Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA) yang menggunakan tiga jenis cat

Ziehl
Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asalm alcohol 3 % dan methylene blue 0,5 %. Dalam pengecatan ini
digunakan sample sputum. Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak yang
menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain yang ada pada objek glass. Apusan yang
dibuat tidak boleh terlalu tebal agar bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis. Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan
menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :
Pada Pewarnaan pertama ini dengan menggunakan zat warna Carbol Fuchsin. Karbol fuchsin merupakan
pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Fenol digunakan sebagai pelarut
untuk membantu pemasukan zat warna kedalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Tujuan memberikan pewarna
karbol fuksin adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Setelah memberikan pewarna karbol fuksin kemudian di
panaskan di atas penangas air, tetapi jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering. Tujuan dari memanaskan
sampel di atas penangas air yaitu supaya pewarna karbol fuksin masuk menembus dinding sel bakteri, karena dinding
bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar di tembus pewarna bakteri. Karena pengaruh
fenol dari pewarna karbol fuksin dan juga pemanasan maka lapisan lilin dan lemak dapat ditembus pewarna karbol
fuksin. Dengan pemanasan menyebabkan pelebaran pori – pori lemak bakteri tahan asam sehingga pewarna karbol
fuksin dapat masuk sewaktu dicuci dengan larutan pemucat, dan zat warna pertama tidak mudah dilunturkan.
Menunggu selama 10 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan
agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula
setelah dilakukan pemanasan. Setelah 10 menit dibilas dengan aquades. Pencucian dengan menggunakan aquades
mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya.

Kemudian sampel di tetesi asam alkohol 3 % dan didiamkan selama 30 detik. Penambahan alkohol ini berfungsi
untuk membilas atau melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri
sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam pada suhu
semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu sampai 10 menit. Saat penambahan asam
alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak
mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA. Bakteri tahan asam pada saat dicuci dengan asam alkohol warna
karbol fuksin tidak lepas atau hilang, sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan lepas atau hilang. Menunggu
selama ½ menit setelah penambahan larutan asam alkohol bertujuan agar zat warna dapat luntur secara sempurna
dan tidak ada yang tersisa. Dan setelah 30 detik dicuci kembali dengan air mengalir atau aquadest.

Setelah itu, sampel di tetesi atau di genangi dengan pewarna tandingan metilen biru dan didiamkan selama 1
menit. Methylene Blue merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna methylene
blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada
bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi
berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat masuk
sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene
blue bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada perbedaan warna
antara bakteri BTA dan Non BTA.
 Kemudian, setelah didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air mengalir atau aquadest. Objek yang
telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas saring atau tissue, tidak ditiup-tiup karena
dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel pada objek glass.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan
menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang
diberikan.

Sampel yang sudah di keringkan, di tetesi dengan emersi oil. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk
olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop dari debu atau
kotoran. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita
amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop, dengan
pembesaran 10X dan 100X.

Berdasarkan pada hasil pengamatan dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 10X terlihat lapang pandang
berwarna ungu, ditemukan sel epitel tenggorokan yang terkelupas saat pasien mengeluarkan sputum, dan sel bakteri
belum terlihat. Sedangkan pada hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop lensa objektif pembesaran 100X
terlihat sel epitel yang ukurannya semakin besar, dan ditemukan bakteri BTA berwarna merah dan bakteri non BTA
berwarna ungu. Sehingga Pada preparat sputum ditemukan bakteri tahan asam (BTA) berbentuk Basil berwarna dan
bakteri tidak tahan asam (non BTA) berbentuk Coccus berwarna ungu. Dengan latar belakang berwarna biru dan sel
epitel dan PMN berwarna biru tua. Dari hasil tersebut dapat didiagnosa bahwa sputum tersebut 2+.

Adapun hal-hal yang harus diperhatikan pada saat pewarnaan BTA ini yaitu pada fase yang paling kritis adalah
dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol
jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan Non
BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol
(underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja
berwarna ungu mendekati warna sel BTA. Saat pemanasan juga tidak boleh sampai mendidih karena akan
menyebabkan sel bakteri lisis. Dan kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades atau air mengalir diantara
penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.

Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan teknis aseptis, hal ini bertujuan untuk mencegah atau meminimaliskan
adanya kontaminasi mikroorganisme baik pada sampel atau praktikan sendiri. Pada praktikum kali ini dilakukan
pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasi dan mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini
disebut tahan asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika ditambahkan larutan asam, bakteri
ini memiliki rantai karbon 8-95 dan dinding selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid sampai
60 % dari berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya kadar lipid pada dinding sel menyebabkan bakteri
ini sulit untuk dilakukan dengan pewarnaan biasa dan perlu perwarnaan khusus.

Pada praktikum ini menggunakan pewarnaan ziehl neelsen untuk identifikasi dan pengamatan bakteri
tahan asam, karena metode ini merupakan salah satu metode pengujian bakteri tahan asam yang cukup
sederhana dan memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Pada praktiknya hal yang pertama
dilakukan adalah pengolesan sampel pada kaca preparat secar aseptis dalam hal ini sampel yang digunakan
merupakan Mycrobacterium tuberculosis, dengan mengambil kaca preparat yang terendam dalam etanol
kemudian dikeringkan dengan kapas sampai benar-benar kering, perendaman kaca preparat ini bertujuan
untuk membunuh bakteri dari praktikum sebelumnya yang masih melekat pada permukaan kaca preparat.
Dimana etanol ini memiliki dua mekanisme dalam membunuh bakteri yakni dengan denaturasi protein dan
pelarutan membrane lemak pada bakteri. Setelah kaca preparat kering selanjutnya dibuat pola lingkaran pada
bagian belakang kaca preparat yang berfungsi sebagai tanda olesan bakteri atau sampel. Kemudiaan
menyalakan api spiritus untuk melakukan fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses pemindahan sampel
dari cawan petri ke kaca preparat tetap dalam keadaan steril atau mencegah kontaminan lain masuk ke
dalam sampel. Hal pertama yang dilakukan adalah fiksasi ose terlebih dahulu untuk mencegah adanya
kontaminan yang menempel pada ose, fiksasi ose ini dilakukan dari ujung kawat dekat batang kaca ose menuju
ujung loop ose, hal ini dilakukan agar panas yang dihantarkan merata serta jika ose dalam keadaan basah
tentu sisa larutan pada ujung loop ose akan lebih efisien untuk dikeringkan dengan cara ini, selanjutnya ose
dibiarkan dingin di tempat yang masih dekat dengan panas spiritus hal ini bertujuan agar ketika ose dimasukan
ke dalam sampel tidak menyebabkan bakteri yang terkandung dalam sampel mati akibat panas dari ose.
Selanjutnya mengambil sampel sebanyak satu loop ose dalam keadaan aseptis,dan oleskan ke atas kaca preparat,
dimana teknik pengolesan sampel harus diperhatikan karena jika olesan terlalu tebal, maka sel-sel bakteri akan
bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk menentukan bentuk sel individu dan jika olesan terlalu tipis dapat
menylulitkan pengamatan secara mikroskopis. Selanjutnya dilakukan fiksasi pada sampel, yang bertujuan untuk
merekatkan sel bakteri pada preparat objek, setelah itu sampel yang telah difiksasi digenangi denga karbol fuksin
selama 5 menit dan dilakukan pemanasan, lama waktu

yang dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna karbol fuksin ini dapat berpenetrasi secara
sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna primer yang
mengandung fucsin basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol pada karbol fuksin ini dapat berfungsi
untuk melunakan lapisan lilin pada dinding sel bakteri sehingga cat warna fuksin dapat masuk ke dalam sel, hal ini
tentu dibantu dengan proses pemanasan yang mengakibatkan terbukanya pori-pori lemak yang menutupi dinding
sel bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin dapat berjalan dengan baik, namun pada pemanasan ini
sampel harus dijaga jangan sampai mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati dan
tidak akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan mengaliri aquadest pada sampel, hal ini
bertujuan untuk mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, kemudian ditambahkan asam alcohol
selama 15 detik, penambahan ini diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang dimana hal ini
akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana jika bakteri bersifat tahan asam, bakteri
tersebut tidak akan melepaskan zat warna primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan
melepaskan zat warna primernya. Penambahan asam alcohol ini tidak boleh dilakukan secara berlebihan karena
akan menyebabkan overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak dapat dipisahkan, namun jangan
pula terlalu sedikit dalam penambahan asam alcohol pada bakteri karena akan menyebabkan
underdecolorization yang dapat menyebabkan zat warna pada non BTA tidak seluruhnya terlepas yang
mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan dalam proses identifikasi dan pengamatan apda sampel. Selanjutnya
dialiri aquadest untuk menutup pori-pori bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses pemucatan oleh asam alcohol,
dan dikeringkan dengan kertas saring untuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel bakteri. Kemudian
preparat sampel bakteri digenagi dengan metilen blue yang berfungsi

sebgai pewarna tandingan, dimana pewarna ini yang akan menunjukan adanya bakteri non tahan asam,
karena bakteri ini akan melepaskan pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau tandingan. Kemudian
dibilas dengan aquadest yang berfungsi untuk mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, selanjutnya
dikeringkan dengan kertas saring yang erfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel, selanjutnya
ditambahkan minya emersi karena cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara
dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan
medium kaca dengan pembiasan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati
garis normal adalah minyak emersi. Selain itu, minyak emersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau
identik dengan kaca,sehingga dapat memfokuskan sampel bakteri pada pengamatan mikroskop, Setelah
ditambahkan minyak emersi dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 10
dan 10 x 100, berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh hasil pengamatan latar belakang berwarna biru terang dan
basil bakteri berwarna merah pucat, hal ini menunjukan adanya bakteri tahan asam pada sampel yakni berupa
Mycrobacterium tuberculosis, bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik pada manusia maupun hewan,
dan bersifat kronis karena mebutuhkan waktu yang lama agar menimbulkan infeksi pada host nya, berbentuk
batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil,
tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif