Analisis protein daun padi selama musim kemarau stres dan pemulihan.

Abstrack

Tanaman padi berumur tiga minggu (Oryza sativa L. cv CT9993 dan cv IR62266) dikembangkan
tekanan air bertahap selama 23 hari transpirasi tanpa penyiraman, selama itu periode potensi air
daun tengah hari menurun menjadi 2.4 MPa, dibandingkan dengan ?? 1.0 MPa dalam kontrol air
yang baik. Lebih dari 1000 bintik protein yang terdeteksi dalam ekstrak daun oleh analisis
proteomik menunjukkan kelimpahan reproduktif dalam replikasi. Dari protein-protein ini, 42
titik menunjukkan perubahan signifikan dalam kelimpahan di bawah stres, dengan 27 dari
mereka menunjukkan pola respons yang berbeda di dua kultivar. Namun, hanya satu protein
(chloroplast Cu-Zn superoxide dismutase) berubah secara signifikan dalam arah berlawanan di
dua kultivar sebagai tanggapan terhadap kekeringan. Yang paling umum perbedaan adalah
karena protein harus diregulasi oleh kekeringan pada CT9993 dan tidak terpengaruh di IR62266;
atau turun-diatur oleh kekeringan di IR62266 dan tidak terpengaruh dalam CT9993. Oleh 10 hari
setelah pengurasan ulang, semua protein telah kembali sepenuhnya atau sebagian besar ke
kelimpahan dari kontrol yang dialiri air. Spektrometri massa membantu mengidentifikasi 16 dari
protein yang responsif terhadap kekeringan, termasuk faktor depolimerisasi actin, yang
merupakan satu tiga protein terdeteksi di bawah tekanan di kedua kultivar tetapi tidak terdeteksi
dalam air tanaman atau tanaman 10 hari setelah pengurasan ulang. Protein yang paling melimpah
diregulasi oleh kekeringan di CT9993 dan IR62266 diidentifikasi hanya setelah cloning cDNA
yang sesuai. Itu ditemukan menjadi homolog R-seperti S-seperti tetapi tidak memiliki dua
histidin situs aktif yang diperlukan untuk aktivitas RNase. Empat tangguh kekeringan baru
mekanisme terungkap oleh pekerjaan ini: up-regulasi homolog S-seperti RNase, actin
depolymerizing factor dan rubisco activase, dan pengaturan turun isoflavon protein seperti
reduktase.

Introduction

Kekeringan adalah salah satu batasan paling parah pada produktivitas dari dataran rendah tadah
hujan dan padi dataran tinggi [1]. Pembiakan program untuk meningkatkan produktivitas di
musim kemarau yang terkena dampak ekosistem fokus pada pelarian kekeringan, menghindari
kekeringan atau toleransi kekeringan [2, 3]. Lapar kekeringan lebih disukai ketika musim hujan
bisa diandalkan tapi singkat. Petani menanam kultivar jangka pendek yang berbunga saat musim
hujan berakhir. Kapan musim hujan lebih panjang dan lebih tidak menentu, durasi lebih lama
kultivar tumbuh tetapi mereka mungkin mengalami kekeringan kapan saja. Penghindaran
kekeringan dicapai di dataran tinggi oleh perkembangan akar yang dalam dan di dataran rendah
oleh penetrasi akar melalui panci keras, lapisan yang dipadatkan tanah ditemukan pada
kedalaman sekitar 25 cm.

Toleransi kekeringan diperlukan saat tanaman mengalami defisit air tanah

berkepanjangan. Tanaman toleran mempertahankan kadar air jaringan, atau bertahan hidup
pengurangan jaringan kadar air, atau pulih lebih banyak setelah pengurasan ulang [5]. Penutupan
stomata dan penyesuaian osmotik [6, 7] adalah di antara tanggapan yang membatasi hilangnya
air. Dalam gandum daun, sukrosa, prolin dan turunan amonium kuaterner adalah osmotika utama
[8]. Sintesis pendamping dan toleransi stres oksidatif memungkinkan tanaman bertahan hidup
defisit air [9], dan alokasi karbohidrat yang dimodifikasi membantu tanaman untuk melanjutkan
pertumbuhan setelah pengurasan kembali.

Dalam upaya untuk mengidentifikasi gen yang mengendalikan sifat-sifat yang terkait
dengan menghindari kekeringan dan toleransi kekeringan, kuantitatif analisis trait locus (QTL)
telah dilakukan dengan populasi pemetaan, yang sebagian besar berasal dari persilangan inter-
subpesifik antara japonica tropis dataran tinggi kultivar seperti CT9993 dan Azucena dan dataran
rendah kultivar indica seperti IR62266 dan IR64. Kunci QTL telah dipetakan untuk morfologi
root, distribusi root dan penghindaran kekeringan [11–16], kemampuan penetrasi akar [4, 17,
18], penyesuaian osmotik dan toleransi dehidrasi [7, 19], konduktansi stomata, penggulungan
daun dan pos tanggal [20], stabilitas membran sel [21] dan asam absisat akumulasi [22]. Kloning
berbasis peta untuk mengisolasi ini gen dan analisis microarray untuk menemukan kekeringan
yang bersifat responsive gen adalah tujuan utama dari genomik fungsional pada tumbuhan.

Proteomik adalah tambahan baru pada alat molekuler digunakan untuk menganalisa
tanaman yang terkena kekeringan [23]. Riccardi et al. [24] meneliti protein responsif kekeringan
dua garis jagung dan hibrida generasi pertama (F1) generasi pertama mereka. Defisit air
berkembang lebih dari 10 hari, saat air daun potensi tercapai 1,5 megapascal (MPa)
(dibandingkan dengan? 0,3 MPa di daun kontrol). Protein diekstra k dari jaringan etiolated daun
termuda dan dianalisis oleh 2-DE. Tujuh puluh delapan dari 413 protein daun menunjukkan
variasi kuantitatif yang signifikan (peningkatan atau menurun), dengan 38 di antaranya
menunjukkan ekspresi yang berbeda dalam dua genotipe. Pengambilan data elektronis
mengidentifikasi sebelas protein yang meningkat dengan faktor 1,3 hingga 5 dalam penekanan
tanaman dan delapan protein yang hanya terdeteksi di menekankan tanaman. Berbagai jalur
metabolism terpengaruh, mulai dari fotosintesis hingga lignifikasi.

Kawasaki dkk. [25] mempelajari tanggapan dari protein daun dari semangka liar hingga 3
hari tekanan kekeringan di Indonesia pot kecil. Potensi air daun dipertahankan pada ?? 1,1 MPa
dibandingkan dengan 0,7 MPa pada tanaman kontrol dan ?? 2 MPa di daun yang bertekanan
kekeringan sensitive semangka jinak. Tujuh protein daun diregulasi di semangka liar, yang
paling berlimpah menjadi homolog 40 kDa deasetilase asetilornitin. Citrulline, diproduksi dari
ornithine oleh transcarbamylation, ditemukan untuk memperhitungkan 50% dari total gratis
kandungan asam amino dalam daun yang ditekan. Ini efisien pemulung radikal hidroksil [26].
Tadah hujan tumbuh dalam keragaman kekeringan yang tidak biasa mempengaruhi ekosistem,
mulai dari dataran tinggi hingga dataran rendah rawan banjir [3]. Kultivar yang disesuaikan
ekosistem ini berbagi beberapa mekanisme penanggulangan dengan kekeringan tetapi berbeda
pada yang lain. Breeding untuk toleransi kekeringan dalam beras adalah perusahaan yang
kompleks efisiensi cenderung ditingkatkan dengan akses ke molekul alat. Kami telah
membandingkan kultivar dataran tinggi CT9993- 10-5-1-M dan kultivar dataran rendah
IR62266–42-2-1 dengan menghormati perubahan protein selama kekeringan dan pemulihan.
CT9993 adalah kultivar japonica yang berakar dalam dikenal untuk menghindari kekeringan, dan
IR62266 adalah dangkal kultivar indica dikenal untuk toleransi kekeringan, khususnya
penyesuaian osmotik [27]. Dalam studi ini, luasnya di mana kekeringan menyebabkan perubahan
pada protein daun reversibel selama pengurasan ulang adalah pertanyaan kunci. Itu musim tanam
di lapangan dicirikan oleh episode-episode defisit air yang berlangsung dari beberapa hari hingga
beberapa minggu. Peternak bertujuan mengembangkan kultivar yang menyesuaikan metabolisme
mereka selama stres kekeringan dan kemudian kembali ke growthoriented metabolisme setelah
pengurasan ulang. Setiap genotipe adalah dinilai untuk perilaku di bawah tekanan dan
perilakunya selama pemulihan [28, 29]. Jika penyesuaian metabolik dilakukan di bawah tekanan
tidak cukup reversibel, pertumbuhan dan pemulihan mungkin terancam. Kami melaporkan di sini
analisis proteomik pertama dari reversibilitas tanggap kekeringan pada tanaman. Kekeringan itu
dibiarkan berkembang perlahan di atas 23 d dalam pot yang cukup besar untuk meniru kondisi
Protein dipisahkan oleh 2-D HALAMAN, diukur dengan analisis digital dan dianalisis oleh MS.
Kami mengajukan empat pertanyaan: (1) Berapa banyak protein daun padi berubah secara
reproduktif sebagai respon terhadap cekaman kekeringan ?; (2) lakukan cluster protein yang
responsif ke dalam kelompok-kelompok yang kohesif berdasarkan fungsi atau tanggapan ?; (3)
adalah perubahan dalam protein daun terbalik pada pengurasan ulang? dan (4) melakukan
tanaman disesuaikan dengan penghindaran kekeringan dan toleransi kekeringan menunjukkan
tanggapan yang berbeda dan tingkat reversibilitas yang berbeda?

Methode

2.1 Pertumbuhan tanaman

Dua genotipe kontras digunakan: IR62266-42-6-2 (dataran rendah indica) dan CT9993-5-10-1-M
(dataran tinggi japonica). Kultivar ini berbeda dalam penyesuaian osmotik, hardpan kapasitas
penetrasi, dan kedalaman sistem akar [27]. Percobaan dilakukan dalam pot polivinil klorida
(Diameter 20 cm, kedalaman 55 cm) di rumah kaca di Internasional Markas besar Rice Research
Institute di Los Baños, Filipina. Aspek fisiologis dari eksperimen, termasuk desain eksperimental
dan pot dan tanah karakter, seperti yang dijelaskan oleh Wade et al. [30]. Pada 20 d setelah
disemai (DAS), kekeringan dimulai dengan menahan air; pot ditimbang setiap hari untuk
merekam massaair hilang karena transpirasi. Pada 43 DAS, ketika tanaman punya terjadi sekitar
4 kg air, mereka dikembalikan (Gambar 1a). Sampel daun diambil dalam rangkap tiga dari
keduanya Menekankan / memasang kembali tanaman dan terus menerus disiram kontrol pada
empat kali: (a) 38 DAS, (b) 43 DAS, (c) 5 d setelah pengurasan ulang (48 DAS), dan (d) 10 d
setelah pengurasan ulang (53 DAS). Untuk setiap titik data (kultivar? Pengobatan? Sampling
tanggal), tiga tanaman diambil sampelnya secara terpisah dan protein daun mereka dianalisis
oleh 2-DE.

2.2 Protein extraction and 2-DE

Prosedur ekstraksi berdasarkan pada Damerval et al. [31] dan Kamo dkk. [32], dengan beberapa
modifikasi. Sampel jaringan triplicate digiling dalam nitrogen cair dan ditangguhkan dalam 10%
w / v TCA alam aseton dengan 0,07% b / v DTT pada? 20? C selama 1 jam, diikuti dengan
sentrifugasi selama 15 menit pada 35 000 g. Pellet dicuci dengan aseton es dingin yang
mengandung 0,07% DTT, diinkubasi pada ? 20? C selama 1 jam dan disentrifugasi lagi pada 4?
C. Langkah ini diulang tiga kali dan kemudian pelet telah terliofilisasi. Bubuk sampel kemudian
dilarutkan dalam lisis buffer (9.5 M urea, 2% w / v CHAPS, 0,8% b / v Pharmalyte pH 3–10, 1%
w / v DTT) dan konsentrasi proteinnya ditentukan oleh Bradford assay (Bio-Rad) dengan BSA
sebagai standar. 2-DE dilakukan seperti yang dijelaskan [33, 34] dengan minor modifikasi.
Untuk gel analitis dan preparatif, 18 cm IPG strip (pH 4-7) direhidrasi semalam dengan 350 L
buffer rehidrasi (8 M urea, 0,5% CHAPS, 20 mM DTT, 0,5% v / v penyangga IPG) dalam
nampan reswelling (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Swedia) di suhu kamar. Untuk gel
analitis dan preparatif, 120 g dan 1,5 mg protein dimuat, masing-masing. IEF dilakukan pada 20?
C dengan Pharmacia Mutiphore II dan kit DryStrip (Amersham Pharmacia Biotech). Itu kondisi
berjalan adalah sebagai berikut: 500 V selama 1 jam, diikuti oleh 1000 V selama 1 jam, dan
akhirnya 3000 selama 16 jam. Fokus strip disetimbangkan dua kali selama 15 menit dalam 10
mL equilibrium larutan. Kesetimbangan pertama dilakukan dalam a larutan yang mengandung 6
M urea, 30% b / v gliserol, 2% b / v SDS, 1% w / v DTT, dan 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.8.
Kesetimbangan kedua dilakukan dalam larutan yang dimodifikasi oleh penggantian DTT oleh
2,5% b / v iodoacetamide.Pemisahan dalam dimensi kedua dilakukan oleh SDS-PAGE dalam
lempengan vertikal akrilamida (12% total monomer, dengan 2,6% crosslinker) menggunakan
PROTEAN II Multi Cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Bintik-bintik protein dalam gel analitis
divisualisasikan oleh pewarnaan dengan perak nitrat pada dasarnya seperti yang dijelaskan oleh
Blum dkk. [35] dengan beberapa modifikasi (http: // www. weihenstephan.de/blm/deg). Gel
preparatif bernoda dengan colloidal Coomassie Brilliant Blue G-250 [36, 37].

2.3 Image and data analysis

Gel bernoda perak dipindai menggunakan densitometer GS-700 (Bio-Rad) pada resolusi 600 titik
dan 12-bit per inci. Perlakuan gambar, deteksi titik, dan protein kuantifikasi dilakukan
menggunakan perangkat lunak Melanie 3 (GeneBio, Jenewa, Swiss). Deteksi tempat dilakukan
pada gambar 12-bit menggunakan parameter yang dioptimalkan sebagai berikut: jumlah
kelancaran, 1; Laplacian ambang batas, 5; ambang parsial, 5; saturasi, 90; puncaknya meningkat,
100; batas minimum, 10. Pencocokan gel adalah dilakukan oleh Melanie 3 perangkat lunak dan
pasangan tempat itu dikonfirmasi secara visual. Plot pencar di antara gel setiap titik data
ditampilkan untuk memperkirakan kesamaan gel atau kesalahan eksperimental dan kalibrasi
dilakukan menggunakan laporan pemasangan kapanpun diperlukan (Melanie 3 user manual).
Massa molekul protein pada gel adalah ditentukan oleh co-elektroforesis protein standar penanda
(Amersham Pharmacia Biotech) dan pI dari protein ditentukan oleh migrasi protein bintik-bintik
pada 18 cm IPG (pH 4-7, linier) strip. Satu gel 2-D per tanaman dijalankan dan persen volume
setiap tempat itu diperkirakan dan dianalisis. Mempertimbangkan dua genotype (CT9993 dan
IR62266) dan dua perawatan (baik-minum dan kekeringan / kekeringan-rewatered), empat
genotipe X kombinasi perlakuan dianalisis dengan analisis satu arah varians (ANOVA) untuk
setiap tahap (38, 43, 48 dan 53 DAS) secara terpisah.

2.4 Identifikasi protein dan pencarian basis data

Bintik-bintik protein dipotong dari poliakrilamida preparative gel yang telah diwarnai dengan
Coomassie Brilliant Blue G-250. Protein dicerna dengan tripsin dan dianalisis oleh MALDI-MS
menggunakan Micromass TofSpec 2E spektrometri massa (Micromass, Manchester, UK) atau
ESI-Q-TOF MS / MS menggunakan Micromass Q-TOF MS di Fasilitas Analisis Proteome
Australia (APAF). Dua pendekatan digunakan untuk identifikasi protein oleh peptide massa.
Pendekatan pertama adalah untuk melawan SWISS-PROT dan basis data TrEMBL dengan
PepIdent perangkat lunak (http://www.expasy.ch/tools/pepident.html), dengan Viridiplantae
sebagai kategori taksonomi. Kedua pendekatan sedang mencari melawan NCBInr dan pdbEST
dengan ProteinProspector (http://prospector.ucsf.edu/ ucsfhtml3.4 / msfit.htm) dengan Oryza
sativa sebagai taksonomi kategori. Kueri basis data dilakukan untuk monoisotop massa peptida
menggunakan parameter berikut: toleransi massa peptida dari 100 ppm; jumlah maksimum
belahan tryptic yang terlewat, 1. Modifikasi yang diizinkan termasuk oksidasi Met, konversi
peptida N-terminal Gln to pyro-Gln, asetilasi dari N terminus. Cys residu diasumsikan telah
berkurang dan teralkilasi oleh iodoacetamide ke carboxyamidomethyl cysteine (CAM).

2.5 Isolasi RNA dan konstruksi cDNA

Populasi Total RNA diekstrak dari berbagai jaringan menggunakan Trizol seperti yang
dijelaskan oleh pabrikan (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA). Double-stranded, cDNA yang
tumpul berakhir disiapkan dengan konstruksi perpustakaan SMART cDNA kit (Clontech, Palo
Alto, CA, USA) menggunakan 1 g total RNA. The cDNA diperkuat oleh PCR jarak jauh.

2.6 Kloning cDNA untuk protein 23

Urutan asam amino EDFFVK, berasal dari ESIQ-TOF MS / MS protein 23, digunakan untuk
mendesain merosot maju primer 5'-GARGAYTTYTTYGTBAA 3 'dan membalikkan primer 5'-
TTVACRAARAARTCYTC-3' (R = G atau A, Y = C atau T, B = G atau C atau T, V = G atau C
atau T). Ini primer digunakan bersama dengan mundur SMART dan maju primer masing-
masing, untuk memperkuat 3'- dan 5'-bagian dari protein pengkodean cDNA 23. Template terdiri
dari 2 L dari SMART double-stranded (ds) Populasi cDNA disintesis dari mRNA kekeringan
Daun-daun. Kondisi PCR berikut digunakan: mulai panas pada 94? C (4 menit) diikuti oleh 35
siklus denaturasi pada 94? C (30 detik), annealing pada 51? C (1 menit), dan ekstensi pada 72? C
(1 menit). Dua produk PCR dikloning ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI,
USA) dan diurutkan menggunakan otomatisasi fasilitas sequencing di MediGenomix,
Martinsried, Jerman. Urutan rancangan protein pengkodean cDNA 23 diperoleh dengan
menggabungkan urutan dari 5'- dan 3'-bagian. Untuk mengkonfirmasi urutan cDNA dan
memperjelas urutan di situs annealing degenerasi primer, protein nondegenerate 23 primer
spesifik (depan: 5'-GCCTCA-AAGGAGTTGGACTACTTCA-3 '; sebaliknya: 5'-
TGAAGTAGTCCAACTCCTTGAGGC-3 ') adalah dirancang berdasarkan rancangan urutan
cDNA dan digunakan untuk memperkuat bagian pusat cDNA dari Populasi SMART ds-cDNA.
Kloning dan pengurutan dari amplikon mengarah pada finalisasi full-length urutan protein cDNA
23.

2.7 Analisis urutan DNA dan protein

Urutan protein 23 yang diprediksi dari Urutan cDNA dibandingkan dengan urutan GenBank
menggunakan FASTA (http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta/ cgi / searchx.cgi?) dan BLAST
(http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /). Urutan protein juga dianalisis menggunakan ScanProsite [38]
dan SignalP V2 [39]. Perataan ganda dilakukan menggunakan program ClustalX [40]. Untuk
analisis filogenetik, urutan asam amino awalnya selaras menggunakan program ClustalX.
Tetangga bergabung (NJ) analisis dilakukan berdasarkan jarak berpasangan antara urutan asam
amino menggunakan program TETANGGA dan PROTDIST dari PHYLIP 3.57c paket [41].

3. Hasil

3.1 Stres kekeringan sebanding di dua kultivar

Di bawah kondisi yang terisi dengan baik, IR62266 terakumulasi berat kering lebih cepat dari
CT9993 (Gbr. 1c). Akumulasi berat kering lebih lambat pada tanaman yang tertekan dari sekitar
13 hari setelah penyiraman terakhir (33 DAS), efek stres lebih ditandai di IR62266. Kedua
kultivar terjadi 3 kg air dalam 18 d (38 DAS) dan 4 kg air dalam 23 d (43 DAS). Tumbuhan
dihidupkan kembali pada 23 hari setelah menahan air, menyebabkan akumulasi lebih cepat dari
materi kering oleh kedua kultivar. Daun bergulung, tanda kekeringan yang terlihat, adalah
terlihat pada kedua kultivar setelah 17 hari tanpa penyiraman. Daun-daun membuka gulungan
dalam waktu 1 hari setelah pengurasan ulang. Potensi air daun rembulan merefleksikan
ekuilibrasi jaringan tanaman dalam kontinum tanah-tanaman-udara dan sering digunakan untuk
menilai status air kontinum [2]. Stres kekeringan menghasilkan sedikit tetapi signifikan
penurunan potensi air daun sebelum kematian (Gambar 1b). Itu penurunan diamati pada 13 hari
setelah penyiraman terakhir dan awalnya lebih cepat di IR62266 daripada di CT9993, mungkin
karena tingkat pertumbuhan awal yang lebih cepat dari yang sebelumnya, sebagaimana yang
dinilai oleh akumulasi berat kering. Air daun tengah hari potensi tanaman yang disiram secara
signifikan lebih rendah dari potensi daun daun semak (Gambar 1b). Kekeringan menyebabkan
penurunan lebih lanjut dalam parameter ini di kedua kultivar. Penghijauan secara signifikan
membalikkan kekeringan diinduksi penurunan potensi air daun sebelum kematian di keduanya
kultivar dan potensi air daun tengah hari di CT9993 tetapi tidak memiliki efek yang ditandai
pada daun tengah hari potensi air di IR62266. Alasan untuk efek terakhir ini tidak jelas tetapi
memperlambat pertumbuhan akar dan lebih cepat pemulihan pertumbuhan daun di IR62266
(tidak ditampilkan) mungkin menjadi faktor. Kedua kultivar mulai mengalami stres sekitar 13
hari setelah penyiraman terakhir. Stres mempengaruhi materi kering akumulasi dan potensi air
daun daun sebelum a lebih besar di IR62266 daripada di CT9993, tetapi tengah hari potensi air
daun sebanding di dua kultivar. Dengan demikian, analisis proteomik dilakukan pada dua
kultivar yang cukup sebanding dengan daun status air.