tinggi. Menurut van Veen dan
Mertens (1933) asam bongkrek mempunyai rumus e m p i r i s
C28H3807# dan menurut de Bruijn et al. (1973) asam bongkrek
mempunyai struktur kimia seperti terlihat pada Gambar 2 .

Gambar 2. Struktur Asam Bongkrek


(de Bruijn et al., 1973)
Asam bongkrek tidak larut dalam air tetapi larut dalam
petroleum eter dan alkohol. Toksin ini dapat dipisahkan da-
ri toksoflavin karena larut dalam pelarut lemak, tetapi ti-
dak larut dalam air, sedangkan toksoflavin larut dalam air
(van Veen, 1967).
Asam bongkrek sukar dibebaskan dari asam lemak yang
ada di dalam minyak kelapa. Di dalam ekstraksi asam
bongkrek akan terikut asam kaprat dan asam kaproat. Apabila
dicampur dengan larutan bikarbonat maka asam bongkrek akan
larut dengan mudah dalam fase cairnya (van Veen, 1967).
Asam bongkrek mudah larut dalam larutan lipofilik dan dapat
dipisahkan dari larutan dengan mengekstraknya memakai larut-
an alkali (Nugteren dan Berends, 1957).
Asam bongkrek yang murni sangat tidak stabil karena ce-

pat teroksidasi dan mempunyai kecenderungan terpolimerisasi


(Latuasan dan Berends, 1961). Asam bongkrek yang tidak
murni sangat stabil dalam medium lemak dan lebih stabil lagi
dalam larutan alkali. Asam bongkrek mudah sekali dioksidasi
dan inaktif pada suhu pemanasan yang lebih tinggi dard 1 0 0 ~ ~
(Hardjohutomo, 1958) .
Stabilitasnya yang tinggi di dalam suatu emulsi minyak
menyebabkan asam bongkrek masih bersifat toksik pada tempe
bongkrek yang digoreng (van Veen, 1967). Pemasakan dan
penggorengan tanpa minyak mempunyai sedikit atau tanpa nen-
punyai efek terhadap toksisitas asam bongkrek.
Asam bongkrek mempunyai sifat-sifat yang penting. Per-
tama, daya toksisitasnya tinggi terhadap semua hewan perco-
baan yang diuji, seperti tikus, burung dara, kera dan yang
lainnya. Kedua, mempunyai aktivitas antibiotik terhadap be-
berapa bakteri, khamir dan kapang. Ketiga, aktivitas optik-
nya cukup kuat, yaitu aE2 = -+ 165O dalam larutan natrium bi-
karbonat 2 persen dan ag2 = -
+ 105O dalam etanol 96 persen.
Keempat, mempunyai absorpsi yang kuat pada daerah sinar ul-
tra violet, maksimum pada panjang gelombang 239 nm dan 267nm
( ~ ~ ~ ~ ' 4000
1 dan ~ 2 ~ 000)
~ ~ dalam
4 5 etanol. Kelima, sangat
tidak stabil dalam medium asam tetapi cukup stabil dalam
larutan garam pada suhu kamar (Nugteren dan Berends, 1957).
KO (1985) telah melakukan isolasi asam bongkrek dari
medium ampas kelapa yang ditumbuhi bakteri P. cocovenenans.
Produksi toksin maksimum adalah 4 mg per g ampas kelapa
kering, dan hasil produksi berkisar antara 2 - 4 mg per g
ampas kelapa kering. Produksi maksimum dicapai setelah 3
sampai 6 hari fermentasi dan suhu inkubasi yang baik untuk
produksi asam bongkrek adalah suhu 30°c,

3. Isolasi ban Pemurnian

Metode isolasi dan pemurnian toksin bongkrek sudah ba-


nyak dilakukan dan dikembangkan oleh beberapa peneliti. Van
Veen dan Mertens (1933) dan van Damme et al. (1960) telah
melakukan isolasi toksoflavin dari ampas kelapa dengan meng-
qunakan kloroform.. Soedigdo (1975) dan Soedigdo (1977) juga
31
telah melakukan isolasi dengan menggunakan alkohol, kloro-
form dan air.
Toksoflavin yang murni dapat diperoleh dengan cara-cara
sebagai berikut : pertama-tama bahan diekstraksi menggunakan
kloroform, kemudian ekstrak kloroformnya diekstraksi dengan
air bebas ion. Air bebas ion yang mengandung toksoflavin
dipekatkan, kemudian ditambah ammonium sulfat sampai jenuh.
Setelah itu ekstraksi diulangi kembali dengan kloroform, dan
kloroform kemudian diuapkan. Toksoflavin yang tertinggal
dilarutkan dalam propanol pada suhu 5 5 O ~kemudian disimpan
di dalam lemari pembeku selama 48 jam sampai akhirnya kris-
tal berbentuk jarum yang berwarna kuning terbentuk (van
D a m e et al., 1960; van Veen 1967).
Toksoflavin dalam suatu larutan dapat dideteksi dengan
menggunakan spektrofotometer, kromatografi lapis tipis, kro-
matografi kertas maupun kromatografi cairan tekanan tinggi.
Eluen yang digunakan pada kromatografi lapis tipis maupun
kromatografi kertas biasanya campuran metanol : etil asetat
(1:1, v/v), sedangkan pada kromatografi cairan tekanan
tinggi dapat digunakan campuran metanol : air : asam asetat
(5:94:1, v/v) (van D a m e et al., 1960; Soedigdo, 1977; KO,
1985). Pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer dan
kromatografi cairan tekanan tinggi biasanya dilakukan pada
panjang gelombang 258 nm.
Metode isolasi asam bongkrek pertama kali dikembangkan
oleh van Veen (van Veen dan Mertens, 1933) yang berdasarkan
32
kenyataan asam bongkrek larut dalam larutan lipofilik dalam
suasana asam kemudian dapat diisolasi dengan ekstraksi
menggunakan larutan alkali encer, Sejak itu berbagai cara
isolasi dilakukan oleh peneliti lainnya (Nugteren dan
Berends, 1957; Lijmbach et al., 1970; Soedigdo, 1975).
Untuk mengetahui apakah asam bongkrek yang dihasilkan
murni atau belum dapat dilakukan pemisahan dengan mengguna-
kan kromatografi lapis tipis. Asam bongkrek akan mudah di-
bedakan dari asam-asam lemak yang terikut, karena asam bong-
krek mempunyai nilai Rf yang lebih rendah daripada asam le-
mak dan mempunyai fluoresensi hitam apabila disinari dengan
sinar ultra violet (Nugteren dan Berends, 1957).
Apabila digunakan kromatografi lapis tipis untuk men-
deteksi asam bongkrek, eluen yang digunakan adalah campuran
kloroforom:metanol:asam asetat (94:5:1, v/v)(Ko et a1.,1979)
atau campuran etil asetat 15 persen:metanol 1 persen dalam
heptana (1 : 1, v/v) (Soedigdo, 1977). Untuk kromatografi
kertas digunakan eluen campuran etanol : ammonia : air (20 :
1 : 4, v/v) (Soedigdo, 1977), sedangkan apabila digunakan
kromatografi cairan tekanan tinggi digunakan eluen campuran
metanol : air : asam asetat (80 : 19 : 1, v/v )(KO, 1985).

4. Mekanisme Keracunan

Telah banyak dilakukan penelitian untuk mengetahui


bagaimana mekanisme keracunan toksoflavin maupun asam bong-
krek terjadi. Selain toksik, menurut penelitian Arbianto
(1975) asam bongkrek dan toksoflavin merupakan kofaktor da-
lam metabolisme lemak pada bakteri P.cocovenenans. Penam-
bahan toksoflavin dan asam bongkrek pada medium pertumbuhan
bakteri tersebut akan mempengaruhi aktivitas pertumbuhan-
nya, yaitu meningkatkan pengambilan oksigen untuk respirasi
sel bakteri tersebut.
Toksin yang diproduksi oleh bakteri P. cocovenenans me-
rupakan antibiotik bagi mikrobe lain sehingga apabila bakte-
ri tersebut tumbuh pada tempe bongkrek mikrobe lainnya tidak
dapat tumbuh (van Veen, 1967). Toksoflavin pada umumnya
berpengaruh terhadap bakteri Gram positif. Toksoflavin
mempunyai sifat antibiotik yang lebih kuat dibandingkan
dengan ampisilin terhadap bakteri Gram negatif tetapi lebih
lemah daripada tetrasiklin (Slamet, 1985). Pada kondisi
aerob toksoflavin mempunyai aktivitas yang tinggi dan dalam
keadaan anaerob tidak.
Latuasan dan Berends (1961')telah meneliti toksisitas
toksoflavin terhadap beberapa mikrobe, seperti Escherichia
coli, Shigella, Micrococcus pyogenes, Proteus vulgaris,
Bacillus subtilis dan khamir. Hasil penelitiannya dapat di-
lihat pada Tabel 3. Toksoflavin juga menghambat pertumbuhan
kapang Aspergillus niger (Nurmandali, 1979; Nugroho, 1980;
Anggraeni, 1990; Suryanti, 1990).
Toksoflavin bersifat toksik terutama pada mikrobe dan
bagian sel yang tidak banyak mengandung enzim katalase.
Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh
van Damme et al. (1960) yang meneliti pengaruh toksoflavin
terhadap metabolisme khamir Saccharomyces cerevisiae, ter-
nyata pertumbuhan khamir tersebut tidak dihambat oleh tokso-
flavin. Menurut penelitian Latuasan dan Berends (1961) sam-
pai konsentrasi 100 pg/ml toksoflavin tidak mempengaruhi
pertumbuhan khamir S.cerevisiae. Hasil penelitian mengenai
kadar toksoflavin yang dapat menghambat pertumbuhan beberapa
mikrobe dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Kadar toksoflavin yang dapat menghambat


pertumbuhan beberapa mikrobe

Jenis mikrobe Kadar toksoflavin


(pg/ml)

E. coli
Shigella
P. vulgaris
B. subtilis
M. pyogenes

Sumber : Latuasan dan Berends (1961)

Ketahanan khamir terhadap toksoflavin meskipun dalam


keadaan aerob, disebabkan karena khamir mempunyai enzim
katalase. Enzim katalase akan mengkatalisis pemecahan
hidrogen peroksida (H202) yang terbentuk karena aktivitas
toksoflavin, menjadi oksigen &an air, dengan demikian
hidrogen peroksida tidak sernpat menyebabkan terjadinya
keracunan pada mikrobe tersebut.
35
Menurut penelitian Latuasan dan Berends (1961) tokso-
flavin berfungsi sebagai suatu pembawa elektron antara NADH
dan oksigen, yang memungkinkan kerja sitokrom dibuat pintas
(by pass) sehingga menghasilkan hidrogen peroksida yang ber-
sifat toksik. Reaksi pembentukan senyawa H20Z adalah seba-
gai berikut :

Jadi kematian karena keracunan toksoflavin disebabkan


karena terbentuknya H202 yang banyak, sedangkan tubuh tidak
cukup banyak menyediakan enzim katalase.
Toksoflavin mempunyai efek memusnahkan antimisin A dan
kalium sianida dalam sel khamir (Latuasan dan Berends,
1961). Toksoflavin menstimulasi pengambilan oksigen dari
sel-sel darah merah dan mengubah oksihemoglobin menjadi
methemoglobin (Baluel, 1978).
Menurut Zainuddin (1981) yang dikutip oleh Suklan
(1984) toksoflavin tidak stabil pada pH rendah seperti dalam

lambung, sehingga menjadi toksoflavin B yang tidak beracun.


Walaupun begitu apabila pH lambung meningkat kemungkinan
toksoflavin akan terserap ke dalam peredaran darah.
Toksoflavin dalam bentuk alami lebih toksik daripada
dalam bentuk kristalnya. Pada keadaan awal toksoflavin
membentuk kompleks yang tidak erat dengan suatu protein.
Pemasakan dan pembakaran makanan yang beracun akan mendena-
turasi senyawa kompleks tersebut dan menyebabkan toksoflavin
bersifat kurang toksik (van Veen dan Mertens, 1933;
Arbianto, 1971).
Toksoflavin lebih toksik apabila diberikan pada hewan
percobaan melalui injeksi ke dalam darah daripada diberikan
lewat mulut. Dosis mematikan atau LDS0 untuk tikus bila di-
berikan lewat penyuntikan adalah sebesar 1.7 mg per kg berat
badan tikus dan apabila diberikan lewat mulut 8.4 mg per kg
berat badan tikus (Latuasan dan Berends, 1961; Lijmbach

Menurut percobaan Nugroho (1980), penyuntikan dengan dosis


1.3 mg sampai 1.5 mg toksoflavin per kg berat badan tikus,

sesudah 18 jam ternyata menyebabkan penurunan kandungan


glikogen hati secara nyata, sedangkan kandungan lemak dan
protein tidak dipengaruhi. Apabila cara penyuntikan tokso-
flavin ke dalam tubuh hewan percobaan berbeda maka pengaruh-
nya juga berbeda.
Toksoflavin diperkirakan menghambat kerja ATP-ase yang
menghidrolisis ATP menjadi ADP + Pi + enersi. Akibat kerja
toksoflavin maka produk ATP pada mitokondria juga terhalang.
Dalam sistem'pernafasan terjadi fosforilasi oksidatif dimana
sebagian enersi yang berasal dari hasil oksidasi disimpan
dalam bentuk ATP. Setiap pasangan elektron yang dihasilkan
oleh fosforilasi substrat dapat membentuk tiga molekul ATP
melalui sistem sitokrom. Akibat kerja toksoflavin yang
memintas sistem sitokrom tersebut maka akan mengakibatkan
dua molekul ATP hilang pada reaksi pernafasan (Suryanti,
1990).
Menurut penelitian Tantie (1985) toksoflavin dapat
menghambat transpor gula di dalam membran eritrosit dan juga
menyebabkan hemolisis darah. Toksoflavin menghambat kerja
enzim glutamat transaminase dan alkali fosfatase yang ada di
dalam eritrosit.
Asam bongkrek lebih toksik daripada toksoflavin sehing-
ga lebih berperanan pada peristiwa keracunan tempe bongkrek
yang terjadi pada manusia. Van Veen dan Mertens (1934) men-
duga asam bongkrek mempunyai efek seperti narkotik dan teta-
nik. Aktivitas fisiologisnya sebanding dengan aktivitas op-
tiknya (Nugteren dan Berends, 1957).
Asam bongkrek bersifat antibiotik terhadap khamir, ka-
pang dan bakteri (Nugteren dan Berends, 1957). Asam bong-
krek mempunyai nilai LDS0 sebesar 2 mg per 100 g berat badan
tikus bila diberikan lewat mulut dan menyebabkan kematian
dalam waktu 2 jam sampai 5 jam (Nugteren dan Berends, 1957;
Welling et al., 1960).
Sifat toksik asam bongkrek bersifat kumulatif (Nugteren
dan Berends, 1957). Hal ini didukung oleh penelitian yang
dilakukan oleh Welling et a1.(1960). Menurut penelitian
mereka apabila asam bongkrek sebesar 1 mg per 100 g berat
badan tikus masih dapat ditolerir, tetapi apabila diulangi
sesudah 48 jam dosis tersebut menjadi letal.
Welling et al. (1960) telah meneliti pula efek biokimi-
awi asam bongkrek dan menyatakan bahwa asam bongkrek adalah
inhibitor kuat bagi enzim mitokondria. Proses oksidasi asam
piruvat, a-ketoglutarat dan malat dihambat oleh asam
bongkrek, tetapi oksidasi suksinat dan 43-hidroksi butirat
distimulasi.
Asam bongkrek akan menutupi gugus -SH dari ATP-ase,
akibatnya produksi ATP pada mitokondria terhenti, sehingga
ATP diproduksi di luar mitokondria secara glikolisis dari
glikogen cadangan yang ada di dalam hati. Proses fosforila-
si oksidatif, yaitu mekanisme pemecahan oksidatif dari kar-
bohidrat dan lipida yang menghasilkan enersi akan dihambat
oleh asam bongkrek sehingga organ-organ tubuh kekurangan
enersi. Apabila siklus Krebs dihambat maka satu-satunya
jalan untuk mem~eroleh enersi adalah melalui penggunaan ADP
dan 3-fosfogliseraldehida. Hal ini akan menyebabkan terja-
dinya penguraian glikogen hati, jantung dan otot-otot se-
hingga kadar gula glukosa darah naik. Setelah persediaan
glikogen habis, maka glukosa darah segera turun dan penderi-
ta keracunan bongkrek akan mengalami asidosis (Nugteren dan
Berends, 1957; Welling et al., 1960; van Veen, 1967).
Pada orang yang keracunan tempe bongkrek, mula-mula
mengalami hiperglikemia, karena terjadi pengerahan glikogen
hati, jantung dan otot-otot, kemudian diikuti dengan
terjadinya hipoglikemia yang fatal karena persediaan gliko-
gen habis. Asidosis akan terjadi karena selama terjadinya
glikolisis terbentuk asam laktat, sedangkan asam laktat akan
terakumulasi karena tidak dapat disintesis lagi menjadi gli-
kogen. Akibat yang lainnya adalah pH darah akan turun.
Penyuntikan glukosa secara intravenous hanya memberikan
keringanan atau memperlambat kematian, tetapi tidak dapat
mencegah kematian karena tidak dapat lagi mengembalikan gli-
kogen hati, jantung dan otot. Hal ini dapat ditunjukkan
bahwa sebelum kematian semua glikogen tidak nampak pada hati
dan otot juga kandungan asam laktat dalam darah naik menjadi
2 sampai 3 kalinya nilai normal (Welling et al., 1960).
Kerja dari asam bongkrek ini tidak sama dengan insulin
dan ha1 ini diuji coba dengan hewan percobaan anjing. Hormon
adrenal'in dan insulin tidak dipengaruhi oleh asam bongkrek
(Soedigdo, 1975). Di dalam tubuh sebenarnya ada glutation .
yang sedikit banyak dapat menawarkan toksin, namun terbatas
jumlahnya. Henderson dan Lardy (1970) juga telah melakukan
penelitian tentang mekanisme kerja asam bongkrek pada mito-
kondria dan hasilnya memperkuat hasil penelitian yang telah
dilakukan oleh Welling et a1.(1960). Mekanisme kerja asam
bongkrek mirip dengan atraktiloksida, yaitu mencegah trans-
lokasi adenin nukleotida ke dalam mitokondria dengan jalan
menghambat enzim translokase, sehingga pembentukan ATP
melalui fosforilasi oksidatif terganggu. Besarnya hambatan
asam bongkrek terhadap translokasi adenin nukleotida sangat
tergantung perbandingan antara kadar asam bongkrek dengan
kadar protein (Arbianto, 1975).
40
Soedigdo (1970) mengungkapkan bahwa asam bongkrek dapat
bertindak sebagai penghambat enzim-SH, sehingga asam bong-
krek akan menghambat enzim papain dan fusin, tetapi tidak
menghambat aktivitas enzim tripsin. Kebenaran dari hasil
penelitian Soedigdo ini didukung oleh peran asam bongkrek
sebagai penghambat kuat terhadap enzim ATP-ase, protease-SH,
penyerapan nutrien di usus halus dan transpor glukosa mela-
lui membran eritrosit (Margonohadi, 1980; Sabikis, 1981;
Murachi et al., 1982). Hambatan yang ditimbulkan oleh asam
bongkrek pada percobaan ini dapat dihilangkan atau dikurangi
dengan penambahan sistein.
Penghambatan translokasi NAD pada mitokondria oleh asam
bongkrek tergantung pada pH. Potensi penghambatan menurun
bila pH lebih tinggi dari 6.5 (Kemp et al., 1970). Aktivi-
tas asam bongkrek terhadap mikrobe sama dengan aktivitasnya
terhadap manusia dan hewan percobaan yang lain, yaitu mem-
pengaruhi metabolisme karbohidrat (Nugteren dan Berends,
1957). Van Veen (1950) menemukan bahwa asam bongkrek dalam
bentuk garamnya sangat aktif sebagai antibiotik terhadap
Rhizopus, Penicillium glaucum dan beberapa khamir serta bak-
teri. Nio (1966) meneliti pengaruh natrium sulfit terhadap
aktivitas antibiotik asam bongkrek pada Aspergillus niger
dan ternyata natrium sulfit dapat menghambat aktivitas anti-
biotik asam bongkrek. Menurut Melanie (1971) natrium sulfit
tidak mengurangi toksisitas asam bongkrek terhadap respirasi
sel, sedangkan sistein dapat mengurangi aktivitas asam bong-
krek secara nyata.
Soedigdo et al. (1981) telah melakukan penelitian ten-
tang aktivitas asam bongkrek merusak dalam jaringan kanker.
Percobaan yang dilakukan dengan menggunakan mencit menunjuk-
kan bahwa asam bongkrek dapat merusak jaringan kanker dengan
jalan menyuntik tumor dengan asam bongkrek sebanyak 1 pg per
g bobot badan setiap selang satu hari selama 10 hari. Tumor
hilang sekitar lima hari sesudah injeksi yang terakhir.

E. Pengujian Toksisitas

Pengujian aktivitas toksin biasanya dilakukan secara


biologis, yaitu dengan cara menguji daya toksisitasnya
terhadap suatu hewan percobaan. Metode untuk deteksi daya
toksisitas yang sudah ada adalah menggunakan hewan percobaan
tingkat tinggi, mikrobe, jaringan tubuh dan hewan percobaan
yang lain seperti tikus, kelinci, mencit, berbagai jenis
burung seperti ayam dan lain-lainnya (Soedigdo et al., 1980;
Suwandi dan Lie, 1988; Kuswanto dan Slamet, 1988).
Uji biologis atau uji toksisitas suatu toksin biasanya
' ditentukan dengan menghitung nilai LD50 atau letal dosis 50
persen. Penentuan nilai DS0 dilakukan dengan menghitung
jumlah kematian hewan percobaan yang terjadi 24 jam pertama
sesudah pemberian dosis tunggal toksin. Pada perhitungan
ini jumlah kematian dipergunakan sebagai tolok ukur untuk
efek toksik suatu toksin pada sekelompok hewan percobaan
(Miya et al., 1973).
Untuk menentukan daerah harga letal dosis 50 persen be-
berapa ahli menganjurkan untuk menggunakan paling tidak em-
pat peringkat dosis dan tiap dosis terdiri dari 8 sampai 10
ekor hewan percobaan. Namun ada ahli yang lain yang masih
menerima jika jumlah hewan percobaan tiap peringkat dosis
paling tidak empat ekor. Dosis dibuat sebagai suatu pe-
ringkat dosis dengan kelipatan logaritmik yang tetap. Dosis
terendah merupakan dosis yang tidak menyebabkan timbulnya
efek atau gejala keracunan dan dosis tertinggi merupakan do-
sis yang menyebabkan kematian 100 persen hewan percobaan.
Ada beberapa cara untuk menentukan nilai LD50t yaitu
antara lain perhitungan dengan metode grafik Miller dan
Tainter, metode grafik De Beer, metode grafik Litchfield dan
~ilcoxon,metode aritmatik dari Karber, metode Reed-Muench
dan lain-lainnya (Miya et al., 1973). Pada penelitian ini
digunakan metode Reed-Muench.
Pada metode Reed-Muench digunakan harga kumulatif se-
bagai dasarnya. Harga kumulatif diperoleh dari asumsi bahwa
hewan percobaan yang tidak mati atau tetap hidup pada suatu
dosis tertentu tidak akan mati oleh dosis yang lebih kecil;
dan suatu hewan yang mati dengan suatu dosis tertentu tentu
akan mati apabila diberikan dosis yang lebih tinggi.
Angka kumulatif kematian diperoleh dengan menjumlahkan
kematian hewan percobaan yang mati pada dosis terkecil
dengan jumlah hewan percobaan yang mati pada dosis-dosis
yang lebih besar. Angka kumulatif hidup diperoleh dengan
menjumlahkan hewan percobaan yang tetap hidup pada dosis
terbesar dengan jumlah hewan percobaan yang tetap hidup pada
dosis-dosis yang lebih kecil. Persentase kematian diperoleh
dari angka kumulatif kematian dibagi dengan jumlah angka ku-
mulatif kematian dan angka kumulatif hidup pada dosis yang
sama (total) dikalikan 100 persen.
Nilai LD50 dapat dihitung berdasarkan persamaan Reed-
Muench berikut ini :

A - B D
Log LDS0 - X log -+ log Dl
C -B
dimana :
A = persentase kematian 50 persen
B = persentase kematian <50 persen
C = persentase kematian >50 persen
D = dosis toksin pada persentase kematian > 50 persen
Dl= dosis toksin pada persentase kematian < 50 persen

Embrio ayam kadang-kadang juga dipergunakan untuk uji


biologis dengan beberapa alasan tertentu antara lain ekono-
misf mudah tersedia, ukurannya cukup kecil, relatif bebas
dari infeksi laten dan kontaminan dan tidak memproduksi
antibodi yang melawan toksin ata; virus yang disuntikkan.
Telur yang digunakan untuk menghasilkan embrio ayam harus
kuat, sehat dan bebas dari penyakit. Dalam penggunaan em-
brio ayam untuk tujuan pengujian biologis perlu diperhatikan
44
hal-ha1 berikut ini : umur embrio ayam, tempat penyuntikan,
pengenceran inokulan dan volume inokulan, suhu inkubasi, dan
sebagainya (Cunningham, 1963).
Untuk uji biologis biasanya digunakan embrio ayam yang
berumur antara 7 - 9 hari, karena pada umur teraebut embrio
ayam diperkirakan sudah cukup kuat untuk diberi perlakuan.
Umumnya embrio ayam mulai umur 10 hari akan cepat bertambah
besar dan berbulu sehingga susah untuk dilakukan peneropong-
an. Selain itu ukuran embrio ayam juga . menjadi bertambah
besar dan terjadi penurunan volume cairan di luar embrio se-
hingga sulit juga dilakukan penyuntikkan pada embrio ayam.
Demikian juga kuning telur yang terdapat pada kantung kuning
telur akan cepat menjadi kering setelah embrio ayam berumur
12 hari dan kulit telur menjadi lebih rapuh (Cunningham,
1963).
Beberapa penelitian yang menggunakan hewan percobaan
embrio ayam maupun anak ayam sudah banyak dilakukan, seperti
Romanoff dan Romanoff (1972) dan Mitruka et al. (1976) telah
mempelajari tentang embriologi dasar dan teratologi dari em-
brio ayam (Ruyani, 1991). Ruyani (1991) juga telah melaku-
kan penelitian untuk mempelajari pengaruh seng sulfat terha-
dap perkembangan embrio ayam selama penetasan.
I

P. Ketahanan Panas

Sejak jaman Purbakala, manusia sudah memanfaatkan panas


yang berupa api untuk pengolahan bahan pangan, agar supaya
dihasilkan suatu produk makanan yang mempunyai rasa lebih
lezat dan lebih mudah dicerna. Pemanfaatan panas untuk me-
ngawetkan bahan pangan baru dimulai pada tahun 1810 oleh
Nicholas Appert. Sejak penemuan ini maka penggunaan proses
termal dalam pengolahan dan pengawetan bahan pangan berkem-
bang dengan sangat pesat. Proses termal adalah salah satu
bidang ilmu yang cukup luas dan berkembang terus. Di dalam
pengolahan bahan pangan dikenal tiga jenis proses termal
yang pent ing , yaitu proses blansir, pasteurisasi dan steri-
lisasi komersial (Fardiaz, 1988/1989).
Faktor suhu sangat berpengaruh terhadap kehidupan mi-
krobe, khususnya bakteri. Suhu mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangbiakan dan daya tahan hidup bakteri. Suhu rendah
pada umumnya memperlambat aktivitas metabolisme sell sedang-
kan suhu tinggi sampai batas tertentu akan mempercepat akti-
vitas sel. Hal ini disebabkan karena adanya pengaruh suhu
terhadap aktivitas enzim dan denaturasi protein atau keru-
sakan bagian sel yang lain.
Blansir adalah suatu proses pemanasan bahan pangan
dengan uap air atau air panas secara langsung pada suhu ku-
rang dari 1 0 0 ~
selama
~ kurang lebih 10 menit.. Proses ini

.
tidak bertujuan untuk menginaktifkan atau mematikan mikrobe.
Proses ini sering dilakukan pada bahan pangan yang akan
dibekukan, dikeringkan atau dikalengkan.
Tujuan proses blansir bermacam-macam tergantung dari
p r o s e s selanjutnya. Di dalam proses p e m b e k u a n d a n
pengeringan, blansir bertujuan untuk menginaktifkan enzim
agar tidak terjadi perubahan warna, tekstur, cita rasa,
maupun nilai gizi selama penyimpanan, sedangkan di dalam
proses pengalengan, blansir bertujuan melayukan jaringan
tanaman agar mudah di pak, menghilangkan gas dari dalam
jaringan, menginaktifkan enzim dan menaikkan suhu awal bahan
pangan sebelum disterilisasi.
Proses termal yang berupa pasteurisasi dan sterilisasi
komersial bertujuan untuk menginaktifkan atau mematikan
mikrobe yang ada pada bahan pangan. Pasteurisasi merupakan
proses termal yang dilakukan pada suhu kurang dari 10oOc,
dengan waktu yang bervariasi dari mulai beberapa detik Sam-
pai beberapa menit. Hal ini tergantung pada suhu yang digu-
nakan, biasanya makin tinggi suhu pasteurisasi, makin sing-
kat proses pemanasannya. Proses pasteurisasi bertujuan
untuk menginaktifkan sel vegetatif dari mikrobe patogen,
mikrobe pembentuk toksin dan mikrobe pembusuk. Ketahanan
panas beberapa bakteri yang penting di dalam proses pasteu-
risasi bahan-pangan dapat dilihat pada Tabel 4.
Sterilisasi komersial nerupakan suatu proses termal
yang dilakukan pada suhu lebih tinggi dari 1 0 0 ~ ~ .Proses
ini bertujuan untuk membunuh semua mikrobe yang dapat
8

menyebabkan kebusukan makanan pada suhu penyimpanan yang di-


tetapkan. Disebut proses sterilisasi komersial karena tidak
semua mikrobe yang terdapat pada bahan pangan yang diste-
rilisasi tersebut inaktif atau mati. Bahan pangan yang
disterilisasi tidak betul-betul steril dalam arti kata yang
sebenarnya. Proses termal ini hanya diterapkan untuk meng-
hilangkan atau wengurangi aktivitas mikrobe yang tidak di-
inginkan terjadi d,i dalam bahan pangan yang diproses.

Tabel 4. Ketahanan panas beberapa bakteri


yang penting dalam pasteurisasi
- -

Ketahanan panas
Golongan bakteri
D (menit) (OF)

Bakteri patogen dan pembentuk


toksin
Mycobacterium tuberculosis
Brucella sp.
Coxiella burnetti
Salmonella sp.
Salmonella senftenberg
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes

D180
~lostridiumbotulinum tipe E 0.10 - 3.00
Jasad renik pembusuk
Bakteri tidak membentuk spora,
khamir, dan kapang 0.50 - 3.00

Sumber : Stumbo (1973)


I

Ketahanan panas beberapa bakteri yang penting dalam


proses sterilisasi komersial dapat dilihat pada Tabel 5.
Pada umumnya bahan pangan yang diproses dengan sterilisasi
komersial dikemas dalam kondisi anaerobik. Pada kondisi ini
Tabel 5. Ketahanan panas beberapa spora dan bakteri
yang penting dalam sterilisasi komersial

Ketahanan Panas
Golongan Bakteri
D (menit) z (OF)

Bahan Pangan Berasam Rendah (pH di


atas 4.5) D150
Bpora Termofilik
Penyebab busuk asam (flat sour)
Bacillus stearothermophillus
.Pembusuk/Produksi gas
4.0 - 5.0 14 - 22
Clostridium thermosaccharolyticum
Pembentuk bau Sulfida
3.0 - 4.0 16 - 22
C . nigrificans 2.0 - 3.0 16 - 22
Spora Hesofilik
Putrefactive Anaerob (PA)
0.10 - 0.20 14 -
C. botulinum tipe A dan B
C. sporogenes (termasuk PA 3679) 0.10 - 1.50 14 - 18
18
Bahan Pangan Asam (pH 4.0 - 4 -5)
Spora Termofilik
8. coagulans
Mesof il D2 12
8. polymyxa dan 8 . macerans 0.10 - 0.50 12 - 16
Anaerob Butirat (C. pasteurianum) 0.10 - 0.50 12 - 16
Bahan Pangan Berasam Tinggi
(pH di bawah 4.0) D15~
Lactobacillus sp.; Leuconostoc sp.;
kapang dan khamir 0.50 - 1.00 8 - 10

Sumber : Stumbo (1973)

spora bakteri pembusuk tidak tahan panas. Selain itu kon-


disi anaerobik dapat mengurangi reaksi oksidasi yang mungkin
terjadi, baik selama pemanasan maupun selama penyimpanan.
Agar supaya kondisinya tetap anaerobik, pada sterilisasi
komersial bahan pangan dikemas dengan kemasan yang kedap
udara, seperti kaleng, gelas, kantung plastik, kertas alumi-
nium dan lain-lainnya.
Untuk mengawetkan bahan pangan harus dipilih proses
termal yang digunakan, ha1 ini tergantung pada jenis bahan
pangannya, karena jenis bahan pangan berpengaruh terhadap
ketahanan panas bakteri yang ada pada bahan pangan tersebut.
Pada umumnya sel atau spora bakteri paling tahan terhadap
panas pada bahan pangan yang mempunyai pH sekitar 7.0. Ke-
naikan keasaman dan kebasaan mempercepat matinya bakteri ka-
rena pemanasan. Pada umumnya perubahan pH ke arah asam le-
bih efektif daripada perubahan ke arah basa.
Di dalam perhitungan proses termal dibutuhkan berbagai
data dan pengukuran. Dua data atau pengukuran yang paling
penting dalam perhitungan proses termal adalah kurva waktu
kematian panas (kurva TDT atau kurva Thermal Death T i m e ) .

untuk bakteri yang paling tahan panas yang mungkin terdapat


dalam bahan pangan yang diawetkan dan kurva penetrasi panas
selama pemanasan dan pendinginan bahan pangan dalam wadah
yang digunakan dengan jenis dan ukuran tertentu.
Kurva TDT menggambarkan ketahanan relatif bakteri ter-
hadap suhu mematikan yang berbeda-beda. Untuk mendapatkan
kurva TDT dapat digunakan beberapa cara, seperti dengan me-
netapkan kurva kecepatan kematian atau kurva kehidupan pada
beberapa suhu dan dengan metode tumbuh tidak tumbuh. Kurva
kecepatan kematian ditentukan dengan cara memanaskan
sejumlah spora berbentuk suspensi di dalam medium atau bahan
b
pangan pada suhu tertentu. dengan interval waktu tertentu,
kemudian dihitung jumlah spora yang masih hidup dengan cara
pemupukan cawan. Apabila hasil pengamatannya diplotkan pada
kertas grafik semilog dengan jumlah spora pada skala loga-
ritmik dan waktu pemanasan pada skala aritmatik, maka akan
diperoleh kurva kecepatan kematian. Pada kurva kecepatan
kematian dapat dilihat besarnya nilai D, yaitu waktu dimana
kurva kecepatan kematian menurun satu logaritmik atau waktu
pemanasan pada suhu tertentu yang menyebabkan kematian spora
atau sel sebanyak 90 persen.
Apabila sudah diketahui nilai D-nya dan jumlah spora
bakteri atau sel dari suatu suspensi bakteri maka dapat
dibuat kurva TDT-nya. Kurva TDT menunjukkan hubungan antara
nilai D (dalam menit) pada skala logaritmik dan suhu dalam
derajat Farenheit pada kertas grafik semilog.
Pada umumnya pada kisaran suhu yang digunakan pada ste-
rilisasi komersial, kurva TDT menunjukkan garis lurus, se-
hingga n i l a i ' ~untuk suhu yang tidak tercatat dapat diramal-
kan dari garis lurus yang didapat dengan cara memperpanjang-
nya. Sudut kemiringan pada kurva TDT disebut nilai z, yaitu
interval suhu dalam derajat Farenheit yang dibutuhkan oleh
kurva TDT untuk melewati satu logqritmik atau derajat Faren-
heit yang dibutuhkan untuk mengubah TDT sampai sepersepuluh
kalinya atau satu logaritmik. Persamaan umum nilai TDT da-
pat dituliskan sebagai berikut [Fardiaz, 19893 :
Selain nilai z dapat juga dihitung nilai F, yaitu waktu
dalam menit yang dibutuhkan untuk membunuh mikrobe di dalam
medium tertentu pada suhu 2 5 0 ~(121.1°c).
~ Nilai z dan F
bervariasi tergantung dari ketahanan panas dan konsentrasi
mikrobe serta medium pemanasan yang digunakan.
.
Pada metode tumbuh dan tidak tumbuh digunakan beberapa
seri contoh is), masing-masing terdiri dari sejumlah contoh
yang sama (r) dan masing-masing contoh mengandung sejumlah
mikrobe (No). Setiap seri yang terdiri dari r contoh ,dipa-
naskan pada suhu yang sama dengan waktu berbeda (sebanyak s
waktu yang berbeda). Setelah pemanasan semua contoh diinku-
basikan pada suhu dan waktu tertentu kemudian diamati,
apakah ada pertumbuhan (p contoh) atau tidak ada pertumbuhan
(q contoh). Apabila suhu pemanasan diplotkan sebagai nilai
aritmatik dan waktu dalam menit sebagai nilai logaritmik
maka diperoleh kurva TDT.
Nilai D suatu mikrobe dapat dihitung dengan beberapa
cara, antara lain dengan metode Stumbo-Murphy-Cochrane.
Metode ini menghitung nilai D dengan cara menghitung tabung
yang masih terjadi kebusukan atay terjadi pertumbuhan sete-
lah perlakuan pemanasan. Apabila jumlah tabung yang dipa-
naskan per satuan waktu r buah, jumlah tabung yang positif
nenunjukkan pertumbuhan mikrobe p buah dan jumlah tabung
yang tidak ada pertumbuhan q buah, maka data yang digunakan
adalah waktu pemanasan dimana r tidak sama dengan p dan r
tidak sama dengan q. Dengan cara ini pendugaan jumlah sel
atau spora yang hidup digunakan rumus (Fardiaz, 1989) :

N = 2.303 log (r/q) .................(2)


Nilai D dihitung dengan rumus :

atau

dimana ,
No = Jumlah sel atau spora mikrobe awal (dalam sel/ml)
t = Waktu pemanasan (dalam menit) setelah dikoreksi
T = Suhu pemanasan (konstan)
DT = Waktu reduksi desimal pada suhu T

Berdasarkan metode Stumbo-Murphy-Cochrane akan diper-


oleh beberapa nilai D untuk setiap suhu pemanasan tertentu
dan nilai D merupakan rata-rata dari nilai D yang diperoleh
pada suhu tersebut. Metode ini dapat digunakan untuk meng-
hitung data meskipun interval waktu pemanasan tidak konstan.
Nilai z dapat dihitung dengan beberapa cara juga, anta-
ra lain dengan metode menggunakan 'nilai DT dan dengan meng-
gunakan data titik akhir. Apabila nilai DT yang tepat dapat
dicari dari dua macam suhu, perkiraan nilai z dapat dihitung
dengan persamaan sebagai berikut :
atau

Jika nilai DT dapat dicari pada lebih dari dua macam


suhu, nilai z dapat ditentukan dengan cara membuat kurva
yang menghubungkan antara log DT dengan T, yang merupakan
kurva TDT phantom.
Kandungan mikrobe pada bahan pangan hasil fermentasi
terutama dipengaruhi oleh jenis mikrobe yang sengaja ditam-
bahkan dan kontaminan yang tumbuh selama proses fermentasi
dilakukan. ~ a k t e r iP. cocovenenans yang tumbuh pada tempe
bofigkrek selama fermentasi, belum diketahui apakah berasal
dari bahan dasarnya atau berasal dari lingkungan selama
dilakukan fermentasi. Oleh karena itu untuk mengetahui ha1
ini maka perlu dilakukan uji ketahanan panas dari bakteri
P. cocovenenans tersebut. Selain itu apabila sudah diketa-
hui ketahanan panas dari bakteri P. cocovenenans maka dapat
ditentukan bagaimana proses pengolahan harus dilakukan supa-
ya bila terjadi kontaminasi padd bahan dasarnya, mikrobe
tersebut dapat dimatikan dan dapat juga digunakan untuk eva-
luasi apakah proses pengolahan yang selama ini telah
dilakukan sudah memenuhi persyaratan yang seharusnya dilaku-
kan atau belum.
Menurut penelitian KO (1985) pada suhu bakteri
~ O C

P . cocovenenans akan mati dan pada suhu 43Oc jumlah sel me-

nurun sesudah satu minggu inkubasi. Pada suhu pertumbuhan


37Oc bakteri berkembang sempurna sedangkan pada suhu 2 2 O ~
pertumbuhan bakteri tidak optimum pada hari pertama, tetapi
akhirnya kurva pertumbuhan mencapai optimum sesudah satu
minggu inkubasi. Oleh karena itu KO (1985) menganggap bahwa
kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri P. cocovenenans
diperkirakan pada suhu antara 30°c sampai 3 7 O ~ .