Laporan Praktikum m.

k Bioteknologi Akuakultur
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan
Departemen Budidaya Perairan
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Institut Pertanian Bogor
2014

Isolasi dan Kuantifikasi RNA pada organ usus ikan betok (Anabas testudineus) dengan
menggunakan metode Isogen/Genezol
Shinta Tiara N. (C14120012)1, Arini Arziani K. (C14120014)1, Nurfitriani Siti Y. (C14120017)1, Eka Aprilia
W. (C14120022)1, Savni Retalia S. (C14120023)1, Deni Yunus W. (C14120032)1, Mohammad Sapta J.
(C14120034)1, Adi Nur Huda (C14120036)1, Muhammad Alkahfi (C14134006)1
1
Departemen Budidaya Perairan, FPIK, IPB

ABSTRAK
Isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik yang dapat membuang dan memisahkan asam nukleat dari
komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis atau
dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. Ada dua metode isolasi asam nukleat yaitu isolasi
DNA dan RNA. Untuk mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari RNA selular) dari campuran molekular
RNA total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Isolasi RNA yang
dilakukan menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole mendapatkan hasil yang paling baik, yaitu dengan
jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai 145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio
perbandingan protein sebesar 1,705. sehingga tingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor Hystocompatibility
Complex) merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka
dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah
RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya.

Kata kunci: Asam nukleat, DNA, Isolasi, MHC, Protein, RNA

Pendahuluan
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu
teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari
teknik biologi molekular. Ekstraksi atau isolasi asam
nukleat dapat membuang dan memisahkan asam nukleat
dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak,
dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat
dianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik
biologi molekular lainnya. Ekstraksi asam nukleat ini
berguna untuk meneliti bahan yang bersifat mikro dengan
alat-alat yang bersifat mikro.
Ada dua metode ekstraksi asam nukleat yaitu ekstraksi
DNA dan RNA. Kedua metode tersebut hampir mirip
dalam prosesnya, namun molekul RNA relatif pendek dan
lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel
dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun molekul
RNA relatif pendek, tetapi RNA sangat mudah didigesti
oleh RNAse yang terdapat endogen dengan konsentrasi
yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari.
Sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan
sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi
harus mengandung detergen kuat untuk segera
mendenaturasi RNAse yang ada. Proses deproteinisasi
harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA sering
berikatan kuat dengan protein. Penambahan DNase dapat
digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian
dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang sering
digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium
thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan
merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat dicek
dengan elektroforesis menggunakan gel agarose.
Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran
23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk
eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang
diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan RNA
lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam
keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi
struktur sekunder pada RNA (Brown et al 2009).
Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi asam
nukleat dapat dikurangi dengan cara: Mempertahankan
suhu inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum
nuklease (370C), misalnya dengan mempertahankan
larutan ekstrak pada suhu es atau 40C. Menginaktivasi
nuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis
pakai dengan bahan kimia seperti DEPC
(diethylpyrocarbonate). Selanjutnya inaktivasi dan atau
penghambatan secara kimiawi, misalnya dengan fenol
atau garam guanidinium. Penghilangan ion logam ko-
faktor untuk nuklease dengan chelating agent. Untuk
mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari
RNA selular) dari campuran molekular RNA total dapat
dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn
oligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi,
mRNA yang mengandung ekor poli(A) akan berikatan
dengan molekul oligo(dT) komplementer pada kolumn
afinitas, sehingga mRNA tetap tertinggal, sedangkan
molekul RNA lainnya dapat dicuci bersih dari kolumn
menggunakan larutan tinggi garam. Selanjutnya, mRNA
yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam metode isogen sebesar 14,95 dengan kemurnian sebesar
berkonsentrasi rendah (Theophilus 2008). 69% dan rasio perbandingan dengan protein sebesar
1,251.
Material dan Prosedur
Ikan uji yang digunakan pada praktikum isolasi RNA Pembahasan
adalah ikan betok (Anabas testudineus). Organ yang Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari
digunakan untuk pengamatan isolasi RNA adalah bagian unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya
usus ikan betok. Alat yang digunakan yaitu mikrotube, deoksinukleotida maka asam nukleat itu disebut
mikropipet, vortex, sentrifuge, gene quant, grinder. Bahan deoksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit
yang digunakan yaitu organ usus ikan betok, isogen, mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA
kloroform, isopropanol, ethanol 70%, DEPC. dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika
Pertama yang dilakukan adalah mengambil organ usus yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida
ikan betok sebanyak 20 mg dan dimasukkan ke dalam terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan
tube yang sudah diisi dengan isogen 200µl. Lalu usus fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan
ikan betok di grinder menggunakan mikropestel sampai posisi 5′ pada mononukleotida lainnya, Asam-asam
halus. Setelah halus, isogen ditambahkan sebanyak nukleat seperti asam deoksiribosa nukleat (DNA) dan
600µl, lalu disimpan selama 5 menit dengan suhu asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi
ruangan. Setelah 5 menit, kloroform ditambahkan pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam
kedalam tube sebanyak 200µl, lalu di vortex selama 15 nukleat merupakan molekul makro yang memberi
detik dan didiamkan selama 2-3 menit. Setelah itu sampel keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan
di sentrifuge (HR-1500FR) selama 5 menit dengan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino
kecepatan 13000 rpm. Setelah itu supernatan yang yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat
terbentuk dipindahkan kedalam tube yang baru yang merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan
sudah berisi cairan isopropanol sebanyak 400µl, lalu monomer yang disebut nukleotida. Dua tipe utama asam
sampel di vortex kembali dan dismpan dalam suhu nukleat adalah asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam
ruanng selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel di ribonukleat (RNA) (Fried dan George 2011). DNA
sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan yang sama adalah sejenis asam nukleat yang tergolong
13000 rpm, lalu supernatant dibuang. Setelah supernatant biomolekul utama penyusun berat kering setiap
dibuang, lalu tambahkan cairan ETOH 70% atau ethanol organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di
dingin sebanyak 1 ml kedalam tube, lalu di sentrifuge dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam
selama 5 menit dengan suhu 4°C dan kecepatan 13000 sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA
rpm. Setelah itu buang supernatan, lalu keringkan di menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini
udara selama 15-30 menit. Setelah itu, larutan DEPC berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara
(Diethylpyrocarbonate) ditambahkan kedalam tube perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus
sebanyak 50µl, lalu di vortex. Setelah itu pengukuran (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV
sampel dengan menggunakan gene quant. (Human Immunodeficiency Virus). DNA terutama
ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban
Hasil kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi
Berikut merupakan tabel hasil isolasi dan kuantifikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk
RNA, memproduksi organisme itu dalam sebagian besar
Tabel 1 Hasil isolasi dan kuantifikasi RNA organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul
NO RNA PROTEIN RATIO PURITY RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA),
(%) meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari
1 46,40 0,1 1,368 76 berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan
2 30,62 0,1 1,431 79 kode DNA-nya (Fried dan George 2011). Struktur dasar
3 41,93 0,1 1,368 77 RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan bahan
4 14,95 0,1 1,251 69 genetik. Ia berfungsi sebagai penyimpan informasi
5 23,67 0,1 1,697 94 genetik, sebagaimana DNA pada organisme hidup lain.
6 55,17 0,1 1,488 82 Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang
7 46,62 0,1 1,447 80 dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang
8 83,84 0,2 1,482 82 kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan
9 21,45 0,1 1,321 72 virus-virus baru. Namun demikian, peran penting RNA
10 145,66 0,4 1,705 94 terletak pada fungsinya sebagai perantara antara DNA
Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini
sampel yang memiliki konsntrasi RNA paling besar berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini,
adalah pada percobaan menggunakan sampel MHC nila RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa
nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa
dengan metode gemzole yang mencapai nilai 145,66
ini tersusun dalam bentuk ‘triplet’, tiga urutan basa N,
dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio
yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi
perbandingan protein sebesar 1,705. Sedangkan sampel dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti),
yang memiliki konsentrasi RNA paling kecil adalah pada monomer yang menyusun protein. RNA merupakan
percobaan menggunakan sampel usus ikan betook dengan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap
nukleotida ,fmemiliki satu gugus fosfat, satu gugus gula
ribosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer
tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat
dari satu nukleotida dengan gugus gula ribosa dari
nukleotida yang lain. Perbedaan RNA dengan DNA
terletak pada satu gugus hidroksil tambahan pada cincin
gula ribosa (sehingga dinamakan ribosa). Basa nitrogen
pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timin pada
DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada
empat pilihan: adenin, guanin, sitosin, atau urasil untuk
suatu nukleotida.Selain itu, bentuk konformasi RNA
tidak berupa pilin ganda sebagaimana DNA, tetapi
bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya
Menurut Sambrook dan Russel (2001) Penentuan
kemurnian RNA berdasarkan ratio antara A260/A280.
RNA dapat menyerap sinar ultraviolet pada panjang
gelombang 260. Di dalam spektofotometer, sample
dilewatkan pada panjang gelombang 260 dan panjang
gelombang 280. Nisbah antara A260/A280 menentukan
tingkat kemurnian dari RNA, terdapat hubungan linear
positif antara kemurnian RNA dan nisbah A260/A280.
Kemurnian RNA yang ideal didapatkan dari proses
isolasi RNA adalah 95-100% dengan nisbah absorbansi
sebesar 2.00±0.05, RNA dengan nilai nisbah A260/A280
sama dengan 2 memiliki tingkat kemurnian sebesar 100%
Pada praktikum kali ini didapatkan kemurnian RNA
terendah pada sample usus betok 69% dengan konsentrasi
RNA 5,42 µg/ml hal ini dikarenakan sample
mengandung kontaminan yang tinggi, proses pengerjaan
yang tidak steril dan diduga pada sel-sel di jaringan usus
materi genetik dari DNA tidak diekspresikan terlalu
banyak sehingga RNA yang didapatkan pada organ ini
sedikit dan tingkat kemurnian yang rendah. Hal ini
berlawanan dengan sample MHC ikan sehingga memiliki
tingkat kemurnian yang tinggi yaitu 94%.
Kuantifikasi RNA menggunakan alat yang disebut
Gene-Quant. Alat ini menggunakan prinsip
spektofotometer, seberkas cahaya UV dilewatkan pada
sampel dengan panjang gelombang tertentu untuk melihat
kemurnian sampel tersebut. Kuantifikasi RNA umumnya
mengukur purity, Konsentrasi protein, Konsentrasi RNA,
dan Absorbansi. Purity merupakan tingkat kemurnian
sampel RNA, Purity didaptkan dari hasil ratio absorbansi
A260/A280. Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus
dengan nilai absorbansi dan berkolerasi positif, dimana
nilai rasio absorbansi sama dengan 2 maka sample tidak
terkontaminasi (Sambrook dan Russel 2001). Protein
merupakan makromolekul yang terdiri dari beberapa
asam amino yang telah memiliki fungsi tertentu. Pada
proses isolasi RNA, protein adalah salah satu molekul
yang menyebabkan RNA terkontaminasi sehingga protein
harus dieleminasi pada sampel tersebut. Pengukuran
konsentrasi protein menggunakan panjang gelombang
280. Konsentrasi RNA merupakan banyaknya RNA (µg)
pada sample tersebut (mL), banyaknya RNA pada suatu
sampel ditentukan oleh aktifitas organ sampel dan
pengekspresian gen tertentu pada suatu organ,.
Konsentrasi RNA diukur dengan panjang gelombang
260. Nilai absorbansi merupakan nilai yang diukur
menggunakan panjang gelombang 260, sehingga nilai
absorbansi merupakan acuan banyaknya konsentrasi
RNA pada suatu sampel.
MHC (Mayor Hystocompatibility Complex)
merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir
semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka
dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang
digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki
jumlah RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan
sampel yang lainnya. Biasanya jumlah molekul MHC
pada setiap sel sangat banyak, yang paling utama pada
sel-sel limfoid. Jumlahnya dapat berkisar antara 10.000-
100.000 molekul setiap selnya. Dari hasil tabel yang di
dapat konsentrasi RNA yang tinggi terdapat di kelompok
10 menggunakan bahan MHC pada ikan Nila dengan
nilai konsentrasi yaitu 145,66 sedangkan nilai konsentrasi
RNA yang terkecil ada pada usus ikan betok dengan nilai
14,95. Menurut Ji-cai Pang et al (2013) MHC yang
paling tinggi terdapat dibagian perut ikan Nila hal
tersebut dapat terjadi karena MHC merupakan wilayah
genomik yang ditandai dengan polimorfisme yang sangat
tinggi dan memiliki peran penting dalam respon imun.
Bagian-bagian tubuh ikan yang memiliki MHC
konsentrasi tinggi yaitu perut, insang dan usus sedangkan
tingkat moderat dalam hati, ginjal, limpa dan hati lalu
ekspresi yang rendah terdapat pada otak, otot dan kulit.
Asam ribonukleat (RNA) merupakan senyawa yang
berasal dari bahan genetik dan memiliki peran utama
dalam ekspresi gen. Dalam dogma pokok (central
dogma) genetika molekuler, RNA menjadi perantara
antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotip
yang diwujudkan dalam bentuk protein. Asam
ribonukleotida (RNA) adalah salah satu molekul asam
nukleat yang dibentuk oleh asam dioksiribonukleotida
(DNA) yang berfungsi untuk mensintesis protein di
dalam inti sel. Molekul RNA merupakan polimer panjang
yang tidak bercabang dari gugus ribonukleotida
monofosfat yang digabungkan dengan ikatan fosfodiester.
Untuk mendapatkan RNA pada organisme yang akan
diamati dengan cara mengisolasi RNA dan untuk
menghitung jumlah RNA dilakukan kuantifikasi RNA.
Isolasi RNA merupakan teknik untuk memperoleh RNA
yang diharapkan bebas dari kontaminan. Isolasi RNA
dapat di manfaatkan untuk mengetahui laju pertumbuhan
pada ikan, mendeteksi penyakit seperti virus, selain itu
digunakan untuk ekspresi gen dan isolasi gen. Contoh
dari isolasi RNA seperti dilakukannya kloning dan
ekspresi gen pada ikan nila. Kloning merupakan proses
pembuatan salinan dari suatu gen dengan prinsip
teknologi DNA atau RNA. Molekul DNA atau RNA
dibuat dengan menyisipkan fragmen yang mengandung
gen target ke dalam vektor. Vektor berperan sebagai
pembawa gen yang akan dikloning ke dalam sel insang.
Dalam proses ini metode yang digunakan yaitu dengan di
lakukannya isolasi DNA atau RNA, serta dilakukannya
proses elektroforesis (Soekarno 2011). Contoh yang
kedua yaitu mendeteksi virus pada ikan koi, metode yang
digunakan dalam mendeteksi virus yang digunakan yaitu
dengan isolasi DNA atau RNA, serta dilakukan proses
PCR. Proses PCR dilakukan setelah isolasi DNA atau
RNA, hasil dari isolasi tersebut dideteksi dengan
menggunakan PCR, lalu visualisasi dengan elektroforesis
(Mulyani et al 2011).
Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat
disimpulkan bahwa sampel yang memiliki kemurnian
RNAyang paling baik adalah pada percobaan
menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole
dengan jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai
145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan
rasio perbandingan protein sebesar 1,705. sehingga
tingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor
Hystocompatibility Complex) merupakan molekul protein
yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel
tubuh suatu organisme, maka dari itu kemungkinan
konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu
MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah RNA yang
lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya.

Daftar Pustaka
Brown S M, Hay J G, Ostrer H. 2009. Essentials of
Medical Genomics. New Jersey [USA]: Second ed.
John Wiley & Sons, Inc.

Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple and

efficient method for isolating RNA from pine trees.
Journal Plant Mol Biol Rep. 11(1993): 98 – 100.

Fried G H, George J H. 2011. Schaums Tss Biologi Ed.2.

Jakarta [ID]: Penerbit Erlangga.

Ji-cai Pang et al. 2013. Major Histocompability complex

class IIA and IIB genes of nile tilapia Oreochromis
niloticus : Genomic structure, molecular
polymorphism and expression patterns. Journal
Fish & Shellfish Immunology. 34 (2013): 486-496.

Sambrook J, Russel D W. 2001. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual 3rd edition. New York (USA) :
Cold Spring Harbor

Soekarno M T. 2011. Kloning dan ekspresi gen tilapia

Growth Hormone (tiGH) untuk memproduksi
protein rekombinan hormon pertumbuhan ikan nila
(Oreochromis niloticus, Linnaeus 1758) [Skripsi].
Depok (ID): Universitas Indonesia.

Theophilus B D M. 2008. Principles and Medical

Applications of the Polymerase Chain Reaction. In:
Molecular Biomethods Handbook Second Edition.
Ed: Walker, J.M., Rapley, R. New Jersey
[USA].Humana Press.