Bioquímica y Farmacia

UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
"OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN EN LA FABRICACIÓN

DE TEQUILA EN LA EMPRESA "TRANCAHUAICO" OÑA-PROVINCIA DEL
AZUAY"
Tesis previa a la obtención del

Título de Bioquímico Farmacéutico
AUTORES:
JUAN ISRAEL GUILLERMO QUINDE
ANDREA FERNANDA MACÍAS MATAMOROS
DIRECTORA:
DRA. SILVANA PATRICIA DONOSO MOSCOSO
ASESORES:
DRA. PAULINA DEL ROCIO ESCOBAR HINOJOSA
DRA. SILVIA JOHANA ORTIZ ULLOA
CUENCA – ECUADOR
Juan Israel Guillermo Quinde

Andrea Fernanda Macías Matamoros Página 1
RESUMEN
El objetivo fue realizar un estudio comparativo del rendimiento alcohólico de tequila a
partir de diferentes fermentos (Cepa de Saccharomyces cerevisiae del fermento
artesanal, Saccharomyces cerevisiae Danstil EDV 493 y Saccharomyces cerevisiae
ZWLDTY48) a partir de jugo de agave reposado y no pasteurizado que reflejaban las
condiciones reales a nivel de fábrica.
Se identificó y aisló la levadura Saccharomyces cerevisiae presente en el

chaguarmishqui y el fermento artesanal, aplicando la siembra por agotamiento en
placas de medio YPD y la confirmación mediante pruebas bioquímicas y fermentativas.
La fermentación se llevó a cabo en 5 replicados para cada una de las cepas de
estudio. Los inóculos se introdujeron en muestras de jugo de agave que fueron
sometidas a condiciones similares a la fábrica.
A nivel de laboratorio, se observó una diferencia significativa entre los volúmenes de

cuerpo (P<0.001) y los rendimientos alcohólicos (P<0.001) de los tres fermentos. Con
la S. cerevisiae ZWLDTY48 se obtuvo el mayor volumen de cuerpo en la destilación, el
cual fue 4.1 veces mayor que la S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) y ésta a su
vez fue 7.6 veces mayor que la S. cerevisiae silvestre (P<0,001).El rendimiento
alcohólico relativo obtenido para la S. cerevisiae ZWLDTY48 fue 0.88 veces mayor que
la S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) y ésta a su vez fue 1.52 veces mayor que
la S. cerevisiae silvestre (P<0,001). El rendimiento alcohólico utilizando la S. cerevisiae
ZWLDTY48 fue 11.2% y 9.7% a nivel de laboratorio y de fábrica, respectivamente.
Palabras claves: Saccharomyces cerevisiae, jugo de agave, tequila, fermentación,

chaguarmisqui.

ABSTRACT
The objetive was realize a comparative study of the alcoholic yield of tequila was
carried out from different yeasts strains (Saccharomyces cerevisiae strain artisanal
ferment, EDV 493 Danstil Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces
cerevisiae ZWLDTY48) using agave juice. This juice was slightly ripened and
unpasteurized, reflecting the actual conditions at factory level.
The yeast Saccharomyces cerevisiae was identified and isolated from the craft
ferment and “chaguarmishqui”. It was performed using the exhaustion sowing
technique in YPD plates. Confirmatory analyses were carried out using biochemical
and fermentation tests. Fermentation was carried out in 5 replicates for each of the
three study yeast strains. The inoculums were introduced in agave juice samples
and then those underwent similar conditions than at the factory.
At laboratory level, a significant differences between the distillation corp’s volume

(P<0.001) and the alcoholic yield (P<0.001) of the three ferments were observed.
Using S. cerevisiae ZWLDTY48, the distillation corp’s volume was the highest. It
was 4.1 times higher than S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) which
subsequently was 7.6 times higher than S. cerevisiae silvestre (P<0,001). The
relative alcoholic yield obtained using S. cerevisiae ZWLDTY48 was 0.88 times
higher than S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) which was 1,52 times higher
than S. cerevisiae silvestre (P<0,001). The alcoholic yield using S. cerevisiae
ZWLDTY48 was 11.2% and 9.7% at laboratory and factory level, respectively.
Key words: Saccharomyces cerevisiae, agave juice, tequila, fermentation,

chaguarmishqui.

ÍNDICE
RESUMEN…………………………………………………………………………………..2
ABSTRACT…………………………………………………………………………………3
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...........15
1. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………………….16
1.1. GENERALIDADES DE LA AGAVÁCEA AMERICANA………………………….16
1.1.1. ORIGEN………………………………..…………………………………………..16
1.1.2. TAXONOMÍA………………………………………………………………...…….17
1.1.3. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA…………………………………………………......17
1.1.4. USOS DEL AGAVE………………………………………………...……………..19
1.2. CHAGUARMISHQUI………………………..………………………………………20
1.2.1. EXTRACCIÓN DEL CHAGUARMISHQUI………………………...……………22
1.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA………………………………………………….22
1.3.1. FERMENTACIÓN A ESCALA INDUSTRIAL…………………………………...25
1.3.1.1. Temperatura……………………………………………………………….…….26
1.3.1.2. pH……………………………………………………………………………...….26
1.3.1.3. °Brix……………………………………………………………………………….26
1.3.1.4. Aireación…………………………………………………………………………26
1.4 TEQUILA……………………………………………………………………………...27
1.4.1. DEFINICIONES…………………………………………………………………....27

1.4.2. PROCESO DE ELABORACIÓN DEL TEQUILA……………………………….27
1.4.2.1. Jima del agave……………………………………………………………….….27
1.4.2.2. Cocimiento de la piña………………………………………………….……….28
1.4.2.3. Extracción de la miel…………………………………………………...……….28
1.4.2.4. Formulación…………………………………………………………..………….28
1.4.2.5. Fermentación…………………………………………………….…………..….28
1.4.2.6. Destilación……………………………………………………...…………….….29
1.5. LEVADURAS…………………………………………………………………………32
1.5.1. Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………….33
1.5.1.1 Composición química………………………………………...………………….34
1.5.1.2. Requerimientos Nutricionales para la levadura Saccharomyces

cerevisiae………………………………………………………………………………….36
1.5.1.3. Inhibidores de crecimiento…………………………………………………….38
1.5.1.4. Requerimientos físico-químicos………………………………………………38
1.5.1.5. Tolerancia al etanol…………………………………………………………….39
2. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….…40
2.1. MÉTODOS…………………………………………...………………………....……40
2.1.1. DISEÑO Y TIPO DE INVESTIGACIÓN…………………………………………40
2.1.2. ZONA DE ESTUDIO…………………………………………………………..…40
2.1.3. TEMPERATURA Y EXTENSIÓN………………………………………..………41
2.1.4. ALTITUD……………………………………………………………………………41
2.2. MUESTREO Y TAMAÑO DE LA MUESTRA……………………………..………41

2.2.1 TIPO DE MUESTREO…………………………………………………………..…41
2.2.2. MUESTREO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL

FERMENTO……………………………………………………………………………….41
2.2.3. MUESTREO PARA LOS ENSAYOS DE FERMENTACIÓN Y

DESTILACIÓN…………………………………………………………………………….41
2.3. CRITERIOS DE INCLUSIÓN y EXCLUSIÓN.……………………………………42
2.4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA……………………………………...……42
2.4.1. EXAMEN FÍSICO………………………………………………………………….43
2.4.1.1. Características organolépticas………………………………………………...43
2.4.1.2. Concentración °Brix……………………………………………………………..43
2.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL CHAGUARMISHQUI Y FERMENTO

ARTESANAL………………………………………………………………………………44
2.6. CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae DEL

FERMENTO ARTESANAL……………………………………………………..……….46
2.6.1. TINCIÓN DE AZUL DE METILENO Y SUERO FISIOLÓGICO………………47
2.6.2. PRUEBAS FERMENTATIVAS…………………………………………………..47
2.6.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS……………………………………………………….47
2.6.4. FLOCULACIÓN……………………………………………………………………48
2.7. AISLAMIENTO DE Saccharomyces cerevisiae………….………………………48
2.8. FERMENTACIÓN……………………………………………………………………48
2.8.1. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae DEL

FERMENTO ARTESANAL……………………..…………………………………..……48

2.8.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae DANSTIL

EDV 493……………………………………………………………………………………49
2.8.3. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae

ZWLDTY48……………………………………………………………………………..…49
2.9. PROCESO DE FERMENTACIÓN EN EL LABORATORIO……………...……..49
2.10. DESTILACIÓN EN EL LABORATORIO…………………………………………49
2.11. PROCESO DE FERMENTACIÓN y DESTILACIÓN EN LA

FÁBRICA.……………………………………………………………………………….…50
2.12. CÁLCULO DEL RENDIMIENTO ALCOHÓLICO……………………………….51
2.13. MATERIALES………………………………………………………………………52
2.13.1. EQUIPOS Y MATERIALES……………………………………………………..52
2.13.2. TINCIONES………………………………………………………………………53
2.13.2.1. Azul de metileno………………………………………………………………53
2.13.3. MEDIOS DE CULTIVOS…………………………………………………..……53
2.13.3.1. Medio Yeast pepton dextrose (YPD)…………...…………………….……..53
2.13.3.2. Agua de peptona………………………………………………………………54
2.13.4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS……………………………………………………...54
2.13.4.1. Agar bismuto sulfito……………………………………………………………55
2.13.4.2. Pruebas de Fermentación…………………………………………………….56
2.13.5. PRUEBA DE LA FLOCULACIÓN………………………………………………57
2.14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO…………………………………………………………58
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………59

3.1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS A NIVEL DEL LABORATORIO……………….59
3.2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS A NIVEL DE LA FÁBRICA…………………….65
4. CONCLUSIONES……………………………………………………………………...67
5. RECOMENDACIONES…………...……………………………………………...…...68
6. REFERENCIAS…………………………………………………………………...…...69
7. ANEXOS………………………………………………………………………………..79
8. ILUSTRACIONES…………………………………………………….………………111





AGRADECIMIENTOS
A Dios por darnos la vida, a nuestros familiares por estar siempre a nuestro lado y
brindarnos su apoyo incondicional.
A nuestras asesoras Dra. Johana Ortiz, Dra. Paulina Escobar, y Dra. Sonia
Goercke por su persistente guía, quienes hicieron posible la conclusión de este
trabajo, ya que con sus constantes aportes logramos la finalización del mismo.
Y un agradecimiento especial al Sr. Salvador Ortega y a su familia, por habernos

permitido la realización de nuestra tesis en su fábrica, brindándonos un apoyo
mutuo durante el desarrollo de esta labor.
A los docentes de nuestra querida Escuela Bioquímica y Farmacia que nos han
acompañado durante el largo camino, brindándonos siempre su orientación con
profesionalismo ético en la adquisición de conocimientos y afianzando nuestra
formación universitaria. En especial a la Dra. Silvana Donoso por su aporte
absoluto.
A todas y todos quienes de una u otra forma han colocado un granito de arena para
el logro de este Trabajo de Grado, agradecemos de forma sincera su valiosa
colaboración.
JUAN Y ANDREA

DEDICATORIA
A mi hijo, Santiago y mi esposo, Juan, que son mi razón de vivir y me dan fuerzas
para seguir adelante. Porque juntos haremos de nuestra vida un horizonte mejor.
Los amo.
A mis padres, Jenny y Eduardo, por su inmenso amor, comprensión y apoyo.

Gracias por brindarme el regalo de la educación y ser ejemplo de lucha. Por
enseñarme que el sacrificio de hoy, es el triunfo del mañana.
A mis hermanos, José y Andrés, por nuestros momentos juntos y porque han sido
mi soporte y los mejores amigos que he podido tener. También a mis pequeños:
Matías y Eliana; deseo verlos crecer y triunfar.
A mi mami Rosa, por sus añorados consejos, y tan tiernos abrazos. A mis tíos y
primos, que son como si fueran mis padres y hermanos. Porque junto a ustedes
aprendí la importancia de la unión y el amor a la familia. Los extraño a diario.
ANDREA
Dedico este trabajo a Dios por darme la vida y bendecirme con una hermosa
familia, a mis padres Jorge y Olga por el apoyo incondicional y por iluminar mi
camino con ejemplo de respeto y responsabilidad; a mis hermanos Fernanda,
Lenin y Andrés por ser mis fieles compañeros, cómplices y amigos, a mi tío Claudio
y a mi abuela Mercedes por enseñarme que en la vida reír es muy importante.
A mi esposa Andrea y a mi hijo Santiago por ser el pilar fundamental de mi vida y

por ser la inspiración de seguir adelante cada día.
JUAN

INTRODUCCIÓN
El tequila se produce desde mediados del siglo XIX. En la Sierra Ecuatoriana,

especialmente en el norte y austro existen comunidades que se dedican a la
producción de tequila.
En algunas zonas, esta producción es considerada como emprendimientos y son

patrocinados por los gobiernos locales para dinamizar la economía de las familias.
Tal es el caso de la Fábrica Trancahuaico en el cantón Oña, donde producen el
primer tequila del Ecuador con registro sanitario.
El tequila se produce a partir del agave, en el cual se “chagua” (extraer) el “misqui”

(agua miel), de dónde proviene su nombre. Este líquido dulce, es sometido a un
proceso de fermentación y destilación para la obtención de tequila.
En la Fábrica Trancahuaico, se produce el tequila con la levadura propia de la

planta, Saccharomyces cerevisiae, sin embargo el rendimiento no es el deseado.
El objetivo de este trabajo fue optimizar el proceso de fermentación en la

elaboración de tequila de la Fábrica “Trancahuaico”; el mismo que consistió en
hacer una comparación entre los diferentes tipos de fermentos comerciales y el
artesanal, en cuanto a la producción de etanol tanto a nivel de laboratorio e
industrial.
Con este estudio se busca beneficiar a la Fábrica Trancahuaico, mejorando su

proceso de fermentación y su economía, incrementado la producción de tequila.

CAPITULO 1
1. MARCO TEÓRICO
1.1. GENERALIDADES DE LA AGAVÁCEAE AMERICANA
1.1.1 ORIGEN
El agave (Agavaceae. americana L), es una planta perenne resistente a terrenos

áridos. Su nombre viene de la palabra griega “agave” que significa “noble” y se
refiere a la alta inflorescencia escamosa presente en esta planta. (Freire Fierro,
2004).
Las palabras maguey y agave son sinónimos. La diferencia está en el uso que se le
da a la planta. Del maguey se produce el pulque, bebida fermentada muy popular
en México y de baja graduación alcohólica. El agave es la planta de cuyos jugos
fermentados y luego destilados se obtiene el mezcal o el tequila. (Ibarra, 2001)
El agave es originario del continente americano, con la mayor concentración de

especies nativas en México en donde se les conoce con el nombre de magueyes o
mezcales. (Sampedro, 2009). En Ecuador, el agave se encuentra a lo largo del
callejón interandino de la Sierra, frecuentemente como cercas vivas. (Cueva et al.,
1999).
Las plantas de agave pueden encontrarse en gran diversidad de hábitats, desde

valles y planicies hasta cerros y laderas pedregosas, incluyendo lugares
montañosos de gran altitud. Se desarrollan mejor, tanto a nivel individual como
poblacional, sobre planicies extensas con suelos aluviales, de profundidad y textura
medias y pH de neutro a ligeramente alcalino. Conviven también con variados tipos
de vegetación, destacando entre otros: la vegetación xerófita, pastizales,
matorrales, bosques, etc. (García, Méndez, y Talavera, 2001)

1.1.2 TAXONOMÍA
La determinación taxonómica es importante en el aprovechamiento y manejo del

agave. A continuación se describe una tabla con su división.
Tabla 1: Taxonomía del Agave americana

Fuente: Jurado y Sarzosa, 2007. Aspectos agrícolas de la cabuya negra
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Liliopsida
Orden Asparagales
Familia Agavaceae
Genero Agave
Especie Agave americana
1.1.3 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
El agave o maguey es una planta que retiene agua y evita la erosión, con raíz
generalmente superficial y que dependiendo del manejo agronómico y de las
condiciones ambientales puede llegar a producir hijuelos o rizomas en uno a tres
años, y en seis a ocho años otros productos (aguamiel, miel, pulque, mezcal,
tequila, fibras, quiote o escapo, bulbillos y semilla).
Las partes principales del agave o maguey son: raíz, hijuelo o rizoma, cogollo o
meristemo, piña o bola, penca u hoja, espina o puya y escapo o quiote. En la
inflorescencia se producen las cápsulas con las semillas. Una planta puede llegar a
producir unas 100,000 semillas. (Comité de Sanidad Vegetal, 2007)
Las hojas de entre 15 y 30 cm. de ancho y más de un metro de largo, crecen desde
el suelo, grandes, lanceoladas y carnosas de color blanco-azulado o blanco-
grisáceo, saliendo todas desde el centro donde permanecen enrolladas a un tallo
central donde se van formando hasta su separación, con espinas en su borde de
casi 3 cm muy duras, rígidas y finas. (Figura 1)

Todas las hojas terminan en una aguja fina de unos 5 cm de longitud y de hasta 1
cm de ancho en su parte menos extrema.
Figura 1: Anatomía del Agave.

Fuente: acamextequila.com.mx./El agave
Florece una sola vez en su vida (muere tras esta floración), aunque no sin haber
dejado una copiosa descendencia en hijuelos o retoños de raíz en un tallo de unos
ocho o diez metros y una anchura superior a los 10 cm de diámetro de él; desde
más de la mitad de su longitud van saliendo pequeñas ramas en forma de pirámide
terminando cada una en un grupo de flores de color amarillo-verdoso, cada flor
tiene un tamaño de unos 5 a 10 cm. El fruto es una cápsula trigonal y alargada.
(Sampedro, 2009)
Los agaves se reproducen de manera sexual y asexual. La reproducción sexual se

logra mediante la polinización que efectúan algunos animales, principalmente
murciélagos nectarívoros, en menor grado, insectos diurnos y nocturnos
(palomillas, abejas, abejorros) y aves (colibríes, aves percheras).
En el maguey pulquero el sistema de reproducción es de tipo semélparo o

monocárpico, es decir, las plantas mueren después de reproducirse; la
semelparidad es una forma de reproducción poco común en las plantas con flores y
pudo haber evolucionado debido a la altura de la inflorescencia, ya que las flores a
mayor altura son más atractivas para los polinizadores; subsecuentemente, al
incrementar las plantas progresivamente su esfuerzo reproductivo, los recursos

asignados al despliegue floral alcanzaron un máximo, causando la muerte de la

planta.
La producción de frutos y semillas es grande en los agaves; producen hasta 65000

semillas, y una vez maduras son dispersadas por el viento.
La mayoría de los agaves se propaga de manera asexual, produciendo clones en

diferentes partes de la roseta o la inflorescencia. Los hijuelos se desarrollan en la
base de la planta, o mediante estolones emergen a alguna distancia de la planta
madre, producen raíces y, con el tiempo, crecen de manera independiente. (Abisai,
2007)
1.1.4 USOS DEL AGAVE
El agave ha tenido una gran diversidad de usos desde tiempos muy remotos, por
ejemplo, ha sido utilizado como alimento, para la obtención de fibras textiles, para
la construcción, entre otros. (Tabla 2)
Uno de los usos más relevantes de un número importante de especies de Agave;

es la elaboración de mezcal o tequila y representa una actividad económica en
potencia para el desarrollo de las regiones productoras de agave. El maguey está
disponible para su uso en la elaboración de mezcal cuando adquiere una edad
entre los 7 y los 12 años (punto de madurez fisiológica), lo que varía según la
especie y de las condiciones agroecológicas y ambientales a las que hayan sido
expuestos. (García, Méndez, y Talavera, 2001.)

Tabla 2: Usos que se les da a varias especies de Agave, productos y parte de la

planta empleada
Fuente: García, Méndez, y Talavera, 2001. El género Agave spp. en México
USO PARTE DE LA
PLANTA
Cercas, casas, corrales. Escapo floral (quite)
Tejas. Canales para colectar Hojas
agua de lluvia.
CONSTRUCCIÓN
Materiales compuestos: Residuos de fibra
resinas termoplásticas o
termófilas, fibras.
Cordelería, y cestería. Fibras de hoja
Escobetillas y cepillos para
FIBRAS
limpieza. Estropajos, tejido y
vestuario.
Arcos florales Fibras de las hojas
ORNAMENTAL En jardines, calles. Planta completa
Jabón o detergente para Hojas, tallos y raíces

trastes y ropa.
DOMESTICO
Macetas, recipientes para Hojas y tallo (piña)
agua.
Industria química, Hojas, raíces, tallo y
farmacéutica, medicamentos y semilla.
productos esteroides
(saponinas).
OTROS USOS
Productos de celulosa para Hojas (pulpa, residuos
papel. del desfibramientos,
Producción de etanol, celulosa bagazo)
y glucosados. Jugos
1.2 CHAGUARMISHQUI
El chaguarmishqui es un líquido dulce, de sabor agradable, color ambarino,

inestable, que si hace calor, debe ser procesado en el día para evitar la
fermentación. El chaguarmishqui y aguamiel son sinónimos del néctar del maguey,
se los denomina de manera diferente dependiendo del lugar donde se haga uso de
ésta bebida. En Ecuador, se lo conoce como chaguarmishqui, mientras que en
México se lo conoce como aguamiel. (Ñamarín, 2009)

El chaguarmishqui o aguamiel (Figura 2), por diversos procedimientos, permite

obtener bebidas estimulantes o fermentadas como el pulque, similar a una chicha,
y del líquido obtenido del corazón asado, se producen por destilación, aguardientes
de alta graduación alcohólica como el mezcal y tequila. Además de México y
Mesoamérica, su utilidad como alimento ha sido señalada en todo el arco andino
desde Colombia y Venezuela hasta Ecuador y Perú, donde se aprovecha el
chaguarmishqui, el que es empleado para la fabricación de bebidas fermentadas.
(Allauca, 2011)
Una planta de Agave puede producir hasta 2000 litros de aguamiel, o sea más de
100 libras de azúcar (Posee azúcares reductores totales (en glucosa) 6 – 12 g/100
mL y azúcares reductores directos (en glucosa) 3 g/100 mL). (Pardo, 2005)
Figura 2: Chaguarmishqui
Fuente: Autores
Cada 100 g de chaguarmishqui contienen 5.30 g de extracto no nitrogenado y

0.4 g de proteínas, cantidad que aunque parece baja, es interesante por su
composición en aminoácidos esenciales como: lisina, triptófano, histidina,
fenilalanina, leucina, tirosina, metionina, valina y arginina. (Ramírez, 2010)
Contiene vitaminas del complejo B, niacina (0.4 a 0.5 mg), tiamina (0.0 2mg) y
riboflavina (0.03 mg), y entre 7 y 11 mg de vitamina C, además de hierro (0.7 mg),
calcio (11 mg) y fósforo (34 mg) por cada 100 g de aguamiel. (Allauca, 2011)

1.2.1 EXTRACCIÓN DEL CHAGUARMISHQUI
Cuando la planta de agave llega a su madurez, comienza a engrosarse el

meristema floral, anunciando la formación del vástago florífero.
El operador se coloca de frente a la planta, haciéndose un camino, despejando las

hojas que están rodeando la mata, para lo cual las corta a unos 30 o 40 cm. del
suelo, de manera que le permitan acercarse sin herirse. Una vez alcanzado el
centro, corta el meristema y con una barreta hace una cavidad en el centro de la
planta, en la que se acumulará la savia.
La cavidad se la protege con una piedra o un pedazo de hoja de la misma planta, a

fin de conservar la humedad del depósito e impedir que los animales domésticos,
abejas, insectos o pájaros, sean atraídos.
Diariamente se retira la savia producida por la planta, que es llamada “aguamiel”,

después de lo cual se raspa el fondo de la cavidad para evitar la cicatrización. Se
utiliza para esto un objeto áspero y con bordes afilados (como una cuchara, un
tenedor, un raspador) adelgazando de algunos milímetros el parénquima y
profundizando la cavidad. Algunas personas lo retiran hasta 3 veces por día si hace
mucho calor, aunque lo más corriente es sacarlo por la mañana y la tarde.
A medida que avanza la madurez, aumenta el contenido de almidón y azúcares,

mejorando el sabor. Se señala además que los dos primeros días iniciales el
aguamiel, es muy fuerte y no es apta al consumo humano, empleándose como
alimento de cerdos. Se empieza a usar el líquido sólo a partir del tercer día.
(Romo, 1996)
1.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
La fermentación alcohólica, es un proceso anaeróbico realizado por levaduras y

algunas clases de bacterias, donde el sustrato mono y di sacáridos en su mayoría,
es transformado principalmente en alcohol etílico y dióxido de carbono; con la
generación de equivalentes de reducción de los compuestos NADH/NAD+,
NADHP/NADP+ y ATP. Los procesos catabólicos inician luego de que los azúcares

son transformados en glucosa-6-fosfato o fructosa-6-fosfato. A partir de allí se

desarrolla la glucólisis y el metabolismo del piruvato. (Acosta, 2012) (Figura 3)
Ecuación 1: Estequiometria de la ruta EMP o Embden-Meyerhorf-Parnas.
Figura 3: Sistema de reacciones en la glucolisis.

Fuente: Nielsen, 2003.
El ácido pirúvico obtenido en la glucólisis puede seguir dos vías. Una vía es
aeróbica (respiración) y la otra es anaeróbica (fermentación). La vía aeróbica es la
vía principal del metabolismo energético de las levaduras en presencia de oxígeno
y la vía anaeróbica es la vía fermentativa que funciona en ausencia de un aceptor
externo de electrones. (Acosta, 2012)

En las levaduras, el piruvato se descarboxila a aldehído para la generación de

etanol, sin la intervención de Acetil-CoA. (Figura 4)
Figura 4: Metabolismo fermentativo en las levaduras.

El acetato presente en el citosol, es posible sintetizar Acetil-CoA que se emplea

como precursor de ácidos grasos, y por la acción del complejo enzimático piruvato-
deshidrogenasa el Acetil-CoA mitocondrial puede iniciar una regeneración del NAD
con reducción del piruvato a ácido láctico y/o acético, lo que se conoce como una
fermentación mixta. (Acosta, 2012) (Figura 5)
Figura 5: Metabolismo fermentativo mixto


Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a

nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae.
Glucosa + 2 ADP + 2 P = 2 Etanol + 2 CO2 +2 ATP
El rendimiento teórico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49

gramos de CO2. Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa
y el rendimiento en etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor teórico. (Ramírez &
Pedroza 2007)
1.3.1. FERMENTACIÓN A ESCALA INDUSTRIAL

La mayoría de las fermentaciones son procesos discontinuos, cuya cinética permite
que los equipos utilizados en este proceso a escala industrial sean operados en
intervalos. Al final del proceso, se procede a la recuperación de la levadura por
centrifugación. Este sistema tiene la ventaja de disminuir los requerimientos de
completa esterilización y así disminuye, el riesgo de pérdidas financieras y facilita
el manejo de materias primas. La desventaja de este sistema es la decreciente
productividad debido al largo tiempo de rotación y retraso en el crecimiento inicial.
Los procesos de fermentación discontinua son llamados también procesos en “lote.

A tiempo cero, la solución esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos (Saccharomyces crevesisiae) y se incuba en condiciones óptimas
de fermentación como un pH de 2.8 a 3.7 y una temperatura entre 28 y 37ºC. A lo
largo del proceso de fermentación se requiere de oxígeno (en forma de aire), un
agente antiespumante (aceite de silicona) y ácidos orgánicos o hidroxisales para
controlar el pH.
Una vez que una levadura y un sustrato (aguamiel) entran en contacto se requiere
optimizar el proceso. Las variables más importantes a ser consideradas son: la
temperatura, el pH y la aireación. (Fajardo & Sarmientos, 2007)
Se describen a continuación:

1.3.1.1. Temperatura
La temperatura óptima de crecimiento de las levaduras especialmente de

Saccharomyces cerevisiae es de 30 a 35ºC. La temperatura afecta el crecimiento
de manera notable, principalmente porque los microorganismos de una especie
dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperaturas, esto afecta de
manera importante el crecimiento microbiano.
1.3.1.2. pH
El pH es la medida de la concentración de iones hidrógeno y tiene un marcado

efecto en la velocidad de crecimiento y el rendimiento. También el pH es óptimo
para algunas especies como la de las levaduras que comprende un rango de 4.0 a
6.0. Un cambio en el valor de pH del medio puede afectar su composición y la
naturaleza de la superficie microbiana al disociarse ácidos y bases. El pH tiene una
gran influencia en los productos finales del metabolismo anaeróbico.
1.3.1.3. °Brix
El °Brix o grados Balling es otra escala del hidrómetro utilizada en la industria

azucarera. Normalmente las escalas brix se calibran a 15.6 a 20°C. Con la escala a
20°C, cada °Brix indica 1 gramo de sacarosa por cada 100 gr de líquido de agua.
En el chaguarmishqui la concentración de azucares varía entre 4.5 y 7 ºBaumé

según la Norma NMX-V-022-1972. Aguamiel. Hydromiel. Normas Mexicanas.
(Anexo 1), que corresponden a 5.5 y 10.5 °Brix respectivamente. (Anexo 2)
1.3.1.4. Aireación
La ausencia o abundancia de oxígeno permite una selección tanto de

microorganismo como de productos metabólicos. Cuando el cultivo se produce en
presencia de oxigeno molecular, la fermentación se denomina fermentación
aeróbica y cuando se realiza en ausencia de oxigeno molecular se denomina
anaeróbico. Si la fermentación es anaeróbico, la mayor parte del carbono se
emplea como energía y solo el 2% se asimila como material celular. (Nieto, 2009)

1.4 TEQUILA
1.4.1. DEFINICIONES
Tequila es una bebida alcohólica típicamente mexicana, obtenida por la

fermentación, destilación y rectificación de mostos preparados con los azúcares
extraídos de las cabezas del agave azul tequilana Weber, permitiéndose adicionar
hasta un 49% de otros azúcares en la preparación de dichos mostos.
Dependiendo de sus características, el tequila se clasifica en cuatro tipos (Macías,

2001):
1. Tequila blanco: es el producto obtenido de la destilación y rectificación,

ajustado con el agua de dilución a su graduación comercial. Es la
presentación más barata.
2. Tequila joven abocado: es el mismo que el tipo blanco, sólo que se realiza el
proceso de abocado consistente en suavizar el tequila mediante la adición
de uno o más suavizantes y colorantes permitidos.
3. Tequila reposado: es aquel que se obtiene luego de dejarse en recipientes
de madera de roble o encino durante por lo menos dos meses y que es
susceptible de ser abocado.
4. Tequila añejo: si el tiempo de maduración es de 18 meses, se produce el
tequila añejo que es el más caro en el mercado; también es susceptible de
ser abocado y ajustado con agua de dilución a su graduación comercial.
1.4.2. PROCESO DE ELABORACIÓN DEL TEQUILA
1.4.2.1. Jima del agave
La jima consiste en cortar las hojas de la planta al ras de la base, para dejar
únicamente la cabeza o corazón de agave. El proceso de fabricación se inicia con
el cocimiento y la molienda de las piñas o cabezas de agave.

1.4.2.2. Cocimiento de la piña
El cocimiento se realiza con vapor de agua a presión, ya sea en los tradicionales

hornos de mampostería o en autoclaves. El tiempo de cocimiento en hornos de
mampostería es de 48 horas mientras que en autoclaves es de 12 horas. La
finalidad de esta etapa es convertir la inulina (azúcar del agave) en azúcares
simples como fructuosa y sacarosa, los cuales son fácilmente fermentables.
Al terminar el cocimiento el agave cocido se transporta a molinos donde se corta en
pequeños trozos de algunos centímetros.
1.4.2.3. Extracción de la miel
Para extraer las mieles del agave cocido se aplica agua a presión al bagazo y
luego se exprime en bandas transportadoras. Las mieles son entonces separadas
para continuar el proceso industrial, mientras que el bagazo se desecha.
Las mieles extraídas del agave cocido son captadas en depósitos. Luego son
transportadas por tuberías a las tinas de formulación, para la elaboración de
Tequila 100 % de agave, según sea el caso.
1.4.2.4. Formulación
Consiste en mezclar las mieles del agave, en una proporción 51:49, con un
preparado de otras mieles, (azúcar estándar, piloncillo, glucosa, fructuosa, melaza,
etc.), para posteriormente ser fermentadas.
1.4.2.5. Fermentación
La fermentación se lleva a cabo en grandes tinas de acero inoxidable que son

cargadas con las mieles, también llamadas mostos. A los mostos se les agrega
agua, levaduras y nutrientes (vitaminas del complejo B) para la fermentación.
El tiempo de fermentación varía de acuerdo con la temperatura ambiental, y ésta, a

su vez, cambia con cada época del año. Sometida a bajas temperaturas en
invierno, la fermentación se prolonga más de 24 horas.

El mosto en plena fermentación es efervescente, y el movimiento cesa cuando las

levaduras terminan su trabajo. En ese momento finaliza el proceso y las levaduras
han terminado la conversión de azúcar en alcohol.
1.4.2.6. Destilación
Durante la destilación se aplica calor y presión, y se separan los fermentos en

productos de riqueza alcohólica y vinazas, estas últimas constituyen un producto
de desecho.
El proceso se efectúa en alambiques de cobre o acero inoxidable, e incluso en

torres de destilación continua. Los alambiques comunes constan de tres partes: la
olla o caldera, donde se deposita el mosto para su calentamiento; la columna o
capitel, que recoge y conduce los vapores, y el serpentín, en el que se enfrían los
vapores y se vuelven líquidos. (Figura 6)
Los puntos de ebullición de los diferentes compuestos así como los diversos
volúmenes y presiones del alambique ayudan a la separación de gases, que se
condensan en productos de mayor riqueza alcohólica. En la elaboración del tequila
son necesarias dos destilaciones, la primera llamada destrozamiento y la segunda,
rectificación.
Con la rectificación se incrementa la riqueza alcohólica y se eliminan los productos

indeseables, obteniendo así uno de mayor pureza. Al Tequila que se recibe del
destrozamiento o primera destilación se le llama “Tequila ordinario”, y el que
termina la segunda destilación o rectificación es considerado como “Tequila
blanco”. (Consejo Regulador de Tequila, 2011)

Figura 6: Destilación de etanol a nivel industrial

Fuente: manunez2@iq.uson.mx / 2014
En el proceso de destilación se pueden diferenciar las siguientes partes del

destilado:
● Volumen inicial (V1)
El volumen inicial corresponde al mosto tequilero antes de la destilación.
● Volumen final (V0)
El volumen final corresponde al residuo del volumen cocinado del chaguarmishqui.
● Cabeza del destilado
Corresponde a la parte más volátil del destilado. La cabeza es la primera en salir

por cuanto tiene puntos de ebullición más bajos. La cabeza está compuesta por

sustancias como la acetona, metanol, y varios ésteres que deben ser eliminados
pues son perjudiciales para el consumo humano.
Normalmente se separan los primeros 50 mL por cada 25 litros de destilado

cuando se utiliza un alambique de columna, o 100 mL por cada 20 litros cuando se
utiliza un alambique tradicional. Para evitar que las cabezas contaminen el resto
del destilado se debe controlar la temperatura, pues éstas entran en ebullición a
partir de los 55 - 78.4°C, normalmente tienen un sabor amargo. (Vásquez &
Vásquez, 2009)
● Cuerpo del destilado
Es la mejor parte de la destilación y entra en ebullición a partir de los 78.4 a 82°C a

una concentración de 45 a 65 % de alcohol. El cuerpo es reconocido por el
destilador a través de su color ampliamente transparente.
El cuerpo es el aguardiente propiamente dicho, el cual es almacenado a

temperatura ambiente en un depósito de acero inoxidable.
● Cola del destilado
Las colas o rabos tienen alcoholes con un punto de ebullición más elevado como
son los furfurales, presenta poco a poco una aprobación alcohólica que se va
debilitando y que producen en el destilado un mal sabor y es descartado.
Las fracciones de la destilación como: cabezas y colas que no son consideradas

como bebidas alcohólicas por tener compuestos nocivos para el ser humano,
pueden tener un uso industrial como solventes para el caso de las cabezas y, de
las colas se puede hacer una re destilación y obtener un alcohol de mayor grado
que también puede tener un uso industrial. (Villanueva, 2013)
● Pérdida del destilado
Es el volumen que se pierde durante la destilación. Se debe a las características

del aparato de destilación, si está bien armado y ajustado en las juntas; y debido a
un retardo de la condensación de vapores en el refrigerante.

● Rendimiento alcohólico
Es el rendimiento de alcohol obtenido del cuerpo en porcentaje, durante el proceso

de destilación. En donde:
 La cantidad real obtenida del producto, dividida por la cantidad teórica

máxima que puede obtenerse (100%) se llama rendimiento.
 La cantidad de producto que debiera formarse si todo el azúcar se

consumiera en la reacción, se conoce con el nombre de rendimiento teórico.
1.5 LEVADURAS
Las levaduras son hongos muy pequeños, unicelulares, que sólo pueden verse a
través de un microscopio. Se alimentan de azúcares de los que obtienen energía
en el proceso denominado fermentación. Las levaduras son raramente tóxicas o
patogénicas y pueden ser utilizadas en la alimentación humana. A pesar de que su
contenido de proteínas no excede el 60%, su concentración de aminoácidos
esenciales tales como la lisina, el triptófano y la treonina es satisfactoria, aunque
tiene un bajo contenido de metionina y cisteína. Las levaduras son muy ricas en
vitaminas (grupo B) y su contenido en ácidos nucleicos es bajo ya que está en el
rango de 4 a 10%. (Petrenko, 2005)
La forma de las levaduras puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme,
cilíndrica, triangular, e incluso alargada, constituyendo un verdadero micelio o un
falso micelio.
Para su crecimiento necesitan oxígeno, fuentes de carbono orgánicas y nitrógeno

mineral u orgánico, diversos minerales y una temperatura y pH adecuados.
El intervalo de temperaturas de crecimiento de la mayoría de las levaduras es, en
general, parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a
30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Algunas especies son
capaces de crecer a temperaturas de 0°C o inferiores. (Méndez, 2011)

Las levaduras utilizan numerosos sustratos carbonados, bien sea por vía oxidativa
o por vía fermentativa, después de una fase inicial de crecimiento aeróbico. En este
último caso, vía fermentativa o anaeróbica, se produce etanol y CO2. El pH óptimo
para el crecimiento de las levaduras varía de 4,5 a 6,5.
La mayoría de las levaduras se reproducen asexualmente por gemación polar,

mecanismo de reproducción mediante el cual una porción de protoplasma
sobresale de la pared de la célula de la levadura y forma una protuberancia; esta
protuberancia, o yema, aumenta de tamaño y finalmente se desprende como célula
de levadura neoformada. (Beitia, 2001)
Las levaduras son seres vivos y sus características morfológicas y químicas

influyen decisivamente en su vida celular.
Tabla 3: Características de Levaduras

Fuente: Fajardo & Sarmientos, 2007. Evaluación de melaza de caña como sustrato
para la producción de Saccharomyces cerevisiae
CARACTERÍSTICAS LEVADURAS
Dimensiones (µm) 4-8
Tiempo de duplicación (h) 1-3
Ph (rango óptimo) 4,5 - 5,5
Nitrógeno (%) 7,5 - 8,5
Proteína (%) 35 - 45
Ácidos nucleicos (%) 6 - 12
Carbohidratos (%) 30 - 45
1.5.1. Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o

blanco, apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares. (Figura 4)

La temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 30ºC. Puede producir ascosporas

cuando hay requerimientos nutricionales adecuados. (Fajardo & Sarmientos, 2007)
Figura 7: Vista macroscópica de Saccharomyces cerevisiae en medio YPD

Fuente: Autores
Son esféricas, elípticas y cilíndricas su tamaño varía notablemente pero el diámetro

de la Saccharomyces cerevisiae oscila de 2 a 8 micras. (Nieto, 2009)
La clasificación taxonómica de la levadura es la siguiente:
Tabla 4: Clasificación Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae.

Clasificación Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae.

Reino Hongo
División Amastogomycota
Clase Ascomycetes
Subclase Hemiascomycetidae
Orden Endomycetales
Familia Sacchaomycetaceae
Subfamilia Saccharomycetaidae
Género Saccharomyces
Especie Cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae es la levadura más conocida a nivel industrial. Esta

levadura es utilizada por excelencia para la obtención de etanol debido a que es un
organismo de fácil manipulación y de recuperación, no es exigente en cuanto a su
cultivo, no demanda altos costos. Además esta levadura, tolera altas
concentraciones de etanol, produce bajas concentraciones de subproductos
durante la fermentación, es osmotolerante, presenta alta viabilidad celular para el
reciclaje y, características de floculación y sedimentación para el procesamiento
posterior. (Fajardo & Sarmientos, 2007)
1.5.1.1 Composición química
Las levaduras contienen un 75% de agua y un 25% de materia seca

aproximadamente conformada por macromoléculas y materia orgánica.
Tabla 5: Composición química de las levaduras

Las sustancias minerales de las levaduras representan por lo general un 5 – 9%

del peso seco. Los componentes principales son ácido fosfórico, alrededor del 50%
y potasio del 30%. Las sustancias nitrogenadas de la levadura representan unas
dos terceras partes de su peso seco (30 – 75%), contienen entre 5 y 12% de
Nitrógeno. Estas sustancias se reparten en un 64% de proteína, 10% de peptonas
y aminoácidos, 8% de amonio, 10% de purina y el resto consiste en pirimidinas y
vitaminas. El contenido normal de aminoácidos depende de la alimentación, de la
cantidad de oxígeno, de la temperatura del cultivo, etc.

En la siguiente tabla se detallan las principales macromoléculas presentes en la

levadura S. cerevisiae. (Cáceres & Reyna. 2002)
Tabla 6: Macromoléculas esenciales para la S. cerevisiae

Fuente: Cáceres & Reyna. 2002. Modelamiento microbiológico para la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
1.5.1.2. Requerimientos Nutricionales para la levadura Saccharomyces

cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae requiere ciertos nutrientes y condiciones ambientales

para su apropiado crecimiento y reproducción. Algunos elementos son necesarios
como por ejemplo carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y fósforo. (Buitrago &
Tenjo, 2007)
Carbono: Los compuestos carbonados son utilizados a la vez como fuente de

energía y como fuente de carbono por Saccharomyces cerevisiae. Los principales
son D-azúcares como hexosas, glucosa, fructosa, manosa, porque los L-azúcares
pueden ser considerados no fermentables por esta levadura.

● Nitrógeno: Este elemento representa alrededor del 10% de peso seco de las
levaduras, S. cerevisiae es capaz de utilizar el nitrógeno en forma de ión amonio.
Otra fuente de nitrógeno son los aminoácidos, los dipéptidos, tripéptidos, y la urea
en asociación con biotina y las bases púricas y pirimídicas.
● Fósforo: Es esencial para el crecimiento, regula la síntesis de los lípidos y los

carbohidratos, y mantiene la integridad de la pared celular. El fósforo es asimilado
por la célula en forma de iones ortofosfato (H2PO-4). Para una fermentación óptima
el medio de cultivo debe contener fuentes de fósforo en una concentración de 0.6
mM/g de células.
● Azufre: Constituye el 0.4% del peso seco de las levaduras. La fuente de azufre
más utilizada por Saccharomyces es el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfato;
la metionina puede ser utilizada como fuente única de azufre y permite un
crecimiento más rápido que los iones sulfatos.
● Elementos traza: Minerales tales como K, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cl. Se requiere en
concentraciones de 0.1–1 mM. El potasio a pH ácidos estimula la fermentación y la
respiración, actúa como efector de numerosas enzimas: piruvato quinasas,
aldolasa, aldehído deshidrogenasa y permeasa e interviene en la estructura de los
ARN. Las fuentes de potasio son el cloruro potásico y los fosfatos mono y
dipotásico. El magnesio es utilizado como activador de las enzimas glicolíticas,
estimula la síntesis de ácidos grasos, regulas las ATPasas de las membranas y
participa con el potasio en la penetración del fosfato. El magnesio es aportado en
los medio de cultivo en forma de sulfato o de cloruro de magnesio.
● Microelementos: Co, B, Cd, Cr, Cu, I, Mo; Ni, Va. Se requieren concentraciones
0.1 - 100µM. Otros microelementos (Hg, Ag, Ar, Ba, Li, Ni, Os, Pb, Se, Te) pueden
actuar como inhibidores del crecimiento de la levadura cuando se encuentran en
concentraciones superiores a 100µM. (Buitrago & Tenjo, 2007)

1.5.1.3. Inhibidores de crecimiento
Entre los elementos inhibidores se tienen la plata, arsénico, bario, litio, níquel,
osmio, plomo, selenio y telurio. (Cáceres & Reyna. 2002)
El inositol juega un papel importante en la síntesis de los lípidos de las membranas.
El pantotenato es un factor de crecimiento para Saccharomyces y debe

presentarse en el medio en forma de pantotenato de calcio a una concentración de
alrededor de 6.25 mg/L.
La vitamina B6 o piridoxina es transformada en fosfato de piridoxal y en

piridoxamina, coenzimas implicadas en la desaminación y descarboxilación de los
aminoácidos.
La tiamina (vitamina B1) tiene un papel en el metabolismo respiratorio, el

metabolismo de los lípidos, la glucólisis y la fermentación alcohólica. Las
necesidades para S. cerevisiae son alrededor de 5 mg/L de tiamina.
La biotina es un factor de crecimiento para las levaduras. Está implicada en

numerosas reacciones anabólicas: carboxilación del piruvato, síntesis de las bases
púricas y pirimídicas, de los nucleótidos y de los ácidos nucleicos, síntesis de las
proteínas, de los polisacáridos y de los ácidos grasos. Las necesidades de biotina
son del orden de 1mg/L para S. cerevisiae. Las otras vitaminas, ácido fólico, ácido
p-amino benzoico y riboflavina son normalmente sintetizadas por las levaduras.
(Buitrago & Tenjo, 2007)
1.5.1.4. Requerimientos físico-químicos
A pesar de la tolerancia bastante amplia de S. cerevisiae el crecimiento es

favorecido a un pH próximo a 4.0 – 5.0 y no se desarrollan bien en medio alcalino a
menos que se hayan adaptado al mismo. El medio ácido influye en el crecimiento
celular, producción enzimática y utilización de glucosa por parte de la levadura. Así
por ejemplo, algunas investigaciones han observado que con un pH inicial entre 4.0

y 4.5 se obtiene mejor crecimiento y utilización de glucosa, mientras que la máxima

producción de enzima se observa a un pH de 3.0. (Fajardo & Sarmiento, 2007)
1.5.1.5. Tolerancia al etanol
No todas las levaduras presentan la misma tolerancia al etanol, siendo las más
resistentes las especies de Saccharomyces sp por lo que son empleadas en los
procesos de fermentación alcohólica para la elaboración de bebidas o la
producción industrial de etanol. Según las cepas y el estado fisiológico del cultivo,
el etanol es tóxico en concentraciones del 8% (p/v) al 18% (p/v). La tolerancia al
etanol depende de la composición en ácidos grasos de las membranas
citoplasmáticas. Las células cultivadas en presencia de ácido linoleico (C18:2)
toleran mejor el etanol añadido al medio que las células en presencia de ácido
oleico (18:1). La viabilidad es mejor en presencia de ergosterol que de
camposterol.
El etanol intracelular es más tóxico para las células que el etanol extracelular. La
viabilidad de los cultivos puede incrementar por la eficiencia de la excreción del
etanol, debido a esto cuando la presión osmótica aumenta en el medio, la
secreción del etanol se disminuye considerablemente. En un medio que contiene
30% (p/v) de sorbitol y 10% (p/v) de sacarosa, no hay prácticamente ninguna
secreción del etanol durante 24 horas mientras que en un medio con presión
osmótica baja, el etanol difunde rápidamente. Las medidas de etanol intracelular
permiten situar el umbral de toxicidad hacia 0.25 mg de etanol intracelular para 106
células viables. Es así que, la presión osmótica elevada de los medios representa
un problema importante en la fermentación alcohólica, que debe ser tenido en
cuenta en el proceso de producción de etanol. (Buitrago & Tenjo, 2007)

CAPITULO 2
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MÉTODOS
2.1.1. DISEÑO Y TIPO DE INVESTIGACIÓN
 Tipo: Analítico –Cuantitativa.
 Nivel: Correlacional
 Diseño: Cuasi - Experimental.
 Tipo de estudio: Transversal
Se define a esta investigación como Analítico – Cuantitativa de nivel Correlacional,

debido a que se expondrán los resultados cuantificados de los análisis realizados a
los diferentes grupos de estudio en forma estadística, preparando tablas y gráficos
de los valores obtenidos por cada cepa de levadura.
El diseño del presente trabajo fué de tipo Cuasi-Experimental de corte Transversal,

pues se midió la capacidad fermentativa de las cepas de levadura manipulándose
el tipo de levadura, pero trabajando con un lote de jugo de agave seleccionado por
conveniencia y las mediciones se realizaron en una sola ocasión.
2.1.2. ZONA DE ESTUDIO
El presente estudio se realizó en la planta de procesamiento de tequila

Trancahuaico ubicada en el cantón de San Felipe de Oña. Se localiza a 102 Km. al
suroeste de la ciudad de Cuenca.

2.1.3. TEMPERATURA Y EXTENSIÓN
El Cantón Oña tiene una superficie de 298 km. En este sector se registra una
temperatura de 15°C en invierno y presenta una estación de lluvias de Enero a
Mayo; llegando hasta los 28°C en verano soleado, con cielos despejados.
2.1.4. ALTITUD
El terreno de Oña es bastante accidentado y se eleva entre los 2260 m.s.n.m. por
lo que presenta una diversidad de pisos climáticos que van desde páramos y
bosques secundarios en las partes altas, hasta pequeños valles calientes en las
zonas bajas junto a los ríos.
2.2. MUESTREO Y TAMAÑO DE LA MUESTRA
2.2.1 TIPO DE MUESTREO
En el presente estudio se aplicó un muestreo probabilístico por conveniencia con el

fin de obtener muestras representativas del jugo de agave del lote disponible para
los diferentes análisis, y del fermento artesanal utilizado para la producción
alcohólica.
2.2.2. MUESTREO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL FERMENTO
Con el fin de caracterizar las levaduras presentes en la materia prima del lugar de
estudio, se tomó 3 muestras del jugo de agave al momento de su llegada a la
fábrica y 3 muestras después de terminada la fermentación. Además se tomó 1
muestra de fermento artesanal. El tamaño de cada muestra fue de 150 mL del jugo
y fermento artesanal respectivamente, este proceso se lo realizó por triplicado
2.2.3. MUESTREO PARA LOS ENSAYOS DE FERMENTACIÓN Y DESTILACIÓN
Se tomaron 5 muestras por triplicado de 750 mL del jugo para ser fermentados con
los 3 tipos diferentes de levaduras (Cepa de Saccharomyces cerevisiae del fermento
artesanal, Saccharomyces cerevisiae Danstil EDV 493 y Saccharomyces cerevisiae
ZWLDTY48). Los análisis se realizaron en el Laboratorio de Alimentos y Nutrición

del Proyecto VLIR-IUC. Campus Balzaín. Se realizó una fermentación y una

destilación a nivel de laboratorio con la levadura de mayor rendimiento alcohólico
relativo.
2.3. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN
Criterios de inclusión:
Jugos madurados durante 4 días.
Jugos que cumplan las características organolépticas según la norma NMX-

V-022-1972. Aguamiel. Hidromiel. Normas Mexicanas: color, olor, sabor,
aspecto. (Anexo 1)
Mezcla de jugos de un mínimo de 4 proveedores.
Jugos que posean un mínimo de 5 °Brix.
Criterios de exclusión
Jugos que presenten sustancias extrañas (insectos, ramas, etc.).
2.4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Para el muestreo se siguió la NTE INEN 1 529-2:99: Control microbiológico de los

alimentos. Toma, envío y preparación de muestras para el Análisis microbiológico
(Anexo 3); tomando en cuenta las características organolépticas y la concentración
de azúcares (°Brix) del jugo. Además se constató que el lote de jugo provenga de
varios proveedores.
Una vez que se realizó este procedimiento se tomaron muestras de 150 mL y 750
mL del jugo, para los diferentes análisis en frascos estériles y etiquetados
apropiadamente.
Las muestras recolectadas fueron transportadas inmediatamente al laboratorio

para su análisis respectivo en condiciones refrigeradas (4-8°C). (Ilustración 1)

2.4.1. EXÁMEN FÍSICO
2.4.1.1. Características organolépticas
Se analizaron las características organolépticas del chaguarmishqui que llego a la

fábrica por parte de los proveedores.
Color: Debe tener un color ambarino, propio del producto.
Olor: Debe ser el característico del producto.
Sabor: El sabor del aguamiel debe ser dulce, sui géneris.
Aspecto: Debe tener aspecto traslúcido. (Anexo 1)
2.4.1.2. Concentración ° Brix
Para la medición de los grados Brix, se utilizó un refractómetro de luz. (Figura 7)

Previo a la medición, se filtró el jugo a través de un papel filtro.
Figura 8: Refractómetro utilizado para medir los ºBrix del chaguarmishqui

Fuente: Autores
Procedimiento
Colocar el refractómetro en una posición tal que difunda la luz natural o

cualquier otra forma de luz artificial que pueda utilizarse para iluminación.
Limpiar cuidadosamente con alcohol y éter de petróleo el refractómetro
antes de hacer la lectura.

Para cargar el refractómetro abrir el doble prisma girando el tornillo

correspondiente y poner unas gotas de muestra sobre el prisma, cerrar y
ajustar finamente.
Verificar la exactitud del refractómetro con agua a 20ºC. A esta temperatura,

el índice de refracción del agua es de 1.3330.
Mover el brazo giratorio del aparato hacia delante y hacia atrás hasta que el
campo visual se divida en dos partes, una luminosa y otra oscura. La línea
divisoria entre esas dos partes, se le conoce como "línea margen". Ajustar la
línea margen y leer directamente el por ciento de sólidos en la escala Brix.
(Figura 9) (Anexo 4).
Figura 9: Refractómetro de jugo de fruta, del vino, etc.

Fuente: ServoVendi
2.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL CHAGUARMISHQUI Y FERMENTO

ARTESANAL
Se preparó la muestra para el análisis atemperándola a 25 °C. Posteriormente se

realizaron las diluciones 1/10 tomando 25 mL del chaguarmishqui con una pipeta
estéril añadiéndolo a un erlenmeyer que contenía 225 mL del agua de peptona
0.1%. (NTE INEN 1529-5: 2006)

Se continuó con las diluciones tomando 1 mL de la primera dilución y colocándolo

en tubos con 9 mL de agua de peptona al 0.1%, repitiendo el mismo procedimiento
hasta obtener diluciones de 10-4. (Ilustración 2)
Una vez realizada las diluciones se sembró por agotamiento en placa en el medio
Yeast pepton dextrose (YPD) con cloranfenicol al 1%.
Procedimiento:
Se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con

la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por
flameado directo a la llama y con ella se recoge la dilución, para colocarlo en
la periferia de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el
inóculo.
A continuación se realiza una estría partiendo de la primera y arrastrando los

microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la
superficie del agar. Se debe procurar que en cada sección de la caja, las
estrías queden trazadas con mayor separación. (Figura 9)
Se repite el paso anterior, por tres veces en el medio de cultivo y se incuba a

25°C durante 72 horas y observamos el crecimiento. (Rojas, 2011)
Figura 9: Siembra por agotamiento

Fuente: Rojas. 2011

2.6. CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae DEL

FERMENTO ARTESANAL
Para la identificación de la cepa de Saccharomyces cerevisiae del fermento

artesanal se observaron las características macroscópicas y microscópicas de las
colonias en el medio de cultivo YPD, se realizaron prueba fermentativas,
bioquímicas y de floculación. (Anexo 5).
Tabla 7: Pruebas de identificación de la Saccharomyces Cerevisiae

Fuente: Martini & Col. 1992. A taxonomic key for the genus Saccharomyces.
Concentración de
Cepas de Temperatura ºC Producción
etanol (v/v) Floculación
levaduras de H2S
10% 13% 15% 25 30 37 45
SN1 +++ ++ - +++ +++ +++ +++ - +
SKS2 +++ ++ - +++ +++ +++ +++ - -
SNR3 +++ ++ - +++ +++ +++ + - +++
SB4 +++ ++ - +++ +++ +++ + - ++
SM5 + - - NT NT NT NT NT NT
SD6 ++ + - +++ +++ ++ - - +
STB7 NT NT NT NT NT NT NT NT NT
SO8 ++ + - +++ +++ ++ - - +
SMK9 +++ ++ - +++ +++ ++ - + ++
SDB10 +++ ++ - +++ +++ ++ - + ++
SRB11 +++ +++ - +++ +++ +++ - - +
SS12 +++ +++ - +++ +++ +++ - - +
SJ13 +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +
SK14 +++ +++ + +++ +++ +++ - - -
SRT15 +++ + - +++ +++ +++ - - +
SM16 +++ ++ - +++ +++ +++ - - +++
SC +++ ++ - +++ +++ +++ - + +++
Respuesta intensiva (+++); Respuesta moderada (++); Respuesta baja (+); Sin reacción (-)
SC: Saccharomyces cerevisiae comercial, como control
NT: No probado

2.6.1. TINCIÓN DE AZUL DE METILENO Y SUERO FISIOLÓGICO
Para la identificación microscópica de Saccharomyces cerevisiae, se utilizó un

microscopio con lente de 40x. (Ilustración 3) (Ilustración 4)
Se colocó primero una gota de solución fisiológica sobre el portaobjeto. Luego, con
asa metálica se tomó una colonia del medio YPD y se emulsionó.
Para realizar el extendido se repite el paso anterior y con ayuda de otro porta
objetos se realizó el frotis.
Para la fijación se pasa lentamente el portaobjeto, en forma horizontal, sobre la

llama del mechero manteniendo el extendido hacia arriba.
Una vez seco el extendido se colocó unas gotas de azul de metileno y se dejó
actuar unos minutos.
Se eliminó el exceso de colorante lavando con agua de forma suave, con ayuda de
piseta. Se secó el extendido a temperatura ambiente.
2.6.2. PRUEBAS FERMENTATIVAS
Se tomó con un asa metálica previamente esterilizada una colonia que tenga las
características macroscópicas y microscópicas de la Saccharomyces cerevisiae, se
inoculó en tubos que contienen una concentración de diferentes azucares (glucosa,
sacarosa, lactosa, galactosa) con un indicador de azul de bromotimol y una
campana de Durham. Se incubó a 37°C durante 48 horas y se observó la
fermentación y el cambio de color en los caldos. (Ilustración 8.5)
2.6.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Se tomó con un asa de platino previamente esterilizada una colonia con las
sembró por el método de la picadura y estriado en el medio de cultivo sulfito de
bismuto.

Se incubó a 37°C durante 48 horas. Se observó la producción de sulfuro de color

negro en el lugar donde se realizó la picadura. (Ilustración 6)
2.6.4. FLOCULACIÓN
Se tomó con un asa metálica previamente esterilizada una colonia que tenga las
inoculó en tubos que contienen caldo YPD. (Asyikeen & Col, 2013)
Se observó la floculación propia de las levaduras. (Ilustración 7)
2.7. AISLAMIENTO DE Saccharomyces cerevisiae
Las colonias que fueron identificadas como Saccharomyces cerevisiae sufrieron

una resiembra en otro medio de YPD, se incubó a 25 °C por 2 días, con la finalidad
conservar las levaduras para su posterior uso.
2.8. FERMENTACIÓN
2.8.1. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae

DEL FERMENTO ARTESANAL
Para la preparación del inóculo se tomaron colonias de Saccharomyces cerevisiae

previamente identificadas y se los inoculó en el caldo YPD.
Para el cálculo del volumen a utilizar en la fermentación se tomó en cuenta que al

ser la levadura aislada del jugo y del fermento artesanal utilizado en la fábrica se
utilizó la relación de volúmenes de la fábrica (1/100), es decir: Se colocó 10 L de
fermento por cada 1000 L de chaguarmishqui. (Anexo 6)
Para el caso del laboratorio se colocó por cada 100 mL de jugo 1 mL de caldo YPD
de la suspensión de levaduras.

2.8.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

DANSTIL EDV 493
Se pesó 0.75 g de la levaduras como lo indica la casa comercial (Ilustración 8),

después fueron reconstituidas con un volumen de 15 mL agua destilada a 40°C. Se
esperó que se active la levadura por un tiempo de 15 minutos. (Anexo 6)
2.8.3. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ZWLDTY48
Se pesó 4 g de la levadura como lo indica la casa comercial (Ilustración 9) y luego

fueron reconstituidas en un volumen 10 mL de una solución acuosa de azúcar al
10% a 30 ºC. Se esperó 5 minutos para usar la levadura. (Anexo 6)
2.9. PROCESO DE FERMENTACIÓN EN EL LABORATORIO
El proceso de fermentación se realizó por triplicado para cada una de las

levaduras. La fermentación se realizó con muestras del jugo inoculadas con los
diferentes volúmenes preparados de las levaduras para 750 mL cada uno. Se tuvo
la precaución de que estos recipientes sean del mismo material del envase en
donde se realiza la fermentación a nivel de la fábrica.
Las condiciones de fermentación fueron las mismas que en la fábrica: temperatura

de 25 ºC, control de pH a 3.5 y °Brix de 6.8, para evaluar empíricamente las
características organolépticas del jugo al inicio y al final de la fermentación.
(Ilustración 10). Además se realizó la prueba del CO2 que consiste en acercar un
fósforo encendido a la boca del recipiente, si éste se apaga es por la liberación de
CO2 por parte de las levaduras durante el proceso de fermentación, caso contrario
este habrá terminado.
2.10. DESTILACIÓN EN EL LABORATORIO
El tipo de destilación que se realizó en el laboratorio fué la destilación fraccionada,

que consiste en usar una columna de fraccionamiento que contiene pequeños
platos distribuidos a lo largo de su longitud, de forma que las pequeñas cantidades

de líquido que se encuentran en cada una de ellas, durante el proceso de la

destilación, contienen mezclas cada vez más enriquecidas en el líquido más volátil.
(Ilustración 13)
Se colocaron 500mL de mosto en el balón de destilación, y se calentó hasta que la

temperatura alcance 75 °C. Se recogieron los primeros mililitros que conforman la
cabeza del aguardiente y contienen un grado alcohólico alto. Al alcanzar los 80°C
hasta 85°C se recogió el cuerpo a una concentración de 45 % v/v. Finalmente al
incrementarse la temperatura bruscamente y observar la baja del grado alcohólico
se dió por terminada la destilación. Esta operación tuvo una duración de 50
minutos aproximadamente. Al final de este estudio se seleccionó la levadura que
mejor rendimiento presentó para realizar el siguiente ensayo a nivel de la fábrica.
2.11. PROCESO DE FERMENTACIÓN Y DESTILACIÓN EN LA FÁBRICA
Una vez seleccionada la levadura del laboratorio con mejor rendimiento, se realizó
el ensayo en la fábrica, añadiendo dicha levadura a un tanque que poseía 330 litros
de chaguarmishqui (Ilustración 11) (Ilustración 12), y conjuntamente se llevó una
muestra de 750 mL chaguarmishqui para realizar la fermentación en el laboratorio
al mismo tiempo, midiendo valores de grados Brix. (Anexo 7)
El proceso de fermentación se llevó a cabo durante 48 horas.
En la Fábrica Trancahuaico la destilación se realizó en un alambique de cobre, de

una capacidad de 330 litros aproximadamente.
El mosto se demoró 2 horas hasta el momento en que cayó la primera gota del
destilado. Se recogió un litro aproximadamente de cabeza del destilado, que a su
vez fue separado del cuerpo.
El cuerpo fue recolectado hasta obtener una concentración de 45 % v/v de etanol,

teniendo así el tequila como producto final. Todo el proceso duró alrededor de 4
horas.

La destilación del ensayo se lo realizó una vez terminada la fermentación en la

fábrica, realizándose al mismo tiempo la destilación en el laboratorio. (Anexo 7)
2.12. CÁLCULO DEL RENDIMIENTO ALCOHÓLICO
El rendimiento alcohólico es la comparación de los gramos de etanol teóricos con

los gramos de etanol obtenidos de la fermentación. Esto se lo logra realizando un
control de la cinética de fermentación es decir midiendo la concentración de
azúcares totales al inicio, durante y final de la fermentación, además de realizar la
destilación de los mostos tequileros adecuadamente evitando la pérdida de etanol.
Una alternativa para la medición del rendimiento alcohólico se puede realizar en

base a la metodología de superficie de respuesta (MSR) que considera el volumen
de tequila producido, las características organolépticas y la calidad del tequila en
base al análisis bromatológico. (Mora & Luna, 2012)
Considerando que el jugo utilizado en el presente estudio no fue pasteurizado una

vez extraído por los proveedores y además sufrió un proceso de fermentación por
la flora microbiana natural durante 4 días antes de llegar a la fábrica, se optó por
calcular un rendimiento alcohólico relativo que se obtuvo comparando el volumen
de etanol obtenido y el volumen de mosto tequilero, tomando como referencia el
estudio que se lo realizó en la Universidad de Guadalajara, Zapopan Jalisco.
México, donde por cada 700 mL de mosto muerto se recupera 200 mL de tequila
ordinario. (Mora & Luna, 2012)
La relación para el estudio es la siguiente:
700 mL de mosto 100%
200 mL de tequila 28.57%
Por lo tanto, en esta relación, el rendimiento alcohólico relativo del volumen total de
tequila obtenido después de la fermentación a partir de mosto es 28.57%. (Mora &
luna, 2012)

2.13. MATERIALES
2.13.1. EQUIPOS Y MATERIALES
 Cooler para transporte de muestras
 Lámparas de alcohol
 Erlenmeyer
 Asa Calibrada
 Asa Recta
 Cajas Petri
 Tubos Tapa rosca
 Estufa a 37°C y 25 °C
 Placas Portaobjetos
 Gradillas para tubos
 Balón de destilación
 Refrigerante
 Mangueras
 Probetas
 Vasos de precipitación
 Soporte metálico
 Pinzas

2.13.2. TINCIONES
2.13.2.1. Azul de metileno
Fundamento:
El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células
bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
(AcuaNatura, 2007).
El azul de metileno permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos

procarióticos (vivos o muertos), mientras que los eucarióticos sólo se tiñen si
están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se
tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. La actividad
reductora de las células de levadura viables transforma el azul de metileno en un
derivado incoloro. Las células de levadura muertas se tiñen de azul. (Castellucci,
2010)
Tinción:
En una placa realizar el extendido de las colonias del medio de cultivo, colocar un
volumen del azul de metileno hasta cubrir el extendido, esperar 2-3 minutos y lavar
la placa, finalmente observar al microscopio.
2.13.3. MEDIOS DE CULTIVOS
2.13.3.1. Medio Yeast pepton dextrose (YPD)
Fundamento:
Este es un medio de uso rutinario que aporta todos los nutrientes necesarios para
que la levadura Saccharomyces cerevisiae crezca. Se compone de extracto de
levadura 1% (p/v), bactopeptona 2% (p/v), y como fuente de carbono: glucosa al

2% (p/v) (medio rico YPD). Y en algunos casos, galactosa al 1% (p/v) (medio de

inducción YP 1% D,1% Gal). Las placas de medio sólido contienen 2% (p/v) de
agar bacteriológico. (Latorre, 2008)
Siembra:
Con un asa redonda tomar la muestra a analizar y sembrar por agotamiento sobre
la placa del medio solidificado.
Incubación:
Incubar a 25 °C por 48 horas.
2.13.3.2. Agua de peptona
Fundamento:
Es un medio utilizado como diluyente y para el enriquecimiento bacteriano a partir

de alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
Es un medio de enriquecimiento no selectivo, en el cual la peptona proporciona

nutrientes necesarios para el desarrollo microbiano y el cloruro de sodio mantiene
el balance osmótico. Permite recuperar células dañadas por procesos
fisicoquímicos a los que ha sido sometido el alimento.
Además puede ser utilizado como diluyente de muestras en reemplazo de solución

fisiológica y como medio base para la fermentación de hidratos de carbono. En
este último caso se debe adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono
en cuestión en concentración final al 1%. (Britania, 2002)
2.13.4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Las pruebas bioquímicas se han desarrollado para demostrar en forma clara las
características bioquímicas de los hongos y bacterias tales como la presencia o

ausencia de enzimas, la facilidad de crecimiento en diferentes condiciones

nutricionales y de temperatura, etc.
Estas pruebas utilizan diferentes métodos de trabajo (caldos de cultivo, medios de

cultivo, indicadores, inhibidores, marcadores, etc.), cada uno de ellos pueden ser
para un mismo microorganismo para comprobar su identidad, aislarlo, etc.
2.13.4.1. Agar bismuto sulfito
Fundamento
Es una modificación del Medio Wilson Blair, utilizado para la detección de

Salmonella, en particular Salmonella typhi de muestras clínicas.
Esta prueba fue tomada del estudio de la Universidade Federal de Ouro Preto,
Brasil del año 2008, en el cual se identificó a la Saccharomices cerevisiae con el
uso del medio de este medio de cultivo.(Oliveira & Col)
La peptona y el extracto de carne aportan nitrógeno, vitaminas, minerales y amino

ácidos esenciales para el crecimiento. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y
provee de carbono y energía.
En este medio el sulfito de bismuto actúa con el verde brillante como agente
selectivo para la inhibición de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella.
Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la producción de ácido

sulfhídrico, mientras que la reducción de las sales de bismuto a bismuto metálico
tiñe las colonias de un brillo negro o café metálico por la reducción del sulfito a
sulfuro, produciendo ácido sulfhídrico.
Las colonias sulfhídrico positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de

hierro. La reducción de los iones bismuto a bismuto metálico produce brillo metálico
alrededor de las correspondientes colonias, que suele aparecer a las 48 h de
incubación. El agar bacteriológico es el agente solidificante. (Condalab, 2010)

El efecto diferenciador se basa en el siguiente mecanismo: las colonias de

gérmenes muy reductoras presentan una elevada presión de electrones en su
interior, que disminuye hacia afuera, por lo tanto, en el centro de esas colonias se
reduce el sulfato y el sulfito a sulfuro, lo cual se denota por un ennegrecimiento a
sulfuro de hierro. En los alrededores, sin embargo, no es posible más que una
reducción de los iones bismuto a bismuto metálico, lo cual da lugar a la aparición
de un brillo metálico alrededor de las colonias. (Condalab, 2010)
Siembra:
Sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendido sobre la superficie del

medio.
Incubación:
A 25 – 35 °C durante 48 horas.
2.13.4.2. Pruebas de Fermentación
Fundamento:
Las pruebas de fermentación de carbohidratos son útiles para complementar los

resultados de las pruebas de utilización de los hidratos de carbono cuando existe
alguna dificultad para la identificación definitiva de un organismo.
Los medios de fermentación contienen peptona, extracto de ternera o de levadura,

un indicador y fuentes de carbohidratos individuales. La fermentación se detecta
únicamente por la producción de gas. La producción de ácidos, como indica el
cambio de color del indicador, no es indicio de fermentación. (Castillo, 2012.)
La degradación de distintos azúcares por distintas vías metabólicas produce ácido

o gas. El ácido se detecta por el viraje al amarillo del indicador rojo fenol, y el gas
por la formación de burbujas que quedan atrapadas en la campana Durham.

La batería de pruebas de fermentación para la identificación de la Saccharomices

cerevisiae se basan en el comportamiento de las especies del género
Saccharomyces frente a los azúcares. (Vaughan-Martini & Martini, 1993)
Siembra:
Sembrar el caldo de cultivo, utilizando un asa redonda tomando colonias de medio

de cultivo.
Incubación:
A 25 °C durante 48 horas.
Interpretación:
Prueba positiva: color amarillo con o sin gas.
Prueba negativa: color rojo con ausencia de gas.
2.13.5. PRUEBA DE LA FLOCULACIÓN
Fundamento:
La floculación de las levaduras es un proceso reversible en el cual las células se

adhieren para formar flóculos de cientos de células y depende del ión Ca 2+ (Bony et
al., 1997).
La floculación se debe a la presencia de lectinas específicas (floculinas) en las

paredes celulares de las levaduras floculantes que se adhieren selectivamente a
los residuos de manosa presentes en la pared celular de células adyacentes. El ión
Ca2+ es necesario para activar la floculina. (Ferreyra, 2006)

Siembra:
Sembrar el caldo de cultivo, utilizando un asa redonda tomando colonias de medio

de cultivo.
Incubación:
A 25 °C durante 48 horas.
2.14. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizaron análisis descriptivos de los resultados. Las diferencias entre las

variables de la destilación (volumen inicial, volumen final, cabeza, cuerpo, cola,
pérdida y rendimiento alcohólico) a partir de los 3 diferentes fermentos fueron
evaluadas utilizando el análisis de varianza (ANOVA). Para la identificación del
fermento con mejor respuesta a las variables indicadas se realizó por medio de la
prueba Scheffe (post-hot pairwise comparison). El nivel de significancia (α)
establecido fue P<0.05 para todos los análisis.
El análisis de los datos se realizó en el programa Stata 10.0 (Stata Corporation,

College Station, TX).

CAPITULO 3
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS A NIVEL DEL LABORATORIO
3.1.1. Análisis organoléptico del chaguarmishqui
Para el inicio del estudio se analizaron las características organolépticas del

chaguarmishqui de los proveedores al inicio y al final de la fermentación.
Tabla 8: Características del jugo antes y después de la fermentación

obtenidas en el desarrollo de la investigación.
Características organolépticas del
chaguarmishqui de los proveedores
COLOR: Ámbar
OLOR: Dulce
SABOR: Sui generis
ASPECTO: Translúcido
3.1.2. Análisis Microbiológico del Chaguarmishqui y el Fermento artenasal:

Identificación de la cepa de Saccharomyces cerevisiae
El análisis microbiológico se realizó por triplicado en el chaguarmishqui recolectado

por la Fábrica Trancahuaico, además se realizó el análisis del fermento artesanal.
(Tabla 9)
Para la identificación de la Saccharomyces cerevisiae del chaguarmishqui y el

fermento artesanal se realizaron prueba fermentativas, bioquímicas y de
floculación. Los resultados de estas pruebas se presentan en la Tabla 9. En donde
se confirmó la presencia de Saccharomyces cerevisiae.

Tabla 9. Pruebas de identificación de la Saccharomyces cerevisiae en el

Chaguarmishqui y el fermento artesanal de la Fábrica Trancahuaico.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
PRODUCCIÓN DE HIDROGENO SULFURADO
Jueves Viernes Lunes Martes Fermento

artesanal
CJ1 CJ2 CJ3 CV1 CV2 CV3 CL1 CL2 CL3 CM1 CM2 CM3 F1 F2 F3
Medio
Sulfito                           
Bismuto
FLOCULACIÓN
Caldo YPD                          

PRUEBAS DE FERMENTACIÓN / PRODUCCIÓN DE GAS
Galactosa +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Fructosa +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Sacarosa +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Maltosa +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Interpretación: C= chaguarmishqui, J= Jueves, V= Viernes, L= Lunes, M= Martes, F= Fermento artesanal.
3.1.2. Evaluación del proceso de Fermentación
Una vez demostrada la presencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae en el

chaguarmishqui y el fermento artesanal, se procedió a la fermentación comparativa
con las otras levaduras comerciales.
Para ello se recolectaron las muestras de un lote para mantener las mismas
condiciones de nutrientes presentes en el chaguarmishqui, el tiempo de
maduración y la carga microbiana inicial, con la medición de pH y ºBrix. (Tabla 10)
(Anexo 8)

Tabla 10: Evaluación del proceso de fermentación de las levaduras comerciales y

silvestre utilizando chaguarmishqui recolectado en la Fábrica Trancahuaico.
Levadura S. cerevisiae Danstil EDV S. cerevisiae

silvestre 493 ZWLDTY48
Inicio de la Fermentación
°Brix 6,8 6,8 6,8
pH 3,5 3,5 3,5
Fin de la Fermentación
°Brix 4,4 4,2 4
pH 3 3 3
Al punto final de la fermentación los valores de pH disminuyeron ligeramente y de

manera similar para todas las levaduras, mientras que una disminución
considerable de ºBrix se presentó en la fermentación con la S. cerevisiae
ZWLDTY48. Esto indica que hubo un mayor consumo de azúcares solubles del
chaguarmishqui; y por lo tanto se podría sugerir que el proceso de fermentación fue
más eficiente con esta levadura. (Josafad & Col, 1998)
Sin embargo, se debe considerar que la diferencia entre la concentración de

azúcares entre las cepas de levaduras estudiadas no se debe sólo a la presencia
de dichas levaduras, sino que también puede deberse a la carga microbiana
elevada presente en el chaguarmishqui. Por lo tanto tampoco fue posible medir la
cantidad exacta de azúcar que fue consumida por cada levadura.
3.1.3. Evaluación del proceso de Destilación
Una vez finalizada la fermentación se procedió a realizar la destilación fraccionada

en la cual se separó la cabeza, cuerpo y cola según las especificaciones
volumétricas de la fábrica. (Tabla 11) (Anexo 9)

Tabla 11: Resultados obtenidos en la destilación a nivel del laboratorio de las

diferentes levaduras estudiadas con un Volumen inicial de 500 mL de
chaguarmishqui.
S.c. Silvestre S.c. DANSTIL S.c. Valor de P

EDV 493 ZWLDTY48
V0 (mL) 500 500 500 -
V1 (mL) 448,1 ± 0,2 440,3 ± 0,7 436,2 ± 0,8 <0,001
Cabeza (mL) 1 1 1 -
Cuerpo (mL) 44,0 ± 0,7 51,6 ± 1,1 56,0 ± 0,7 <0,001
Cola (mL) 4,5 ± 0,5 5,1 ± 0,2 4,7 ± 0,4 0,998
Pérdida (mL) 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,8 2,2 ± 0,4 0,087
Rendimiento (%) 8,8 ± 0,1 10,3 ± 0,2 11,2 ± 0.1 <0,001
Interpretación: V0 = Volumen Inicial, V1 = Volumen Final
La concentración del tequila producido en la fábrica Trancahuaico es de 45 %v/v

de etanol, por lo que la destilación a nivel de laboratorio terminó cuando el cuerpo
del destilado alcanzó dicha concentración.
Los volúmenes del destilado obtenidos con cada uno de los fermentos, fueron
comparados utilizando el análisis de varianza (ANOVA). En base a estos
resultados, se observaron diferencias significativas entre los 3 fermentos con
respecto al volumen final (P<0.001), al cuerpo (P<0.001) y al rendimiento
alcohólico (P<0.001).
Con la finalidad de identificar la diferencia entre los 3 fermentos, se utilizó la prueba

de Scheffe. Según esta prueba, para el volumen final la S. cerevisiae Danstil EDV
493 fue 7.84 veces menor al de la cepa S. cerevisiae del fermento artesanal y 4.1
veces mayor a la S. cerevisiae ZWLDTY48. Por lo tanto, el volumen mayor residual
que quedó de la destilación fue aquel obtenido con la cepa S. cerevisiae del
fermento artesanal.

Considerando que el objetivo del presente estudio fué determinar el porcentaje de

rendimiento alcohólico de cada una de las levaduras estudiadas, el producto final
de la fermentación terminó al alcanzar 45% v/v de etanol, es decir, la concentración
se mantuvo constante y solo varía el porcentaje de rendimiento relativo.
Según el análisis ANOVA, existió una diferencia significativa entre los volúmenes
de cuerpo de los tres fermentos (p<0.001). En base a la prueba Scheffe, el
volumen del cuerpo de la S. cerevisiae Danstil EDV 493 fue 7.6 veces mayor que la
cepa S. cerevisiae del fermento artesanal (P<0.001) y 4.1 veces menor que la S.
cerevisiae ZWLDTY48 (P<0.001). Por lo tanto, con la S. cerevisiae ZWLDTY48 se
obtuvo el mayor volumen de cuerpo en la destilación (56,0 ± 0,7 mL).
De igual manera, existió una diferencia significativa entre los rendimiento

alcohólicos relativos de los tres fermentos (P<0.001). El rendimiento alcohólico
relativo obtenido para la S. cerevisiae ZWLDTY48 fue el mayor (11,2 ± 0.1%), el
cual fue 0.88 veces mayor que la S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) y ésta a
su vez fue 1.52 veces mayor que la cepa S. cerevisiae del fermento artesanal
(P<0,001).
En el Gráfico 3.1.1 y 3.1.2 se realiza una comparación del rendimiento alcohólico

relativo y el volumen del cuerpo obtenidos por las tres levaduras, con la finalidad de
valorar la capacidad de fermentación.

Gráfico 3.1.1: Rendimiento alcohólico relativo (%) obtenido para cada una de las
levaduras estudiadas a nivel de laboratorio.
Rendimiento alcohólico
12
10
11,2
Porcentaje (%)
8 10,3
8,8
6
4
2
0
Cepa S. cerevisiae del S. cerevisiae Danstil S. cerevisiae
fermento artesanal EDV 493 ZWLDTY48
Levaduras
Gráfico 3.1.2: Volumen de cuerpo (mL) obtenido a partir de la fermentación con

cada una de las levaduras estudiadas a nivel de laboratorio
Volumen del cuerpo

60
50 56
52
40
44
mL
30
20
10
0
Cepa S. cerevisiae del S. cerevisiae Danstil S. cerevisiae
fermento artesanal EDV 493 ZWLDTY48
Levaduras
Es importante indicar que al igual que el consumo de azúcares, el rendimiento

alcohólico no se debe exclusivamente a las levaduras inoculadas. Además se debe
considerar la posible presencia de bacterias productoras de etanol. (Garzón &
Hernández, 2009). Por este motivo, en el presente estudio se calculó el
rendimiento alcohólico relativo tomando como referencia el estudio realizado por

Mora & Luna, 2012 cuya metodología fue la más próxima al procedimiento que se
realiza en la Fábrica Trancahuaico.
3.2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS A NIVEL DE LA FÁBRICA
Tanto el volumen de etanol, como el rendimiento alcohólico fueron mayores cuando

la fermentación se llevó a cabo con S. cerevisiae ZWLDTY48. Por lo tanto el
estudio de fermentación en la fábrica se lo realizó con esta levadura, y
simultáneamente se realizó otra con el fermento artesanal.
Con fines comparativos, la fermentación también se realizó a nivel de laboratorio

utilizando el mismo lote de chaguarmishqui con la cepa de S. cerevisae
ZWLDTY48. La destilación se realizó conjuntamente el mismo día.
Tabla 3.2.1: Comparación de la destilación a nivel de la fábrica y en el laboratorio

al mismo tiempo, usando la levadura comercial ZWLDTY48 y el fermento artesanal.
Destilación en Destilación en el Destilación en

laboratorio la fábrica la fabrica
Fermento
Fermento ZWLDTY48
artesanal
Mililitros Litros Litros
V0 (mL) 500 330 330
Cabeza (mL) 1 2 1
Cuerpo (mL) 52 32 28
% v/v 45 45 45
Cola (mL) 5 6 2
Rendimiento (%) 10,3 9,7 8,5
La mayor diferencia observada en la destilación a nivel de la fábrica fue el volumen

en la cola. Durante la destilación al separar la cola del cuerpo la medición del
volumen de la cola inició cuando se alcanzó un grado alcohólico de 38 % v/v de
etanol recolectándose alrededor de 6 litros al utilizar la levadura comercial

ZWLDTY48 a diferencia de la cola de la destilación obtenida a partir del fermento

artesanal (2 litros).
En base a estos resultados, el rendimiento alcohólico de la cepa S. cerevisae

ZWLDTY48 a nivel de la fábrica fue de 15% menor al obtenido a nivel de
laboratorio, pero se mantuvo mayor al obtenido utilizando el fermento artesanal
(12%).
La diferencia en el rendimiento alcohólico observado entre la fábrica y el laboratorio

puede deberse a la diferencia de volumen utilizado en el ensayo y también al tipo
de material en el cual se realizó la destilación (vidrio en el laboratorio y cobre en la
fábrica) lo que puede llevar a pérdidas o ganancias en el proceso.
Es importante destacar que a nivel de laboratorio se utilizó la cepa S. cerevisiae del

fermento artesanal previamente purificada. A partir de esta levadura se obtuvo un
rendimiento alcohólico de 8.8% a nivel de laboratorio, y con el fermento artesanal a
nivel de fábrica se obtuvo un rendimiento de 8.5 %. Por lo tanto esta diferencia
(3.5% menor a nivel de fábrica) no fue tan considerable como la obtenida con la S.
cerevisae ZWLDTY48.

4. CONCLUSIONES
Se obtuvo una diferencia significativa entre los rendimientos alcohólicos relativos

de los tres fermentos (p<0.001).
El rendimiento alcohólico relativo obtenido para la S. cerevisiae ZWLDTY48 se

caracterizó con un consumo más acelerado de los azúcares presentes en el
chaguarmishqui y por lo tanto esto favoreció a una mayor producción de etanol.
Así, dicha cepa fue la que presentó el mejor rendimiento alcohólico (11,2 ± 0.1%),
resultado 0.88 veces mayor que la S. cerevisiae Danstil EDV 493 (P<0,001) y ésta
a su vez fue 1.52 veces mayor que la cepa S. cerevisiae del fermento artesanal
(P<0,001).
La cepa de Saccharomyces cerevisiae ZWLDTY48 representa una mejor opción

para el proceso de producción de tequila en términos comerciales.
Los resultados obtenidos con esta levadura a nivel de laboratorio se reprodujeron a

nivel de la fábrica.

5. RECOMENDACIONES
Este estudio fue realizado con el apoyo de la Fábrica de tequila Trancahuaico, por
lo que se recomienda:
La recolección del jugo de los proveedores deberá ser pasando un día para
evitar un mayor desarrollo de los microorganismos.
Realizar un proceso de pasteurización con el fin de eliminar los

microorganismos que puedan afectar la buena conservación del aguamiel,
brindando estabilidad microbiológica y asegurando los nutrientes para el
desarrollo de la levadura.
Utilizar la levadura Saccharomyces cerevisiae ZWLDTY48 la cual mejoraría

el rendimiento alcohólico. En su defecto, el fermento artesanal debería ser
renovado constantemente para asegurar la presencia de la levadura activa.
En el caso del rendimiento alcohólico se recomienda implementar mejores

técnicas de análisis de los azucares, con el fin de evaluar el proceso de
fermentación y validar la medición relativa del rendimiento alcohólico.
Para la continuidad del control de calidad en base al presente estudio se

recomienda:
Realizar la caracterización e identificación de Saccharomyces cerevisiae de

la planta de agave, para confirmar la presencia de la levadura como nativa
de la planta, con su posterior aislamiento.
Pasteurizar el chaguarmishqui, para asegurar que el consumo de glucosa es
realizado por las levaduras, y efectuar la mediciones de los azucares
presentes en el jugo.
Optimizar el proceso de destilación a nivel de fábrica.

6. REFERENCIAS
1. Abisai, García. Los agaves de México. Universidad Nacional Autónoma de

México. Septiembre, 2007. [Fecha de Consulta 18/12/2013]. Disponible en:
http://www.revistaciencias.unam.mx/images/stories/Articles/87/02/Los%20ag
aves%20de%20Mexico.pdf
2. Academia mexicana de tequila. Acamex tequila. El agave. 2001. [Fecha de

Consulta 18/12/2013]. Disponible en:
http://www.acamextequila.com.mx/amt3/elagave.html
3. Acosta Romero Carolina. Tesis de investigación presentada como requisito

parcial para optar al título de: Magister en ingeniería química. Evaluación de
la fermentación alcohólica para la producción de hidromiel. Universidad
Nacional de Colombia. Facultad de ingeniería. Bogotá, Colombia 2012.
[Fecha de Consulta: 29/12/2013]. Disponible en:
http://www.bdigital.unal.edu.co/9933/1/300060.2012.pdf
4. AcuaNatura. Técnicas de tinción. 2007. [Fecha de Consulta 12/06/2013].

Disponible en:
http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetinci
on.pdf
5. Alberto Rojas-Triviño. Conceptos y práctica de microbiología general.

Universidad Nacional de ColombiaSede Palmira2011. VERSIÓN: 0.0.
[Fecha de Consulta 07/01/2014]. Disponible en:
http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf
6. Allauca Salguero Rosa Elizabeth. Diversificación del uso del chaguarmishqui

en la gastronomía del cantón Guano. 2010. Escuela Superior Politécnica de
Chimborazo. Facultad de Salud Pública. Escuela de gastronomía.
Riobamba, Ecuador. 2011. [Fecha de Consulta 18/12/2013]. Disponible en:
http://dspace.espoch.edu.ec/handle/123456789/2324

7. Andrade Paulette, Carrasco Karen, García Judith, Herrera

Carla. Aislamiento, selección, conservación de los microorganismos
aislados de la elaboración de vino de araza. Universidad de San Carlos de
Guate. Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Químicas.
Escuela Bioquímica y Farmacia. [2010-2011]. [Fecha de Consulta
19/05/2013]. Disponible en:
https://www.google.com.ec/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=4&v
ed=0CDcQFjAD&url=http%3A%2F%2Fjudithv.wikispaces.com%2Ffile%2Fvi
ew%2FPROYECTO%2BVINO%2BDE%2BARAZA.docx&ei=0kCoUbucJYW
C9gSosYDgBw&usg=AFQjCNFE7_dDv1xuZ3SQXfHZ-
HXir3shCg&bvm=bv.47244034,d.eWU&cad=rja
8. Beitia Samudio Jorge Luis. Proyecto de grado para optar al título de

Ingeniero de producción agroindustrial. Influencia del subcultivo de la
levadura Saccharomyces cerevisiae en el desarrollo de una fermentación
alcohólica. Universidad de la Sabana. Facultad de ingeniería. Programa de
producción agroindustrial Bogotá, D.c. 2001. [Fecha de Consulta:
http://intellectum.unisabana.edu.co:8080/jspui/bitstream/10818/5079/1/13002
0.pdf
9. Buitrago Estrada Johanna Carolina & Tenjo Camacho Olly Giselle. Trabajo
de grado presentado como requisito parcial para optar el título de:
Microbiólogo industrial. Obtención de un sustrato fermentable de origen
vegetal y su evaluación con células libres de Saccharomyces cerevisiae.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá, D.c. Enero
2007. [Fecha de Consulta: 29/12/2013]. Disponible en:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis285.pdf
10. Cáceres García Juan Carlos & Reyna López Andrés. Modelamiento
microbiológico para la levadura Saccharomyces cerevisiae. Universidad de
la Sabana. Facultad de ingeniería de producción agroindustrial. Bogotá
2002. [Fecha de Consulta: 29/12/2013]. Disponible en:

http://intellectum.unisabana.edu.co:8080/jspui/bitstream/10818/5072/1/13002
8.pdf
11. Casco Montenegro Gerardo. Caracterización química de tres marcas

comerciales de aguardiente en Honduras (Tatascan, Yuscaran y Ron plata).
[Tesis de Grado para Licenciatura en Ingeniería en Agrindustria]. Honduras.
[Diciembre 2005]. [Fecha de Consulta 19/05/2013]. Disponible en:
http://bdigital.zamorano.edu/bitstream/11036/1067/1/T2032.pdf
12. Castellucci Federico. Análisis Microbiológico de vinos y mostos. Revisión de

la Resolución OENO 8/95. [Fecha de Consulta 18/12/2013]. Disponible
en: https://www.google.com.ec/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=
7&cad=rja&ved=0CFkQFjAG&url=http%3A%2F%2Fdocencia.izt.uam.mx%2
Fsmk%2F233208%2Fpracticas%2Fexpoequipo4.ppt&ei=hCvMUqDzOcOnk
Qe9sICgDQ&usg=AFQjCNFuu8q7LNJo0nhWuolmtBF1dmvkFw
13. Castillo Ávila, Berenice. Pruebas bioquímicas. 2012. [Fecha de Consulta

https://www.google.com.ec/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=12&
cad=rja&ved=0CC0QFjABOAo&url=http%3A%2F%2Flabacteriologia.files.wo
rdpress.com%2F2012%2F05%2Fpruebas-bioquimicas-
4102c.pptx&ei=teO9Uq2gCqGr2QWmh4CYDw&usg=AFQjCNE6q3nM8DUj
HbdBXbUwu4Ig44jnrw&bvm=bv.58187178,d.b2I
14. Comité Estatal de Sanidad Vegetal. Guanajuato. Campana de manejo

fitosanitario de agave. 2007. [Fecha de Consulta 12/06/2013]. Disponible en:
http://www.cesaveg.org.mx/html/folletos/folletos_07/folleto_agave_07.pdf
15. Consejo Regulador de Tequila. El Tequila. Elaboración. Jalisco. México.

2011. [Fecha de Consulta 07/01/2014]. Disponible en:
http://www.crt.org.mx/index.php?option=com_content&view=article&id=92&It
emid=174

16. Cueva E., Van Den V., Cabrera O., 1999. “Plantas silvestres comestibles del
sur del Ecuador”. Ediciones Abya-Yala. Quito. Ecuador. Pág. 80.
17. Fajardo Castillo Rika Esperanza & Sarmiento Forero Sandra Constanza.
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para obtener el título de
Microbiólogo Industrial. Evaluación de melaza de caña como sustrato para la
producción de Saccharomyces cerevisiae. Pontificia Universidad Javeriana.
Facultad de Ciencias. Bogotá, D.C. Agosto de 2007. [Fecha de Consulta:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis26.pdf
18. Ferreyra María Mercedes. Estudio del proceso biotecnológico para la

elaboración de una bebida alcohólica a partir de jugo de naranjas.
Universidad politécnica de Valencia. Departamento de tecnología de
alimentos. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones
Industriales (CINDEFI). UNLP. Concordia/ Valencia. Marzo de 2006. [Fecha
de Consulta 18/12/2013]. Disponible en:
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/1933/tesisUPV2468.pdf
19. Freire Fierro, A. 2004. Botánica Sistemática Ecuatoriana. Missouri Botanical

Garden, FUNDACYT, QCNE, RLB y FUNBOTANICA. Murray Print, St.
Louis. Pág. 79-91.
20. Fundación Ñamarín: Centro de Información Recolecciones. Datos. Usos del

Chaguarmishqui. Quito. Centro de Turismo. 2009.
21. García, E. Javier; Méndez, S. de Jesús; Talavera, Daniel. El género agave

spp. En México: principales usos de importancia socioeconómica y
agroecológica. 2001. RESPYN Revista Salud Pública y Nutrición. Edición
Especial No. 5‐2010. (ISSN 1870‐0160). México. [Fecha de Consulta
18/12/2013]. Disponible - -

22. Ibarra, Silvia. Maguey o Agave. 2001. [En línea]. [Fecha de Consulta
http://www.elportaldemexico.com/cultura/bebidas/magueyagave.htm
23. Instituto Ecuatoriano de Normalización. NTE INEN 1 529-2:99. Control

microbiológico de los alimentos. Toma, envío y preparación de muestras
para el Análisis microbiológico
24. del Ecuador. [Fecha de Consulta 17/05/2013]. Disponible en:

http://normaspdf.inen.gob.ec/pdf/nte/1529-2.pdf
25. Jurado López Sofía Evelyn, Sarzosa Pazmiño Xavier Santiago. Estudio de la
cadena agroindustrial de la cabuya en la producción de miel y licor de
cabuya. Escuela Politécnica Nacional. Facultad de Ingeniería Química y
Agroindustria. Quito, Junio 2009. [Fecha de Consulta 18/12/2013].
Disponible en: http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/1693/1/CD-
2305.pdf
26. Laboratorios Britania S.A. Caba – Argentina. Ref B0215206. 2002. [Fecha
http://www.britanialab.com/productos/363_hoja_tecnica_es.pdf
27. Laboratorios Conda S.A. Abril. 2010. [Fecha de Consulta 18/12/2013].

Disponible en:
http://www.condalab.com/uploads/media/1011__AGAR_BISMUTO_SULFIT
O_02.pdf
28. Latorre García Lorena. Análisis estructural y modificación funcional de la

glucoamilasa de Saccharomyces cerevisiae var. Diastaticus. Universitat de
València. Departament de Bioquímica i. Biologia molecular. 2008. [Fecha de
Consulta 18/12/2013]. Disponible
en: http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/9556/LATORRE.pdf;jsessionid
=9ACECFD89721CFA10325689474D85B0B.tdx2?sequence=1

29. Macías Alejandro. El cluster en la industria del tequila en Jalisco, México.

Centro Universitario del Sur. Universidad de Guadalajara. México. Revista
Agroalim v.13 n.13 Mérida dic. 2001. [Fecha de Consulta 12/06/2013].
Disponible en: http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S1316-
03542001000200005&script=sci_arttext
30. Martínez María del Carmen; Pérez Alvarado Leticia. Análisis del mercado
potencial del tequila 100% agave. México. 2008. [Fecha de Consulta
http://itzamna.bnct.ipn.mx/dspace/bitstream/123456789/8879/1/MARINEZ%2
0MORALESpdf
31. Mario Cervantes Contreras & Aura Marina Pedroza Rodríguez. El pulque:
características microbiológicas y contenido alcohólico mediante
espectroscopia Raman. Departamento de Matemáticas. Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología-Instituto Politécnico Nacional. Ticoman.
México D.F. 07340. Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial.
Laboratorio de Biotecnología aplicada. Departamento de Microbiología.
Pontificia Universidad Javeriana. 12 de mayo del 2007. [Fecha de Consulta
http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA_9/nova8_artorig3.pdf
32. Méndez. Microbiología básica. Generalidades de los microorganismos

(morfología, taxonomía, nutrición, reproducción y crecimiento). Julio. 2011.
http://microbiologiadelosalimentosgastronomi.blogspot.com/2011_07_01_arc
hive.html
33. Montoya Rodríguez Isabel; Quintero Suárez Julia. Esquema tecnológico

integral de la producción de bioetanol carburante. Universidad Nacional de
Colombia. Facultad de Ingeniería y Arquitectura. Ingeniería Química. [Enero
2005]. [Fecha de Consulta 17/05/2013]. Disponible en:
http://www.cosaslibres.com/leer-

online/?title=Esquema+Tecnol%C3%B3gico+Integral+de+la+Producci%C3%
B3n+de+Bioetanol+...&doc=http%3A%2F%2Fwww.bdigital.unal.edu.co%2F1
043%2F1%2Fmariaisabelmontoyarodriguez.2005.pdf.pdf
34. Nieto Galarza Hernán Oswaldo. Proyecto previa a la obtención de Grado

Académico o Título de: Ingeniero en Biotecnología. Evaluación de las
condiciones de la fermentación alcohólica utilizando Saccharomyces
cerevisiae y jugo de caña de azúcar como sustrato para obtener etanol.
Escuela Politécnica del Ejército. Ingeniería en Biotecnología Sangolqui.
Diciembre de 2009. [Fecha de Consulta: 29/12/2013]. Disponible en:
http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/990/1/T-ESPE-026782.pdf
35. NMX-F-103-1982. Alimentos. Frutas y derivados. Determinación de grados

Brix. Foods. Fruits and derivatives. Determination of degrees brix. Normas
mexicanas. Dirección general de normas. [Fecha de Consulta 07/01/2014].
Disponible en: http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-
103-1982.PDF
36. NOM-006-SCFI-1994. Norma Oficial Mexicana. Bebidas alcohólicas.

Tequila-Especificaciones. [Fecha de Consulta 12/06/2013]. Disponible en:
http://www.colpos.mx/bancodenormas/noficiales/NOM-006-SCFI-1994.PDF
37. Pardo, Oriana. El agave americano (Agave americana L.): uso alimentario
en el Perú. Chloris Chilensis. Año 8 Nº 2. 2005. [Fecha de Consulta
18/12/2013]. Disponible
en: http://www.chlorischile.cl/agavepardo/Agavetexto.htm
38. Pérez Linan. A y Col. Determinación química y estudio terapéutico de agave

tequilana Weber. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de
Nuevo León. México. Laboratorio de Química y Manejo integral de Recursos
Naturales. RESPYN Revista Salud Pública y Nutrición. Edición Especial No.
5‐2010 (ISSN 1870‐0160). [Fecha de Consulta 12/06/2013]. Disponible en:
http://www.google.com.ec/url?sa=t&rct=j&q=agave%20azul%20composicion
%20quimica%20pdf&source=web&cd=2&ved=0CDEQFjAB&url=http%3A%2

F%2Fwww.respyn.uanl.mx%2Fespeciales%2F2010%2Fee-05-
2010%2Fdocumentos%2F22.pdf&ei=a9_2UZ30A4zk8gTYoIGgBw&usg=AF
QjCNF7ijMuHGGy4ADKDwe09i0xgXtgQw&bvm=bv.49784469,d.eWU&cad=
rja
39. Ramírez Delia. 2010. [Fecha de Consulta 18/12/2013]. Disponible en:

http://repositorio.utn.edu.ec/bitstream/123456789/1991/1/03%20IEA%20306
%20DOCUMENTO%20TESIS.pdf.
40. Romo, Alfonso. Química, universo, tierra y vida. VI. Fermentaciones,

pulque, colonche, tesgüino, pozol, modificaciones químicas. 1996. [Fecha de
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen1/ciencia2/51/htm/sec
_9.html
41. Sampedro Alban, Milton Paul. Estudio e investigación del Shawarmishki

(agua miel), análisis de sus propiedades, su explotación, aplicación culinaria
de este producto milenario. Universidad Tecnológica Equinoccial. Facultad
de turismo, preservación ambiental, hotelería y gastronomía. Quito. [2009].
http://repositorio.ute.edu.ec/bitstream/123456789/9605/1/37366_1.pdf
42. Valenzuela Zapata Ana Guadalupe. Las denominaciones de origen tequila y

mezcal y la biodiversidad en el género agave sp. 2007. [Fecha de Consulta
http://www.esac.pt/cernas/comunicacoes_biodo/3.%20ana%20valenzuela_p
df.pdf
43. Petrenko, Olena. Estudio de algunas características de las cepas de

levaduras y de su rendimiento celular utilizando un medio de cultivo a base
de suero lácteo. Universidad de Belgrano. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Buenos Aires, 2005. [Fecha de Consulta 05/03/2014]. Disponible
en: http://www.ub.edu.ar/investigaciones/tesinas/147_petrenko.pdf

44. Oliveira, Valdineia y Col. Biochemical and Molecular characterization of

Saccharomyces cerevisiae strains obtained from sugar-cane juice
fermentations and their impact in Cachaca production. Universidade Federal
de Ouro Preto. Departamento de Química. Centro de Biología. Vol. 74. No 3.
Brasil, 2008. [Fecha de Consulta 24/09/2013].
45. Vaughan Martini, Ann. Martini, Alessandro. A taxonomic key for the genus
Saccharomyces. Universita di Perugia. Dipartimento di Biologia Vegetale.
New York. 1992. [Fecha de Consulta 24/09/2013].
46. Asyikeen, Noroul y Col. A new source of Saccharomyces cerevisiae as a

leavening agent in bread making. University Kebangsaan Malaysia. Faculty
of Science and Technology. Malaysia. 2013.
47. Linares María, Solís Francisco. Identificación de levaduras. Revista

Iberoamericana de Micología - ISBN: 978-84-611-877. 2007. [Fecha de
http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo11.pdf
48. Josafad Santiago, Mendoza Mariano, Borrego Fernando. Evaluación de

tomate (Lycopersicon esculentum, MILL) en invernadero: criterios
fenológicos y fisiológicos. Agronomía Mesoamericana 9(1): 59-65. México.
http://www.mag.go.cr/rev_meso/v09n01_059.pdf
49. Garzón Sandra; Hernández Catalina. Estudio comparativo para la

producción de etanol entre Saccharomyces cerevisiae silvestre,
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Y Candida utilis ATCC 9950.
Universidad Tecnológica de Pereira. Facultad de Tecnologías. 2009. [Fecha
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/1689/1/66182G245.pdf
50. Téllez Mora, Peraza Luna, Feria Velasco, Andrade González. Optimización
del proceso de fermentación para la producción de tequila, utilizando la

metodología de superficie de respuesta (MSR). Instituto Tecnológico de

Tlajomulco, Jalisco y de Tizimín,. Universidad de Guadalajara. Rev. Mex.
Ing. Quím vol.11 no.1 México abr. 2012. [Fecha de Consulta 20/03/2014].
Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1665-
27382012000100014&script=sci_arttext
51. Vásquez Mayra; Vásquez Ligia. Obtención de vodka a partir de dos tipos de
maíz (Zea mays): maíz amarillo amiláceo y maíz blanco de Grano vitrio.
Universidad Técnica del Norte. Facultad de Ingeniería en Ciencias
Agropecuarias y ambientales. Ibarra. Ecuador. 2009. [Fecha de Consulta
http://repositorio.utn.edu.ec/bitstream/123456789/528/1/03%20AGI%20239
%20TESIS.pdf
52. Villanueva Elizabeth. Determinación de parámetros en la elaboración de un

destilado de uvas pasas (Vitis vinífera l.), Variedad Italia blanca a través de
sus características físico químicas y sensoriales. Universidad Nacional Jorge
Basadre Grohmann – Tacna. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Perú.
http://tesis.unjbg.edu.pe:8080/bitstream/handle/unjbg/270/155_2013_Villanu
eva_Quejia_EM_FCAG_Aliementarias_2013.pdf?sequence=1

7. ANEXOS
1. NORMA NMX-V-022-1972
EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-V-022-1972. AGUAMIEL. HYDROMEL. NORMAS MEXICANAS.
DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.
1. GENERALIDADES Y DEFINICIONES
Generalidades
El aguamiel es un líquido traslúcido, de color ambarino, de olor y sabor característicos

que se aprecian mediante prueba de catado.
Usos
El aguamiel se utiliza principalmente como substrato fermentable en la elaboración del

pulque.
Alcance
Esta Norma se aplica a las características, recepción, clasificación, valuación y

aprovechamiento del aguamiel que, en forma directa o indirecta, sirva como substrato
fermentable.
Datos para el pedido
Para la fácil identificación del aguamiel normalizada, el pedido debe especificar los
siguientes datos: nombre del producto, tipo, cantidad expresada en unidades de
producto, volumen expresado en litros, en caso de no hacer uso del Sello Oficial de
Garantía, señalamiento del lugar donde se verifique la calidad, incluyéndose, si es
necesario, otros datos que faciliten el intercambio comercial y Norma de referencia.
Definiciones
Aguamiel
Para los efectos de esta Norma, se entiende por aguamiel, el jugo que se obtiene
mediante el raspado previo del cajete o cavidad central del maguey pulquero.
Maguey pulquero

Es la planta de la que se obtiene el aguamiel para la producción del pulque, que se

cultiva principalmente en los estados de México, Hidalgo y Tlaxcala y que corresponde a
ciertas especies del género Agave.
Maguey al "hilo"
Es la planta que habiendo alcanzado su óptimo desarrollo vegetativo, momento en que

se abren las puntas de las hojas centrales, se encuentra en condiciones de ser sometida
a la práctica de "capazón o capado".
"Capado o capazón del Maguey"
Es el corte que se practica en la base del vástago incipiente, de la floración, para evitar
que esta se efectúe.
Añejado del Maguey
Es el tiempo en que la planta, después de ser "capada", alcanza las condiciones que
son favorables para la obtención del aguamiel, mediante el raspado.
Picado del Maguey
Es la formación manual de la cavidad o cajete del maguey, hasta un diámetro que esté
de acuerdo con el tamaño de la planta; dando a los restos del material picado tiempo
suficiente para lograr repetidamente las condiciones favorables a la explotación de la
planta.
Raspado del Maguey
Es el corte cuidadoso y fino que se practica diariamente en los tejidos del bordeu orilla
del cajete del maguey, para evitar la cicatrización y estimular la producción del
aguamiel, ahondando la cavidad de dicho cajete para permitir su almacenamiento.
CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES
CLASIFICACIÓN
El aguamiel se clasifica en 2 tipos, con un solo grado de calidad.
TIPO I.- Es el producto que cumple con las definiciones señaladas en los incisos 1.2.1.
al 1.2.7. y que debe satisfacer las especificaciones anotadas en la Tabla I. (Ver inciso
4.1.1.).
TIPO II.- Es el producto que cumple con las definiciones señaladas en los incisos
1.2.1. al 1.2.7. y que debe satisfacer las especificaciones anotadas en la Tabla I (Ver
inciso 4.1.2)..

Especificaciones Físicas y Químicas. Bioquímicas
2.2.2.1 Organolépticas
TABLA 1.
TIPO I TIPO II
MENOR
ESPECIFICACIONES
pH 6.6
MÍNIMO 7.5
MÁXIMO 4.5
DE:
Densidad grados Baumé (Bé) 5 7 4.5
Índice de refracción con el refractómetro de inmersión 59 100 27
Sólidos
a 20°C. totales g/100 ml. 13 17 7
Azúcares reductores totales (en glucosa) g/100 ml. 8 12 6
Azúcares reductores directos (en glucosa) g/100 ml. 2 3 3
Gomas (en glucosa) g/100 ml. 2 6 0.20
Proteínas mg/100 ml. 300 600 100
Cenizas mg/100 ml. 300 430 180
NO MAYOR DE:
Acidez mg/100 ml (como ácido láctico). 0.90 1.03 4.00
Color: Debe tener un color ambarino, propio del producto.
Olor: Debe ser el característico del producto.
Sabor: El sabor del aguamiel debe ser dulce, suigéneris.
Aspecto: Debe tener aspecto traslúcido.
Muestreo
Para definir la aceptación o rechazo del producto, el muestreo se realiza determinando,

como mínimo, las siguientes especificaciones fijas que son: el pH y el contenido de
reductores totales. Para tal fin, se debe tomar una muestra no menor de 100 ml por
unidad o envase.
El resto de las especificaciones de la Tabla I, se determina en la muestra de común

acuerdo comprador y vendedor; a falta de este acuerdo se procede como se indica en la
Tabla II.
TABLA II
NO. DE ENVASES DE NO. DE ENVASES A

AGUAMIEL MUESTREAR
1 – 5 unidades 1 envase
6
DE– UN
20 unidades
SOLO TIPO 5 envases
21 – 50 unidades 10 envases
De cada envase a muestrear, se toma una muestra constituida con porciones

aproximadamente iguales, extraídas de los niveles inferior, medio y superior(ver inciso
4.1.3.). El volumen extraído no debe ser menor de dos litros, que constituye la muestra
final, la cual debidamente homogeneizada, se utiliza para determinar las
especificaciones de la Tabla I.
2.2.3.2 Debido a la inestabilidad del producto, la verificación de las especificaciones

debe hacerse de inmediato a la entrega del producto en el lugar de recepción.
Envasado
El producto debe envasarse en recipientes que garanticen su calidad sanitaria.
Marcado
Cada envase debe llevar impresas, en forma destacada y perfectamente legibles, las
siguientes indicaciones:
Nombre el producto, contenido neto expresado en litros, lugar de envasamiento y

nombre o razón social del productor.
En caso de que del producto se embarque a granel, los datos anteriores figurarán en los
documentos de la transacción comercial.
MÉTODOS DE PRUEBA
Para verificar las especificaciones que se establecen en esta Norma, deben aplicarse
las siguientes Normas de Métodos de Prueba en vigor:
NMX-V-017 Determinación del Extracto Seco y Cenizas en Bebidas Alcohólicas.

NMX-V-024 Determinación de la Densidad (grados Baumé).
NMX-V-029 Determinación de Proteínas.
NMX-V-040 Determinación de Reductores Totales y directos (en glucosa). NMX-
V-041 Determinación de pH.
NMX-V-043 Determinación de la Acidez Total.
NMX-V-045 Determinación el Indice de Refracción con el Refractómetro
de inmersión.
NMX-F-111 Determinación de Sólidos Totales.
Determinación Gomas, aplíquese el Método de Prueba NMX-V-40 con la
siguiente modificación:
Cuando se trate determinar Gomas como dextrinas, se sigue el mismo procedimiento

que para Reductores Totales, hasta donde se enuncia calentar a baño de vapor a
60° durante 10 minutos en vez de esta temperatura será calentar a ebullición y reflujo
durante una hora y se continúa el método.

La cantidad de gomas estará dada por el valor obtenido en la determinación de gomas

menos el de Reductores Totales.
APÉNDICE
Observaciones
Para obtener aguamiel de Tipo I se recomienda, se inicie la recolección del producto 15

días después del primer raspado, en un lapso que varíe de 30 a 60 días.
El aguamiel en ambos tipos no debe presentar signos de fermentación avanzada.
Para efectuar el muestreo a tres niveles, debe emplearse un tipo de sonda para tres
niveles con la cual se obtengan resultados satisfactorios.
BIBLIOGRAFÍA
Datos proporcionados por el Patronato del Maguey y la Secretaría de Salubridad y

Asistencia.
Fecha de aprobación y publicación: Septiembre 26, 1972. Esta Norma Cancela a la:
NMX-V-022-1970.

2. TABLAS DE CONVERSIÓN DE UNIDADES DE MEDIDA

3. NTE INEN 1 529-2:99
Control microbiológico de los alimentos. Toma, envío y preparación de

muestras para el Análisis microbiológico
1. OBJETO
1.1 Esta norma, según la naturaleza del producto, establece los procedimientos generales
para la toma de muestras de alimentos, el envío al laboratorio y su preparación en el
laboratorio.
2. ALCANCE
2.1 Los procedimientos establecidos en esta norma para la preparación de la muestra se
refieren al tratamiento inicial al que se deben someter las muestras de alimento destinadas
al análisis microbiológico, según se indica en la serie de NTE "INEN 1529 Control
Microbiológico de los Alimentos", excepto en las NTE INEN 1529-1 y 1529-12.
2.2 Esta norma no se aplica para casos de brotes epidémicos o intoxicaciones, ni para
decidir el tamaño de la muestra.
3. DEFINICIONES
3.1 Para los efectos de esta norma se adoptan las definiciones contempladas en cada una
de las Normas Técnicas Ecuatorianas (NTE) INEN de Requisitos sobre alimentos y las que
a continuación se detallan:
3.1.1 Lote. Es la cantidad de alimento producida y manipulada bajo condiciones que se
suponen uniformes. En la práctica, esto generalmente significa un alimento producido en
un bach, o cuando el proceso es continuo dentro de un período de tiempo definido y en un
lugar determinado, por ejemplo, en una línea de producción determinada, en un autoclave
u otra unidad crítica de tratamiento. Los diferentes lotes son identificados mediante
códigos.
3.1.2 Partida. Es la cantidad de alimento, grande o pequeña, enviada a un determinado
destinatario. Normalmente consiste en numerosas cajas de alimento procedente de uno o
más lotes.
3.1.3 Toma de muestras. Es el acto de seleccionar y coger una determinada cantidad, o un
número de recipientes o unidades de producción de un mismo lote de alimento, o de áreas
de superficie que son o que entran en contacto con productos alimenticios.
3.1.4 Unidad de muestreo. Es la parte definible más pequeña de un lote (unidad de
producción). Esto puede significar una lata, o un paquete. Cuando la producción es a
granel y se envasa en cajas, bidones, barriles, sacos, etc., entonces la unidad de muestreo
es arbitraria y puede depender del utensilio para tomar muestras. No se debe confundir
esta unidad de muestreo con la unidad de muestra realmente utilizada en el análisis.
3.1.5 Unidad de muestra. Es la cantidad de material (tomada de la muestra de población)
que realmente se utiliza en el análisis, es la unidad analítica. En general, para los ensayos
microbiológicos se utiliza una unidad de muestra de 10 ó 25 g ó cm3 o sus múltiplos.
3.1.6 Muestra. Parte del conjunto (población) a partir de la cual se trata de estimar,
mediante análisis o examen, las propiedades del conjunto. Se debe tener en cuenta que

sólo puede someterse a análisis una parte (unidad de muestra) de la muestra de población
(ver 3.1.5 y 3.1.7).
3.1.7 Muestra de población. Número total (una o más) de unidades de muestreo
individuales tomadas de la población (idealmente, obtenidas de una forma aleatoria) que
se destinan al análisis de acuerdo con un programa de muestreo determinado (ver nota 1)
3.1.8 Muestra selectiva (sesgada). Es la muestra de alimento, tomada para demostrar o
documentar las condiciones insatisfactorias observadas por el inspector, o bien, para
contar con una unidad del alimento que se sospecha insatisfactorio y someterlo al análisis
microbiológico.
3.1.9 Muestra aleatoria. Conjunto de unidades de muestreo elegidas de la población de
modo que cada unidad tenga la misma probabilidad de ser seleccionada, con lo que se
excluye lassubjetividades del que toma las muestras. Normalmente implica la utilización de
la tabla de los números aleatorios.
3.1.10 Muestra representativa. Es aquella cuyas características son tan similares como
posible a las de la población de la cual proceden.
3.1.11 Programa de muestreo. Es la relación de los criterios de aceptación que se
aplicarán a un lote basados en el análisis, por métodos específicos, del número necesario
de unidades de muestra.
3.1.12 Programa de atributos. Es el programa de muestreo en que cada unidad de muestra
seleccionada se clasifica de acuerdo a las características de calidad del producto y en el
que solo hay dos o tres grados de calidad. Por ejemplo: aceptable, rechazable; presente,
ausente; aceptable, provisionalmente aceptable, rechazable; recuento bajo, recuento
medio, recuento alto (ver nota 2).
3.1.13 Categoría. Serie de factores relacionados con la naturaleza y tratamiento de un
alimento, enmarcados en 15 series (1 a 15 categorías), que determina por anticipado el
peligro de la presencia de determinadas especies o grupos bacterianos en un alimento.
3.1.14 "n". Número de unidades de muestra de un lote que se deben analizar, para
satisfacer las exigencias de un determinado programa de muestreo.
3.1.15 "c". Número máximo aceptable de unidades de muestra que pueden presentar una
tasa microbiana comprendida entre "m" y "M". Cuando se encuentra un número superior a
"c", se rechaza el lote.
3.1.16 "m". Valor (criterio) microbiológico aceptable de bacterias por gramo o cm3. Los
valores superiores a "m" se aceptan provisionalmente o se rechazan.
3.1.17 "M". Valor (criterio) microbiológico utilizado solo en programas de tres clases, para
separar la calidad rechazable de la provisionalmente aceptable. En cualquier unidad de
muestra, los valores iguales a, o superiores a "M" no son aceptables.
3.1.18 Aceptación-rechazo. La decisión de aceptar o rechazar un lote, en base a un
programa de muestro asociado a un análisis microbiológico determinado, se aplica solo al
propósito para el que se realizó dicho análisis (o varios de ellos).
NOTA 1 La muestra de población y la unidad de muestra pueden ser lo mismo pero, de

preferencia, la muestra de población debe ser considerablemente más grande que la
unidad de muestra que habrá de analizarse y cada muestra de población proporciona sólo

un resultado por cada análisis realizado. Por tanto, si se analiza más de una unidad de
muestra de la misma muestra de población, los resultados se promedian.
NOTA 2 En las Normas Técnicas Ecuatorianas (NTE) de requisitos se utilizan programas

de muestreo por atributos, de dos y tres clases. Un programa de muestreo de dos clases
requiere de las siguientes especificaciones: "n", "c" y "m" y los de tres clases: "n", "c", "m" y
"M".
3.1.19 Suspensión inicial (dilución primaria). Es la suspensión, solución o emulsión

obtenida después que la cantidad del producto en análisis (o de la porción de muestra
preparada para elensayo) ha sido pesada o medida y luego mezclada, utilizando un
homogeneizador cuando esnecesario y observando las precauciones apropiadas, con un
volumen de diluyente igual a nueveveces la unidad de muestra, para que los
microorganismos presentes en la unidad de muestra se distribuyan lo más uniformemente
posible y se permita que las partículas grandes, si las hay, se sedimenten (ver nota 3).
3.1.20 Otras diluciones decimales. Las suspensiones, soluciones o emulsiones obtenidas
mezclando un volumen específico de la dilución primaria con nueve veces el volumen del
diluyente y repitiendo esta operación con cada dilución así preparada, hasta obtener una
serie de diluciones decimales adecuada para la inoculación del medio de cultivo.
4. EQUIPO, MATERIAL Y DILUYENTES

4.1 Generalidades
4.1.1 El equipo y material utilizados en la toma de muestras deben ser de acero inoxidable
u otro material de resistencia adecuada, que no produzca cambios en la muestra que
puedan afectar los resultados de los exámenes subsiguientes. El equipo debe ser lo
suficientemente robu sto para evitar deformaciones en el uso y lo suficientemente leve que
permita al operador moverlo en el producto, fácil y rápidamente. Si los utensilios o
aparatos son soldados, la suelda debe resistir temperaturas de 180°C. Todas las
superficies deben ser lisas y libres de hendeduras, todas las esquinas deben ser
redondeadas. El equipo para tomar muestras debe cumplir con los requisitos específicos
adecuados a cada producto.
4.1.2 Los frascos para muestras y sus cierres, deben ser de un material resistente a
esterilizaciones repetidas, inerte, impermeable al agua y a las grasas (acero inoxidable,
vidrio y algunos plásticos). También se puede utilizar envases desechables de plástico,
hojas de aluminio o fundas plásticas con cierres apropiados. De preferencia deben ser
opacos y de capacidad y forma adecuadas para tomar la unidad de muestra deseada. Los
frascos para productos sólidos, semisólidos o viscosos deben ser de boca ancha.
4.1.3 Todo el material y utensilios utilizados en la toma, envío y preparación de muestras
para el análisis microbiológico deben estar perfectamente limpios, secos, envueltos
individualmente y estérilizados por uno de los siguientes métodos físicos:
4.1.3.1 Vapor a presión de 15 libras/ pulgada2 (autoclave): 121°C durante 20 min, mínimo.
4.1.3.2 Aire caliente: 170-175°C, en el punto más frío, durante 1 h, mínimo. Utilizar un
horno con una eficiente circulación de aire para que haya la seguridad de que en todas las
partes del horno se mantiene la temperatura fijada. Si por alguna razón, es imposible la

esterilización por estos dos métodos, utilizar los siguientes métodos alternos, que son
secundarios, y se los recomienda siempre que el material sea utilizado inmediatamente
después de esterilizado y enfriado.
4.1.3.3 Vapor fluente: 100°C por una hora.
4.1.3.4 Agua hirviente: ebullición en agua por 20 min, mínimo.
NOTA 3 En algunos casos puede necesitarse, especialmente para productos que dan una
suspensión inicial 1+9 demasiado viscosa o demasiado espesa, añadir más diluyente. En
algunos otros casos, cuando se necesita relacionar los resultados de los análisis con
determinados criterios de especificación, puede ser necesario una dilución primaria más
concentrada que 1+9. Estos factores deben ser tenidos en cuenta para las operaciones
subsiguientes y/o en la expresión de resultados.
OBSERVACIÓN. Las definiciones contenidas en los numerales 3.1 al 3.18, inclusive, son
según la FAO y la "International Commission on Microbiological Specifications for Foods"
(ICMSF).
4.1.3.5 Inmersión en etanol al 96% (v/v) y flameado hasta que el etanol se consuma. Para
materiales que resisten la llama directa.
4.1.3.6 Combustión: exponer a la llama de un mechero de Bunsen o de alcohol hasta la
incandescencia y enfriar. Para objetos que resistan la incandescencia.
4.2 Equipo y material

4.2.1 Para abrir envases: tijeras, cuchillos, abridores de latas y de botellas, martillos,
alicates, destornilladores, herramienta especial para abrir cajas de cartón, bisturíes, etc.
4.2.2 Para tomar muestras: sierras; sondas especiales que penetren en el producto y
corten un trozo cilíndrico; taladros; cucharas; cucharones de draga; pinzas; tenedores;
torundas; plantillas de metal, con un cuadrado de superficie conocida recortado en el
centro; fundas plásticas con cierre apropiado; papel aluminio; compuesto obturante, para
cerrar los orificios dejados en los quesos al tomar las muestras.
4.2.3 Para tomar muestras congeladas: taladro eléctrico de alta velocidad, hacha, cincel.
4.2.4 Para controlar la temperatura: termómetro manual de cuadrante, para controlar la
temperataura ambiente y del producto.
4.2.5 Para transportar muestras: refrigeradora portátil capaz de enfriar hasta 0°C a 5°C en
poco tiempo. Nevera isotérmica con cierre hermético y material aislante entre la pared
interna y la externa, para transportar muestras congeladas o refrigeradas.
4.2.6 Para etiquetar: etiquetas y marcadores.
4.2.7 Equipo para esterilización: autoclave u horno portátiles o mechero de alcohol, y un
agente desinfectante (alcohol al 70%).
4.2.8 Equipo para mantener muestras: refrigeradora, para almacenar muestras a 2°C y
congelador para almacenar a temperaturas menores de -20°C.
4.2.9 Equipo para descongelar muestras: baño de agua controlado termostáticamente con
agitador, que opere 37 ± 1°C y otro, a 45 ± 1°C.

4.2.10 Frascos para muestras: frascos de boca ancha con tapa de rosca, envases
desechables de plástico. Para el transporte de muestras deben ser de un material que
absorba los golpes.
4.2.11 Equipo para homogeneizar muestras: homogeneizadores, vortex, trituradores,
"stomacher", molinos.
4.2.12 Equipo para medir el pH: pH metro, con compensación de temperatura y
sensibilidad de 0,1de unidad de pH.
4.2.13 Equipo para pesar muestras: Balanza con exactitud clase II y graduación mínima de
0,1 g.
4.2.14 Materiales varios: erlenmeyers, probetas, tubos, pipetas, jeringuillas.
4.3 Diluyentes
4.3.1 Agua peptona al 0,1% : para uso general.
4.3.2 Agua peptona tamponada: para Salmonella.
4.3.3 Agua peptona sal al 15%: para extremamente halófilos.
4.3.4 Agua peptona sal al 5%: para halófilos moderados y halotolerantes.
4.3.5 Caldo TSB: para revitalización.
4.3.6 Caldo reforzado para clostridios: para anaerobios.
4.3.7 Solución de calgón [hexametafosfato sódico, (NaPO3)6] al 1% en solución Ringer
diluida al ¼: diluyente para hisopos de alginato.
4.3.8 Solución de citrato sódico al 2%, pH 7,5 ± 0,1: para quesos, leches fermentadas,
leche enpolvo "roller".
4.3.9 Solución de fosfato dipotásico al 2%: para caseína ácida, caseína láctica y suero
ácido en polvo el diluyente debe tener un pH de 8,4 ± 0,1 y 7,5 ± 0,1 para crema ácida,
quesos, caseínatos.
4.3.10 Solución de fosfato tripotásico (K3PO4.7H2O) al 8% para ajustar el pH de las
muestras.
4.3.11 Solución Ringer al 1/4: para mantequillas
4.3.12 Solución de sacarosa al 20%: para osmófilos.
4.3.13 Solución salina peptonada: para uso general.
5. TOMA DE MUESTRAS
5.1 Disposiciones administrativas (ver nota 4)
5.1.1 La toma de muestras debe realizar un agente autorizado o un agente independiente
autorizado que ha recibido formación técnica apropiada. El o la agente debe actuar
independientemente y no aceptar la interferencia de terceros. Bajo su responsabilidad
puede recibir ayuda de otros. Cuandosea posible, se debe permitir a los delegados de las
partes interesadas presenciar la toma de muestras. El agente y su(s) ayudante debe tomar
las medidas adecuadas para prevenir cualquier contaminación tanto del envío [o lote(s)]
como de las unidades de muestreo (por ejemplo, lavarse y desinfectarse las manos antes
de manipular el material a muestrearse, vestir un delantal u overol blanco y limpio, usar
mascarilla y gorro, trabajar observando rigurosamente todas las medidas previstas en el
programa de la planta para la higiene y desinfección de los empleados).

5.1.2 Se sellará y etiquetará cada muestra. Fijar el sello de manera que sea imposible
remover el contenido o la etiqueta sin destruir el sello. Las etiquetas deben ser de tamaño
y calidad adecuadas para el propósito (por ejemplo una cartulina de color claro, un cartón
a prueba de grasa y de agua y con un ojete reforzado). Escribir la información con tinta
indeleble indicando, por lo menos, la naturaleza del producto, el número y código del lote,
la fecha de la toma de muestras, el nombre y la firma del agente que tomó las muestras.
Cuando sea necesario, se puede incluir información adicional tal como el propósito de la
toma de muestras, la masa o volumen de la muestra, la marca de identificación de la
unidad (caja, bidón, etc.) de donde se tomó la muestra.
5.1.3 Se tomarán todas las muestras, cuando menos, por duplicado y se conservarán en
condiciones idénticas a las que tenían en el momento de la toma. De ser necesario, y
cuanto antes, se debe poner una serie a disposición de la otra parte. Previo convenio de
las partes, se recomienda la toma de series adicionales de muestras, las cuales, en caso
necesario, deben guardarse para un arbitraje independiente. Una vez tomadas las
muestras, enviar las muestras al laboratorio para su análisis.
5.1.4 Las muestras se deben acompañar de un informe de la toma de muestras firmado
por el agente responsable de la toma y refrendado por posibles testigos. En el informe
debe constar la siguiente información:
5.1.4.1 Lugar, fecha y hora en que se realizó la toma de muestras.
5.1.4.2 Nombre y dirección del agente que realizó la toma de muestras y de los posibles
testigos.
5.1.4.3 Método exacto de la toma de muestras (aleatorio en todo el lote, aleatorio en las
partes accesibles o por otro método).
5.1.4.4 Procedimiento exacto utilizado para tomar las muestras, si éste difiere de las
instrucciones dadas en esta norma.
5.1.4.5 Motivo de la toma de muestras.
5.1.4.6 Naturaleza del alimento.
5.1.4.7 Número y código del lote, códigos de los baches y el número y tamaño de las
unidades que constituyen el lote.
5.1.4.8 Tamaño y número de las muestras de población debidamente identificadas en
relación al lote, bache y/o unidad (caja, bidón, etc.) del cual proceden.
5.1.4.9 Lugar a donde se enviarán las muestras.
5.1.4.10 Ensayos solicitados.
5.1.4.11 Nombre y dirección del laboratorio que analizará las muestras.
5.1.4.12 Temperatura del producto al momento de la toma de muestras.
5.1.4.13 Origen del envío y lugar de destino.
5.1.4.14 Si es posible, el nombre y la dirección del fabricante, importador, vendedor o
comprador, según proceda.
5.1.4.15 Cuando convenga, se debe mencionar en el informe, además, cualquier condición
o circunstancia relevante de la toma de muestras (por ejemplo, el estado de los envases y
sus alrededores, la temperatura y humedad atmosféricas, la edad del producto, método de
esterilización del material para tomar muestras), si la muestra es una mezcla de
submuestras y cualquier información especial referente al producto muestreado, por
ejemplo, la dificultad para homogeneizar el producto.

5.2 Número de muestras de población que se deben tomar

5.2.1 Se debe tomar un número de muestras de población equivalente al número "n" de
unidades de muestra indicado en el programa de muestreo especificado, ya sea, en las
respectivas NTE de requisitos o en un contrato, o según lo acordado entre las partes
interesadas o según un programa diseñado para enfrentar una situación emergente (brote
de intoxicación, por ejemplo).
5.3 Técnicas para la toma de muestras

5.3.1 Generalidades
5.3.1.1 Tomar las muestras en condiciones asépticas, con rapidez pero cuidadosamente, y
de tal manera, para que la muestra sea representativa del producto que se quiere analizar.
5.3.1.2 Antes de abrir un envase limpiar la zona apropiada con agua tibia y jabón y pasar
alcohol al 70% sin flamear, o si es un envase de papel, retirar la parte externa. Abrir el
envase asépticamente con instrumentos estériles. Para cada envase utilizar un
instrumento estéril.
5.3.1.3 Cuando sea posible, mezclar bien el producto hasta que esté homogeneizado y,
cuando no lo es, asépticamente, tomar alícuotas de diferentes sitios del recipiente hasta
completar una cantidad no inferior a 100 g ó cm3.
5.3.1.4 Si se han de realizar diferentes tipos de análisis (microbiológicos, químicos, físicos
y sensoriales), asépticamente tomar primero y por separado las unidades de muestra
destinadas al análisis microbiológico. Para conservar estas muestras no se debe utilizar
preservantes
5.3.1.5 Registrar la temperatura del aire de la sala de almacenamiento o del vehículo,
tomar la muestra, luego, insertar el termómetro en el alimento del que se tomó la muestra y
registrar su temperatura. Cuando el alimento está envasado en pequeños envases
cerrados, registrar la temperatura del alimento en un envase adyacente en la misma caja
de cartón o embalaje.
5.3.1.6 El tamaño de la muestra de población debe ser de 100 cm3 o gramos, mínimo. En
muchos casos será el de la unidad de producción del lote como latas herméticamente
cerradas conteniendo muchas veces la cantidad de alimento equivalente a la unidad de
muestra, o envases muy pequeños de los que se necesitará tomar varios de ellos hasta
completar los 100 g.
5.3.2 Procedimientos para tomar muestras
5.3.2.1 Productos en envases pequeños. Los alimentos, sean éstos líquidos, pastosos,
sólidos o pulverulentos envasados en pequeños recipientes deben tomarse en su propio
envase original, sin abrir.
a) Las mantecas, margarinas, mantequillas que se encuentren en unidades de 250 o más
g, dividirlas en cuatro partes y tomar como muestras las dos cuartas partes opuestas. Si la
unidad pesa menos de 250 g, tomar toda la unidad.
b) De los quesos pequeños y de las porciones de queso envueltas y empacadas en
envases pequeños tomar como muestra un queso completo y de las porciones, un número
suficiente de ellas para que la muestra no sea inferior de 100 g.

5.3.2.2 Productos a granel (bidones, tambores, etc.).
a) Productos líquidos.
a.1) Evitando contaminar el contenido, mezclar los productos líquidos cuidadosamente con
un cucharón estéril o mecánicamente, hasta que el producto esté totalmente mezclado;
inmediatamente después de la mezcla, con un cucharón estéril y asépticamente transferir
a un envase estéril una cantidad no inferior a 100 cm3. Si es difícil obtener una buena
homogeneización, de sitios apropiados del recipiente tomar varias submuestras de manera
aobtener una muestra no inferior a 100 cm3 y que sea representativa del envase.
Inmediatamente cerrar y etiquetar el frasco. Para tomar una muestra de un ducto de salida,
primero dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar la salida con el flujo y
luego tomar la muestra, no menos de 100 cm3.
a.2) En el caso de cremas, dar un número suficiente de golpes con el cucharón para
asegurar una buena mezcla, sumergir el cucharón moviendo de un lado para otro con
mucho cuidado para evitar la formación de espuma y de mantequilla. Tomar no menos de
100 cm3 demuestra.
a.3) En el caso de leche condensada y evaporada mezclar muy cuidadosamente utilizando
un agitador adecuado para raspar el material adherido a las paredes y al fondo del
recipiente. Del contenido mezclado, trasladar de 2 a 3 litros a un recipiente más pequeño y
agitarlo. Tomar no menos de 100 cm3 de muestra.
b) Productos sólidos.
b.1) En el caso de productos sólidos, cuando la capa superficial no hace parte de la
muestra, retirarla del área de muestreo con una espátula, cuchillo o cuchara estériles,
hasta no menos 5 mm de profundidad y tomar la muestra con otro instrumento estéril. Si el
producto es un polvo, la capa superficial se retira antes de mezclar. Si el alimento está
formado por capas o extractos, separadamente y evitando contaminar las partes tomar
muestras de cada una en la misma proporción en que se encuentran en el producto
original.
b.2) En el caso de mantecas, margarinas, mantequillas a granel y el producto está en
bloque, y para que la muestra no sea inferior a 100 g, realizar dos sondajes o más
introduciendo una sonda verticalmente en el centro del bloque. Si el producto se encuentra
en barriles, incertarla sonda diagonalmente a través de la masa del producto desde el
borde del barril sin que penetre en la superficie del fondo. En los dos casos, hacer girar la
sonda una vuelta completa y retirar el material por completo. Sostener la punta de la sonda
encima de la abertura del frasco estéril, y con un cuchillo o espátula transferir
inmediatamente la muestra de la sonda en pedazos de aproximadamente 75 mm. Dejar
una porción de aproximadamente 25 mm o más de largo para obturar el agujero dejado
por la sonda. No permitir que estos productos entren en contacto con papel o superficies
absorbentes (porcelana) del agua o grasa. Los productos congelados hasta el punto de
resistir la presión de la sonda deben ser ablandados manteniéndoles por 24 h a 10°C.

5.3.2.3 Productos a granel congelados. Para muestrear estos productos utilizar brocas,
saca bocados y otros instrumentos cortantes estériles. Los productos congelados deben
mantenerse en su estado congelado hasta su llegada al laboratorio (ver 6.7). Se debe
evitar descongelar y congelar
nuevamente la muestra.
a) La toma de muestras de piezas o bloques de alimentos de gran tamaño se puede
realizar de la siguiente manera: sobre el alimento asegurar, con la copa hacia arriba, un
embudo plástico estéril con el vástago recortado por donde se introduce la broca estéril de
un taladro. Las virutas del alimento son conducidas a la superficie y se acumulan en la
copa del embudo. Transferir estas virutas a un frasco estéril para muestras.
Inmediatamente identificar la muestra y acondicionarla para su envío al laboratorio.
5.3.2.4 Toma de muestras de superficies vivas. Utilizando un hisopo humedecido, frotar la

superficie de la palma de una mano, la superficie interna de los dedos y de las uñas (ver
5.3.2.7 literal b.1). También se puede realizar mediante la técnica del lavado: colocar la
mano dentro de una funda plástica, verter 50 cm3 de diluyente y frotar con el líquido las
palmas, entre los dedos y uñas.
5.3.2.5 Toma de muestras de superficies inertes.

a) Botellas, envases, recipientes, utensilios pueden muestrearse mediante lavado, y si es
posible, con hisopo (ver 5.3.2.7 literal b.1). Prestar especial atención a la porción de los
utensilios que se introduce en la boca, por ejemplo, borde superior interno y externo de
copas y vasos, porción cóncava de cucharas, etc. De los platos, la parte que entra en
contacto con los alimentos.
b) La toma de muestras de superficies lisas puede realizarse con hisopo (ver 5.3.2.7 literal
b.1) o con cilindros de agar. El cilindro de agar es un medio de agar estéril solidificado
dentro de un tubo plástico estéril. Asépticamente, cortar uno de los extremos del cilindro,
presionar la superficie de agar descubierta contra la superficie en estudio, con un
escalpelo estéril cortar una rodaja y colocarla en una placa Petri, con la superficie
sembrada hacia arriba. Identificar la muestra.
c) Las superficies lisas también se pueden muestrear utilizando un portaobjeto (ver 5.3.2.7
literal b.3).
5.3.2.6 Toma de muestras destinadas al análisis de bacterias anaerobias. Evitar que las
muestras que contienen bacterias anaerobias entren en contacto con el aire, por ejemplo,
de los tejidos profundos no tomar muestras pequeñas. Si esto no es posible y si se utilizan
hisopos, humedecer el hisopo en el medio de transporte de Stuart (medio reducido), ver
NTE INEN 1529-1 y una vez tomada la muestra, colocar el hisopo en un tubo que
contenga este medio.
5.3.2.7 Otros
a) Quesos grandes. En el caso de quesos grandes tomar de las diferentes partes
suficientes submuestras, hasta completar una muestra de por lo menos 100 g. De los
maduros, retirar la envoltura externa y dejar intacta la interna (costra, cera, películas

plásticas o de tela en los quesos sin corteza). Dependiendo de la forma, la masa, el tipo y
el grado de madurez del queso, utilizar una de las siguientes técnicas:
a.1) Toma de muestras por medio de cortes. Si el queso tiene una base circular, con un
cuchillo con hoja puntiaguda, hacer dos cortes radiales a partir del centro del queso, y si
tiene un base rectangular, hacer dos cortes paralelos con los lados. El tamaño de la pieza
obtenida debe ser de tal manera, que una vez eliminada la capa superior incomible, la
porción comestible restante no sea inferior a 100 g.
a.2) Toma de muestras por medio de una sonda.
a.2.1) En una de las superficies planas, por lo menos a 10 cm del borde, insertar
oblicuamente hacia el centro una sonda estéril de 15 a 20 mm de diámetro, una o varias
veces.
a.2.2) Insertar la sonda perpendicularmente por una de las superficies del queso hasta
llegar, pasando por el centro, al lado opuesto.
a.2.3) Por la superficie vertical del queso, a igual distancia entre las dos superficies planas,
insertar la sonda horizontalmente hasta el centro del queso.
a.2.4) De los quesos contenidos en barriles, cajas u otros recipientes de dimensiones
grandes, o de los quesos que forman cubos grandes compactos, la muestra puede
tomarse insertando la sonda oblicuamente, desde arriba hacia abajo, por el contenido del
recipiente.
a.2.5) En el caso de quesos duros de grandes dimensiones, si el queso tiene envoltura
interna, frotar con etanol al 70% (V/V) el sitio de muestreo e insertar una sonda estéril de
15 a 20 mm de diámetro. Girar la sonda una vuelta completa y retirar el pedazo. Si no se
necesita una muestra de la superficie, guardar la parte exterior (mínimo 2 cm) que contiene
la envoltura interna para obturar el agujero(s) hecho en el queso y el resto del pedazo(s)
con un escalpelo o un cuchillo estériles transferir asépticamente al frasco de muestra.
Repetir este procedimiento hasta obtener una muestra no menor de 100 g.
Con los tapones, obturar los agujeros con cuidado, y si es posible, cubrir con un
compuesto sellante adecuado, ver NTE INEN 1529-1.
b) Toma de muestras de canales vacunas y ovinas. Muestrear las canales con una de las
siguientes técnicas:
b.1) Hisopos o torundas. Con guantes estériles colocar la plantilla (ver 4.2.2) sobre la
superficie que se va a muestrear. Tomar asépticamente un hisopo, abrir un tubo que
contenga el diluyente adecuado, humedecer el hisopo y con movimietos rotatorios
presionarlo contra las paredes del tubo para retirar el exceso de diluyente. Friccionar
fuertemente el área de la superficie que se va a examinar, haciendo frotes paralelos con
una ligera rotación del hisopo. Friccionar nuevamente la superficie haciendo trazos
paralelos perpendiculares a los anteriores, repetir tres veces este proceso humedeciendo
cada vez el hisopo. Cuidar que se frote toda el área elegida. Regresar el hisopo al tubo y
con una tijera estéril o cualquier otro implemento cortar o quebrar el palillo y dejar caer la
cabeza dentro del tubo, tapar el tubo con la tapa de rosca y colocarlo en un envase a
prueba de agua, acondicionar el envase con hielo picado o cualquier otro refrigerante
disponible. Si el bastón no es de madera, agitar el hisopo en el tubo 10 veces hacia arriba

y abajo. Identificar la muestra. Para realizar recuentos, utilizar la cantidad necesaria del
diluyente para obtener una dilución inicial de 10-1.
b.2) Toma de muestras por disección. Con un escalpelo y pinza estériles tomar lonchas
superficiales muy delgadas de aproximadamente 2 mm de espesor de la herida del
sacrificio, región pectoral, costado, regiones sacra, anal, renal y cuello. De las canales de
cerdo, tomar a partir del cuello y del área situada detrás de las orejas. Colocar las lonchas
en el frasco para muestras. Tomar una muestra no menor de 100 g
b.3) Toma de muestras con portaobjetos. Este método se utiliza especialmente para
recuentos directos. Presionar un portaobjeto estéril contra la muestra del alimento,
identificar y dejar que se seque. Enviar al laboratorio donde se fija, tiñe y se observa al
microscopio. Para determinaciones cualitativas rápidas de la microflora dominante
proceder de la siguiente manera: después de presionado el porta contra la superficie de la
carne aplicar el porta a la superficie de agar de una placa y retirarlo con una pinza estéril y
luego incubar la placa.
6. ENVÍO DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO.

6.1 Enviar las muestras al laboratorio lo más rápido posible y en condiciones que reduzcan
al mínimo la posibilidad de cambio de su calidad microbiológica y evitar que durante el
transporte las muestras sean expuestas a la luz solar directa.
6.2 Manipular y empacar las muestras de modo que una manipulación posterior no pueda
cambiar su identidad ni sugerir ninguna duda a cerca de su identidad.
6.3 Siempre que sea posible, se deben enviar las muestras al laboratorio en su envase
original, sin abrir. Todas las muestras envasadas, para su envío deben empacarse con
materiales que puedan absorber los golpes para evitar que sufran daños durante el
transporte.
6.4 Los productos de vida comercial prolongada, no necesitan de precauciones especiales
excepto, por ejemplo: evitar temperaturas por encima de 45°C para los productos
enlatados (latas en su estado normal) y ambientes húmedos para los productos en polvo.
6.5 Las latas hinchadas se deben refrigerar y enviarlas acondicionadas con mucho papel y
material amortiguador y material refrigerante.
6.6 Los productos perecederos no congelados se enfrían hasta 0 a 5°C, sea en un
refrigerador o más rápidamente en un baño de hielo (en fundas plásticas) y se los envía en
recipientes isotérmicos, cubiertos con una bandeja que contenga suficientes fundas
plásticas con hielo picado o una mezcla de polialcoholes congelados, para mantener la
temperatura de 0 a 5°C hasta su llegada al laboratorio. No utilizar hielo suelto ya que si el
envase se revienta o tiene fugas puede contaminar el producto. Si se utiliza hielo seco,
acondicionar la muestra de manera que no entre en contacto con el hielo para evitar su
congelamiento.
6.7 Productos congelados, las muestras de estos productos se deben recoger en
recipientes preenfriados y colocarlos inmediatamente en un congelador, o en hielo seco.
Enviar al laboratorio en un recipiente isotérmico, o en caja de cartón, con nieve carbónica
(dióxido de carbono sólido). Evitar que las muestras congeladas, tomadas en fundas
plásticas, entren en contacto directo con el hielo seco porque el plástico se torna friable y
puede romperse. Utilizar papel u otro material adecuado para proteger la muestra. Como

control que la muestra no se ha descongelado durante el transporte, colocar dentro del

paquete un recipiente con trocitos de hielo que deben estar intactos a la llegada del
paquete con las muestras.
6.8 Indicar claramente sobre el paquete si la muestra es peresible o no, la temperatura a
que debe mantenerse, refrigerada en hielo seco, si es frágil, etc.
6.9 Enviar las muestras juntamente con el informe de la toma (ver 5.1.4).
7. RECEPCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO.

7.1 Chequeo de las condiciones de las muestras. Al recibir las muestras se debe
observar los siguientes aspectos:
7.1.1 Etiquetado e informe. Chequear si cada muestra está debidamente sellada,
etiquetada y acompañada de una copia del respectivo informe de la toma de muestras (ver
5.1.2 y 5.1.4).
7.1.2 Estado de los envases. Chequear cuidadosamente si el envase tiene defectos, tales
como: fisuras, perforaciones, fugas, deformaciones; fracturas y tapas flojas en los de
plástico; perforaciones en fundas plásticas.
7.1.3 Control de la temperatura. Anotar la temperatura de las muestras perecederas no
congeladas. Las muestras congeladas deben llegar al laboratorio en su estado congelado,
controlar si no ha habido descongelamiento (ver 6.7). Las muestras frescas perecederas
deben tener una temperatura entre 0 a 5°C. Anotar cualquier discrepancia en la hoja de
registro.
7.1.4 Apego al programa de muestreo. Verificar que el número de las muestras de
población está conforme con el programa de muestreo utilizado.
7.2 Almacenamiento de las muestras. Las muestras deben almacenarse protegidas de
cualquier contaminación, de la luz solar directa o de otras fuentes de calor y a las
temperaturas que se indican:
7.2.1 Productos congelados, a -20°C, máximo hasta siete días.
7.2.2 Productos perecederos no congelados, entre 0°C y 5°C, por no más de 24 horas.
7.2.3 Productos estables: enlatados, productos deshidratados, etc., a temperatura
ambiente en lugares secos y frescos, hasta siete días.
7.2.4 Productos misceláneos: enjuagues, hisopos, aguas de efluentes, entre 0°C y 4°C,
hasta 12 h.
8. PREPARACIÓN DE LA UNIDAD DE MUESTRA PARA EL ANÁLISIS

8.1 Generalidades. Implica la preparación en el laboratorio de una submuestra de modo
que sea tan representativa como sea posible de la muestra de población de la cual
procede.
8.1.1 Si es posible, realizar los ensayos de las muestras luego después de la recepción en
el laboratorio. Las muestras deben manipularse asépticamente y de preferencia sin
interrupciones, si éstas son inevitables, deben ser lo más cortas posible y el producto se
debe mantener en refrigeración durante este período.
8.1.2 Antes de manipular la muestra limpiar el área de trabajo y sus proximidades, e
inmediatamente desinfectar el área con etanol al 70% o con cualquier otro desinfectante.

8.1.3 En muchos casos la unidad de muestreo, sin preparación adicional alguna, puede
utilizarse como unidad de muestra. Si se necesita mezclar dos o más unidades de
muestreo para formar la unidad de muestra, transferir las unidades de muestreo a un
recipiente estéril suficientemente grande y mezclar bien.
8.1.4 Antes de abrir cualquier envase, sean éstos rígidos o semirígidos, limpiar
externamente el envase con jabón o detergente y agua, secarlos con papel toalla y, en las
proximidades de la tapa o en el área donde se va a abrir el envase flamear (con o sin
etanol al 70% v/v evitando sobrecalentamientos) o aplicar una mezcla desinfectante que se
le deja secar sin aplicar calor; sin embargo, cuando el envase o el material del embalaje es
muy delgado y no resiste el proceso de limpieza omitir este paso y desinfectar con mucho
cuidado. Cuando el envase puede removerse sin riesgo alguno de contaminar el producto,
entonces, la limpieza y desinfección del envase no son necesarias. Todas las
manipulaciones, durante y después de la abertura deben realizarse en condiciones tan
asépticas como posible y de preferencia sin interrupciones; utilizar una cámara de flujo
laminar vertical, si es posible. Durante cualquier interrupción se debe mantener el producto
bajo refrigeración. El intervalo entre la agitación de la muestra y la remoción de la unidad
analítica no debe ser mayor de tres minutos, y se debe tener cuidado para eliminar,
incluso, cualquier espuma de la unidad analítica.
8.1.5 Abrir los envases de lata por la tapa no codificada, cuidando de no dañar el doble
cierre.
8.1.6 Al tomar muestras de latas abombadas deben observarse las siguientes
precauciones a fin de disminuir la salida violenta del contenido:
8.1.6.1 Abrir las latas abombadas en sitios especiales y NUNCA deben abrirse en áreas
destinadas a pruebas de esterilidad.
8.1.6.2 Antes de abrir, refrigerar la lata lavada y seca.
8.1.6.3 Colocar la lata en una bandeja poco profunda que contenga una mezcla
desinfectante, ver NTE INEN 1529.1. Si se sospecha la presencia de Clostridium
botulinum, la bandeja debe contener una solución saturada de carbonato de sodio.
8.1.6.4 Desinfectar la lata frotando una mezcla desinfectante y dejando secarse, pero,
NUNCA aplicando calor.
8.1.6.5 Para tapar la lata, utilizar un embudo de vidrio que tenga el vástago largo y
firmemente taponado con algodón hidrófilo, a través del cual pasa un varilla de acero con
su extremidad inferior afilada (todo el aparato debe estar envuelto, y esterilizado). Cubrir la
lata con el embudo y sobre la tapa de ésta hacer descansar el extremo afilado de la varilla,
y luego, cuidadosamente, golpear la varilla.
8.1.6.6 Abrir la lata después que la presión ha descendido, y según proceda, continuar con
uno de los procedimientos indicados a continuación:
8.2 Procedimiento
8.2.1 Líquidos
8.2.1.1 Si el espacio de cabeza es lo suficientemente grande, se debe mezclar el producto
agitando el envase 25 veces en 10 segundos haciendo un arco de 300 mm. Se puede
utilizar un homogeneizador estandarizado para asegurar una distribución uniforme de los
microorganismos.

8.2.1.2 Si el espacio de cabeza es pequeño, mezclar el producto invirtiendo el envase 25

veces y luego:
a) retirar una porción de líquido hasta que haya suficiente espacio de cabeza y entonces
mezclar mediante agitación (ver 8.2.1.1); o
b) transferir la muestra completa, o un parte de ella, a un envase estéril de tamaño
adecuado y agitando mezclar bien (ver 8.2.1.1). En el caso de muestras líquidas con gas,
incorporar unas perlas de vidrio estériles y agitar.
8.2.2 Polvos. Seguir los procedimientos indicados en 8.2.1.1 y 8.2.1.2 utilizando una
espátula estéril.
8.2.3 Productos congelados. Si las muestras están congeladas, utilizar una de los
siguientes procedimientos:
8.2.3.1 Descongelarlas parcialmente en su recipiente original cerrado (o en el que llegó al
laboratorio), por no más de 24 h en un refrigerador entre 2°C y 5°C. Cuando se necesitan
más de 24 h para descongelar las muestras, se pueden colocar en un baño de agua a una
temperatura menor de 37°C y se les mantiene solo hasta que se fundan (máximo hasta 15
minutos, pero, la temperatura debe permanecer baja para evitar lesionar a los
microorganismos) o, a temperatura ambiente por no más de 1 hora.
8.2.3.2 Si la muestra congelada puede picarse fácilmente, el descongelamiento no es
necesario.
8.2.3.3 Con productos fácilmente descongelables (productos obtenidos con taladro, por
ejemplo: jujos congelados, huevos congelados, etc.), se les descongela en un baño de
agua o a temperatura ambiente, según se indica en 8.2.3.1.
8.2.3.4 Los helados se funden según se indica en el numeral 8.2.3.1 (si se encuentran en
su envase original primero se los transfiere a un frasco estéril con tapa). Mezclar bien la
muestra fundida.
8.2.4 Mantequilla, margarinas y mantecas.
8.2.4.1 Colocar la muestra de mantequilla en el refrigerador (4°C ± 1°C), hasta que se
torne dura y se pueda cortar.
8.2.4.2 Con utensilios estériles, dividir la muestra de mantequilla, margarina o manteca en
tres partes y del centro de cada una de estas superficies (no contaminadas) que quedan
expuestas, pesar la unidad analítica en un frasco y añadir el diluyente (ver 4.3.11) a 32°C,
en un volumen necesario para completar, juntamente con la fase acuosa, dos veces la
unidad analítica, por ejemplo: las mantequillas y margarinas que tengan una humedad de
16%, pesar 25 g de muestra y añadir 46 cm3 de diluyente; si se pesan 50 g, añadir 92
cm3.
8.2.4.3 En el caso de las mantecas añadir un volumen igual a dos veces la muestra: 25 g
de muestra y 50 cm3 diluyente.
8.2.4.4 Colocar el frasco en un baño de agua a no más de 45°C y, evitando un
calentamiento excesivo, agitar hasta que la muestra y el diluyente se mezclen
completamente.
8.2.4.5 Conservar el frasco en el baño de agua hasta que la materia grasa se separe de la
fase líquida. Utilizar esta fase líquida para las determinaciones microbiológicas: 2 cm3 de

este líquido corresponden a 1 g de muestra y 0,2 cm3 a 0,1 g. Continuar el ensayo según
lo indicado en 9.2.1.2
8.2.5 Mayonesa. Preparar la muestra según lo indicado en 8.2.4
8.2.6 Carnes y otros productos. Cuando por su naturaleza, el producto en análisis puede
causar dificultades si se homogeneiza directamente, entonces, antes de manipular,
aséptica mente proceder según 8.2.6.1 y/o 8.2.6.2
8.2.6.1 Picado. Colocar el material en una superficie estéril, cortar en cubos de 1 cm3 y
continuar según lo indicado en 8.2.6.2.
8.2.6.2 Trituración. Colocar el material (picado o no) en un frasco estéril, adicionar el
exudado que hubiere, mezclar, homogeneizar dos veces y continuar según lo indicado en
9.2.2.
8.2.7 Canales de aves y productos misceláneos. Anotar el peso de la muestra, colocar la
canal en una funda plástica estéril y lavar con 300 cm3 de agua peptonada al 0,1%
friccionando la superficie de la muestra durante 30 segundos. Aplicar este procedimiento a
frutas secas, cereales, legumbres y ensaladas, lavando con una cantidad de diluyente 10
veces el peso de la muestra. Si es necesario, continuar como se indica en 9.2.1.3
8.2.8 Hisopos o torundas. Al tubo que contiene el hisopo juntamente con el diluyente (ver
5.3.2.7 literal b.1) y 5.3.2.4), agitarlo vigorosamente, haciendo 50 ciclos completos de 15
cm en 10 segundos golpeando contra la palma de la otra mano, para desprender los
microorganismos de la superficie del hisopo. La dispersión obtenida se puede diluir
decimalmente. Si es necesario, continuar como se indica en 9.2.1.3.
8.2.9 Productos formados por capas. Si el alimento está formado por capas o extractos,
examinar una porción de 10 g del paquete completo o, separadamente, preparar una
suspensión inicial de cada una de estas partes, dependiendo del propósito del ensayo.
Preparar como se indica en 9.2.2.
9. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN INICIAL O DILUCIÓN PRIMARIA Y

OTRAS DILUCIONES
9.1 Generalidades.
9.1.1 El tamaño de la unidad muestra generalmente es 10 g ó 10 cm3 o un múltiplo de 10
y, debe ser tal, que permita realizar todos los ensayos requeridos.
9.1.2 Para la detección de Salmonella, en general, preparar la suspensión inicial con una
unidad de muestra de 25 g (cm3) y 225 cm3 del diluyente indicado en la NTE INEN 1529-
15. Si la unidad de muestra prescrita difiere de 25 g, utilizar la cantidad necesaria de
diluyente para obtener una dilución de aproximadamente 1/10 (masa/volumen). Ver nota 5.
NOTA 5 Con el objeto de reducir la sobrecarga de trabajo en el laboratorio, y cuando hay

evidencias de que la mixtura de dos o más unidades de muestra no afecta el resultado
para aquel alimento particular, existe la alternativa de preparar unidades de muestra
compuesta. El tamaño máximo de una unidad de muestra compuesta es de 375 g (15
unidades de muestra de 25 g). Por ejemplo, si es necesario analizar 10 unidades de
muestra de 25 g, se mezclan las 10 unidades para formar una unidad de muestra
compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 litros del diluyente, ver NTE INEN 1529-15.
Alternativamente, se puede preparar una muestra compuesta transfiriendo alícuotas de 0,1

cm3 de cada uno de los 10 cultivos de pre-enriquecimiento a un frasco que contenga 100
cm3 de caldo RV, o alícuotas de 10 cm3 a un frasco que contenga 1 litro de caldo selenito
cistina o caldo tetrationato.
9.1.3 Mezclar la unidad de muestra o porción de ensayo con un volumen de diluyente igual
a nueve veces el peso de la unidad analítica. Si se obtiene una suspensión inicial
demasiad o viscosa o espesa adicionar más diluyente. Esto se debe tener en cuenta para
las operaciones subsiguientes y/o expresión de resultados.
9.1.4 Para evitar lesionar a los microoganismos por cambios súbitos de la temperatura, la
temperatura de los diluyentes debe ser aproximadamente la misma de la muestra, a
menos que haya otra indicación.
9.1.5 La preparación de la suspensión inicial de algunos tipos de productos necesitan de

cuidados especiales, tales como:
9.1.5.1 Calentar a temperaturas inferiores a 45°C por no más de 15 minutos productos
como el cacao en polvo, gelatina, productos en polvo, mantecas, mantequillas. Para los
quesos utilizar el diluyente a 44°C ± 1°C.
9.1.5.2 Neutralizar los alimentos ácidos con una solución estéril de fosfato tripotásico al
8%, antes de preparar la suspensión inicial.
9.1.5.3 Reconstituir los productos deshidratados y revitalizar a los microorganismos
lesionados por los procesos de elaboración y almacenamiento de los productos
alimenticios.
9.1.5.4 Para productos grasosos o pulverulentos que forman grumos adicionar al diluyente
un agente humectante tal como el "Tergitol Aniónico 7" (1% m/v).
9.1.5.5 Cuando se va a realizar recuento de esporos, a la suspensión inicial,
inmediatamente después de preparada, someterla a un tratamiento térmico (por ejemplo,
80°C por 10 minutos) seguido de un enfriamiento rápido en un baño de agua helada.
9.2 Suspensión inicial o dilución primaria (10-1)

9.2.1 Líquidos: Productos líquidos no viscosos (agua, leche, jugos, enjuagues, etc.) en los
cuales los microorganismos se distribuyen homogéneamente o que fácilmente se los
puede homogeneizar por medios mecánicos; fase líquida de mezclas heterogéneas que se
considera que es lo suficientemente representativa de la muestra en conjunto (fase líquida
de las grasa vegetales o animales) y productos líquidos viscosos.
9.2.1.1 Líquidos no viscosos, con una pipeta estéril transferir 10 cm3 a un frasco y añadir
90 cm3 de diluyente. Mezclar cuidadosamente esta solución agitando el frasco 25 veces
en 10 segundos haciendo un arco de 300 mm, o aspirando 10 veces con una pipeta estéril,
o utilizando un homogeneizador tipo "vortex" por 5 a 10 segundos. Seleccionar la velocidad
de tal manera para que el líquido, en torbellino, suba hasta 2 o 3 cm del borde del vaso. Si
se requieren otras diluciones, continuar según lo indicado en 9.3.
9.2.1.2 De las mantequillas y mantecas, de la fase líquida (ver 8.2.4.5) tomar 2 cm3 y
añadir 8 cm3 de diluyente, se obtiene la dilución 10-1. Para otras diluciones, continuar
según lo indicado en 9.3.
9.2.1.3 Enjuagues, la solución de enjuague obtenida en los numerales 8.2.7 y 8.2.8
constituye la dilución primaria, siempre que, para el enjuague se utilice el volumen

adecuado de diluyente (ver 5.3.2.7 literal b.1). Para otras diluciones, continuar como se
indica en 9.3.
9.2.1.4 De los líquidos viscosos y helados fundidos (ver 8.2.3.4) pesar 10 g de muestra en
90 cm3 de diluyente y mezclar bien mediante agitación (para pesar, se puede utilizar una
cuchara o una pipeta, dependiendo de la consistencia de la muestra). Para otras diluciones
continuar según lo indicado en 9.3.
9.2.2 Productos sólidos. (Ver notas 6)

9.2.2.1 Pesar con una precisión de 0,1 g en un frasco (si se utiliza homogeneizador
rotatorio), o en una funda plástica (si se utiliza "stomacher") 10 g (o un múltiplo de 10 g) de
la muestra de población o de la submuestra preparada. Añadir 90 cm3 de diluyente (o
múltiplo de 90) a la temperatura adecuada (dilución 10-1).
9.2.2.2 Hacer funcionar el homogeneizador a baja velocidad y en pocos segundos pasar a
la velocidad entre 15 000 a 20 000 rpm. Cuidar escrupulosamente que el tiempo de
homogeneización a alta velocidad no exceda los dos minutos. Para productos blandos o
que forman mucha espuma es suficiente un minuto.
9.2.2.3 Hacer funcionar el "stomacher" 1 ó 2 minutos, según la naturaleza del producto (ver
nota 6.2).
9.2.2.4 Si es necesario, dejar en reposo hasta 15 minutos para que las partículas grandes
se sedimenten. Para preparar otras diluciones utilizar la capa superficial y si hay una capa
de grasa, tomar de la parte acuosa.
9.3 Otras diluciones. (Ver nota 7)

9.3.1 Si la dilución primaria se homogeneizó con pipeta, utilizar la misma pipeta para
transferir 1 cm3 de la suspensión inicial (dilución 10-1) a otro tubo que contenga 9 cm3 de
diluyente estéril a la temperatura adecuada, evitar que la pipeta entre en contacto con el
diluyente y con otra pipeta estéril mezclar cuidadosamente. De esta manera se obtiene la
dilución 10-2.
9.3.2 Si es necesario, repetir lo indicado en el numeral 9.3.1 para la dilución 10-3 y
siguientes diluciones, hasta obtener el número necesario de diluciones y alcanzar el
número adecuado de microorganismos por cm3. Cada dilución sucesiva disminuirá 10
veces la concentración.
9.4 Duración del procedimiento. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de

la suspensión inicial y la mezcla de las diluciones con el medio de cultivo (descrito en el
método específico de ensayo) no debe ser mayor que 45 minutos. El tiempo transcurrido
entre la preparación de la suspensión inicial y el inicio de la preparación de las siguientes
diluciones no debe exceder los 30 minutos.
9.5 Revitalización
9.5.1 Los microorganismos presentes en los alimentos pueden estar lesionados o
debilitados debido a los tratamientos que se utilizan en el procesado de alimentos. Entre
los tratamientos que lesionan a los microorganismos tenemos el calor, frío, desecación,
liofilización, congelación, baja actividad de agua e irradiación. Los tratamientos químicos

adversos como carencia de nutrientes, pH bajo, preservantes y exposición a

desinfectantes.
NOTAS 6:
6.1 Con algunos productos no es aconsejable utilizar el "stomacher" (por ejemplo, los que
tienen elementos puntiagudos o cortantes, o aquellos que no se disgregan fácilmente),
pudiéndose utilizar siempre que haya evidencia (datos publicados o ensayos
comparativos) que los resultados obtenidos no difieren significativamente de los obtenidos
con un homogeneizador rotatorio.
6.2 Prestar atención al hecho que para determinados productos, en especial cereales, los
tiempos de 1 y 2 minutos no son adecuados para microorganismos tales como los mohos y
levaduras. En este caso el "stomacher" permite una mejor recuperación que el
homogeneizador rotatorio. Hacer funcionar el "stomacher por 10 minutos evitando
separaciones, ya que se pueden perder algunos mohos y levaduras del líquido
sobrenadante.
NOTA 7 Para las pruebas de presencia o ausencia de microorganismos en 0,1 cm3 ó 0,1 g
de producto, no se necesita preparar las siguientes diluciones.
9.5.2 El número de microorganismos que son detectados en los diferentes medios

depende de la severidad y duración de las condiciones adversas, tipo de microorganismos
presentes y la composición del medio utilizado, especialmente si es selectivo.
9.5.3 Cuando es necesario, los procedimientos de revitalización están incluidos en las
secciones pertinentes de las NTE INEN 1529.

4. NMX-F-103-1982.
ALIMENTOS. FRUTAS Y DERIVADOS. DETERMINACIÓN DE GRADOS BRIX.

FOODS. FRUITS AND DERIVATIVES. DETERMINATION OF DEGREES BRIX.
NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Esta Norma Mexicana establece el método refractométrico para la determinación de los

grados Brix en productos derivados de las frutas y líquidos azucarados.
2. DEFINICIÓN
Para los efectos de esta Norma, se establece la siguiente definición:
Grados Brix: Es el por ciento de sólidos disueltos en un producto derivado de las frutas o
de un líquido azucarado.
3. FUNDAMENTO
Este método se basa en el cambio de dirección que sufren los rayos luminosos en el límite
de separación de dos medios en los cuales es distinta la velocidad de propagación.
4. REACTIVOS Y MATERIALES
· Alcohol
· Éter de petróleo
· Bromonaftaleno
· Papel
5. APARATOS Y EQUIPO
5.1 Aparatos
Refractómetro Abbé
RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS
6. PROCEDIMIENTO
Colocar el refractómetro en una posición tal que difunda la luz natural o cualquier otra
forma de luz artificial, que pueda utilizarse para iluminación. Hacer circular agua a 293 K

(20ºC) a través de los prismas. Limpiar cuidadosamente con alcohol y éter de petróleo el
refractómetro antes de hacer la lectura.
Para cargar el refractómetro abrir el doble prisma girando el tornillo correspondiente y

poner unas gotas de muestra sobre el prisma, cerrar y ajustar finamente.
Verificar la exactitud del refractómetro con agua a 293 K (20ºC) a esta temperatura, el
índice de refracción del agua es de 1.3330, o bien utilizar la placa de cuarzo que viene con
el equipo, usando bromonaftaleno, al leer hacer las correcciones necesarias.
Mover el brazo giratorio del aparato hacia delante y hacia atrás hasta que el campo visual
se divida en dos partes, una luminosa y otra oscura. La línea divisoria entre esas dos
partes, se le conoce como "línea margen". Ajustar la línea margen y leer directamente el
por ciento de sólidos en la escala Brix.
Nota: Esta método también incluye tanto a los refractómetros manuales (o portátiles), en
los cuales únicamente se coloca la muestra y se observa a contraluz para tomar la lectura
directamente; como a los refractómetros digitales en los cuales el mismo procedimiento
anteriormente descrito en esta norma, se simplifica siguiendo las indicaciones específicas
que para cada aparato proporciona el fabricante.
7. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Los resultados deben expresarse en grados Brix, previa corrección por temperatura.

5. OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA Saccharomyces cerevisiae

6. PROCESO DE FERMENTACIÓN Y DESTILACIÓN EN EL LABORATORIO

7. PROCESO DE FERMENTACIÓN Y DESTILACIÓN EN LA FÁBRICA Y EN EL

LABORATORIO

8. TABLA DE DATOS: EVALUACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN CON

LAS LEVADURAS COMERCIALES Y SILVESTRE AL INICIO Y AL FINAL DE LA
FERMENTACIÓN.
Inicio de la Fermentación Fin de la Fermentación

°Brix pH °Brix Ph
Silvestre 6,8 3,5 4,4 3,0
6,8 3,5 4,4 3,0
6,8 3,5 4,3 3,0
6,8 3,5 4,4 3,0
6,8 3,5 4,3 3,0
PROMEDIO 6,8 3,5 4,4 3,0
DESVIACION ESTANDAR 0 0 0,1 0
Danstil EDV 493 6,8 3,5 4,2 3,0

6,8 3,5 4,2 3,0
6,8 3,5 4,1 3,0
6,8 3,5 4,1 3,0
6,8 3,5 4,2 3,0
PROMEDIO 6,8 3,5 4,2 3,0
DESVIACION ESTANDAR 0 0 0,1 0
ZWLDTY48 6,8 3,5 4,0 3,0

6,8 3,5 4,0 3,0
6,8 3,5 4,0 3,0
6,8 3,5 4,0 3,0
6,8 3,5 4,0 3,0
PROMEDIO 6,8 3,5 4,0 3,0
DESVIACION ESTANDAR 0 0 0 0

9. TABLAS DE DATOS: RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DESTILACIÓN A NIVEL DEL LABORATORIO DE LAS

DIFERENTES LEVADURAS
REPLICADO Volumen Volumen CABEZA CUERPO COLA PERDIDA Rendimiento

inicial (mL) final (mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (%)
S C. DEL
1 500 448 1 43 5 2,5 8,6
CHAWARMISHQUE
2 500 448 1 45 4 2 9
3 500 448,5 1 44 4,5 2,5 8,8
4 500 448 1 44 4 2 8,8
5 500 448,2 1 44 5 2 8,8
PROMEDIO 448,1 44,0 4,5 2,2 8,8
DESVIACION ESTANDAR 0,2 0,7 0,5 0,3 0,1
S.c. DANSTIL EDV 493 1 500 441 1 50 5 3 10

2 500 440 1 52 5 2 10,4
3 500 439,5 1 53 5,1 1 10,6
4 500 441 1 51 5 2 10,2
5 500 440 1 52 5,5 3 10,4
PROMEDIO 440,3 1,0 51,6 5,1 2,2 10,3
DESVIACION ESTANDAR 0,7 0,0 1,1 0,2 0,8 0,2
S.c. ZWLDTY48 1 500 436 1 56 4,5 2 11,2

2 500 437 1 56 4 3 11,2
3 500 435 1 57 5 2 11,4
4 500 436 1 55 5 2,1 11
5 500 437 1 56 5 2 11,2
PROMEDIO 436,2 56,0 4,7 2,2 11,2
DESVIACION ESTANDAR 0,8 0,7 0,4 0,4 0,1


8. ILUSTRACIONES
1. Recolección de muestras
2. Diluciones de la muestra

3. Colonias de Saccharomyces cerevisiae en Agar YPD
4. Levaduras teñidas con Azul de metileno visto con lente de 40x

5. Prueba de Azucares reductores (Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Manosa)
6. Prueba de Hidrógeno sulfurado en Agar Bismuto Sulfito
7. Prueba de Floculación en Caldo YPD

8. Levadura DANSTIL 493 EDV
9. Levadura ZWLDTY48
10. Fermentación en el Laboratorio

11. Fermentación en la Fábrica
12. Fermentación en la Fábrica
13. Destilación


Bioquímica y Farmacia

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Bioquímica y Farmacia

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

"OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN EN LA FABRICACIÓN

Tesis previa a la obtención del

JUAN ISRAEL GUILLERMO QUINDE

ANDREA FERNANDA MACÍAS MATAMOROS

DRA. SILVANA PATRICIA DONOSO MOSCOSO

DRA. PAULINA DEL ROCIO ESCOBAR HINOJOSA

DRA. SILVIA JOHANA ORTIZ ULLOA

Juan Israel Guillermo Quinde

Se identificó y aisló la levadura Saccharomyces cerevisiae presente en el

A nivel de laboratorio, se observó una diferencia significativa entre los volúmenes de

Palabras claves: Saccharomyces cerevisiae, jugo de agave, tequila, fermentación,

Juan Israel Guillermo Quinde

At laboratory level, a significant differences between the distillation corp’s volume

Key words: Saccharomyces cerevisiae, agave juice, tequila, fermentation,

Juan Israel Guillermo Quinde

1.1. GENERALIDADES DE LA AGAVÁCEA AMERICANA………………………….16

1.1.3. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA…………………………………………………......17

1.1.4. USOS DEL AGAVE………………………………………………...……………..19

1.2.1. EXTRACCIÓN DEL CHAGUARMISHQUI………………………...……………22

1.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA………………………………………………….22

1.3.1. FERMENTACIÓN A ESCALA INDUSTRIAL…………………………………...25

Juan Israel Guillermo Quinde

1.4.2. PROCESO DE ELABORACIÓN DEL TEQUILA……………………………….27

1.4.2.1. Jima del agave……………………………………………………………….….27

1.4.2.2. Cocimiento de la piña………………………………………………….……….28

1.4.2.3. Extracción de la miel…………………………………………………...……….28

1.5.1. Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………….33

1.5.1.1 Composición química………………………………………...………………….34

1.5.1.2. Requerimientos Nutricionales para la levadura Saccharomyces

1.5.1.3. Inhibidores de crecimiento…………………………………………………….38

1.5.1.4. Requerimientos físico-químicos………………………………………………38

1.5.1.5. Tolerancia al etanol…………………………………………………………….39

2.1.1. DISEÑO Y TIPO DE INVESTIGACIÓN…………………………………………40

2.1.2. ZONA DE ESTUDIO…………………………………………………………..…40

2.1.3. TEMPERATURA Y EXTENSIÓN………………………………………..………41

2.2. MUESTREO Y TAMAÑO DE LA MUESTRA……………………………..………41

Juan Israel Guillermo Quinde

2.2.1 TIPO DE MUESTREO…………………………………………………………..…41

2.2.2. MUESTREO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL

2.2.3. MUESTREO PARA LOS ENSAYOS DE FERMENTACIÓN Y

2.3. CRITERIOS DE INCLUSIÓN y EXCLUSIÓN.……………………………………42

2.4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA……………………………………...……42

2.4.1. EXAMEN FÍSICO………………………………………………………………….43

2.4.1.1. Características organolépticas………………………………………………...43

2.4.1.2. Concentración °Brix……………………………………………………………..43

2.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL CHAGUARMISHQUI Y FERMENTO

2.6. CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae DEL

2.6.1. TINCIÓN DE AZUL DE METILENO Y SUERO FISIOLÓGICO………………47

2.6.2. PRUEBAS FERMENTATIVAS…………………………………………………..47

2.6.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS……………………………………………………….47

2.7. AISLAMIENTO DE Saccharomyces cerevisiae………….………………………48

2.8.1. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae DEL

Juan Israel Guillermo Quinde

2.8.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae DANSTIL

2.8.3. PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA Saccharomyces cerevisiae

2.9. PROCESO DE FERMENTACIÓN EN EL LABORATORIO……………...……..49

2.10. DESTILACIÓN EN EL LABORATORIO…………………………………………49

2.11. PROCESO DE FERMENTACIÓN y DESTILACIÓN EN LA

2.12. CÁLCULO DEL RENDIMIENTO ALCOHÓLICO……………………………….51

2.13.1. EQUIPOS Y MATERIALES……………………………………………………..52

2.13.2.1. Azul de metileno………………………………………………………………53