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PRÁCTICA No.

4 “MODELOS IN VITRO”

Yoval Colorado Paola, Hernández Chávez Julio Vladimir, Méndez Gómez Luis
Ángel, García Peña Isaí.
Facultad de Química Farmacéutica Biológica, Campus Xalapa, Universidad Veracruzana.
Yovalcolorado@gmail.com

Palabras clave: antinflamatorio, in vitro, estabilidad de membrana.

Abstract. se encuentra bajo condiciones controladas


que intentan ser las más cercanas a las del
the in vitro technique is a procedure in the organismo. El objetivo de esta práctica fue
biomedical sciences. this allows us to study a crear un modelo in vitro para estudiar el
phenomenon outside of the living organism efecto antiinflamatorio de dos de los
with conditions under control, they try to be fármacos más utilizados en la población.
as close as possible to the conditions of a Para esto se necesitó de células sanguíneas
living organism. the objective of this practice las cuales se sometieron a diferentes
was in vitro model for evaluate the anti- condiciones de calor y de presión osmótica
inflammatory effect of two most used drugs. dentro de un tubo de ensaye donde se
to do it we needed blood cells, these were adiciono igualmente el principio activo con el
subbmitted to pressure and heat conditions fin de evaluar su
with the drug inside of a test tube. efecto ante tales condiciones. Los datos
obtenidos fueron recapitulados en una tabla
The results obtained are shown in a table that
que muestra el efecto “protector” de fármaco
show us the relationship between the
a la membrana de los eritrocitos, el cual se
protective effect on the erythrocyte
pudo determinar por espectrofotometría, al
membrane which was measured with the
obtener la absorbancia de la hemoglobina
absorbance of hemoglobin released by the
que se liberó por la hemolisis de estos.
hemolysis of erythrocytes. next these results
Posteriormente estos resultados se
were concentrate in a bar chart that shows
concentraron en un gráfico de barras que nos
the percentage of hemolysis and
muestra el porcentaje de hemolisis y de
transformation of the erythrocyte membrane
estabilidad de la membrana eritrocitaria al
when relating the added concentration of
relacionar la concentración añadida de AINE
NSAIDs and the hemolysis factor. It was
y el factor de hemolisis. Se llegó a la
concluded that in heat conditions it is
conclusión de que en condiciones de calor es
preferable to increase the dose of the drug
preferible aumentar la dosis del fármaco y
and when it was subjected to pressure it was
cuando se sometió a presión fue favorecido
favored to decrease the concentration of the
disminuir la concentración del principio
active principle.
activo.
Resumen.

la técnica de “in vitro” es un procedimiento de


Introducción: El conocimiento científico
los más utilizadas en las ciencias biomédicas surge de la aplicación del método científico.
ya que permite estudiar un Este último se fundamenta en la observación
fenómeno fuera de un organismo vivo, el cual de un fenómeno natural, la formulación de
una hipótesis y la verificación de esta a experimental en un subconjunto de las partes
través de experimentos. El experimento es constitutivas de un organismo. (Akram &
una situación generalmente controlada en la Aftab, 2009).
cual se reproduce el fenómeno observado. Si Tiende a enfocarse en órganos, tejidos,
bien experimentalmente intentamos células, componentes celulares, proteínas y/o
acercarnos a la situación real en la que fue biomoléculas. Es más apropiada para deducir
observado dicho fenómeno, la multitud de un mecanismo de acción, con menos
variables existentes hace que a muchas de variables y reacciones amplificadas. (Aguirre,
ellas no las podamos conocer, o más aún, et. al. 2010)
que ni sospechemos su presencia. En el
mejor de los casos, estas variables Todos los organismos se encuentran
desconocidas o incontrolables pueden no ser constantemente expuestos a compuestos y
las determinantes del fenómeno, pero en elementos químicos que no pueden utilizar
otros casos pueden ser las que condicionen como alimento y serían dañinos si se
la respuesta de nuestro sistema y las acumularan en sus células, ya que no
estemos ignorando (1). tendrían una función metabólica. Estos
Cada ciencia tiene sus modelos para el compuestos potencialmente dañinos son
estudio de los fenómenos. Así, las ciencias llamados xenobioricos. Los xenobióticos
biomédicas se basan en diferentes modelos como las drogas sintéticas, los venenos
experimentales para poner a prueba las naturales y los antibióticos son detoxificados
hipótesis: modelos in vivo, in vitro e in silico. por un conjunto de enzimas xenobióticas‐
Los ensayos in vivo son aquellos en los metabolizadoras. En los humanos, esto
cuales hacemos el estudio en las condiciones incluye a las citocromo oxidasas P450, las
más próximas al fenómeno observado, por UDP‐glucuroniltransferasas y las glutatión‐S‐
ejemplo un ensayo clínico (1). Como transferasas (Akram & Aftab, 2009)
contracara de los estudios in vivo se
encuentran los estudios in vitro, los cuales La interpretación de los resultados de
intentan simular las condiciones naturales en estudios in vitro de metabolización
que se realizó la observación o al menos representa la etapa más delicada y requiere
aproximarse a las condiciones aplicadas en la consideración de diversos parámetros en
los experimentos in vivo. Estos experimentos el análisis. Entre estos parámetros
son herramientas adecuadas para el estudio necesarios se incluyen, entre otros, la
de mecanismos involucrados en los presencia de metabolitos activos, la
fenómenos observados. Sin embargo, un existencia de vías metabólicas accesorias y
estudio in vitro muestra parcialmente el el polimorfismo genético. Esta información
mecanismo en estudio (1). La creación o debe, a su vez, complementarse con datos
simulación de modelos experimentales que obtenidos en seres humanos, como la
se recrean en sistemas tales como las determinación de la concentración circulante
computadoras, son llamados modelos in del medicamento y sus metabolitos, las
silico(2). concentraciones de enzimas hepáticas, las
vías de eliminación del medicamento y su
índice terapéutico. (Akram & Aftab, 2009)
Fundamento.

In vitro (latín: dentro del vidrio) se refiere a La Fragilidad Globular o también conocida
una técnica para realizar un determinado como la fragilidad osmótica del eritrocito, es
experimento en un tubo de ensayo, o la resistencia globular que presentan los
generalmente en un ambiente controlado glóbulos rojos frente a soluciones hipotónicas
fuera del organismo vivo. Muchos o hipertónicas, además compara la
experimentos en biología celular son llevados resistencia de los eritrocitos normales y la de
a cabo fuera del organismo, en células. patológicos (Fernandez, 2004).
Porque las condiciones a veces pueden no
corresponder a las condiciones dentro del La prueba de fragilidad osmótica, se basa en
organismo, los experimentos in vitro pueden la medición de la hemólisis de los eritrocitos
ser poco exactos. Este tipo de investigación en condiciones de estrés osmótico, y permite
apunta a describir los efectos de una variable evaluar las propiedades de las membranas
citoplasmáticas y el efecto en el volumen La principal ventaja de trabajar en vitro es
intracelular. La osmosis es la difusión de que permite un enorme nivel de la
agua de un medio con menor concentración simplificación del sistema bajo estudio, por lo
de solutos hacia medios con mayor que el investigador puede centrarse en un
concentración de solutos a través de una pequeño número de componentes. Por
membrana semipermeable, para lograr un ejemplo, la identidad de las proteínas del
equilibrio de concentraciones a ambos lados sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos), y
de la membrana (Fernandez, 2004). el mecanismo por el cual se reconocen y se
Suspendidos en la solución del NaCI en unen a los antígenos extraños, seguiría
concentraciones decrecientes, y tendiéndose siendo muy oscuro si no fuera por el uso
una hemólisis inicial (Hi) cuando empieza a extensivo del trabajo in vitro para aislar las
haber cambio de color en el tubo y una proteínas, identificar las células y los genes
hemólisis total (Ht) cuando no se observa que las producen, el estudio de la física
sedimento, a continuación, se presenta propiedades de su interacción con los
valores de referencia en la altura y costa antígenos, e identificar cómo las
(Fernandez, 2004). interacciones conducen a las señales
celulares que activan otros componentes del
●Valores a nivel del mar: hemólisis inicial 4 sistema inmune. (Aguirre, et. al. 2010)
g%, y hemólisis terminal 3 g%.

●Valores en la altura hemólisis inicial 4.6 - Desventajas


4.0 g% y hemólisis terminal 3.6 - 3.0 g %.
-Simplicidad: Información a veces parcial
La prueba de fragilidad osmótica es muy útil -Dificultad de interpretación de los resultados
para el diagnóstico diferencial de anemias -Dificultad para extrapolar al hombre
hemolíticas hereditarias caracterizadas por la -No sustituyen del todo los ensayos in vivo
destrucción acelerada de los eritrocitos (Geli, -No se pueden detectar efectos secundarios
et. al. 2015). -Necesidad de validación formal
-Todavía no están aceptados legalmente, ni
incorporados en los protocolos oficiales para
Ventajas el registro de nuevos fármacos

-Se evitan interferencias de la respuesta del


organismo La principal desventaja de los estudios
-Versatilidad en el diseño experimental experimentales in vitro es que a veces puede
-Ahorro de tiempo y coste económico ser muy difícil extrapolar a partir de los
-Posibilidad de automatización, robotización, resultados de ensayos in vitro de trabajo de
miniaturización nuevo a la biología del organismo intacto.
-Necesidad de poca cantidad de producto en Los investigadores hacen en el trabajo in
estudio vitro debe ser cuidadoso para evitar la mala
-Se puede utilizar material biológico humano interpretación de sus resultados, a veces
-Reducción del número de animales. puede llevar a conclusiones erróneas acerca
de organismos y biología de sistemas.
(Aguirre, et. al. 2010)
eritrocitos bajo diferentes temperaturas y
concentración iónica del medio acuoso.
Objetivos. Evaluar la capacidad
antiinflamatoria in vitro de un fármaco o Hipótesis.
medicamento, empleando la prueba de
estabilidad de membrana bajo las variables Realizar un experimento en un ambiente
de temperatura y concentración iónica del controlado fuera del organismo vivo, cual es
el efecto de fármacos antiinflamatorios sobre
medio acuoso. Preparar diferentes las células de este modelo sometidas en
concentraciones de un fármaco o diferentes ambientes tanto de temperatura y
medicamento antiinflamatorio. Efecto de la concentraciones de las soluciones.
concentración sobre la membrana de los
Evaluación in-vitro de la actividad anti-
Metodología. inflamatoria en el método de
estabilización de la membrana por
Fase de preparación
hemolisis inducida con calor:
1) Extraer una muestra sanguínea en un tubo
9) Se incuban a 56 °C durante 30 min los
de EDTA.
tubos que contenían 0.5ml de la solución al
2) Preparar 10ml de una solución al 10% de 10% de glóbulos rojos con las diferentes
eritrocitos en NaCl 0.9%. sustancias a las mismas concentraciones del
experimento anterior y luego se enfrían a
3) Preparar una solución madre de 1000 temperatura ambiente.
µg/ml del antiinflamatorio en solución salina y
tomar de esta para hacer las diluciones 10) Se centrifugan a 2500 rpm durante 5 min,
correspondientes. y se mide la absorbancia del sobrenadante a
560 nm.
Fase de evaluación in-vitro de la actividad
anti-inflamatoria en la prueba de 11) De manera similar al experimento
estabilización de membrana por hemolisis anterior, se emplea como control negativo un
inducida con solución hipotónica: tubo con 0.5ml de la solución de glóbulos
rojos más 1 ml de solución salina fisiológica
4) Realizar un una mezcla de reacción con que corresponde al 100% de la hemolisis.
1mL de las sustancias a probar a diferentes
concentraciones (50, 100, 200 y 400 µg/ml) 12) Como estándar farmacológico se usa
con 0.5 mL de la solución al 10% de glóbulos diclofenaco (100g/ml) como grupo
rojos. estabilizador de la membrana.

5) Adicionar 1mL de buffer de fosfato pH 7.4 13) Se calcula el % de hemolisis como un


más 1mL de solución hipotónica (0.3% p/v). indicativo de estabilización de la membrana
Se incuba a 37°C por 30 min y se centrifuga con la siguiente fórmula:
a 2,500 rpm durante 20 min.
% 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ó 𝐴 =
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
6) Este mismo procedimiento se emplea (𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
× 100
como control negativo un tubo con 1ml de
NaCl 0.9%, 0.5 mL de solución de glóbulos % de estabilidad de la membrana = 100
rojos + 1ml de buffer de fosfato pH 7.4 más
1mL de solución hipotónica (0.3% p/v).

7) Se lee la absorbancia del sobrenadante a


560 nm para medir el contenido de
hemoglobina.

8) Se calcula el % de hemolisis como un


indicativo de estabilización de la membrana
con la siguiente fórmula:

% 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ó 𝐴 =
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
× 100

% de estabilidad de la membrana = 100 - A


En la tercera fila correspondiente a
ibuprofeno se realizaron las lecturas de
absorbancia en dos espectrofotómetros
distintos.

La absorbancia del control para la hemólisis


por temperatura se obtuvo de promediar los
valores obtenidos por los equipos (igual a
0.567). Mientras que el control para la
solución hipotónica fue tomado de
experiencia previa como 0.250.

Equipo Control 62 125 250 500


µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
Paracetamol 0.501 0.092 0.100 0.111 0.091
+56ºC
Paracetamol 0.132 0.104 0.133 0.124 0.139
+ NaCl 0.3%
Ibuprofeno 0.910 0.118 0.186 0.121 0.176
+56ºC 0.164 0.750 0.820 0.135 0.760
Análisis estadístico. Ibuprofeno 0.108 0.103 0.093 0.099 0.107
+ NaCl 0.3%
Paracetamol+ 0.091 0.121 - - 0.146
El análisis de la actividad hemolítica dada por Ibuprofeno + 0.084 - - 0.108
NaCl 0.3%
alta temperatura y por la solución hipotónica Paracetamol+ 0.685 0.352 - - 0.355
de cloruro de sodio al 0.3% se calculó por Ibuprofeno + 0.338 - - 0.377
medio de una fórmula matemática dada con 56ºC
Paracetamol+ 0.175 - 0.152 0.211 -
anterioridad. Ibuprofeno + - 0.178 0.166 -
Los valores de absorbancia de las muestras 56ºC
fueron promediados. Dentro de las Tabla 1. Absorbancias según la dosis administrada de
absorbancias obtenidas por dos distintos AINE
espectrofotómetros en el ibuprofeno con
prueba de temperatura se tomaron en cuenta Se promediaron los datos de absorbancia
sólo los valores del espectrofotómetro 1, obtenidos para el mismo factor de hemólisis y
puesto que fueron los más congruentes con misma concentración de AINE. Con los
los valores obtenidos por otros equipos en resultados obtenidos se calculó el porcentaje
las mismas condiciones. de hemólisis de los eritrocitos presentes en
El control para la hemólisis por solución de
los tubos con diferente concentración de
NaCl fue descartado por no ser congruente
con el resto de los datos. AINE, a partir de la siguiente fórmula:
El porcentaje de hemólisis y de estabilidad de
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
la membrana eritrocitaria se muestra en dos %𝐻𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = × 100
gráficos de barras (Gráfico 1 y 2) dónde se 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
relacionan la concentración añadida de AINE
La tabla 2 muestra los porcentajes de
el AINE añadido y el factor de hemólisis
(calor o solución hipotónica). hemólisis de los eritrocitos, obtenidos por
todos los equipos.
Resultados
Equipo 62 µg/ml 125 250 500
µg/ml µg/ml µg/ml
En la tabla 1 se muestran los valores de las Paracetamol 39.15% 22.22% 28.39% 39.32%
absorbancias obtenidas por la hemoglobina +56ºC
Paracetamol 45% 53.2% 49.6% 57%
presente debido a la hemólisis de los + NaCl 0.3%
Ibuprofeno 40.21% 32.09% 25.30% 48.76%
eritrocitos. Dicha hemólisis fue causada por +56ºC
dos distintos factores presentados en la Ibuprofeno 37.4% 37.2% 39.6% 43%
+ NaCl 0.3%
tabla, por calentamiento a 56°C y por Paracetamol+ 45% - - 57%
disolución en una solución hipotónica de Ibuprofeno + 37.4% - - 43%
NaCl 0.3%
NaCl 0.3%. Paracetamol+ 39.15% - - 39.32%
Ibuprofeno + 40.21% - - 48.76%
56ºC 90.00%
Paracetamol+ - 22.22% 28.4% - 80.00%

% de estabilidad
Ibuprofeno + - 32.09% 25.3% - 70.00%
56ºC 60.00%
Tabla 2. Porcentaje de hemólisis en los eritrocitos 50.00%
40.00%
60.00% 30.00%
20.00%
% de hemólisis

50.00%
40.00% 10.00%
30.00% 0.00%
20.00%
10.00%
0.00%
Parectamol 56°C
Concentración del AINE
Ibuprofeno 56°C Parectamol 56°C
Ibuprofeno 56°C
Parectamol 0.3%
Concentración del AINE Parectamol 0.3% NaCl
NaCl Ibuprofeno 0.3% NaCl
Gráfico 1. % de hemólisis de los eritrocitos, según la
dosis administrada de AINE.
Gráfico 2. % de estabilidad de la membrana de los
eritrocitos, según la dosis administrada de AINE.
A partir de los resultados de porcentaje de
hemólisis obtenidos, se calculó el porcentaje Discusión.
de estabilidad de la membrana de los
eritrocitos presentes en los tubos con Un modelo in vitro es una técnica para
diferente concentración de AINE, a partir de realizar un determinado experimento en un
tubo de ensayo, o generalmente en un
la siguiente fórmula:
ambiente controlado fuera del organismo
%𝐸𝑠𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑎 = 100 − % 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 vivo, de esta forma realizamos la práctica,
haciendo una solución de eritrocitos al
La tabla 3 muestra los porcentajes de hipotónica 0.3% y otra por calor,
estabilidad de membrana de los eritrocitos, comparamos los resultados con todo el grupo
para observar cuales fueron los resultados
obtenidos por todos los equipos. correspondientes y de lo que se obtuvo se
hicieron varias aclaraciones, primero que el
Equipo 62 µg/ml 125 250 500
µg/ml µg/ml µg/ml método por la prueba de estabilización de
Paracetamol 60.85% 77.78% 71.61% 60.68% membrana por hemolisis inducida con calor,
+56ºC también se localizaron muchas variantes, se
Paracetamol 55% 46.8% 50.4% 43%
+ NaCl 0.3% discutió que había que bajar el porcentaje de
Ibuprofeno 59.78% 67.90% 74.69% 51.23% solución salina, para haber obtenido un mejor
+56ºC
resultado, se observó que a altas
Ibuprofeno 62.6% 62.8% 60.4% 57%
+ NaCl 0.3% temperaturas favorece el aumento de la
Paracetamol+ 55% - - 43% dosis, al final todo se promedió en una parte
Ibuprofeno + 62.6% - - 57%
NaCl 0.3%
por solución hipotónica y otra por calor, y se
Paracetamol+ 60.85% - - 60.68% cambió el control para los cálculos, tomando
Ibuprofeno + 59.78% - - 51.23% como estándar un valor de 0.250.
56ºC
Paracetamol+ - 77.77% 71.6% -
Ibuprofeno + - 67.91% 74.7% -
56ºC
Tabla 3. Porcentaje de estabilidad de los eritrocitos
Conclusión: cuando se someten eritrocitos a
altas temperaturas, la concentración de los
antiinflamatorios debe ser considerablemente
grande, mientras que la concentración
para los sometidos a soluciones hipotónicas
debe ser baja.
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