Persyaratan penting untuk pengujian enzim dijelaskan dan sering terjadi kesalahan dan perangkap serta

penghindarannya dibahas. Faktor utama, yang harus dipertimbangkan untuk menguji enzim, adalah
suhu, pH, kekuatan ionik dan konsentrasi yang tepat dari komponen penting seperti substrat dan enzim.
Standarisasi parameter ini akan diinginkan, tetapi keragaman fitur dari enzim yang berbeda mencegah
penyatuan assay
kondisi. Namun demikian, banyak enzim, terutama yang berasal dari sumber mamalia, memiliki pH
optimum dekat pH fisiologis 7,5, dan suhu tubuh sekitar 37 1C dapat berfungsi sebagai suhu pengujian,
meskipun karena alasan eksperimen sering 25 1C lebih disukai. Tetapi dalam banyak kasus fitur khusus
dari enzim individu menentukan kondisi pengujian khusus, yang dapat menyimpang jauh dari kondisi
yang direkomendasikan. Selain itu, nilai yang tepat untuk konsentrasi komponen pengujian seperti
substrat dan enzim tidak dapat diberikan, kecuali aturan umum tergantung pada tingkat relatif saturasi
dapat dinyatakan. Aturan untuk melakukan pengujian enzim, penanganan yang tepat, aspek metodis,
persiapan campuran uji dan kosong, pilihan waktu uji, dibahas dan saran untuk menghindari kesalahan
sering dan sepele diberikan. Hal-hal khusus dari pengujian enzim yang lebih kompleks, termasuk reaksi
reversibel dan tes gabungan dipertimbangkan. Akhirnya perlakuan data eksperimen untuk
memperkirakan aktivitas enzim dijelaskan. Prosedur untuk menentukan kecepatan enzim awal dan
transformasinya ke dalam unit enzim tertentu serta saran untuk dokumentasi hasil disajikan.

Enzim adalah zat sensitif yang hadir dalam jumlah kecil dan aktivitasnya di sel sering dapat dideteksi
hanya pada kondisi optimumnya. Berbagai reaksi enzim memerlukan kondisi khusus, misalnya jika
keseimbangan termodinamika tidak baik. Enzim lain, terutama dari organisme extremophilic hanya aktif
dalam kondisi yang benar-benar berbeda dari rentang fisiologis.

Untuk pengujian enzim, harus dipertimbangkan bahwa reaksi enzim tergantung pada lebih banyak faktor
daripada pH, suhu dan kekuatan ion. [2] Yang terpenting adalah konsentrasi sebenarnya dari semua
komponen pengujian. Pengaruh lebih lanjut dari senyawa yang tidak terlibat langsung dalam reaksi dapat
terjadi, mis. interaksi ion, terutama ion logam, zat hidrofobik atau deterjen dengan permukaan protein

Kesulitan untuk menentukan standar umum untuk tes enzim dengan contoh ketergantungan pH. (A)
Kurva pH skematik dengan aktivitas tertinggi (Vmax) pada optimum. Panah kiri dan kanan dari
pertunjukan optimal bahwa aktivitas enzim dapat ditentukan juga pada pH di luar optimum, namun,
tetapi nilai-nilai yang lebih kecil kemudian harus diterima (rasio yang dipilih secara acak dari Vmax harus
melambangkan tingkat penurunan). (B) Enzim berbeda dalam optima pH mereka dan tidak setiap enzim
memiliki aktivitas pH yang optimal hanya pada pH fisiologis (kurva hitam). Tetapi menerima aktivitas
yang menurun, sejumlah enzim yang lebih besar dapat diukur pada satu pH standar (kurva biru dan
kuning), sedangkan untuk enzim lain terjadi pengurangan yang cukup besar (kurva pink), mereka akan
diuji secara istimewa pada pH optimumnya sendiri. Enzim yang rentang optima pHnya benar-benar di
luar rentang fisiologis (kurva merah) tampak tidak aktif di sana dan harus diuji pada pH optimumnya
sendiri.

Nilai pH dari maksimum kurva aktivitas-pH adalah pH optimum. Karena di sini enzim menunjukkan
aktivitas tertinggi (Vmax), biasanya dipilih sebagai pH standar untuk pengujian enzim ini. PH optimum
dari banyak enzim berada dalam rentang fisiologis (sekitar pH 7,5), tidak dalam pH akurat, tetapi sering
antara pH 7–8. Karena kurva optimum memiliki maksimum yang lebih luas, pH fisiologis dapat diambil
dalam kasus-kasus tersebut tanpa mengurangi aktivitas enzim

Optima pH beberapa enzim, bagaimanapun, jauh dari kisaran fisiologis biasa. Contoh yang menonjol
adalah pepsin, protease lambung, dengan pH optimum 2, optimum asam fosfatase pada pH 5,7, yaitu
alkalin fosfatase pada pH 10,5 (database Brenda). Enzim-enzim tersebut harus diuji pada optima mereka
sendiri. Kadang-kadang kondisi tertentu merekomendasikan pH uji yang berbeda dari pH optimum.
Aktivitas optimum alkohol dehidrogenase hanya pada pH fisiologis (7,5) dan di sana dapat dengan
mudah diuji dengan acetaldehyde dan NADH sebagai substrat. Namun, memanipulasi asetaldehida yang
beracun dan mudah menguap, dan memulai reaksi dengan NADH yang sangat menyerap; tidak nyaman.
Karena reversibilitas reaksi, enzim juga dapat diuji dengan etanol dan NAD (yang tidak menyerap dalam
kisaran ini) sebagai substrat, tetapi kesetimbangan sudah ada di sisi ini, merusak pembentukan
asetaldehida dan NADH. Reaksi, bagaimanapun, dapat dipaksa dalam arah yang berlawanan dengan
menerapkan pH basa 9,0, yang menyebabkan deprivasi ion H + (Bergmeyer, 1983).

Biasanya enzim ini cukup stabil pada pH optimumnya sendiri, dan karenanya ini disarankan tidak hanya
untuk pengujian, tetapi juga untuk penyimpanan. Ini juga penting untuk kinerja tes enzim, karena
penambahan alikuot dari larutan stok enzim ke campuran uji tidak akan mempengaruhi pH pengujian.
Kadang-kadang, bagaimanapun, solusi stok enzim memiliki pH yang berbeda, seperti tripsin, yang harus
disimpan pada pH asam kuat 3,0 meskipun pH basa optimumnya adalah 9,5, untuk menekan autolisis
(tidak seperti kebanyakan enzim lain, trypsin mentoleransi pH ekstrim ini) (Bisswanger, 2011). Dalam
kasus seperti itu harus diperhatikan bahwa aliquot yang ditambahkan tidak memodifikasi pH campuran
pengujian, suatu keadaan, yang harus dipertimbangkan untuk penambahan apapun, jika pHnya
menyimpang dari campuran assay.