Rancangan Operasional Penelitian

Prosedur Adaptasi dan Pemeliharaan Hewan Coba

Tikus dikarantina selama 1 minggu yang bertujuan untuk

menghilangkan stres akibat transportasi dan mengkondisikan
hewan dengan suasana laboratorium. Temperatur dan kelembaban
juga harus diperhatikan. Temperatur dipertahankan sesuai suhu
kamar sedangkan kelembapan antara 40 – 60% (Atmojo, 2009).

Sebelum tikus mendapat perlakuan, persiapan kandang

perlu dilakukan terlebih dahulu. Bahan kandang dapat digunakan
dari kawat / bak plastik, sedangkan kandang yang terbuat dari
kayu tidak dianjurkan karena tikus adalah binatang pengerat.
Kandang yang terbuat dari bak plastik nantinya akan ditutup
kawat kasa ukuran kecil dan diberi kawat pengait sebagai tutup
kandang. Untuk kadang dengan bak plastik dapat diberi alas
berupa serbuk gergaji, sekam atau zeloit (lebih mahal harganya).
Setelah itu dalam satu kandang dapat dimasukkan 3-4 tikus jantan
sehat, dengan berat badan 200-250 gram. Minuman yang
diberikan kepada hewan coba bersih dan tidak terkontaminasi
agen infeksius, sedangkan makanan untuk hewan coba tikus harus
mengandung protein yang cukup (Suryaningtyas et al., 2015).
 Pembagian Kelompok pada Penelitian

Sampel diperoleh dari populasi yang diambil secara acak

(random) dan dibagi dalam 2 kelompok besar. Kemudian masing-
masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus wistar. Pada kelompok
pertama setelah mengalami penyesuaian dilakukan pencabutan
gigi dan tidak diberi aplikasi bahan atau digunakan sebagai
kelompok kontrol (K). Pada kelompok kedua dilakukan
pencabutan gigi kemudian diaplikasi gel Kulit Buah Citrus limon
atau dapat digunakan sebagai kelompok perlakuan.

b. Pembuatan Minyak Esensial Kulit Buah Citrus limon

1. Jeruk lemon (Citrus limon) disiapkan kemudian dikupas, diambil
kulitnya lalu dicuci, menghasilkan simplisia basah kulit jeruk lemon
(Citrus limon).
2. Simplisia basah kulit jeruk lemon yang didapatkan kemudian
dihaluskan menggunakan blender.
3. Kulit jeruk lemon yang telah dihaluskan dimasukkan dalam labu
distilasi.
4. Ditambahkan aquades ke dalam ketel uap.
5. Pemanasan dimulai dengan menggunakan hot plate, dilakukan
selama kurang lebih 7 jam.
6. Hasil distilasi kemudian dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer
untuk memasuki tahap selanjutnya yaitu pemisahan minyak esensial
dengan air yang masih bercampur menjadi satu.
 7. Hasil distilasi ditambahkan hexane melalui corong pemisah untuk
mengekstraksi minyak esensial yang terdapat dalam campuran hasil
distilasi.
8. Hasil distilasi dengan campuran hexane dimasukkan dalam rotary
vapour selama hingga hexane menguap.
9. Hasil yang didapat berupa minyak esensial yang bebas air.
10. Kemudian minyak esensial tersebut dilarutkan dalam CMC 3%
hingga didapatkan campuran dengan kandungan minyak esensial
sebesar 0,78%.

Pencabutan Gigi Tikus Putih

1. Ulasi larutan antiseptik pada bagian tikus yang akan dianestesi

yaitu bagian gingiva labial dan palatal gigi insisivus satu kiri
rahang bawah menggunakan alkohol 70% atau povidone iodine
10%
2. Anestesi menggunakan ketamine 1000 mg/ 10 mL untuk
menghilangkan rasa sakit saat pencabutan. Suntikkan jarum injeksi
dan melakukan aspirasi terlebih dahulu. Jika jarum injeksi sudah
ditempatkan dengan benar maka obat dapat didiponirkan sebanyak
0,2 mL
3. Tikus akan tertidur selama ± 3 menit pasca injeksi dan akan
kembali sadar selama ± 1 jam
4. Pemisahan akar gigi dari gingival menggunakan lecron
termodifikasi. Lalu ekstraksi gigi tikus menggunakan needle holder
termodifikasi secara hati-hati untuk menghindari patahnya gigi
5. Irigasi soket dengan akuades steril untuk membersihkan sisa
fragmen gigi.
6. Kontrol pendarahan dengan tampon atau kasa steril (Widyastomo,
2013)

Pemberian Analgetik Pasca Pencabutan

Prosedur pemberian analgetik pada tikus pasca pencabutan yaitu
diberikan Novalgin yang merupakan golongan analgetik non narkotik
sebagai peringan gejala namun tidak menyembuhkan. Novalgin diberikan
sebanyak 1 x 1 hari dalam dosis 0,3 mL secara intraperitoneal.
 Pemberian Gelatin Kulit Buah Citrus limon
1. Gel Kulit Buah Citrus limon diberikan pada soket gigi tikus
insisivus satu rahang bawah sebanyak 1cc dengan pipet yang
dimasukkan hingga menyentuh dasar soket.
2. Gelatin Kulit Buah Citrus limon diulaskan menggunakan cotton
bud pada soket gigi tikus secara merata
3. Pemberian gelatin Kulit Buah Citrus limon pada soket hingga hari
ke tujuh untuk kelompok tikus perlakuan, dan no treatment untuk
kelompok kontrol tidak diberi perlakuan

Perawatan Hewan Coba Pasca Pencabutan gigi

1. Pakan tikus pasca pencabutan dengan mengencerkan makanan
(pelet komersial)
2. Pemberian makanan dengan teknik sondasi menggunakan sonde
gastrik yang akan langsung menuju lambung tanpa melalui mulut
sehingga mencegah terjadinya gangguan penyembuhan pada soket
gigi
3. Pemberian pakan dilakukan dua kali sehari pagi dan sore serta
pemberian air minum secukupnya dengan air PDAM

Pengambilan Sampel Jaringan

1. Pengambilan sampel jaringan dilakukan pada hari ke-3, ke-5 dan dan
ke-7 untuk melihat ekspresi vascular endothelial growth factor
(VEGF) pada jaringan di soket gigi hewan coba
2. Anastesi dengan menggunakan inhalasi eter (ketamine) dosis letal
yaitu tiga kali dosis anastesi
3. Mengonfirmasi kematian tikus dengan melihat apakah jantungnya
sudah benar-benar berhenti berdetak serta tidak berkedip apabila
disentuh pada bagian bola mata
4. Dekaputasi dan pengambilan tulang rahang bawah dimana terdapat
soket bekas pencabutan hewan coba menggunakan scalpel no.11
5. Rahang bawah dimasukkan ke dalam tabung berisi formalin 10%
untuk fiksasi jaringan dan diberi label
6. Jasad tikus putih strain wistar kemudian dikuburkan secara layak
(Widyastomo, 2013)
Teknik Pemrosesan Preparat Jaringan
1. Sampel jaringan dari hewan coba difiksasi dalam larutan formalin
10% selama 18-24 jam
2. Jaringan dicuci dengan air mengalir selama 15 menit
3. Dekalsifikasi menggunakan EDTA 14% dan dicuci dengan air
selama 15 menit
4. Dehidrasi dengan aseton sebanyak 1 jam x4
5. Clearing dengan xylol sebanyak 30 menit x4
6. Impregnasi dengan paraffin cair pada suhu 55ºC-80ºC
7. Penanaman jaringan ke dalam paraffin block (embedding) dan
didinginkan selama 24 jam
8. Penyayatan sediaan dengan menggunakan microtom rotary dengan
ketebalan berkisar 3-6 µm lalu meletakkan sayatan pada water baht
dengan suhu 50ºC
9. Sayatan yang telah menempel kemudian didiamkan selama 24 jam
10. Masuk ke dalam tahap pewarnaan menggunakan teknik indirek
imunohistokimia

Teknik Indirek Pewarnaan Imunohistokimia

1. Melakukan deparafinasi preparat (blok parafin) dengan xylene
sebanyak tiga kali masing-masing tiga menit
2. Preparat direhidrasi dengan etanol 100%, etanol 95%, dan etanol
70% masing-masing selama dua menit, dua menit, satu menit, dan
terakhir dengan air selama satu menit
3. Rendam dalam peroxidase blocking solution pada suhu kamar
selama 10 menit
4. Inkubasi preparat dalam prediluted blocking serum 25˚C selama 10
menit
5. Rendam preparat di dalam antibodi monoklonal anti rat- VEGF 25˚C
selama 10 menit
6. Cuci preparat dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) selama 5 menit
7. Inkubasi preparat dengan antibodi sekunder (conjugated to horse
radish peroxidase) 25˚C selama 10 menit
8. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit
9. Inkubasi preparat dengan peroksidase 25˚C selama 10 menit
10. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit
11. Inkubasi preparat dengan kromogen DAB (Diaminobenzinidine)
25˚C selama 10 menit
12. Inkubasi preparat dengan Hematoxylin Eosin selama 3 menit
13. Cuci preparat dengan air mengalir
14. Bersihkan preparat dan tetesi dengan mounting media
15. Tutup preparat dengan coverslip
 16. Mengamati ekspresi vascular endothelial growth factor VEGF
(warna cokelat) pada sel menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 1000x (Gambar 4.2)
(Cancer Chemoprevention Research Center Fakultas Farmasi UGM,
2010)

Penghitungan Ekspresi VEGF

Pemeriksaan ekspresi vascular endothelial growth factor (VEGF)
menggunakan kit VEGF Ab-1 atau antibodi monoklonal anti-VEGF.
Penghitungan ekpresi VEGF menggunakan bantuan mikroskop cahaya
dengan perbesaran kuat 1000x untuk memeriksa 20 daerah pandang dengan
densitas tinggi. Kemudian masing-masing daerah tadi diperiksa dengan
perbesaran kuat (1000x). Setiap daerah diperiksa sebanyak ± 200 sel
sehingga total ± 1000 sel yang diperiksa.
Pemeriksaan ekspresi VEGF adalah presentase sel positif dari
jumlah sel yang dihitung. Dalam setiap lapang pandang diklasifikasikan sel P
(+) apabila ditemukan inti sel besar dengan sitoplasma berwarna kecokelatan
atau hitam keunguan dan sel N (-) apabila inti sel besar atau kecil dengan
sitoplasma berwarna kebiruan atau jernih. Kemudian sel dihitung secara
manual untuk memperoleh data yang akurat (Nugrahaningsih et al, 2015 ;
Destri et al, 2017).
Keterangan :

K = Kelompok Kontrol

P = Kelompok Perlakuan
Analisa Data
Data yang diperoleh ditabulasi dan dianalisis secara statistik. Mula-mula
data diuji dengan menggunakan Shapiro-wilk untuk mengetahui apakah
data berdistribusi normal dengan melihat nilai signifikansi lebih dari 0,05
(p>0,05). Setelah diketahui bahwa data masing-masing kelompok
berdistribusi normal, maka selanjutnya dilakukan Levene’s test untuk
menguji homogenitas dari variasi data tiap-tiap kelompok. Apabila nilai
signifikansi lebih dari 0,05 (p>0,05) data dapat diuji perbandingan
kelompok dengan jumlah kelompok lebih dari 2 dengan menggunakan uji
hipotesis One Way Anova (Analisis of Varian) dua arah dengan tingkat
kepercayaan 95% (P<0,05) untuk mengetahui kemaknaan perbedaan
antara kelompok perlakuan. Setelah diuji menggunakan One Way Anova,
keseluruhan kelompok menunjukkan hasil nilai signifikansi kurang dari
0,05 (p<0,05) maka hipotesis diterima lalu dilanjutkan dengan uji Post-
Hoc menggunakan LSD (Least Significance Difference) untuk
mengetahui perbandingan antara mean perlakuan yang satu dengan mean
perlakuan lain atau untuk mengetahui manakah diantara mean-mean
perlakuan tersebut yang berbeda nyata satu dengan yang lain. Apabila data
berdistribusi tidak normal dan varian data tidak homogen, maka
digunakan uji Kruskal Wallis dilanjutkan dengan uji Mann Whitney.