Aislamiento de proteínas

Introducción

En bioquímica es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, su

estructura y de ser posible su función,. Para dicha purificación se emplean métodos
basados en sus propiedades de solubilidad. Cada proteína tiene una composición de
aminoácidos específica que las hace diferentes unas de otras y,por lo tanto, su
comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas
son insolubles en agua y resistentes a la degradación enzimática, sin embargo, con
soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las proteínas globulares son
relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas
coagulan cuando se calientan. La composición de aminoácidos, es también responsable del
comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de pH. Así al acidificar o
alcalinizar una determinada proteína, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, es decir,
alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto precipitar. La leche es un producto rico en
proteínas, tales como las caseínas y globulinas, además de contener carbohidratos y ácidos
grasos. De la leche se puede separar la caseína por precipitación en su punto isoeléctrico
(pH 4.6).La caseína representan el 80% del total de la leche. Está constituida por varios
tipos de fracciones, aparecen en forma de proteína y glicoproteínas en suspensión coloidal.

La prueba de Biuret
Los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada para la valoración de
los mismos, llamada reacción de Biuret. Las proteínas por sus uniones peptídicas
reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de
color violeta.Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos
NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la
cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

Objetivos
1. Aislar la proteína caseína comprobando su presencia mediante la prueba de Biuret.
2. Comprobar el efecto de las sales neutras en las proteínas (precipitación por salado)
3. Comprobar el efecto de la temperatura sobre las proteínas.
Desarrollo
1. Calentar en un matraz 125ml de leche a 38ºC, sin retirar del baño.
2. Agregar gota a gota y con agitación ácido acético 2 N hasta obtener un
máximo de precipitado coposo (aproximadamente 25 ml)
3. Dejar reposar 15 minutos y filtrar (se obtendrá el precipitado y un
sobrenadante, GUARDE el sobrenadante para pasos posteriores y trabaje
con el precipitado).
4. Transfiera a un vaso de precipitado, agregue 20 ml de alcohol etílico, agite y
deje reposar diez minutos.
 5. Decante, deseche el sobrenadante.
9. Después del tercer lavado abra el papel filtro en la campana de extracción y
deje evaporar el éter entre 15 y 20 minutos​.(GUARDE SU MUESTRA EN
PAPEL ALUMINIO DENTRO DE UN FRASCO CON TAPA, ROTULE Y
GUARDE EN EL REFRIGERADOR HASTA LA SESIÓN SIGUIENTE)
10. Pese aproximadamente 400 mg de la caseína obtenida, transfiera al matraz
aforado con ayuda de 50-75ml de NaCl al 1%, calentar en el baño María a
38ºC y añadir la mínima cantidad posible de NaOH al 50% hasta la disolución
total, afore con agua destilada. (SOLUCIÓN PROBLEMA). ​GUARDE LA
CASEÍNA EN POLVO

11. Del sobrenadante obtenido en el paso 3 coloque un ml en el tubo de ensaye

y agregue un ml de solución saturada de sulfato de amonio, observe.
12. En un tubo de ensaye coloque un ml de sobrenadante obtenido en el paso 3 y
caliente en el baño María a ebullición, observe.

Resultados

Al agregar el ácido acético notamos una decoloración del blanco de la

leche a amarillo, y se noto una precipitación de cierto sólido blanco
con textura de queso. obtuvimos un buen precipitado y un
sobrenadante que es el suero de leche. El resultado por lo tanto fue
positivo ya que requerimos la precipitación de la caseína para
separarla de lo demás.

Interpretación de resultados y discusión

Como primer paso, se calentó la leche descremada, esto con el propósito de
obtener el precipitado de caseína, la caseína es por definición fosfoglucoproteínas
que precipitan de la leche descremada a pH 4.6 y mayor a 20°C, es decir la caseína
se asienta, o precipita, ​debido a que la acidez tiene dos efectos: En primer lugar,
según baja el pH se van rompiendo los enlaces entre los grupos fosfato y el ion
calcio, al reducirse la ionización de los fosfatos. En segundo lugar, las repulsiones
entre las micelas se reducen, al acercarse el pH al punto isoeléctrico de las
caseínas las caseínas se agregan, formando una cuajada poco mineralizada. ​A este
precipitación se le llama caseína ácida y forma la base para la elaboración de
quesos. Al calentar y agregar ácido acético hemos logrado las condiciones antes
descritas, obteniendo como sobrenadante el suero de leche.
Igualmente la adición de disolventes orgánicos, como etanol, disminuye la
solubilidad de las proteínas. La solubilidad de una proteína a un pH y fuerza iónica
determinados está en función de la constante dieléctrica del medio. Puesto que el
etanol posee una constante dieléctrica, menor que la del agua su adición a una
disolución acuosa de proteína incrementa la fuerza de atracción entre las cargas
opuestas, disminuyendo de este modo el grado de ionización de los grupos R de la
proteína. Como resultado, las moléculas de proteína tienden a agregarse y
precipitan.

Se pudo observar cambio de color en ambos, primeramente en el tubo con sulfato

de amonio se observó dos fases, quedando en la parte superior un precipitado que
posteriormente torno completamente la solución a un blanco lechoso, esto se
explica debido a que el sulfato de amonio tiene la capacidad para influir en la
solubilidad de las proteínas, lo cual está en función de su fuerza iónica. Esta
precipitación se conoce como precipitación por salado.
En el segundo tubo se observó un cambio en la coloración parecido al tubo con
sulfato de amonio, logramos desnaturalizar la proteína por acción del calor en el
suero.
Al realizar el comparativo los resultados fueron más claros en el primer tubo (sulfato
de amonio) debido a la observación de las dos fases, cosas que no pudimos
apreciar en el tubo 1, igualmente esto se vio más claramente debido al volumen de
la solución.

CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué precipita la caseína con el HCl?

Por el cambio de pH, la acidificación que protona los grupos fosfato que
solubilizan a la proteína llegando a un pH de su punto isoeléctrico.

2. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Biuret?

El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina
(gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la
formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación
de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos.
3. ¿Cuál es la explicación física de la precipitación por salado?
Interacciones ​electrolito​-no electrolito, en el cual a altas
concentraciones salinas (o alta ​fuerza iónica​) algunos solutos
como ​proteínas o ​polímeros ​precipitan debido al aumento de las
interacciones hidrofóbicas​ entre ellos.
SALTING IN Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al
incrementar la concentración de sales.
SALTING OUT Disminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la
concentración de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en la
exclusión del cosolvente, en este caso la sal.
Las proteínas precipitadas por salado retienen su conformación nativa y
pueden disolverse de nuevo, normalmente sin experimentar
desnaturalización. El sulfato amónico es el preferido para precipitar las
proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que
permite alcanzar fuerzas iónicas muy elevadas.

4. ¿Cómo afecta la
temperatura a las
proteínas?
Ocurre una
desnaturalización ya que
aumenta la energía
cinética de la proteína ,
se debilitan las
interacciones
electrostáticas más
débiles (iónicas),
puentes de hidrógeno y
fuerzas de van der
Wals.Hay una perdida de
estructura y de
 solubilidad.Puentes disulfuro:
• Interacciones covalentes
• Poco afectados por incremento de temperatura) confieren rigidez a la
estructura de la proteína)
-La caseína se asienta, o precipita, en una solución en su punto
isoeléctrico porque el polo positivo de una molécula proteica atrae
el polo negativo de otra, provocando que las moléculas se unan.
El punto isoeléctrico es el punto en el cual el número de cargas
positivas, en la molécula proteica, iguala al número de cargas
negativas. En otras palabras, es el punto en el cual la molécula
proteica es eléctricamente neutra.

Las β-lactoglobulinas son las más afectadas en estos tratamientos

(Rynne et al., 2004) proporcionando el “gusto ácido” de la leche,
mientras que las micelas de caseína son notablemente estables e
incluso a temperaturas de hasta 140 °C (Tornadijo et al., 1998).
Sin embargo, cuando se calienta por encima de los 100 ° C
puede existir una disminución del pH, que es causada por la
formación de ácidos orgánicos de la degradación de la lactosa y
la precipitación de fosfato de calcio

Reactivo Biuret

Composición de la leche
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y
vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas
cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos
(lactosa) y lípidos.En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lactoalbúminas y
lactoglobulinas
Características de la caseína
● Compone el 80% total de las
proteínas de la leche de vaca
● sólido blanco-amarillento, sin sabor
ni olor, insoluble en agua

● Es una proteína conjugada de la

leche del tipo fosfoproteína que se
separa de la leche por acidificación
y forma una masa blanca.
● Precipitan a pH 4.6 (punto
isoeléctrico) baja solubilidad y
formando un coágulo
● Existen 4 diferentes moléculas de
caseína: Alfa -caseína,Beta
caseina,kapa -caseína
● Ni la alfa ni la beta caseína son
solubles en la leche. Si se añade
la para - k - caseína a las dos
anteriores o a cada una de ellas
por separado se forma un
complejo de caseína que es
solubilizado en forma de micela.
●
● Presencia de fosfato cálcico
forman micelas estables de
caseína en equilibrio con la fase
soluble de la leche​.​La micela
está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son
fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.
● La parte hidrófoba de la caseína queda hacia adentro y la hidrofílica hacia afuera,
● El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento
en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura
secundaria. La caseína no contiene puentes disulfuro. La carencia de estructura
terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la
unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insolubles en agua

Características del suero láctico

● Líquido opaco, de color verdoso amarillento, turbio
● Producto lácteo obtenido de la separación del coágulo de la leche, mediante la
acción ácida.
 ● Se encuentran en el partículas suspendidas solubles y no solubles (proteínas,
lípidos, carbohidratos, vitaminas y minerales), y compuestos de importancia
biológica-funcional
● Suero dulce, cuando se produce a partir de acción enzimática y contiene más
lactosa.
● 2) Suero ácido, aquel que se obtiene por acción ácida, con mayor concentración de
proteínas .

COMPOSICIÓN

PROTEÍNA DESCRIPCIÓN

● Alfa - lactoalbúmina Clasificada dentro de las albúminas, esta proteína

parece estar presente en la leche de todos los
mamíferos, lo que la hace característica del suero
lácteo. Es una proteína cuyo peso molecular alcanza
los 14.200 Da aproximadamente.

● Beta-lactoglobulina

● Inmunoglobulinas En la leche son las mayores moléculas encontradas

y tienen la propiedad de transmitir inmunidad. Su
peso molecular es de aproximadamente 180.000 Da
y son las más sensibles a la desnaturalización por
temperatura.

● Lactoferrina Agente antioxidante no enzimático ,encontrado

en la fracción del suero .SE compone de
aproximadamente 700 aminoácidos residuales y
de una cadena de polipéptidos individuales con
dos sitios de unión para iones férrico

Diferencias entre caseínas y proteínas del suero láctico

L
​ a proteína de suero de leche tiene más cantidad de leucina, un 
aminoácido que ​se ha asociado​ a mayores ganancias musculares. 
La proteína de suero de leche se absorbe más rápido, es decir, provee 
aminoácidos al organismo en menor tiempo,mientras que la caseína 
ofrece lo mismo de forma moderada y a mediano- largo plazo. 
Efecto del ácido acético 2N y por qué ahí no precipitan las proteínas del suero

El ácido acético protona a los grupos fosfatos de las proteínas, es decir acidifica el pH de tal
manera que este llega a igualar el PI de la proteína y por ende precipita, como el PI varía
entre las proteínas, el ácido acético es de tipo ácido débil y este no logra igualar el punto
isoeléctrico de las proteínas del suero láctico. Estas proteínas pueden solubilizarse

Fundamento de precipitado por salado y efecto de la temperatura en proteínas del

suero láctico
La precipitación salina en un método de separación de proteínas basado en el incremento
de la fuerza iónica del medio.
Al agregar cantidades de sal en diferentes concentraciones, las moléculas de agua tienen
mejor afinidad por los iones de la sal que por las proteínas, esto hace que la capa de
solvatación en proteínas disminuya y por lo tanto las interacciones proteína-proteína
aumenten formando así el precipitado proteico.
Las proteínas requieren de concentraciones de sal diferentes, por esta razón el precipitado
por salado se considera un método de separación selectivo ya que nos permite precipitar
ciertas proteínas con concentraciones de sal específicas, usualmente se utiliza sulfato de
amonio.
Ahora bien, cuando se le estimula una cierta temperatura las proteínas se mantienen
estables en un intervalo de 0 -40 °C esto hace que sean más solubles en el medio, sin
embargo cuando sobrepasan el límite de temperatura vuelven inestables y tienden a
desnaturalizarse y precipitar
Conclusión
Se pudo aislar la proteína caseína de la leche, sin embargo no se cuantificó el
rendimiento obtenido de la proteína. A partir de distintas condiciones se favorece
predominantemente su precipitación, por medio del tratamiento de leche bajo
distintas condiciones (pH, temperatura, solventes orgánicos, etc) se logró identificar
cómo cada una de estas condiciones favorece la desnaturalización de la caseína,
tomando en cuenta las propiedades de esta proteína para hacerla más específica.
Se reconoció y se efectuó la precipitación por salado para el sobrenadante, suero de
leche, en el cual los resultados fueron favorables .
Se pudo entender el proceso por el cual a traves de distintas condiciones
desnaturalizamos la proteina
Ahorita lo sigo editando voy a bañarme, si pueden ayudarme complementando un
poco la conclusión, estoy trabada y es parte esencial del reporte, porfa.

Referencias
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Salting-in-Salting-out-precipitacion-sol
ventes.pdf​ Consultado el 30/09/18
Cardella Rosales, Lidia (2007) Bioquimica Humana.La Habana. Educación.

Gil A. (2010).Tratados de Nutrición (2 Ed) Panamericana.