PRÁCTICA No.

4 “MODELOS IN VITRO”

Yoval Colorado Paola, Hernández Chávez Julio Vladimir, Méndez Gómez Luis
Ángel, García Peña Isaí.
Facultad de Química Farmacéutica Biológica, Campus Xalapa, Universidad Veracruzana.
Yovalcolorado@gmail.com

Palabras clave: antinflamatorio, in vitro, estabilidad de membrana.

Abstract. se encuentra bajo condiciones controladas

the in vitro technique is a procedure in the
biomedical sciences. this allows us to study a
phenomenon outside of the living organism
with conditions under control, they try to be
as close as possible to the conditions of a
living organism. the objective of this practice
was in vitro model for evaluate the anti-
inflammatory effect of two most used drugs.
to do it we needed blood cells, these were
subbmitted to pressure and heat conditions
with the drug inside of a test tube.
The results obtained are shown in a table that
show us the relationship between the
protective effect on the erythrocyte
membrane which was measured with the
absorbance of hemoglobin released by the
hemolysis of erythrocytes. next these results
were concentrate in a bar chart that shows
the percentage of hemolysis and
transformation of the erythrocyte membrane
when relating the added concentration of
NSAIDs and the hemolysis factor. It was
concluded that in heat conditions it is
preferable to increase the dose of the drug
and when it was subjected to pressure it was
favored to decrease the concentration of the
active principle.
Resumen.
que intentan ser las más cercanas a las del
organismo. El objetivo de esta práctica fue
crear un modelo in vitro para estudiar el
efecto antiinflamatorio de dos de los
fármacos más utilizados en la población.
Para esto se necesitó de células sanguíneas
las cuales se sometieron a diferentes
condiciones de calor y de presión osmótica
dentro de un tubo de ensaye donde se
adiciono igualmente el principio activo con el
fin de evaluar su
efecto ante tales condiciones. Los datos
obtenidos fueron recapitulados en una tabla
que muestra el efecto “protector” de fármaco
a la membrana de los eritrocitos, el cual se
pudo determinar por espectrofotometría, al
obtener la absorbancia de la hemoglobina
que se liberó por la hemolisis de estos.
Posteriormente estos resultados se
concentraron en un gráfico de barras que nos
muestra el porcentaje de hemolisis y de
estabilidad de la membrana eritrocitaria al
relacionar la concentración añadida de AINE
y el factor de hemolisis. Se llegó a la
conclusión de que en condiciones de calor es
preferible aumentar la dosis del fármaco y
cuando se sometió a presión fue favorecido
disminuir la concentración del principio
activo.

la técnica de “in vitro” es un procedimiento de

Introducción: El conocimiento científico
los más utilizadas en las ciencias biomédicas surge de la aplicación del método científico.
ya que permite estudiar un Este último se fundamenta en la observación
fenómeno fuera de un organismo vivo, el cual de un fenómeno natural, la formulación de
una hipótesis y la verificación de esta a
través de experimentos. El experimento es
una situación generalmente controlada en la
cual se reproduce el fenómeno observado. Si
bien experimentalmente intentamos
acercarnos a la situación real en la que fue
observado dicho fenómeno, la multitud de
variables existentes hace que a muchas de
ellas no las podamos conocer, o más aún,
que ni sospechemos su presencia. En el
mejor de los casos, estas variables
desconocidas o incontrolables pueden no ser
las determinantes del fenómeno, pero en
otros casos pueden ser las que condicionen
la respuesta de nuestro sistema y las
estemos ignorando (1).
Cada ciencia tiene sus modelos para el
estudio de los fenómenos. Así, las ciencias
biomédicas se basan en diferentes modelos
experimentales para poner a prueba las
hipótesis: modelos in vivo, in vitro e in silico.
Los ensayos in vivo son aquellos en los
cuales hacemos el estudio en las condiciones
más próximas al fenómeno observado, por
ejemplo un ensayo clínico (1). Como
contracara de los estudios in vivo se
encuentran los estudios in vitro, los cuales
intentan simular las condiciones naturales en
que se realizó la observación o al menos
aproximarse a las condiciones aplicadas en
los experimentos in vivo. Estos experimentos
son herramientas adecuadas para el estudio
de mecanismos involucrados en los
fenómenos observados. Sin embargo, un
estudio in vitro muestra parcialmente el
mecanismo en estudio (1). La creación o
simulación de modelos experimentales que
se recrean en sistemas tales como las
computadoras, son llamados modelos in
silico(2).
Fundamento.
In vitro (latín: dentro del vidrio) se refiere a
una técnica para realizar un determinado
experimento en un tubo de ensayo, o
generalmente en un ambiente controlado
fuera del organismo vivo. Muchos
experimentos en biología celular son llevados
a cabo fuera del organismo, en células.
Porque las condiciones a veces pueden no
corresponder a las condiciones dentro del
organismo, los experimentos in vitro pueden
ser poco exactos. Este tipo de investigación
apunta a describir los efectos de una variable
experimental en un subconjunto de las partes
constitutivas de un organismo. (Akram &
Aftab, 2009).
Tiende a enfocarse en órganos, tejidos,
células, componentes celulares, proteínas y/o
biomoléculas. Es más apropiada para deducir
un mecanismo de acción, con menos
variables y reacciones amplificadas. (Aguirre,
et. al. 2010)
Todos los organismos se encuentran
constantemente expuestos a compuestos y
elementos químicos que no pueden utilizar
como alimento y serían dañinos si se
acumularan en sus células, ya que no
tendrían una función metabólica. Estos
compuestos potencialmente dañinos son
llamados xenobioricos. Los xenobióticos
como las drogas sintéticas, los venenos
naturales y los antibióticos son detoxificados
por un conjunto de enzimas xenobióticas‐
metabolizadoras. En los humanos, esto
incluye a las citocromo oxidasas P450, las
UDP‐glucuroniltransferasas y las glutatión‐S‐
transferasas (Akram & Aftab, 2009)
La interpretación de los resultados de
estudios in vitro de metabolización
representa la etapa más delicada y requiere
la consideración de diversos parámetros en
el análisis. Entre estos parámetros
necesarios se incluyen, entre otros, la
presencia de metabolitos activos, la
existencia de vías metabólicas accesorias y
el polimorfismo genético. Esta información
debe, a su vez, complementarse con datos
obtenidos en seres humanos, como la
determinación de la concentración circulante
del medicamento y sus metabolitos, las
concentraciones de enzimas hepáticas, las
vías de eliminación del medicamento y su
índice terapéutico. (Akram & Aftab, 2009)
La Fragilidad Globular o también conocida
como la fragilidad osmótica del eritrocito, es
la resistencia globular que presentan los
glóbulos rojos frente a soluciones hipotónicas
o hipertónicas, además compara la
resistencia de los eritrocitos normales y la de
patológicos (Fernandez, 2004).
La prueba de fragilidad osmótica, se basa en
la medición de la hemólisis de los eritrocitos
en condiciones de estrés osmótico, y permite
evaluar las propiedades de las membranas
citoplasmáticas y el efecto en el volumen
intracelular. La osmosis es la difusión de
agua de un medio con menor concentración
de solutos hacia medios con mayor
concentración de solutos a través de una
membrana semipermeable, para lograr un
equilibrio de concentraciones a ambos lados
de la membrana (Fernandez, 2004).
Suspendidos en la solución del NaCI en
concentraciones decrecientes, y tendiéndose
una hemólisis inicial (Hi) cuando empieza a
haber cambio de color en el tubo y una
hemólisis total (Ht) cuando no se observa
sedimento, a continuación, se presenta
valores de referencia en la altura y costa
(Fernandez, 2004).
●Valores a nivel del mar: hemólisis inicial 4
g%, y hemólisis terminal 3 g%.
●Valores en la altura hemólisis inicial 4.6 -
4.0 g% y hemólisis terminal 3.6 - 3.0 g %.
La prueba de fragilidad osmótica es muy útil
para el diagnóstico diferencial de anemias
hemolíticas hereditarias caracterizadas por la
destrucción acelerada de los eritrocitos (Geli,
et. al. 2015).
Ventajas
-Se evitan interferencias de la respuesta del
organismo
-Versatilidad en el diseño experimental
-Ahorro de tiempo y coste económico
-Posibilidad de automatización, robotización,
miniaturización
-Necesidad de poca cantidad de producto en
estudio
-Se puede utilizar material biológico humano
-Reducción del número de animales.
Objetivos. Evaluar la capacidad
antiinflamatoria in vitro de un fármaco o
medicamento, empleando la prueba de
estabilidad de membrana bajo las variables
de temperatura y concentración iónica del
medio acuoso. Preparar diferentes
concentraciones de un fármaco o diferentes ambientes tanto de temperatura y
medicamento antiinflamatorio. Efecto de la
concentración sobre la membrana de los
La principal ventaja de trabajar en vitro es
que permite un enorme nivel de la
simplificación del sistema bajo estudio, por lo
que el investigador puede centrarse en un
pequeño número de componentes. Por
ejemplo, la identidad de las proteínas del
sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos), y
el mecanismo por el cual se reconocen y se
unen a los antígenos extraños, seguiría
siendo muy oscuro si no fuera por el uso
extensivo del trabajo in vitro para aislar las
proteínas, identificar las células y los genes
que las producen, el estudio de la física
propiedades de su interacción con los
antígenos, e identificar cómo las
interacciones conducen a las señales
celulares que activan otros componentes del
sistema inmune. (Aguirre, et. al. 2010)
Desventajas
-Simplicidad: Información a veces parcial
-Dificultad de interpretación de los resultados
-Dificultad para extrapolar al hombre
-No sustituyen del todo los ensayos in vivo
-No se pueden detectar efectos secundarios
-Necesidad de validación formal
-Todavía no están aceptados legalmente, ni
incorporados en los protocolos oficiales para
el registro de nuevos fármacos
La principal desventaja de los estudios
experimentales in vitro es que a veces puede
ser muy difícil extrapolar a partir de los
resultados de ensayos in vitro de trabajo de
nuevo a la biología del organismo intacto.
Los investigadores hacen en el trabajo in
vitro debe ser cuidadoso para evitar la mala
interpretación de sus resultados, a veces
puede llevar a conclusiones erróneas acerca
de organismos y biología de sistemas.
(Aguirre, et. al. 2010)
eritrocitos bajo diferentes temperaturas y
concentración iónica del medio acuoso.
Hipótesis.
Realizar un experimento en un ambiente
controlado fuera del organismo vivo, cual es
el efecto de fármacos antiinflamatorios sobre
las células de este modelo sometidas en
concentraciones de las soluciones.

Metodología.
Fase de preparación
1) Extraer una muestra sanguínea en un tubo
de EDTA.
2) Preparar 10ml de una solución al 10% de
eritrocitos en NaCl 0.9%.
3) Preparar una solución madre de 1000
µg/ml del antiinflamatorio en solución salina y
tomar de esta para hacer las diluciones
correspondientes.
Fase de evaluación in-vitro de la actividad
anti-inflamatoria en la prueba de
estabilización de membrana por hemolisis
inducida con solución hipotónica:
4) Realizar un una mezcla de reacción con
1mL de las sustancias a probar a diferentes
concentraciones (50, 100, 200 y 400 µg/ml)
con 0.5 mL de la solución al 10% de glóbulos
rojos.
Evaluación in-vitro de la actividad anti-
inflamatoria en el método de
estabilización de la membrana por
hemolisis inducida con calor:
9) Se incuban a 56 °C durante 30 min los
tubos que contenían 0.5ml de la solución al
10% de glóbulos rojos con las diferentes
sustancias a las mismas concentraciones del
experimento anterior y luego se enfrían a
temperatura ambiente.
10) Se centrifugan a 2500 rpm durante 5 min,
y se mide la absorbancia del sobrenadante a
560 nm.
11) De manera similar al experimento
anterior, se emplea como control negativo un
tubo con 0.5ml de la solución de glóbulos
rojos más 1 ml de solución salina fisiológica
que corresponde al 100% de la hemolisis.
12) Como estándar farmacológico se usa
diclofenaco (100g/ml) como grupo
estabilizador de la membrana.

5) Adicionar 1mL de buffer de fosfato pH 7.4 13) Se calcula el % de hemolisis como un

más 1mL de solución hipotónica (0.3% p/v).
Se incuba a 37°C por 30 min y se centrifuga
a 2,500 rpm durante 20 min.
6) Este mismo procedimiento se emplea
como control negativo un tubo con 1ml de
NaCl 0.9%, 0.5 mL de solución de glóbulos
rojos + 1ml de buffer de fosfato pH 7.4 más
1mL de solución hipotónica (0.3% p/v).
indicativo de estabilización de la membrana
con la siguiente fórmula:
% 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ó 𝐴 =
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
× 100
% de estabilidad de la membrana = 100

7) Se lee la absorbancia del sobrenadante a

560 nm para medir el contenido de
hemoglobina.

8) Se calcula el % de hemolisis como un

indicativo de estabilización de la membrana
con la siguiente fórmula:

% 𝐻𝑒𝑚𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ó 𝐴 =
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
(𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
× 100

% de estabilidad de la membrana = 100 - A

 En la tercera fila correspondiente a
ibuprofeno se realizaron las lecturas de
absorbancia en dos espectrofotómetros
distintos.

La absorbancia del control para la hemólisis

por temperatura se obtuvo de promediar los
valores obtenidos por los equipos (igual a
0.567). Mientras que el control para la
solución hipotónica fue tomado de
experiencia previa como 0.250.

Equipo Control 62 125 250 500

µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
Paracetamol 0.501 0.092 0.100 0.111 0.091
+56ºC
Paracetamol 0.132 0.104 0.133 0.124 0.139
+ NaCl 0.3%
Ibuprofeno 0.910 0.118 0.186 0.121 0.176
+56ºC 0.164 0.750 0.820 0.135 0.760
Análisis estadístico. Ibuprofeno 0.108 0.103 0.093 0.099 0.107
+ NaCl 0.3%
Paracetamol+ 0.091 0.121 - - 0.146
El análisis de la actividad hemolítica dada por Ibuprofeno + 0.084 - - 0.108
NaCl 0.3%
alta temperatura y por la solución hipotónica Paracetamol+ 0.685 0.352 - - 0.355
de cloruro de sodio al 0.3% se calculó por Ibuprofeno + 0.338 - - 0.377
medio de una fórmula matemática dada con 56ºC
Paracetamol+ 0.175 - 0.152 0.211 -
anterioridad. Ibuprofeno + - 0.178 0.166 -
Los valores de absorbancia de las muestras 56ºC
fueron promediados. Dentro de las Tabla 1. Absorbancias según la dosis administrada de
absorbancias obtenidas por dos distintos AINE
espectrofotómetros en el ibuprofeno con
prueba de temperatura se tomaron en cuenta Se promediaron los datos de absorbancia
sólo los valores del espectrofotómetro 1, obtenidos para el mismo factor de hemólisis y
puesto que fueron los más congruentes con misma concentración de AINE. Con los
los valores obtenidos por otros equipos en resultados obtenidos se calculó el porcentaje
las mismas condiciones. de hemólisis de los eritrocitos presentes en
El control para la hemólisis por solución de
los tubos con diferente concentración de
NaCl fue descartado por no ser congruente
con el resto de los datos. AINE, a partir de la siguiente fórmula:
El porcentaje de hemólisis y de estabilidad de
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
la membrana eritrocitaria se muestra en dos %𝐻𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = × 100
gráficos de barras (Gráfico 1 y 2) dónde se 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
relacionan la concentración añadida de AINE
La tabla 2 muestra los porcentajes de
el AINE añadido y el factor de hemólisis
(calor o solución hipotónica). hemólisis de los eritrocitos, obtenidos por
todos los equipos.
Resultados
Equipo 62 µg/ml 125 250 500
µg/ml µg/ml µg/ml
En la tabla 1 se muestran los valores de las Paracetamol 39.15% 22.22% 28.39% 39.32%
absorbancias obtenidas por la hemoglobina +56ºC
Paracetamol 45% 53.2% 49.6% 57%
presente debido a la hemólisis de los + NaCl 0.3%
Ibuprofeno 40.21% 32.09% 25.30% 48.76%
eritrocitos. Dicha hemólisis fue causada por +56ºC
dos distintos factores presentados en la Ibuprofeno 37.4% 37.2% 39.6% 43%
+ NaCl 0.3%
tabla, por calentamiento a 56°C y por Paracetamol+ 45% - - 57%
disolución en una solución hipotónica de Ibuprofeno + 37.4% - - 43%
NaCl 0.3%
NaCl 0.3%. Paracetamol+ 39.15% - - 39.32%
Ibuprofeno + 40.21% - - 48.76%
56ºC 90.00%
Paracetamol+ - 22.22% 28.4% - 80.00%

% de estabilidad
Ibuprofeno + - 32.09% 25.3% - 70.00%
56ºC 60.00%
Tabla 2. Porcentaje de hemólisis en los eritrocitos 50.00%
40.00%
60.00% 30.00%
20.00%
% de hemólisis

50.00%
40.00% 10.00%
30.00% 0.00%
20.00%
10.00%
0.00%
Parectamol 56°C
Concentración del AINE
Ibuprofeno 56°C Parectamol 56°C
Ibuprofeno 56°C
Parectamol 0.3%
Concentración del AINE Parectamol 0.3% NaCl
NaCl Ibuprofeno 0.3% NaCl
Gráfico 1. % de hemólisis de los eritrocitos, según la
dosis administrada de AINE.
Gráfico 2. % de estabilidad de la membrana de los
eritrocitos, según la dosis administrada de AINE.
A partir de los resultados de porcentaje de
hemólisis obtenidos, se calculó el porcentaje Discusión.
de estabilidad de la membrana de los
eritrocitos presentes en los tubos con Un modelo in vitro es una técnica para
diferente concentración de AINE, a partir de realizar un determinado experimento en un
tubo de ensayo, o generalmente en un
la siguiente fórmula:
ambiente controlado fuera del organismo
%𝐸𝑠𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑎 = 100 − % 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 vivo, de esta forma realizamos la práctica,
haciendo una solución de eritrocitos al
La tabla 3 muestra los porcentajes de hipotónica 0.3% y otra por calor,
estabilidad de membrana de los eritrocitos, comparamos los resultados con todo el grupo
para observar cuales fueron los resultados
obtenidos por todos los equipos. correspondientes y de lo que se obtuvo se
hicieron varias aclaraciones, primero que el
Equipo 62 µg/ml 125 250 500
µg/ml µg/ml µg/ml método por la prueba de estabilización de
Paracetamol 60.85% 77.78% 71.61% 60.68% membrana por hemolisis inducida con calor,
+56ºC también se localizaron muchas variantes, se
Paracetamol 55% 46.8% 50.4% 43%
+ NaCl 0.3% discutió que había que bajar el porcentaje de
Ibuprofeno 59.78% 67.90% 74.69% 51.23% solución salina, para haber obtenido un mejor
+56ºC
resultado, se observó que a altas
Ibuprofeno 62.6% 62.8% 60.4% 57%
+ NaCl 0.3% temperaturas favorece el aumento de la
Paracetamol+ 55% - - 43% dosis, al final todo se promedió en una parte
Ibuprofeno + 62.6% - - 57%
NaCl 0.3%
por solución hipotónica y otra por calor, y se
Paracetamol+ 60.85% - - 60.68% cambió el control para los cálculos, tomando
Ibuprofeno + 59.78% - - 51.23% como estándar un valor de 0.250.
56ºC
Paracetamol+ - 77.77% 71.6% -
Ibuprofeno + - 67.91% 74.7% -
56ºC
Tabla 3. Porcentaje de estabilidad de los eritrocitos
Conclusión: cuando se someten eritrocitos a
altas temperaturas, la concentración de los
antiinflamatorios debe ser considerablemente
grande, mientras que la concentración
para los sometidos a soluciones hipotónicas
debe ser baja.
Bibliografía.

1.- Fina, B. Lombarte, M. Rigalli, A. (2013).

INVESTIGACIÓN DE UN FENÓMENO
NATURAL: ¿ESTUDIOS IN VIVO, IN VITRO
O IN SILICO? Actualizaciones de osteología:
Vol. 9 (no. 3).

2.- Scior. T. Martínez, E. Salinas, E. (2007).

Los modelos in silico, una herramienta para
el conocimiento farmacológico. Elementos:
vol. 68; 45-48.

3. Alanes Fernandez, A. M. (2004, vol.5

[citado 2018-04-06],). Fragilidad osmótica en
sujetos con eritrocitosis de la altura, sujetos
control y ratas Sprague Dawley. Ciencia y
Medicina [online], 33-34.

4.Alonso-Geli, Yamirka, Alonso-Moreno,

Yamisleydi, Falcón-Diéguez, José E,
Lucambio-Miró, Liset, & Castro-Piñol,
Mariana. (2015). Caracterización de la
fragilidad osmótica de eritrocitos humanos en
la anemia drepanocítica. Revista Cubana de
Química, 27(2), 110-118. Recuperado en 06
de abril de 2018, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_artte
xt&pid=S2224-
54212015000200001&lng=es&tlng=es

5. Aguirre G, Jean B, Ligue L. Aplicaciones

del cultivo de tejidos en la multiplicación y
conservación de los recursos fitogenéticos.
Universidad Mayor de San Simón.
Cochabamba, Bolivia; 2010. p 55.

6. Akram M, Aftab F. An efficient method for

clonal propagation and in vitro establishment
of softwood shoots from epicormic buds of
teak (Tectona grandis L.). For Stud China.
2009; 11(2): 105-10.