Thalidomide dan analognya mengatasi resistensi obat pada beberapa manusia sel myeloma untuk terapi

konvensional

Meskipun thalidomide (Thal) pada awalnya digunakan untuk mengobati multiple myeloma (MM)
karena efek antiangiogeniknya yang diketahui, mekanisme aktivitas anti-MM-nya tidak jelas. Studi-studi ini
menunjukkan aktivitas klinis Thal terhadap MM yang refrakter terhadap terapi konvensional dan
menggambarkan mekanisme aktivitas anti-tumor Thal dan analog potennya (obat imunomodulator [IMiDs]).
Yang penting, agen-agen ini bertindak secara langsung, dengan menginduksi apoptosis atau penangkapan
pertumbuhan G1, dalam garis sel MM dan sel MM pasien yang resisten terhadap melfalan, doxorubicin, dan
deksametason (Dex). Selain itu, Thal dan IMiDs meningkatkan aktivitas anti-MM dari Dex dan, sebaliknya,
dihambat oleh interleukin 6. Adapun Dex, pensinyalan apoptosis yang dipicu oleh Thal dan IMiDs terkait
dengan aktivasi terkait adhesi tyrosine kinase. Studi-studi ini menetapkan kerangka kerja untuk pengembangan
dan pengujian Thal dan IMiDs dalam paradigma pengobatan baru untuk menargetkan sel tumor dan lingkungan
mikro, mengatasi resistansi obat klasik, dan mencapai hasil yang lebih baik pada penyakit yang saat ini tidak
dapat disembuhkan ini. (Darah, 2000; 96: 2943-2950)
Pengantar
Thalidomide (Thal) pada awalnya digunakan di Eropa untuk pengobatan morning sickness pada
1950-an tetapi ditarik dari pasar pada 1960-an karena laporan teratogenisitas dan phocomelia terkait dengan
penggunaannya. Minat baru di Thal berasal dari spektrum yang luas dari efek farmakologis dan imunologi.
Karena efek imunomodulator dan antiangiogeniknya, telah digunakan untuk mengobati eritema nodosum
leprosum secara efektif, manifestasi inflamasi kusta. Aplikasi terapeutik potensial menjangkau spektrum
penyakit yang luas, termasuk kanker dan kondisi terkait, penyakit infeksi, penyakit autoimun, penyakit
dermatologi, dan gangguan lain seperti sarkoidosis, degenerasi makula, dan retinopati diabetik. Laporan terbaru
dari peningkatan angiogenesis sumsum tulang (BM) pada multiple myeloma (MM), ditambah dengan sifat
antiangiogenik yang diketahui dari Thal, memberikan alasan untuk penggunaannya untuk mengobati MM. Yang
penting, respon klinis Thal diinduksi pada 32% dari pasien MM yang penyakit refrakter terhadap terapi
konvensional dan highdose, menunjukkan bahwa obat ini dapat mengatasi resistensi obat karena mekanisme
alternatif dari aktivitas anti-MM. Selain agen alkilasi dan kortikosteroid, Thal sekarang, oleh karena itu,
merupakan kelas ketiga yang berbeda dari agen yang berguna dalam pengobatan MM.
Mengingat spektrum aktivitasnya yang luas, Thal mungkin bertindak melawan MM dalam beberapa
cara. Pertama, Thal mungkin memiliki efek langsung pada sel MM dan / atau sel stroma BM untuk menghambat
pertumbuhan dan kelangsungan hidup mereka. Sebagai contoh, kerusakan DNA oksidatif yang diperantarai
radikal bebas mungkin memainkan peran dalam teratogenisitas Thal dan mungkin juga memiliki efek anti-
tumor. Kedua, adhesi sel MM ke sel stroma BM keduanya memicu sekresi sitokin yang meningkatkan
pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel MM dan memberikan resistansi obat; Thal memodulasi interaksi
perekat dan, dengan demikian, dapat mengubah pertumbuhan sel tumor, kelangsungan hidup, dan resistensi
obat. Ketiga, sitokin disekresikan ke lingkungan mikro BM oleh MM dan / atau sel stroma BM, seperti
interleukin (IL) -6, IL-1b, IL-10, dan tumor necrosis factor (TNF) -a, dapat meningkatkan pertumbuhan sel MM
dan kelangsungan hidup, dan Thal dapat mengubah sekresi dan bioaktivitas mereka. Keempat, faktor
pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan faktor pertumbuhan fibroblast dasar 2 (bFGF-2) disekresikan oleh
MM dan / atau sel stroma BM dan dapat memainkan peran baik dalam pertumbuhan sel tumor dan
kelangsungan hidup, serta angiogenesis BM. Mengingat aktivitas antiangiogenik yang diketahui, Thal dapat
menghambat aktivitas VEGF, bFGF-2, dan / atau angiogenesis dalam MM. Namun, Singhal et al. mengamati
tidak ada korelasi angiogenesis BM dengan respon terhadap Thal, menunjukkan bahwa itu mungkin tidak
memediasi aktivitas anti-MM oleh efek antiangiogeniknya. Akhirnya, Thal mungkin bertindak melawan MM
dengan efek imunomodulatorinya, seperti induksi respon sel T1 dengan sekresi interferon gamma (IFN-g) dan
IL-2. Sudah 2 kelas analog Thal telah dilaporkan, termasuk phosphodiesterase 4 inhibitor yang menghambat
TNF-a tetapi tidak meningkatkan aktivasi sel-T (obat penghambat sitokin yang dipilih [SelCIDs]) dan lainnya
yang bukan merupakan penghambat phosphodiesterase 4 tetapi secara nyata menstimulasi sel-T proliferasi serta
produksi IL-2 dan IFN-g (obat imunomodulator [IMiDs]).
Dalam studi ini, kami telah mulai mengkarakterisasi mekanisme aktivitas Thal dan analog ini
terhadap sel MM manusia. Delineasi mekanisme aksi mereka, serta mekanisme resistensi terhadap agen-agen
ini, keduanya akan meningkatkan pemahaman tentang patogenesis penyakit MM dan menurunkan strategi
pengobatan baru.
Bahan dan metode

Garis sel yang diturunkan dari MM dan sel pasien Dexamethasone (Dex) -sensitif (MM.1S) dan Dex-
resistant (MM.1R) garis humanMMcell yang ramah disediakan oleh Dr Steven Rosen (Northwestern University,
Chicago, IL). Doxorubicin (Dox) -, mitoxantrone (Mit) -, dan melphalan (Mel) -sensitif dan -terahan RPMI-
8226 sel MM manusia yang baik disediakan oleh DrWilliam Dalton (Moffitt Cancer Centre, Tampa, FL). Sel
RPMI-8226 yang tahan terhadap Dox, Mit, dan Mel termasuk sel Dox 6 dan Dox 40, sel MR20, dan sel LR5,
masing-masing. Hs Sultan human MM cells diperoleh dari American Type Culture Collection (Rockville, MD).
Semua lini sel MM dikultur dalam media RPMI-1640 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) yang mengandung 10%
serum janin sapi, 2 mmol / L L-glutamine (GIBCO, Grand Island, NY), 100 U / mL penisilin, dan 100 mg / mL
streptomisin (GIBCO). Garis sel yang tahan obat dikultur dengan Dox, Mit, Mel, atau Dex untuk
mengkonfirmasi kurangnya kepekaan obat. Sel pasien MM (96% CD381CD45RA2) dimurnikan dari sampel
BM pasien, seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Thal dan analog

Thal dan analog (Celgene, Warren, NJ) dilarutkan dalam DMSO (Sigma) dan disimpan pada 220 ° C
hingga digunakan. Obat-obatan dilarutkan dalam media biakan (0,0001 hingga 100 mM) dengan, 0,1% DMSO
segera sebelum digunakan. The Thal analog yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 SelCIDs (SelCIDs 1,
2, 3, dan 4), yang merupakan penghambat phosphodiesterase 4 yang menghambat produksi TNF-a dan
meningkatkan produksi IL-10 dari lipopolisakarida (LPS) - merangsang sel mononuklear darah perifer (PBMCs)
tetapi tidak merangsang proliferasi sel-T; dan 3 IMiDs (IMiD1, IMiD2, dan IMiD3), yang merangsang
proliferasi sel T, serta sekresi IL-2 dan IFN-g, tetapi bukan merupakan phosphodiesterase 4 inhibitor. IMiDs
juga menghambat TNF-a, IL-1b, dan IL-6 dan sangat meningkatkan produksi IL-10 oleh PBMC yang
terangsang oleh LPS.
Sintesis DNA
DNA sintesis diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya.19MMcells (3 3 104 sel / baik) diinkubasi
di piring budaya 96-baik (Costar, Cambridge, MA) di hadapan media, Thal, SelCID1, SelCID2, SelCID3,
SelCID4, IMiD1, IMiD2 , IMiD3, dan / atau IL-6 rekombinan (50 ng / mL) (Genetika Institute, Cambridge,
MA) selama 48 jam pada 37 ° C. Sintesis DNA diukur dengan [3H] -thymidine (3H-TdR; NEN Products,
Boston, MA) serapan. Sel-sel berdenyut dengan 3H-TdR (0,5 mCi / baik) selama 8 jam terakhir budaya 48 jam,
dipanen ke filter kaca dengan pemanen sel otomatis (Cambridge Technology, Cambridge, MA), dan dihitung
dengan menggunakan skintilisasi LKB Betaplate counter (Wallac, Gaithersburg, MD). Semua percobaan
dilakukan dalam rangkap tiga. Tes kolorimetri juga dilakukan untuk menguji aktivitas obat. Sel-sel dari kultur
48 jam berdenyut dengan 10 mL 5 mg / mL 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenil tetrasodium bromide
(MTT; Chemicon International Inc, Temecula, CA) untuk masing-masing baik selama 4 jam, diikuti oleh 100
mL isopropanol yang mengandung 0,04 HCl. Pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 570 nm diambil
pada spektrofotometer (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).
Analisis siklus sel
Sel-sel MM (1 3 106) dikultur selama 72 jam di media saja, Thal, IMiD1, IMiD2, dan IMiD3
dipanen, dicuci dengan fosfat-buffered saline (PBS), difiksasi dengan 70% etanol, dan pra-perawatan dengan 10
mg / mL RNAse (Sigma). Sel diwarnai dengan propidium iodida (PI; 5 mg / mL; Sigma), dan profil siklus sel
ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak program M pada sitometer aliran Epik (Coulter Immunology,
Hialeah, FL), seperti pada penelitian sebelumnya.
Deteksi apoptosis
Selain mengidentifikasi sel sub-G1 seperti yang dijelaskan di atas, apoptosis juga dikonfirmasi
dengan menggunakan pewarnaan aneksin V. Sel-sel MM dikulturkan dalam media (0,01% DMSO) atau dengan
10 mmol / L Thal atau 1 mmol / L IMiD1, IMiD2, dan IMiD3 pada 37 ° C selama 72 jam, dengan penambahan
obat pada interval 24 jam. Sel kemudian dicuci dua kali dengan PBS dingin dan disuspensikan kembali (1 3 106
sel / mL) dalam buffer pengikat (10 mmol / L HEPES, pH 7,4, 140 mmol / L NaCl, 2,5 mmol / L CaCl2). Sel
MM (1 3 105) diinkubasi dengan annexin V-FITC (5 mL; Pharmingen, San Diego, CA) dan PI (5 mg / mL)
selama 15 menit pada suhu kamar. Sel apoptosis Annexin V1PI2 dihitung dengan menggunakan Epic cell sorter
(Coulter).
Immunoblotting
Sel-sel MM dikulturkan dengan 10 mmol / L dari Thal, IMiD1, IMiD2, atau IMiD3; dipanen; dicuci;
dan lisis menggunakan buffer lysis: 50 mmol / L HEPES (pH 7.4), 150 mmol / L NaCl, 1% Triton-X 100, 30
mmol / L natrium pirofosfat, 5 mmol / L EDTA, 2 mmol / L Na3VO4, 5 mmol / L NaF, 1 mmol / L
phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), 5 mg / mL leupeptin, dan 5 mg / mL aprotinin. Untuk mendeteksi p21,
sel lisat menjadi sasaran SDS-PAGE, ditransfer ke membran polyvinylidene difluoride (PVDF), dan
immunoblotted dengan antibodi anti-p21 (Ab; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Membran ditelanjangi dan
diulangi dengan anti-alpha tubulin Ab (Sigma) untuk memastikan pemuatan protein yang setara. Untuk
mendeteksi p53, sel lisat dibuat dari sel MM (2 3 107) dengan menggunakan buffer lisis. Lisat diinkubasi
dengan anti-mutan (mt) atau wild-type (wt) p53 monoclonal Abs (Calbiochem, San Diego, CA) dan kemudian
immunoprecipitated semalam dengan protein A Sepharose (Sepharose CL-4B; Pharmacia, Uppsala, Swedia).
Kompleks imun dianalisis dengan imunoblotting dengan horseradish peroxidase-konjugasi anti-p53 Ab reaktif
dengan baik mt dan wt p53 (Calbiochem). Untuk mengkarakterisasi sinyal pertumbuhan, imunoblotting juga
dilakukan dengan MAPK Ab anti-fosfus tertentu (New England Biolabs, Beverly, MA) dengan ada atau
tidaknya IL-6 (Genetics Institute) dan / atau inhibitor MEK 1 PD98059 (New England) Biolabs), seperti pada
penelitian sebelumnya.21 Kompleks antibodi-antigen dideteksi dengan menggunakan chemiluminescence yang
ditingkatkan (Amersham, Arlington Heights, IL). Blot dilepas dan diperiksa ulang dengan anti-ERK2 Ab (Santa
Cruz Biotech) untuk memastikan pemuatan protein yang setara. Untuk mengkarakterisasi pensinyalan apoptosis,
sel MM dikulturkan dengan 100 mmol / L dari Thal, IMiD1, IMiD2, atau IMiD3; dipanen; dicuci; dan lysed
dalam 1 mL buffer lysis (50 mmol / L Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 5 mmol / L EDTA, 2 mmol / L
Na3VO4, 5 mmol / L NaF, 1 mmol / L PMSF, 5 mg / mL leupeptin, dan 5 mg / mL aprotinin), seperti pada
penelitian sebelumnya.22 Lysate diinkubasi dengan anti-adhesi focal tyrosine kinase (RAFTK) Ab selama 1 jam
pada 4 ° C dan kemudian selama 45 menit setelah penambahan protein G-agarose (Santa Cruz Biotech).
Kompleks imun dianalisis dengan immunoblotting dengan anti-P-Tyr Ab (RC20; Transduction Laboratories,
Lexington, KY) atau Abs anti-RAFTK. Protein dipisahkan oleh elektroforesis dalam 7,5% gel SDS-PAGE,
ditransfer ke kertas nitroselulosa, dan dianalisis dengan imunobloting. Kompleks antigen-antibodi
divisualisasikan oleh chemiluminescence.
Analisis statistik

Signifikansi statistik dari perbedaan yang diamati dalam budaya yang diobati obat versus kontrol
ditentukan dengan menggunakan uji t Student. Tingkat signifikansi minimal adalah P, .05.

Hasil
Pengobatan pasien MM dengan Thal
Tujuh belas (39%) dari 44 pasien dengan MM yang dirawat di institut kami menanggapi Thal (Tabel
1). Tanggapan ini termasuk 6 pria dan 11 wanita. Pasien-pasien ini telah menerima median dari 4 (1-9) rejimen
pengobatan sebelumnya, dan 10 pasien memiliki terapi dosis tinggi sebelumnya dan transplantasi sel induk
hematopoietik. Satu pasien mencapai respon lengkap (tidak adanya protein monoklonal pada imuniksasi dan
biopsi BM normal), 11 pasien mencapai respon parsial (50% penurunan protein monoklonal), dan 5 pasien
mencapai penyakit stabil (penurunan 50% protein monoklonal). Pasien menerima median 400 mg (kisaran, 100-
800 mg) dosis maksimum Thal harian selama rata-rata 6 bulan (kisaran, 1,5-13 bulan). Pada 1 Januari 2000, 11
pasien memiliki tanggapan lanjutan pada rata-rata 6 bulan (kisaran, 4-13 bulan), dan 6 pasien telah berkembang
rata-rata 4,5 bulan (kisaran, 1,5-10 bulan).
Pengaruh Thal dan analog pada sintesis DNA oleh garis sel MM dan sel MM pasien
Efek Thal dan analognya, termasuk IMiD1, IMiD2, IMiD3, SelCID1, SelCID2, SelCID3, dan
SelCID4, pada sintesis DNA garis sel MM (MM.1S, Hs Sultan, U266, dan RPMI-8226) ditentukan dengan
mengukur Penyerapan 3H-TdR selama 8 jam terakhir kultur 48 jam, dengan ada atau tidaknya obat pada
berbagai konsentrasi. IMiD1, IMiD2, dan IMiD3 menghambat ambilan 3H-TdR MM.1S (Gambar 1A) dan Hs
Sultan (Gambar 1B) sel dengan cara bergantung pada dosis. Lima puluh persen penghambatan proliferasi sel
MM.1S tercatat pada 0,01-0,1 mmol / L IMiD1, 0,1-1,0 mmol / L IMiD2, dan 0,1-1,0 mmol / L IMiD3 (P,
.001). Lima puluh persen penghambatan proliferasi sel Hs Sultan tercatat pada 0,1 mmol / L IMiD1, 1,0 mmol /
L IMiD2, dan 1,0 mmol / L. Sebaliknya, hanya 15% dan 20% penghambatan di MM.1S dan sel Sultan, masing-
masing, diamati dalam kultur pada konsentrasi yang lebih tinggi (100 mmol / L) dari Thal. Tidak ada
penghambatan signifikan sintesis DNA dari sel U266 MM yang tercatat dalam kultur dengan 0,001 hingga 100
mmol / L Thal atau IMiDs ini (data tidak ditampilkan). Efek dari obat ini pada proliferasi dikonfirmasi dengan
menggunakan tes MTT untuk sel MM.1S (Gambar 1A) dan sel Hs Sultan (Gambar 1B). Meskipun ada juga
penghambatan tergantung dosis proliferasi sel MM.1S oleh SelCID, 50% inhibisi hanya diamati pada dosis
tinggi (100 mmol / L) hanya untuk 2 dari 4 SelCID (SelCID 1 dan 3, Gambar 1C) . Penelitian lebih lanjut, oleh
karena itu, berfokus pada Thal dan IMiDs. IMiD3 (P, .001).
Efek Thal dan analog dalam sintesis DNA sel MM tahan terhadap terapi konvensional
Untuk menguji apakah ada resistensi silang antara Thal dan IMiDs dengan terapi konvensional,
RPMI-8226 sel MM tahan terhadap sel Dox (Dox6 dan Dox40), sel Mit (sel MR20), atau Mel (sel LR5), dan
MM.1R tahan terhadap Dex yang sama dipelajari. Proliferasi sel Dox6 dan Dox40, MR20, LR5, atau MM1.R
tidak terpengaruh oleh kultur dengan 60 nmol / L dan 400 nmol / L Dox, 20 nmol / L Mit, 5 mmol / L Mel, dan
1 mmol / L Dex, masing-masing (data tidak ditampilkan). Yang penting, penyerapan 3H-TdR dari Dox6,
Dox40, MR20, atau LR5 dihambat dalam kultur dengan Thal dan IMiDs dengan cara yang tergantung dosis (1-
100 mmol / L) dibandingkan budaya media saja (Gambar 2A-D). Sebagai contoh, 10 mmol / L IMiD1
memblokir proliferasi sel Dox6, Dox40, MR20, dan LR5 masing-masing sebesar 20%, 33%, 32%, dan 21% (P,
.001). IMiDs juga menghambat sintesis DNA sel MM.1R dengan cara yang bergantung pada dosis, dengan lebih
dari 50% inhibisi pada lebih dari 1 mmol / L IMiD1 (P, .001; Gambar 2E). Data ini menunjukkan mekanisme
resistensi independen terhadap Dox, Mit, Mel, dan Dex versus Thal dan analognya.
Efek Dex dan IL-6 pada respon sel MM ke Thal dan ImiDs

Untuk menentukan apakah efek Thal dan IMiDs aditif dengan terapi konvensional, kami selanjutnya
memeriksa efek Dex (0,001-0,1 mmol / L) bersama dengan 1 mmol / L Thal atau ImiDs pada proliferasi Dex-
sensitif MM.1S sel . Seperti dapat dilihat pada Gambar 3A, IMiDs (1 mmol / L) secara signifikan menghambat
penyerapan 3H-TdR sel MM.1S (60% -75% blok, P, .01), dan Dex (0,001-0,1 mmol / L ) meningkatkan
hambatan ini dengan cara yang bergantung pada dosis. Sebagai contoh, dosis 0,001-0,01 mmol / L Dex
ditambahkan ke 1 mmol / L IMiD1 meningkatkan penghambatan proliferasi oleh 35% relatif terhadap budaya
dengan 1 mmol / L IMiD1 sendiri (P, .01). Mengingat efek aditif Dex dan IMiDs, serta peran IL-6 yang dikenal
sebagai faktor pertumbuhan dan inhibitor spesifik dari apoptosis sel MM Dex-induced, 19,22,23 kami juga
memeriksa apakah IL-6 eksogen dapat mengatasi penghambatan sintesis DNA yang dipicu oleh Thal dan
IMiDs. Gambar 3B menunjukkan bahwa IL-6 (50 ng / mL) memicu sintesis DNA sel MM.1S dalam kultur
dengan media saja, serta dalam kultur dengan IMiDs (0,1 dan 1 mmol / L).

Pengaruh Thal dan analog pada sintesis DNA sel MM pasien

Efek Thal dan IMiDs onDNAsintesis pasien MMcells selanjutnya diperiksa (Gambar 4). Seperti
yang berlaku untuk MM.1S dan Hs Sultan MMcell lines, 3H-TdR serapan pasien MMCells juga dihambat oleh
IMiDs (0,1-100 mmol / L) dalam mode tergantung dosis, sedangkan efek penghambatan Thal, bahkan pada 100
mmol / L, tidak signifikan. Lima puluh persen penghambatan sel pasien MM diamati pada 100 mmol / L
(Gambar 4A) dan 1 mmol / L (Gambar 4B) IMiD1, masing-masing (P, .001).
Pengaruh Thal dan analog pada profil siklus sel sel MM dan sel MM pasien

Untuk menganalisa lebih lanjut mekanisme penghambatan sintesis DNA Thal dan IMiD dan untuk
menentukan apakah obat-obatan ini menginduksi apoptosis sel MM, pertama-tama kita memeriksa profil siklus
sel MM.1S, sel Hs Sultan, dan sel MM pasien yang dikulturkan dengan media saja, Thal (10 mmol / L), atau
IMiDs (1 mmol / L). Sel dipanen dari biakan 72 jam dan diwarnai dengan PI. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 5A, semua 3 IMiDs, dan Thal ke tingkat lebih rendah, meningkatkan sub-G1 MM.1S sel. Induksi
apoptosis terjadi pada kurva dosis-respons yang dicatat untuk penghambatan proliferasi. Budaya dua belas jam
dengan Dex (10 mmol / L) berfungsi sebagai kontrol positif untuk memicu peningkatan sel sub-G1. Sebaliknya,
tidak ada peningkatan sel sub-G1 yang diamati pada kultur sel Hs Sultan atau sel MM pasien dengan Thal atau
IMiDs. Yang penting, Thal dan IMiDs menginduksi penahanan pertumbuhan G1 di kedua sel Hs Sultan dan sel
MM pasien AS. Untuk mengkonfirmasi hasil ini, kami melakukan pewarnaan sel-sel annexin V dalam budaya-
budaya ini. Seperti dapat dilihat pada Gambar 5B, persentase sel annexin V-positif dalam kultur sel MM.1S
dengan Thal, IMiD1, IMiD2, dan IMiD3 adalah 32%, 55%, 51%, dan 43%, masing-masing. Empat puluh enam
persen pewarnaan annexin V diamati pada kultur dengan Dex, sedangkan hanya 22% sel annexin V-positif yang
hadir dalam kultur dengan media saja. Persentase sel annexin V-positive Hs Sultan dan sel MM pasien AS
adalah 4% hingga 7%, masing-masing, di bawah semua kondisi budaya dan tidak meningkat oleh Thal atau
IMiDs.

Efek Thal dan analog pada ekspresi p21 dalam garis sel MM dan sel pasien

Kami selanjutnya berkorelasi dengan sekuel biologis yang berbeda dari Thal dan IMiDs dengan status
p21 dalam MM.1S dibandingkan Hs Sultan dan sel MM pasien. Seperti dapat dilihat pada Gambar 6A, ekspresi
p21 diturunkan oleh IMiDs, serta oleh Dex, dalam sel MM1.S; dan IL-6 mengatasi efek penghambatan ini.
Sebaliknya, IMiDs mengatur p21 dalam sel Hs Sultan dan patientMMcells. Immunoblotting dengan anti-
tubulinAb mengkonfirmasi pemuatan protein setara. Wt-p53 diakui dalam sel MM.1S, sedangkan kedua wt- dan
mt-p53 diakui dalam sel Hs Sultan dan sel MM pasien (Gambar 6B). Studi-studi ini lebih lanjut mendukung
pengamatan bahwa Thal dan IMiDs dapat menginduksi apoptosis atau penahanan pertumbuhan G1 pada sel
MM yang sensitif, dan mereka konsisten dengan Thal dan IMiD p53-mediated down-regulation p21 dan
kerentanan terhadap p53-mediated apoptosis dalam MM. Sel 1S, berbeda dengan induksi p21 dan penahanan
pertumbuhan pada sel Hs Sultan dan sel MM pasien, memberikan perlindungan dari apoptosis.

Pengaruh Thal dan analog pada pertumbuhan dan pensinyalan apoptosis pada sel MM.1S dan MM.1R
Kami sebelumnya telah mencirikan sinyal kaskade mediasi MMcell pertumbuhan dan apoptosis,
serta efek antiapoptotic dari IL-6.19,22-25 Karena kami telah menunjukkan bahwa proliferasi IL-6-induksi
dimediasi oleh ras-dependent mitogen-activated protein kinase ( MAPK) cascade, 19 kita selanjutnya menguji
efek Thal dan IMiDs pada fosforilasi tirosin MAPK di IL-6- respons MM.1S sel. Fosforilasi tirosin konstitutif
dari MAPK di MM.1S sel turun-diatur oleh inhibitor MEK1 PD98059 (50 mmol / L), yang berfungsi sebagai
kontrol positif (Gambar 6A), dan pada tingkat lebih rendah oleh IMiDs (1 mmol / L) ; Gambar 7A) atau Thal
(10 mmol / L; data tidak ditampilkan). Perlakuan sel MM.1S dengan IL-6 meningkatkan fosforilasi tirosin
MAPK, yang sebagian diblokir oleh PD98059 tetapi tidak terpengaruh oleh ImiDs (Gambar 7A) atau Thal (data
tidak ditampilkan). Mengupas noda dan reprobing dengan anti-ERK2 Ab mengkonfirmasi pemuatan protein
setara.
Pengamatan bahwa IL-6 dapat mengatasi efek dari Thal, IMiDs, dan Dex, ditambah dengan
penelitian sebelumnya yang menggambarkan sinyal kaskade mediasi Dex-induced apoptosis dan efek protektif
dari IL-6,22,23,25 menyarankan bahwa aktivasi RAFTK dapat diinduksi selama apoptosis yang dipicu oleh
Thal dan IMiDs. Sel MM.1S dan MM.1R, oleh karena itu, selanjutnya dikultur dengan 1 mmol / L Thal, IMiD1,
IMiD2, atau IMiD3 selama 12 jam. Budaya dua belas jam dengan Dex (10 mmol / L) berfungsi sebagai kontrol
positif untuk aktivasi RAFTK. Total lisat sel menjadi sasaran imunopresipitasi dengan anti-RAFTK Ab dan
dianalisis dengan imunoblotting dengan anti-P-Tyr Ab atau anti-RAFTK Ab. Seperti dapat dilihat pada Gambar
7B, Dex menginduksi fosforilasi tirosin RAFTK dalam sel MM.1S tetapi tidak dalam sel MM.1R. Yang
penting, IMiD1 menginduksi fosforilasi tirosin RAFTK baik pada MM.1S dan MM.1R
Diskusi

Studi ini menunjukkan untuk pertama kalinya efek tergantung langsung dosis Thal dan analog ini
pada sel tumor. Thal telah menunjukkan aktivitas klinis anti-MM di University of Arkansas7 dan dalam
penelitian ini, dan Thal pada konsentrasi tinggi (100 mmol / L) menghasilkan penghambatan sederhana (20%)
sintesis DNA in vitro sel MM. SelCID juga menginduksi penghambatan tergantung dosis sel MM, tetapi hanya
2 dari 4 SelCID yang diuji mencapai 50% penghambatan proliferasi, bahkan pada 100 mmol / L konsentrasi.
Yang penting, semua 3 IMiDs yang diuji mencapai 50% penghambatan sintesis DNA pada konsentrasi (0,1-1,0
mmol / L) yang sesuai dengan tingkat serum yang mudah dicapai, keduanya mengkonfirmasi aksi langsung
mereka pada sel tumor dan menyarankan utilitas klinis potensial mereka. Selain itu, IMiDs menghambat
proliferasi sel Dox-, Mit-, dan Mel-resistant MM sebesar 20% hingga 35%, dan sel MM Dex-resistant sebesar
50%. Efek in vitro ini berkorelasi dengan aktivitas klinis Thal yang diamati pada pasien dengan MM yang
refrakter terhadap terapi konvensional, baik di University of Arkansas7 dan dilaporkan dalam penelitian ini, dan
menyarankan utilitas klinis mereka untuk mengatasi resistensi obat. Selain itu, penelitian kami lebih lanjut
menunjukkan bahwa Dex dapat menambah efek antiproliferatif dari Thal dan IMiDs in vitro, menunjukkan
utilitas potensial kopling agen-agen ini terapeutik. Akhirnya, penelitian kami juga mengidentifikasi sel-sel MM
yang resisten terhadap Thal dan analog (sel U266), yang karenanya, dapat digunakan untuk mempelajari
mekanisme resistensi Thal. Studi kami menunjukkan bahwa Thal dan IMiDs bertindak langsung pada sel MM,
dengan tidak adanya aksesori BM atau sel T. Juga mungkin bahwa agen-agen ini mungkin memediasi efek anti-
MM mereka dengan sitokin, mengingat efek penghambatan yang diketahui pada TNF-a, IL-1b, dan IL-6.15
Penelitian kami sebelumnya telah mengkarakterisasi efek pertumbuhan IL-6 pada manusia. Sel MM, 12,26 dan
kami, oleh karena itu, selanjutnya menentukan efek IL-6 eksogen pada aktivitas obat. Studi kami menunjukkan
bahwa IL-6 dapat mengatasi efek Thal dan IMiDs pada sel MM dan sel pasien, menunjukkan bahwa obat-obat
baru ini, setidaknya sebagian, dapat menghambat produksi IL-6. Studi kami sebelumnya telah lebih lanjut
menunjukkan bahwa proliferasi IL-6-terinduksi sel MM dimediasi melalui kaskade MAPK dan bahwa blokade
jalur ini dengan oligonukleotida MAPK antisense atau MEK1 inhibitor PD98059 dapat membatalkan respons
ini. Penelitian ini menunjukkan fosforilasi MAPK konstitutif dalam sel MM yang dihambat oleh PD98059 dan,
pada tingkat lebih rendah, oleh IMiDs. Yang penting, IL-6-dipicu MAPK tyrosine phosphorylation juga diblokir
oleh PD98059 tetapi tidak oleh IMiDs. Studi-studi ini, oleh karena itu, menunjukkan bahwa IMiDs tidak bekerja
hanya dengan secara langsung menghambat signaling pertumbuhan MAPK dan lebih lanjut mendukung
aktivitas potensial mereka dalam meregulasi produksi IL-6. Dalam MM, produksi IL-6 dalam sel tumor dapat
bersifat konstitutif atau induksi, mediasi pertumbuhan sel tumor autokrin.26,27 Selain itu, IL-6 juga diproduksi
oleh sel-sel stroma BM di MM, sebuah proses yang diregulasi oleh adhesi sel tumor ke sel-sel stroma BM,
dengan pertumbuhan sel tumor terkait dalam mekanisme parakrin.10,11 Penelitian yang sedang berlangsung
kami, oleh karena itu, mengevaluasi efek Thal dan analog ini pada IL-6 produksi di lingkungan mikro BM.
Setelah menunjukkan efek penghambatan Thal dan IMiDs pada 3H-TdR serapan sel tumor, kami selanjutnya
memeriksa efeknya pada siklus sel MM. Menariknya, obat-obatan ini memiliki sekuela fungsional yang berbeda
dalam MMcells. Secara khusus, IMiDs, dan pada tingkat lebih rendah Thal, menginduksi apoptosis sel MM.1S,
dibuktikan dengan peningkatan sel sub-G1 pada pewarnaan PI dan peningkatan sel-sel annexin V-positif. Dalam
sel-sel ini yang memiliki p53, agen-agen ini (dan Dex) menurunkan-mengatur p21, sehingga memfasilitasi
transisi G1-ke-S dan kerentanan terhadap apoptosis. Efek apoptosis ini mungkin berkorelasi dengan pengamatan
klinis bahwa respons lengkap terhadap Thal jarang diamati. IL-6 mengatasi penurunan regulasi p21 yang
diinduksi oleh agen-agen ini, konsisten dengan peningkatan sintesis DNA yang dipicu oleh IL-6 bahkan di
hadapan obat-obatan ini. Sebaliknya, pada sel Hs Sultan (wt dan mt p53) dan sel pasien (p53 dan p53 pt), IMiDs
dan Thal menginduksi p21 dan penangkapan pertumbuhan G1 terkait, dengan demikian memberikan
perlindungan dari apoptosis, seperti yang telah diamati pada sistem lain. 28,29 Dalam penelitian kami
sebelumnya, 20 p21 juga secara konstitutif diekspresikan dalam mayoritas sel MM dan juga menghambat
proliferasi baik pada mekanisme yang bergantung pada p53 dan bergantung. Laporan sebelumnya bahwa sel-sel
overexpressing protein p21 menunjukkan kemoresistance30 lebih lanjut mendukung efek perlindungan dari
penangkapan pertumbuhan G1 yang diinduksi oleh agen-agen ini dalam sel Hs Sultan MM dan sel MM pasien.
Sebaliknya, seringnya pertumbuhan kembali MM progresif yang dicatat secara klinis pada penghentian
pengobatan Thal mungkin berkorelasi dengan pelepasan penahanan pertumbuhan G1 terkait obat. Percobaan
klinis yang sedang berlangsung adalah menghubungkan respon terhadap Thal dengan parameter laboratorium
(yaitu, serum IL-6 atau penanda pengganti C reaktif protein) dan akan mendapatkan wawasan lebih lanjut ke
dalam mekanisme aktivitas anti-tumor in vivo.
Akhirnya, penelitian kami sebelumnya telah mencirikan kaskade sinyal apoptosis dalam MM, serta
efek perlindungan IL-6, terutama terhadap apoptosis Dex-diinduksi.22,23,25,31 Secara khusus, kami telah
menunjukkan bahwa Dex menurunkan-mengatur pertumbuhan kinase , seperti MAPK dan p70RSK, 23 yang
penting, mengaktifkan RAFTK, yang diperlukan untuk apoptosis yang diinduksi Dex dan dibatalkan oleh IL-6.
Studi saat ini menunjukkan bahwa IMiD1 bertindak mirip dengan Dex, karena mengaktifkan RAFTK dan
apoptosis dalam sel MM.1S, gejala sisa yang diblokir oleh IL-6. Mengingat penelitian kami sebelumnya, yang
menunjukkan bahwa apoptosis sel MM yang diinduksi oleh radiasi UV, iradiasi, dan ligasi Fas tidak melibatkan
RAFTK, 22 studi sinyal saat ini, oleh karena itu, lebih lanjut mendukung kedua kemampuan IMiDs untuk
bertindak melalui riam signaling yang berbeda. untuk mengatasi resistensi obat, serta peningkatan aktivitas anti-
tumor yang diamati ketika Thal atau ImiDs digabungkan dengan Dex. Sebagai kesimpulan, hasil penelitian ini,
oleh karena itu, menunjukkan bukti untuk aktivitas langsung Thal dan IMiDs terhadap sel MM manusia. Untuk
mengkonfirmasi mekanisme aksi in vivo mereka, senyawa ini dan SelCID akan diperiksa dalam model binatang.
Yang penting, penelitian ini menyediakan kerangka kerja untuk pengembangan dan pengujian paradigma
pengobatan biologis berbasis baru yang menggunakan agen baru ini, baik sendiri atau bersama-sama dengan
terapi konvensional, untuk menargetkan baik sel tumor dan lingkungan mikronya, mengatasi resistansi obat
klasik, dan mencapai hasil yang lebih baik pada penyakit yang saat ini tidak dapat disembuhkan ini.