ENZIMOLOGÍA II
I. - INTRODUCCIÓN
k1 k3
E + S ES E + P
k2
k2 + k3
Km = Donde k1, k2 y k3 son constantes de velocidad
k1
V =
[S ] V max
Donde [S ] + Km
V = velocidad de la reacción
Vmax = velocidad máxima
[S] = concentración de sustrato
Km= constante de Michaelis-Menten
V max
V max
-----------
2
Km [S]
Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una
representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk,
proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración
de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico
1 La pendiente de la
V Recta es igual a
Km / Vmax
1
V max
−1 1
Km S
4.- pH
5.- Inhibidores
Muchos tipos diferentes de moléculas inhiben las enzimas, y actúan de diversas formas.
Estos inhibidores pueden provocar una inhibición irreversible o una inhibición reversible.
¾ Inhibidores reversibles: Los diversos modos de inhibición reversible implican todos ellos la
unión NO COVALENTE de un inhibidor a la enzima, pero difieren en los mecanismos por
medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de
la reacción. Dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos, no competitivos y
incompetitivos. Sin embargo, los tipos de inhibición más frecuentes son la competitiva y la no
competitiva.
1. Material de estudio
Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que
hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que
hidrolizaba la sacarosa, La llamó Ferment inversif. Más recientemente se le ha llamado:
invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa.
El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa.
En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste
en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder
reductor de los productos.
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
Reactivos
1 2 3 4 5 Blanco
Buffer Acetato 0,1 M pH 4,7 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 2 mL
Sacarosa 0,05 M 1 mL - - - - -
Sacarosa 0,10 M - 1 mL - - - -
Sacarosa 0,20M - - 1 mL - - -
Sacarosa 0,30 M - - - 1 mL - -
Sacarosa 0,50 M - - - - 1 mL -
Invertasa 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 2 3 4 5
Absorbancia
8) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia en la curva de calibración
(práctico N°2), para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla:
1 2 3 4 5
Producto
(µmol)
1 2 3 4 5
Cantidad de Sustrato (sacarosa)
(μmol)
Producto / 5 = Velocidad
10) Complete la siguiente tabla y confeccione un gráfico de 1/S versus 1/V, (gráfico de
Lineweaver – Burk )
1 2 3 4 5
1 / Sustrato
1 / Velocidad
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
TUBOS
Reactivos
1 1e 2 2e 3 3e
Buffer Acetato 0,1 M
1 mL 2 mL 1 mL 2 mL 1 mL 2 mL
pH 4,7
Sacarosa
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
0,6 M
Invertasa
1 mL - 1 mL - 1 mL -
Temperatura de
3ºC Ambiente 99ºC
Incubación (5 minutos)
1 2 3
Absorbancia 00000 00000
10) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración
(práctico N°2) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla: