“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

Universidad Nacional Agraria

La Molina

Facultad de Pesquería
Departamento de acuicultura e industrias
pesqueras
.
Curso:
Genética aplicada a la acuicultura

Práctica N°4:
EXTRACCIÓN DE ADN EN PECES

Profesor:
M.Sc.; Blgo. César Abram Cruz Castellón

Alumna:
Macedo Jamanca Paola (20120406)

Realización de la práctica:
29/05/18

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TABLA DE CONTENIDO
I.INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 2
II.REVISIÓN BIBLIOGRAFICA ................................................................................................. 3
III.MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................. 4
IV.RESULTADOS ................................................................................................................... 6
V.DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 7
VI.CONCLUSIONES ............................................................................................................... 8
VII. CUESTIONARIO ............................................................................................................. 8
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................... 10

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 I. INTRODUCCIÓN

La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con alto grado de pureza y
poderlas utilizar en investigación científica, en medicina o para la ciencia forense.

La mayor parte de los métodos que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero la
lisis o ruptura de la célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los
constituyentes de la célula.

A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en cuenta varios
factores:

 La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.

 El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.
 La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.
 El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado.
 Uso que se le va a dar al ADN extraído.

Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de muchos

sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales, tejidos vivos, cultivos
celulares, líquido amniótico, entre otros.

El lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad
de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que este debe bastar para
lograr la lisis de las células, pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede
ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse
con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se
puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros
componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra
la separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas de ADN de
alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas relativamente puras,
siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración
de sales, que son los factores que aseguran una buena separación. Las desventajas de este
método son el uso de disolventes orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden
quedar como trazas en la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como
el PCR, que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de
varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra (Fernández et al,
en línea).

De esta manera se realizará la extracción de ADN de manera casera a partir de muestra de

hígado de pez y pollo, para hacer un reconocimiento microscópico de la estructura fibrilar del
ADN.

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 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Importancia de la calidad y cantidad de ADN

Disponer de una fuente de ADN de calidad y cantidad suficiente resulta un aspecto clave en los
estudios de genética de la conservación. Especialmente en especies amenazadas para las
cuales la información proporcionada por los análisis genómicos resulta de un valor insustituible
(AGOSTINHO et al., 2005; SNOW y PARKER 1998; AVISE 1996). No obstante, este tipo de
estudios requieren de un volumen de muestras que proporcione suficiente representatividad
estadística, por lo que resulta obvia la necesidad de obtenerlas de forma incruenta e incluso no
invasiva, causando la menor perturbación a las poblaciones estudiadas.

2.2. Obtención de ADN en peces

La obtención de ADN en peces se complica ligeramente respecto a otros grupos de

vertebrados, requiriendo en todo caso de su captura, para la toma de la muestra. Pero en
especies ícticas de talla muy reducida como el Espinoso (Gasterosteus aculeatus) la
complicación es aún mayor debido a su tamaño, que hace inviables otras técnicas de
obtención de ADN procedente de: músculo (HILSDORF et al. 1999 citado por Gamboa, 2011),
sangre (CUMMINGS y THORGAARD 1994; ESTOUP et al. 1996; MARTINEZ et al. 1998 citado por
Gamboa, 2011), frotis corporal o bucal (LIVIA at al. 2006) o larvas (LOPERA-BARRERO et al.,
2008 citado por Gamboa, 2011) entre otros.

Numerosos trabajos confirman la viabilidad del empleo de fragmentos de aleta como muestras
para la extracción de ADN (NAM et al., 2003; WASKO et al., 2003, LOPERA-BARRERO et al.,
2006, SHIOZAWA et al. 1992; WHITMORE et al. 1992; ZHANG et al. 1994; ESTOUP et al. 1996;
NIELSEN et al. 1999; ADCOCK et al. 2000 citado por Gamboa, 2011). No obstante,
prácticamente la totalidad de los autores han empleado muestras de 200-300 mg. (1-2 cm2);
mientras que en ejemplares de especies de talla muy pequeña como el Gasterosteus aculeatus
no es posible disponer de una muestra de más de ~5 – 30 mg (~4 – 25 mm2) sin ocasionar una
ablación severa con notable repercusión sobre la movilidad y por tanto indirectamente sobre
la supervivencia del ejemplar.

A esta escasez de muestra debe sumarse la dificultad añadida para este tipo de tejido en
función de su consistencia, lo que podría conducir a la obtención de una cantidad de ADN
insuficiente y de baja calidad de no emplear un protocolo de muestreo y extracción,
optimizado. Razón por la que se considera de importancia la adaptación de los protocolos de
extracción, así como la cuantificación del ADN obtenido para evaluar la viabilidad del
procedimiento, como se indica seguidamente (Gamboa, 2011).

2.3. Acción de detergente

Las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos con proteínas
transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de
las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se
descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la membrana
junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la

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membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace
que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos (Martínez, 215.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

•Se utilizó los siguientes materiales : Bandeja plástica, 4 Laminas porta y cubre
objetos,estuche de disección, microscopio óptico compuesto,balanza digital de
sensibilidad de ± 0,1g , pizeta, probeta 25mL ,bicker 50 mL y 100mL,mortero con pilón
,2 sobres de gasa ,embudo de plástico, 2 placas Petri, 20g de detergente
común,bagueta y guantes quirúrgcos.
,. •Se utilizó los siguientes Reactivos:20 mL de alcohol etilico de 96%, Cloruro de sodio 2M ,
solución salina fisiológica , safranina.
•Muestra: 10g de hígado de pollo y hígado de pescado(Sarda chiliensis chiliensis)

•Se procedió a pesar 10g de hígado de pollo y 10g de hígado pescado con la ayuda de
una balanza digital.
.

• Luego se procedió a triturar los hígados por separado en un mortero.

• Al tener una consistencia pastosa se le agrego 15mL de solución salina fisiológica a
. cada muestra.

•Preparación de 50 ml de solución de cloruro de sódico 2M:

•Se pesó 5,84 g de cloruro sódico en una balanza digital.
•Se disolvió en un bicker de 100ml con 50 ml de agua destilada.

•Se filtro la muestra triturada en un embudo plástico con 3 capas de gasa.

•La muestra filtrada se deposito en un bicker.Lo mismo se realizo tanto para la muestra
de hígado de pescado como para el hígado de pollo.

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•Se añadio al filtrado 15mL de cloruro sódico 2M a cada muestra.

•Se peso 10g de detergente utilizando la balanza digital y un bicker de plástico.

•Se añadio 10g de detergente a cada muestra que contenia los 15mL de cloruro sódico.
•Se procedio a agitar con una bagueta un tiempo de 10 minutos.

•Pasados los 10 minutos se pasó a vertir la solución de alcohol etilico al 96%, se hecho
con mucho cuidado hasta observar la formación de tres capas.

•Con una bagueta se procedió a retitar suavemente las fibras blanquecinas , agitamos
en una solo dirección.

•Se colocó una muestra de las fibras blanquecinas en 2 láminas porta objetos, lo
mismo se realizo tanto para la muestra de hígado de pescado como para el hígado de
pollo.
•Se agrego 2 gotas de safranina a cada lámina porta objetos y se dejo actuar por 2
minutos.Se retiro el excedente con agua destilada.

•Se seco cada lámina porta objetos con una vela.

•Se fotografió solo 1 lámina portaobjetos de cada muestra tanto para el hígado de
pescado como para el hígado de pollo, a un objetivo de 4X y ocular de 10x .

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 IV. RESULTADOS

Figura 1: Vista de la única lámina portaobjeto observable de la muestra de hígado de pollo a un

objetivo de 4X y ocular de 10x. Se aprecia la molécula de ADN como una estructura fibrilar en
la zona que indica la flecha.

Figura 2: Vista de la única lámina portaobjeto observable de la muestra de hígado de pescado

a un objetivo de 4X y ocular de 10x. Se aprecia la molécula de ADN como una estructura fibrilar
en la zona que indica la flecha.

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 V. DISCUSIÓN

Se extrajo moléculas de ADN a partir de hígado de pollo e hígado de pescado, se utilizó un

método casero por el bajo costo, sin embargo, como indica Fernández (En línea) al ser un
método económico, este también involucra directamente al rendimiento que se obtendrá. Por
ende, este método usado es para adiestrarnos en la extracción de ADN, puesto que realiza los
mismos pasos que un método más costoso, los cuales presentan otros reactivos. Como por
ejemplo nosotros usamos detergente, pero los protocolos indican que sería más eficiente la
extracción de ADN utilizando SDS (dodecilsulfato sódico) (Malajovich, en línea) este no es un
detergente usual.

En la figura 1 se observa la molécula de ADN de pollo y en la figura 2 la molécula de ADN de

pescado. Comparando ambas figuras, se observa con mayor claridad la molécula de ADN de
pollo, esto puede deberse a que este método como indica Fernández (en línea) se puede usar
para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas
relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la fase
acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran una buena separación.
Entonces se podría inferir que el peso de la molécula de ADN de pollo sea mayor y por ende se
aprecio mejor con el microscopio. También es muy importante tener un control del pH durante
el proceso de extracción, lo cual no se tuvo en la práctica.

También hay diferencias en los resultados de acuerdo al detergente utilizado (Malajovich, en

línea) comparo la eficiencia de dos agentes detergentes en la extracción de ADN de arvejas
secas: el detergente de lozas Limp y el detergente de ropa Ariel líquido. Como este último
contiene enzimas (proteasas, lipasas y celulasas) omitió el agregado de proteasas en el
procedimiento correspondiente. En las imágenes se observa que con el uso de detergente de
ropa ariel liquido hay mayor cantidad y se observa con mejor claridad las fibras blanquecinas
en el proceso de extracción. En la práctica en la muestra de pescado al colocar el detergente,
este poseía unas esferas rojas, las cuales no estaban en el detergente colocado en la muestra
de pollo. Estas esferas rojas pueden haber sido abrasivas, siendo una de las posibles causas de
que no se aprecie con claridad en el microscopio la fibra de ADN.

Martínez, 2015 indica que se tiene que realizar un baño caliente y un baño frío. Baño caliente:
se utiliza para liberar el ADN de sus barreras protectoras. La incubación se utiliza para acelerar
el proceso de rotura de las membranas y para ayudar a disolver la bicapa de fosfolípidos
mediante la desnaturalización de las proteínas de membrana y rotura de los enlaces que
mantienen los fosfolípidos unidos. El calor “ablanda” la membrana.
Baño frio: El agua fría ayuda a mantener el ADN intacto durante el proceso de extracción. El
enfriamiento de la solución ayuda a prevenir la desnaturalización que podría destruir el DNA si
se expusiera al calor de manera prolongada (protege el DNA de enzimas que pueden destruirlo
como las DNAasas ya que la refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas). Sin embargo
Malajovich, en línea al encontrar en los protocolos que la mezcla de “sopa” + sal+ detergente
sea colocada en baño María a 55-60ºC, de modo de inactivar las enzimas presentes y favorecer
la liberación del ADN. En otros protocolos, la temperatura del baño es de 70ºC. En todos ellos,
una vez transcurridos 15 minutos exactos, la mezcla debe ser transferida a un baño de hielo,

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para evitar la degradación del ADN. Malajovich presenta fotografías de sus resultados e indica
que el tratamiento con calor resulta superfluo. Comparando con la práctica este paso de baño
caliente y baño frío no fue realizado y al observar las muestras al microscopio si se pudo
observar las fibras de la molécula de ADN.

VI. CONCLUSIONES

 Nos adiestramos y aprendimos la técnica de extracción de ADN casero.

 Se extrajo ADN de 2 muestras biológicas.
 Se reconoció la estructura fibrilar del ADN, tanto para el hígado de pollo y de pescado.

VII. CUESTIONARIO

7.1. ¿Qué otras muestras biológicas podrían utilizarse para extraer el ADN?

Lopera et al 2008 indica que en peces, la utilización de aletas (Nam et al., 2003; Wasko et al.,
2003, Lopera-Barrero et al., 2006), sangre (Cummings y Thorgaard, 1994), escamas (Adcock et
al, 2000; Sire et al, 2000; Yue y Orban, 2001; Wasko et al, 2003), células bucales (Livia et al,
2006), óvulos (Aranishi, 2006) y músculo (Weber et al, 2003; Chakraborty et al, 2006) requiere
de varios protocolos, donde la utilización de Chelex 100 (Sigma, EUA), silica, micro-wave,
nitrógeno líquido, fenol-cloroformo y sal común han sido bastante utilizados.

7.2. ¿Cuál es el modelo estructural del ADN?

En enero de 1953, sin conocimiento de Franklin, Wilkins le mostró a Watson la famosa foto 51
de la forma B del ADN, en la que se evidenciaba que la estructura del ADN obedecía a una
doble hélice; algo que Watson y Crick no habían establecido hasta entonces, y que usarían
como uno de los elementos clave para desarrollar su modelo de la molécula del ADN. Watson
comprendió, enseguida,que el diagrama, con una cruz negra dominando la foto, correspondía
a una estructura helicoidal.La prueba de que era una hélice fue tan evidente para él como lo
había sido antes para Franklin.

También proporcionaba otros parámetros esenciales, como el diámetro de la molécula y el

ángulo de inclinación de las bases; además, permitía realizar ciertos cálculos para determinar
el número de cadenas por molécula.

Watson y Crick empezaron a relacionar toda la información disponible sobre el ADN como
nadie lo había hecho hasta entonces. Además de los datos de Franklin, usaron las reglas de
Chargaff, que había mostrado que la proporción relativa entre parejas de bases púricas y
pirimídicas de la molécula de ADN (A-T y G-C) era 1:1. Después de varias charlas sobre este
asunto con el matemático John Griffith, que realizó unos cálculos de las interacciones puestas
en juego, Crick comprendió que las fuerza de atracción se producían entre bases
complementarias y no entre bases semejantes (Gribbin, 1986). En definitiva, Watson y Crick
elaboraron su modelo con gran creatividad a partir de ideas propias, como el apareamiento de
las bases nitrogenadas12, de suma importancia biológica, y con datos del ADN aportados por
otros investigadores.

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En la primavera de 1953, Watson y Crick construyeron el modelo que resolvería la estructura
del ADN (figura 3). Esta consistía en dos cadenas antiparalelas; el esqueleto azúcar-fosfato
dispuesto hacia el exterior, mientras que las bases nitrogenadas estaban proyectadas hacia el
interior; y, por último, las dos cadenas unidas por puentes de hidrógeno entre bases
nitrogenadas complementarias enfrentadas (A-T y G-C) Acevedo et al 2016.

Figura 3. Watson y Crick con su modelo de la estructura del ADN.

Fuente: Acevedo et al, 2016

7.3. ¿El ADN que se extrae siguiendo el procedimiento planteado es puro? ¿Por qué?

Martínez, 2015indica que el procedimiento no permite una purificación completa del DNA, es
más, lo que observamos no es únicamente DNA sino una mezcla de ácidos nucleicos (RNA y
DNA).

Por una parte, sé ha obtenido DNA ya que es lo que dicen los protocolos que he consultado y
los resultados se corresponden con estas, pero por otro lado sigue quedando la duda de si
realmente los hilitos blancos que observo son ácidos nucleicos.

Supongo que necesitaría realizar otro protocolo que me permitiera teñir específicamente
ácidos nucleicos y estaría bien si dispusiera del material necesario para manipularlo y realizar
más experimentos con él.

7.4. ¿Qué otros colorantes podrían ser usados para visualizar el ADN?

Con el hígado de ternera se depositó algunos de filamentos sobre un porta objetos y se añadió
unas gotas de azul de metileno, se dejó que se tiñan durante unos cinco minutos. A
continuación, se lavó la preparación con agua destilada, cuidando de no arrastrar las fibras de
ADN, secaron la preparación y observaron al microscopio. Las fibras de ADN presentan una
coloración azul Kiresa, en línea.

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VIII. REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS

 Acevedo-díaz, José Antonio; García-carmona, Antonio.(2016) Rosalind Franklin y la

Estructura Molecular del ADN: Un caso de historia de la ciencia para aprender sobre la
naturaleza de la ciencia - Rosalind Franklin and the Molecular Structure of DNA: A case
history of science to learn about the nature of science. Revista científica, [S.l.], v. 2, n.
25, p. 162-175. ISSN 2344-8350. Disponible en:
<http://revistas.udistrital.edu.co/ojs/index.php/revcie/article/view/10845>. Fecha de
acceso: 11 jun. 2018 doi:https://doi.org/10.14483/udistrital.jour.RC.2016.25.a2.
 Kiresa (En línea).Extracción de ADN y observación al microscopio. Consultado el 10 de
julio del 2018.Disponible en: https://inakiresa.wordpress.com/2011/12/06/extraccion-
de-adn-y-observacion-al-microscopio/
 Lopera-Barrero, Nelson M, Povh, Jayme A, Ribeiro, Ricardo P, Gomes, Patricia C,
Jacometo, Carolina B, & Silva Lopes, Tais da. (2008). Comparación de protocolos de
extracción de ADN con muestras de aleta y larva de peces: extracción modificada con
cloruro de sodio. Ciencia e investigación agraria, 35(1), 77-86.
https://dx.doi.org/10.4067/S0718-16202008000100008
 Fernández M., Manzilla K., Vargas N. (En línea). Separación, caracterización y grado de
pureza obtenido en el ácido desoxirribonucleico-ADN. Laboratorio de Bioquímica
avanzada. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Tunja.
 Gamboa J. (2011). Resultados sobre la viabilidad de micro-muestras de aleta para
extracción de ADN. Consultado el 10 de julio del 2018.Disponible en:
http://biotecno.org/espinosos/2011/04/29/resultados-sobre-la-viabilidad-de-micro-
muestras-de-aleta-para-extraccion-de-adn/
 Malajovich M. (En línea). Guías de actividades Biotecnología. Brasil. Consultado el 10
de julio del 2018.Disponible en:
https://bteduc.com/guias_es/69_Extraccion_de_ADN_(procedimiento_basico).pdf
 Mártinez L. (2015). Extracción de ADN: Experimento con reactivos de la vida cotidiana.
Consultado el 10 de julio del 2018.Disponible en:
http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez%2
0Mart%C3%ADn2015_4_19P21_19.pdf

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