Disciplina de Mét. Purif. e Anál.

Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Métodos de Purificação
de Proteínas Recombinantes

Prof. Marcos Túlio de Oliveira

mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
 Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Agradecimentos à Flávia
(Depto. Tecnologia) por alguns slides

Prof. Marcos Túlio de Oliveira

mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
 Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
Isolamento
• Extração 1. Material de Partida ------
Separação
Extrato Bruto
2. Desintegração celular

Fracionamento

Diálise
•Solubilidade
Ultra filtração
•Tamanho
•Carga Coluna
Cromatografica
•Afinidade Ligação
Cromatografia em coluna
 Gel-Filtração
• A separação é feita de acordo com o tamanho molecular
Cromatografia de
troca iônica
Cromatografia de
Afinidade

 Pequenas proteínas
são ligadas aos
suportes e a mistura
complexa de
proteínas é aplicada

 Proteínas ligadas
podem ser eluídas
com moléculas
pequenas ou
reagentes
 0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN

C+ Ind S FT W1

Blue-Sepharose

Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4

1 2 3 4
S FT W1 W2

Fosfocelulose
 Como analisar o resultado da
purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?

Absorbância
280nm

SDS-PAGE
 Como analisar o resultado da
purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?
Western Blot
 Coloração com Prata Western Blot

Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646

©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Cromatografia de Afinidade
Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot

Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

 Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

ou

6 códons para His (CAT ou CAC)

Inclusão dos códons de His
 Expressão
Heteróloga de
Proteínas
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática – Vetor de
Expressão para Células Humanas
 Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pET SUMO
Sítio de
Operador
lac clonagem
Promotor forte
IPTG induzido

Repressor
lac Proteína
fusionada à
sequência de
SUMOilação
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pEX-C-GST

Proteína
fusionada à
Glutationa S-
Transferase

Purificação usando
cromatografia de
afinidade
(glutationa-agarose)
Tags de Fusão de Proteína Comuns
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pEX-C-GST

Sítio para a
TEV protease

Eliminação da
cauda de GST após
purificação...
Eliminação da
cauda
(nem sempre
necessário)
 Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:

1 - Abundância

2 - Especificidade pela Coluna

Cromatográfica
 Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante

Quilos de ovos de D. Coluna de DNA- Expressão em Sf9

melanogaster celulose
Extrato Celular
Extrato Celular Coluna de Octil-
sefarose Coluna de
Centrifugação Fosfocelulose
diferencial Coluna de Blue-
agarose Precipitação com
Coluna de (NH4)2SO4
Fosfocelulose Sedimentação em
Gradiente de Glicerol Coluna de Ni-NTA
Precipitação com
(NH4)2SO4 Sedimentação em
Gradiente de Glicerol
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster

Nativa vs
Recombinante
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Fonte?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Fonte? Extração de humanos?

Voluntários? Ética?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos
Que tecido? Por quê?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Que tipo de extração?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Onde parkin se encontra nas
células?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Onde parkin se encontra nas
células? Qual sua função?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Componente do proteassomo –
degradação de proteínas
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Centrifugação diferencial?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

Gel filtração? Separação por
tamanho?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
Cromatografia de troca iônica?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
Cromatografia de afinidade?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys
Troca iônica? Uma ou duas colunas?
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys
Duas colunas aniônicas: forte e fraca
 Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

E isso tudo será que é suficiente?

 Exercícios
Situação hipotética: Considerando que a purificação da Parkin
nativa tem se mostrado extremamente trabalhosa, monte uma
estratégia para expressar e purificar uma versão recombinante da
Parkin humana.

Para casa...
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