UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

00 CARRERA DE INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
ENZIMOLOGÍA

Integrantes: Corredor Daniel NRC: 4535

Ger Sebastián Fecha de entrega: 11/10/2018
Pazmiño María Fernanda Práctica N°: 1
Santillán Michelle
Terán Vanessa

1. TEMA:
Actividad de la amilasa en detergente en polvo comercial
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Determinar la actividad de la amilasa en detergente en polvo comercial
2.2. Objetivos específicos
 Determinar la actividad amilasa siguiendo la reacción de hidrolisis de almidón
 Evaluar la actividad de la amilasa por medio del método del DNS y el método del yodo
 Cuantificar la enzima presente en el detergente comercial
3. MARCO TEÓRICO

Los detergentes han usado enzimas desde los 30s, basándose en enzimas pancreáticas, para luego en los 60s
se emplean enzimas de origen bacteriano (Martínez Gallegos , 2005, p. 66). Las enzimas en los detergentes
pueden estar en dos formas: liquidas o granulares. Su concentración es menor al 1%, esto debido a la gran
eficiencia que poseen, pues una sola enzima es capaz de catalizar la transformación de varias moléculas sin
consumirse en el proceso. Su papel primordial es la descomposición de las “manchas” en la ropa para que
así sea mucho más soluble al agua (Aznáres Lopez, et al., 2015, pp. 20-21).

En la actualidad las enzimas más usadas son las hidrolasas, encargadas de eliminar manchas producidas por
proteínas, lípidos y polisacáridos. Entre las hidrolasas más comunes tenemos las proteasas, amilasas,
celulasas, lipasas y enzimas redox (enzimas oxidasas o reductasas) (Martínez Gallegos , 2005, pp. 69-71).

Las amilasas, son enzimas glucolíticas capaces de hidrolizar enlaces éter de las cadenas de polisacáridos,
provocando su degradación a mono, di y oligosacáridos, fácilmente solubles en agua. Ciertos tipos de
amilasas conocidas como glucoamilasas, son capaces de degradar uniones glucosídicas α-1, 4 y α-1, 6 (De
Lera Santín, 2011, pp. 61-62).

4. METODOLOGÍA

a) Método del DNS

En primer lugar, se etiquetaron 4 tubos de ensayo, en uno se colocaron 1mL de disolución de detergente
(que contiene las enzimas como la α-amilasa) y 4mL de disolución de almidón (10 g/L) como sustrato. El
instante en el que se mezclan las dos sustancias fue tomado como tiempo cero. Posteriormente 1mL de la
mezcla se extrajo para ponerlo en contacto con el reactivo de color, DNS (Reactivo dinitrosalicílico: 1g de
ácido 3,5-dinitrosalicílico en 20mL de NaOH 2 N, y 50mL de agua. Se añadió además 30g de tartrato sódico-
potásico 4 H2O y se aforó a 100mL), en el siguiente tubo rotulado y fue medida su absorbancia a 540nm en
el espectrofotómetro. Fue repetida esta operación para medir la absorbancia de la mezcla a los 15, 30 y 60
minutos después del tiempo cero (Ávalos & Granda, 2017).

Después de que había transcurrido los tiempos anteriormente mencionados se dispuso a calentar a todos los
tubos durante 15 minutos a 85-90ºC por inmersión a baño maría. Paso seguido se añadieron 4mL de agua a
cada tubo para medir su absorbancia a la misma longitud de onda. Los datos obtenidos se compararon con
aquellos obtenidos a tiempo cero (Ávalos & Granda, 2017).

Tabla 1

Preparación de soluciones para el Método del DNS

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Blanco
t0 t15 t30 t45
Reactivo DNS
2.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(mL)
Mezcla
detergente- 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0
almidón (mL)

Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

b) Recta de calibrado

Al mismo tiempo en que se midió los datos obtenidos del procedimiento anterior, se realizó una recta de
calibrado del método DNS utilizando una solución patrón de dextrosa (4mM). Para ello se rotularon 5 tubos
de ensayo que contenían las siguientes cantidades (Ávalos & Granda, 2017):

Tabla 2

Preparación de soluciones patrón de dextrosa

Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Disolución de
0.0 0.0 0.2 0.3 0.6 0.8 1.0
dextrosa (mL)
Agua destilada
0.0 1.0 0.8 0.7 0.4 0.2 0.0
(mL)
Reactivo DNS
2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(mL)
Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)
Luego los tubos fueron incubados en baño maría a 90°C durante 15 minutos y se midió su absorbancia a
540 nm. Los datos fueron representados en una gráfica (Ávalos & Granda, 2017).

Es importante recalcar que en este método, el reactivo DNS en todo momento estuvo siempre cubierto para
que no incida la luz ni el CO2. Además el blanco de reactivo utilizado fue agua y también el reactivo de
color DNS (Ávalos & Granda, 2017).

c) Método de medida con yodo

Siguiendo un procedimiento similar que el método de DNS, se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de

disolución de detergente y 4 mL de disolución de almidón. Fue establecido este momento como tiempo
cero, se tomó 1mL de la mezcla detergente-almidón, se puso en contacto con 4 ml del agua y 0.2 mL de
reactivo de yodo (Disolución de povidona yodada 10 veces diluida) (Ávalos & Granda, 2017).

La operación anterior para cuando fueron transcurridos 15, 30, y 45 minutos y se midieron la absorbancias
de cada tiempo a 590nm usando agua como blanco de reactivo (Ávalos & Granda, 2017).

Tabla 3

Preparación de soluciones para el Método de medida con yodo

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Blanco
t0 t15 t30 t45
Mezcla
detergente- 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0
almidón (mL)
Agua destilada
2.0 4.0 4.0 4.0 4.0
(mL)
Reactivo de Yodo
0.0 0.2 0.2 0.2 0.2
(mL)

Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

Finalmente los tubos se calientan a 40 ºC por 15 minutos y se mide de nuevo las absorbancias a una longitud
de onda de 590nm.

5. RESULTADOS

Método con DNS

 Tabla 4

Resultados de absorbancia de la disolución patrón de dextrosa a 540 nm para la recta de calibración

Coloración Absorbancia Observaciones Imagen

Tubo 0 Amarillo 0,091 Sin Dextrosa

Tubo 1 Anaranjado 0,172 [Dextrosa]

0.2 mM

Tubo 2 Rojo-anaranjado 0,283 [Dextrosa]

0.4 mM

Tubo 3 Rojo-anaranjado 0,572 [Dextrosa]

0.6 mM

Tubo 4 Ladrillo 0,798 [Dextrosa]

1.2 mM

Tubo 5 Ladrillo intenso 0,998 [Dextrosa]

2 mM

Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

 Recta de calibración del método DNS

RECTA DE CALIBRACIÓN DNS CON DEXTROSA

1.2
1 y = 0.4714x + 0.1399
Abs ( 540 nm)

0.8 R² = 0.9301
0.6
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[Dextrosa] mM

Figura 1. Recta de calibración de absorbancia (540 nm) vs concentración de dextrosa (mM)

Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

𝜀 𝐴𝑏𝑠 (540 𝑛𝑚) = 0,474 𝑐𝑚−1 [Dextrosa] −1 (mM)

Tabla 5

Resultados de absorbancia de la disolución de detergente con almidón y DNS a 540 nm

Tiempo Absorbancia Color

(min) (540 nm)
0 0,054 Amarillo
15 0,436 Anaranjado
30 0,836 Anaranjado
60 1,02 ladrillo
Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

Método del DNS

1.2
1 y = 0.022x + 0.0918
Abs ( 540 nm)

R² = 0.9775
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (minutos)
 Figura 2. Grafica de Relación de los resultados de los ensayos de la mezcla almidón con detergente
(amilasa) y DNS como una dispersión de puntos de las absorbancias (540 nm) vs el tiempo de reacción
(min).
Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

De esta manera se tiene que a actividad enzimática de la amilasa es la cantidad de enzima necesaria para
producir un µmol de dextrosa por minuto, en las condiciones específicas del experimento la fórmula es:
𝐴𝑏𝑠∗𝑉𝑟 ∗1𝑐𝑚∗𝑓.𝑐
𝐴. 𝐸 = 𝑡∗𝑉𝑚 ∗𝜀540𝑛𝑚
(Condori, Garcia, Siles, & Turba, 2008).

Donde 𝑉𝑟 o volumen de reacción es de 5 ml de almidón y detergente y 𝑉𝑚 o volumen de muestra es de

1 ml de mezcla t es tiempo en minutos y 𝑓. 𝑐 factor de conversión de milimol a µmol; en la figura 2 la
gráfica de regresión lineal de Absorbancia vs tiempo sabemos que abs/t es la pendiente de la recta lo que
reemplazando quedaría:

∆Abs
∙ 5mL ∗ 1000
t (min)
𝐀(𝐄) = (μmoles/min)
1mL ∗ 0.471𝑐𝑚−1 [𝐷𝑒𝑥𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎]−1 (mM)

0.022 ∙ 5 ∗ 1000
𝐀(𝐄) = = 232,0675(μmoles/min)
0.471

Método con yodo

Tabla 6

Resultados de absorbancia de la disolución de detergente con almidón y yodo a 590 nm

Tiempo Absorbancia
(min) (590 nm)
0 1,149
15 1,142
30 1,122
45 1,05
Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)
 Método de medida con yodo
1.18

1.16
Abs (590 nm)
1.14

1.12 y = -0.0021x + 1.1633

R² = 0.8161
1.1

1.08

1.06

1.04
0 10 20 30 40 50
Tiempo (min)
Figura 3. Gráfico de relación de los resultados de los ensayos de almidón con yodo como una dispersión
de puntos de las absorbancias (590 nm) vs el tiempo de reacción (min).
Elaborado por: Corredor, Ger, Pazmiño, Santillán & Terán (2018)

La acción de la amilasa en el almidón crea azucares reductores los cuales no reaccionan con el yodo y
ello hace que el color se pierda de manera progresiva por ello la absorbancia va decreciendo con el paso del
tiempo demostrando actividad enzimática que degrada el almidón en azucares más simples, esto debido a
la pendiente negativa de la figura 3.

6. DISCUSIÓN

El ensayo enzimático con DNS reaccionando frente a azucares reducidos comprobó la presencia de amilasa
dado que este reactivo adquiere un color ladrillo característico al tener presente dextrosa, maltosa o un
azúcar reducido (Gusakov, Kondratyeva, & Sinitsyn, 2011, pp. 4-8). La pendiente de a figura 2 indica el
crecimiento de la absorbancia en función del tiempo de tal manera que la absorbancia aumento en 0,022 por
cada minuto transcurrido.

La actividad enzimática está definida como la cantidad de enzima necesaria para la formación de un micro
mol de sustrato en un minuto (Castro I. N., 2001, pp. 108-111), la figura 2 relaciona está pendiente en la
formula descrita por Condori (Condori, Garcia, Siles, & Turba, 2008, pp. 42-46) ;en este ensayo usando la
ley de Lambert y Beer se llega a determinar la cantidad de producto formado en determinado tiempo de
reacción, donde el producto formado son azucares reducidos y al obtener un coeficiente de extinción molar
de 0.471𝑐𝑚−1 [Dextrosa]−1 (mM) se obtiene que la actividad de la amilasa en detergente es de
232,0675(μmoles/min) una actividad alta en relación a la industria textil (341,7 U/mL) (Singh, Singh,
Bali, Sharma, & Mangla, 2014, pp. 34-43).

Los resultados del método del Yodo para comprobar la desaparición de un sustrato como el almidón son
igual de validos; en este caso la pendiente negativa denota actividad enzimática como la desaparición de
Reactivo en un minuto (Castro I. N., 2001), el enzima crea nuevos azucares reducidos pero al no tener una
curva de calibración no es posible obtener una actividad enzimática con la pendiente de la figura 3. Se
determina actividad enzimática experimental por el decremento de absorbancia de la mezcla con el Yodo
dado que en presencia de azucares reducidos este no demuestra coloración (Xiao, Storms, & Tsang, 2006,
p. 154).

Al comparar los datos obtenidos con aquellos presentados en el trabajo de Obón de Castro et al. (2010),
donde se manejó la misma metodología, podemos destacar que la ecuación de la recta de la curva de
calibración que se obtuvo fue: Absorbancia (540nm)=0,2385[Maltosa (mM)] y la obtenida en el presente
informe fue: Absorbancia (540nm)=0.4714 [Dextrosa (mM)] + 0.1399 (Castro & otros, 2010, p. 9). Los
datos obtenidos no son similares pero tienen la misma tendencia en estos dos estudios. La razón por la cual
sucede esto puede ser debido a la utilización y manejo del espectrofotómetro, de igual manera a la
preparación del reactivo DNS y a las condiciones ambientales con las cuales se cuenta en el laboratorio.

Empezando por los errores provenientes del equipo que pueden estar influenciadas por la edad del equipo,
las mediciones pueden no ser tan precisas debido a factores ambientales como es la temperatura, debido a
que esta debe ser estable (de 21-25ºC). El laboratorio donde fue realizada la práctica, debido a la entrada de
luz solar está destinado a sufrir cambios de temperatura que pueden influir en la variación del error del
instrumento. Igualmente la humedad tanto como los contaminantes en el aire pueden llegar a reducir
gradualmente la vida útil y la precisión a largo plazo del espectrofotómetro (Datacolor, 2018).

Para evitar los errores del equipo se dispuso a utilizar como blanco el reactivo DNS anterior al blanco de
agua destilada para eliminar los errores del equipo y poder obtener una absorbancia confiable cuando se
midiera la absorbancia de los tubos problema. Pero también es importante destacar la importancia de la
preparación del reactivo DNS que debe tener un color amarillo claro y una correcta preparación de las
soluciones de dextrosa. El reactivo DNS por su gran capacidad de producir reacciones redox puede perder
su función. La reacción del DNS es colorimétrica, el ácido 3-5-dinitrosalicílico es de color amarillo,
mientras que la aparición de ácido 3-amino-5-nitrosalicílico provoca un viraje a pardo oscuro, cuya
intensidad será proporcional a la cantidad de azucares reductores (Miller, 1959, p. 427). El reactivo DNS
obtenido tenía un tono inicial aproximado que tendía a anaranjado.

7. CONCLUSIONES

Aplicando los métodos de DNS y de yodo, se comprobó la actividad enzimática de la amilasa contenida en
los detergentes, teniendo como función la degradación de polisacáridos, en este caso almidón, aumentando
el rendimiento del producto.

El método de DNS es un método cuantitativo, de donde pudimos calcular los parámetros cinéticos; mientras
que el método con yodo es cualitativo, donde, mediante la reducción de la absorbancia se comprueba la
actividad enzimática, debido a la afinidad del yodo a las moléculas de almidón.

8. BIBLIOGRAFÍA

Ávalos, R., & Granda, S. (12 de Abril de 2017). Guía para Prácticas de Laboratorio, Taller o Campo.
Actividad de la Amilasa en Detergente en Polvo Comercial.
Aznáres Lopez, C., Aznarez Lopez, R., Claver Ruano , I., Diaz de Aguinaga, A., Ferreira Corchero, R.,
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De Lera Santín, A. (15 de Julio de 2011). Aplicaciones enzimáticas en procesos de conservación y
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Singh, S., Singh, S., Bali, V., Sharma, L., & Mangla, J. (2014). Production of Fungal Amylases Using
Cheap, Readily Available Agriresidues, for Potential Application in Textile Industry. Biomed
Research International, 34-43. doi:10.1155/2014/215748
Xiao, Storms, & Tsang. (2006). A quantitative starch-iodine method for measuring alpha-amylase and
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16500607

9. ANEXOS