SPEKTROMETER UV-VIS

TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengetahui prisip kerja Spektrometer UV-Vis serta cara
penggunaannya.
2. Mahasiswa dapat menentukan konsentrasi sampel dengan metode deret standar
dan metode addisi standar

DASAR TEORI
Violet: 400 - 420 nm
Indigo: 420 - 440 nm
Blue : 440 - 490 nm
Green : 490 - 570 nm
Yellow : 570 - 585 nm
Orange: 585 - 620 nm
Red: 620 - 780 nm

Gambar 1. Pita Warna Sinar UV-Vis

Penyerapan radiasi elektromagnetik mulai range ultraviolet hingga inframerah
adalah 180 - 1100 nm. Bagian dari spektrum elektromagnetikini disebut 'UV / Visible'
karena termasuk radiasi jelas terlihat mata manusia pada umumnya.
Mayoritas penelitian senyawa organik diukur dengan menggunakan
spektrometer UV-Vis. Kelompok Fungsional senyawa organik (keton, amina, turunan
nitrogen, dll), yang responsible terhadap absorbansi daerah UV / Vis disebut
chromophores. Serangkaian molekul memiliki Chromophores terisolasi yang sama
maka posisi dan intensitas dari pita absorbansinya tetap konstan, namun ketika
molekul chromophores memiliki beberapa chromophores terisolasi maka hasilnya
akan berbeda.
Tabel 1. Karakteristik Chromophores
Λmaks ɛmaks
Gugus Chromophores
(nm) (Lmol-1cm-1)
amina -NH2 195 3000
Oxima =NOH 190 5000
Nitro -NO2 210 3000
Nitrit -ONO 230 1500
Nitrat -ONO2 270 12
Nitroso -N=O 300 100
Range Serapan
Daerah spektrum secara konvensional dibagi menjadi tiga sub-domain
disebut UV (185-400 nm), Visible (400-700 nm) dan sangat dekat dengan inframerah
(700 -1100 nm). spektrofotometer komersial yang mencakup rentang spektral dari
185 untuk 900 nm. Batas bawah dari instrumen tergantung pada sifat optik
komponen yang digunakan dan kehadiran udara dan uap air di jalur optik,karena
(udara dan uap air) menyerap intens di bawah 190 nm.

Praktikum Spektrometer UV-Vis 1 Kartini Megasari

 Beberapa instrumen dapat beroperasi mencapai 150 nm dengan syarat
bahwa mereka beroperasi dalam ruang hampa. Batas panjang gelombang biasanya
ditentukan oleh respon dari detektor dalam spektrometer.
Asal-usul absorbansi dalam range ini adalah interaksi foton dari sumber
dengan ion atau molekul sampel. Ketika molekul menyerap foton dari daerah / UV
Vis, energi yang bersangkutan akan ditangkap oleh satu (atau beberapa) elektron
terluar.

Gambar 2 Kuantifikasi Energi Molekul

Hukum Lambert-Beer

Gambar 3. Mekanisme penyerapan Sinar

Konsentrasi dari suatu analit dalam larutan dapat ditentukan dengan
mengukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu dengan menerapkan Hukum
Lambert-Beer.
Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b),
konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi
(senyawa) pada suatu panjang gelombang
A=abc

Praktikum Spektrometer UV-Vis 2 Kartini Megasari

Jika konsentrasi (c) diekspresikan sebagai molaritas (mol/L) dan ketebalan sel (b)
dinyatakan dalam centimeter (cm), koefisien absorptivitas molekuler (a) disebut
koefisien ekstinsi molar (ε) dan memiliki satuan [L/(mol.cm)]
A=ɛbc
Untuk campuran, Hk. Lambert-Beer bersifat aditif.

Persamaan diatas berlaku dengan asumsi:

1. Radiasi sinar datang harus monokromatis.
2. Spesi penyerap (molekul, atom, ion, dll) independen satu sama lain.
3. Radiasi sinar datang merupakan berkas paralel yang tegak lurus dengan
permukaan media penyerap.
4. Radiasi sinar melintasi media penyerap dengan panjang yang sama.
5. Media penyerap homogen dan tidak menyebabkan penghamburan sinar.
6. Radiasi sinar datang mempunyai intensitas yang tidak terlalu besar yang
menyebabkan efek saturasi
Spektrometer UV-Vis menganalisis sampel dan menghasilkan spektrum
senyawa yang diwakili dengan nilai transmitansi (Atau absorbansi) sebagai fungsi
dari panjang gelombang sepanjang absis.
Transmitansi (T) adalah nilai attenuasi dari sinar monokromatik berdasarkan
perbandingan antara intensitas dari sinar yang diteruskan (I) dan sinar datang (Io)
pada saat sampel ditempatkan, dalam jalur optik antara sumber dan detektor. T
dinyatakan sebagai fraksi atau persentase.

atau

Dengan :
T : Transmitansi
I : Sinar yang diteruskan
Io : Sinar datang
A : Absorbansi
Faktor yang mempengaruhi Absorbansi
Pelarut
Setiap pelarut memiliki polaritas yang karakteristik . Karena diketahui bahwa
semua elektronik transisi dapat memodifikasi distribusi muatan senyawa dalam
larutan, maka posisi dan intensitas pita absorbansi akan sedikit bervariasi jika
digunakan pelarut yang berbeda Sifat / interaksi pelarut dan zat terlarut
mempengaruhi jenis transisi.

Praktikum Spektrometer UV-Vis 3 Kartini Megasari

 Gambar 4. Spectra dari benzofenon dalam sikloheksana (1)
dan benzofenon dalam etanol (2).
Gambar 4 menujukkan bahwa dengan dua pelarut yang berbeda
menyebabkan dua jenis transisi yang berbeda yaitu efek bathochromic dan efek
hypsochromic. pH pelarut memberikan efek besar pada spektrum karena
berpengaruh terhadap tampilan dan warna senyawa yang akan diukur.

Gambar 5 Pengaruh pH pada larutan fenolftalein

Gambar 5 disajikan dalam bentuk perspektif 3Dimensi yang menunjukkan bahwa
untuk pH asam tidak ada absorbansi di range yang terlihat spektrum. Sebaliknya,
absorbansi muncul saat pH menjadi basa dan panjang gelombang 500nm. larutan
fenolftalein ini tidak berwarna pada pH kurang dari 8, warna merah muda terang jika
pH lebih dari 9,5.

Instrumentasi Spektrometer UV-Vis

Praktikum Spektrometer UV-Vis 4 Kartini Megasari

Menurut konfigurasinya spektrofotometer UV-Vis dibagi menjadi 3:
Single Beam:

Gambar 6 Instrumentasi Spektrometer UV-Vis Single Beam

Double Beam

Gambar 6 Instrumentasi Spektrometer UV-Vis Double Beam

Spektrofotometer UV-Vis dirancang tiga modul dasar: sumber, sistem

dispersif (dikombinasikan dalam monochomator ), yang merupakan bagian optik dan
detection system.
Sumber Radiasi
Sumber radiasi yang digunakan bergantung pada radiasi yang dibutuhkan
untuk pengukuran. Sumber cahaya ini akan memberikan sinar yang memiliki energi
yang nilainya bergantung pada panjang gelombang yang dimilikinya
• Argon 100 – 160 nm
• Tungsten 350 – 800 nm
• Deuterium 160 – 360 nm
• Xenon 200 – 900 nm

Praktikum Spektrometer UV-Vis 5 Kartini Megasari

KUVET (wadah cuplikan)
Kuvet yang digunakan dalam analisa ini harus dipersiapkan dengan hati-hati
agar tidak mengganggu pengukuran cuplikan. Untuk itu, pemilihan bahan kuvet
dipilih yang transparent. Bahan yang biasanya digunakan adalah kwarsa atau
silicon.
Selain itu, kebersihan kuvet sebelum digunakan juga harus diperhatikan.
Untuk itu, kuvet harus direndam dalam alkohol. Pemindahan kuvet dan pengisian
cuplikan yang akan digunakan dalam kuvet pun harus hati-hati agar dinding kuvet
tidak tersentuh. Pengukuran akan terganggu jika dinding kuvet mengandung minyak
atau lemak

Monokromator
Sumber cahaya yang digunakan pada spektroskopi umumnya berupa cahaya
polikromatik. Untuk mengubahnya menjadi cahaya monokromatik untuk memilih
panjang gelombang yang sesuai maka digunakan monokromator Sebuah
monokromator terdiri dari celah masuk, gratting, lensa atau cermin, dan juga celah
keluar

Praktikum Spektrometer UV-Vis 6 Kartini Megasari

Detektor
Detektor merupakan alat yang digunakan untuk mengubah hasil pengukuran
menjadi sinyal-sinyal elektrik sehingga dapat dibaca/diketahui hasil pengukurannya.
Dalam analisa spektroskopi UV-Vis detektor yang digunakan biasanya adalah
phototube atau photomultiplier tube. Untuk spektroskopi UV-Vis single beam
biasanya lebih banyak digunakan detector pothotube.

Photovoltaic

Phototube

Bila suatu radiasi datang, elektron akan diemisikan dari permukaan katoda dan
ditarik menuju anoda sehingga timbullah arus listrik. Besarnya arus yang dihasilkan
sebanding dengan intensitas radiasi yang melewati detektor

Metode 1,10-fenantrolina.
Besi (II) bereaksi dengan 1,10 fenantrolina membentuk kompleks jingga-
merah [C12H8N2]3Fe3+. Intensitas warnanya tak bergantung pada keasaman dalam
jangka pH 2-9 dan stabil untuk waktu yang lama. Besi (III) dapat direduksi dengan
hidroksilamonium klorida atau dengan hidrokuinon. Perak, bismut, tembaga, nikel

Praktikum Spektrometer UV-Vis 7 Kartini Megasari

dan kobalt mengganggu dengan serius seperti juga perklorat, sianida, molibdat dan
tungstat, kompleks besi-fenantrolina (seperti perklorat) dapat diekstrak dengan
nitrobenzena dan diukur pada 515 nm terhadap blanko reagensia. Baik besi (II)
maupun besi (III) dapat ditetapkan secara spektrofotometri : kompleks besi (II)
jingga-kemerahan menyerap pada 515 nm, dan baik kompleks besi (II) maupun
kompleks besi (III) yang berwarna kuning mempunyai absorpsi identik pada 396 nm,
dengan absorbansi yang aditif. Larutan yang sedikit bersifat asam oleh asam sulfat,
diolah dengan 1,10-fenantrolina, dan dibufer dengan kalium hidrogenftalat pada 3,9 :
pembacaan pada 396 nm menghasilkan besi total sedangkan pada 515 nm besi (II).
Alat
Peralatan yang digunakan adalah :
1. Seperangkat spektrometer UV-Vis
2. Labu takar 50 mL
3. Labu takar 100 mL
4. Pipet ukur 5 mL
5. Pipet volume 10 mL
6. Beker gelas 100 mL
Reagensia.
Siapkan larutan-larutan berikut : 1,10-fenantrolina, larutan 0,25 persen
monohidrat dalam air, natrium asetat 0,2 M dan 2 M. Larutan hidroksilamonium
klorida 10 persen dalam air atau larutan hidrokuinon 1 persen dalam suatu bufer
asam asetat yang ber-pH sekitar 4,5 (campuran 65 cm3 asam asetat 0,1 M)
disiapkan jika diperlukan.
Cara kerja
Destruksi
1. Timbang sampel yang akan diteliti menggunanakan timbangan analitik, catat
beratnya.
2. Masukan kedalam beker teflon kemudian tambahkan 5 mL HNO3 pekat.
3. Lakukan pemanasan menggunakan kompor listrik dilemari asam hingga sampel
terlarut seluruhnya dan uap kuning hilang.
4. Lakukan penambahan HNO3 pekat hingga sampel terlarut. (jaga volume agar
tidak gosong).
Penyiapan Sampel
1. Ambil 2 mL sampel encerkan dalam labu takar hingga 50 mL.
2. Dipipet 2 mL larutan no 2 dimasukan ke labu takar 50 mL tambahkan natrium
asetat hingga pH menjadi 3,5 ± 1,0.

Praktikum Spektrometer UV-Vis 8 Kartini Megasari

3. Tambahkan 5 mL hidroksilamonium klorida 10% atau 4 mL hidrokuinon dan 4
cm3 larutan 1,10 fenantrolina. Tambahkan air suling sampai tanda, campur baik-
baik dan biarkan selama 1 jam agar reduksi besi menjadi lengkap.
Nb: untuk metode addisi standar penyiapan sampel hanya dilakukan point 1
saja!!!
Penyiapan Standar
Metode deret standar :
1. Hitung dan rencanakan pembuatan 5 deret standar dari larutan besi (II) dengan
konsentrasi 1 hingga 50 ppm.
2. Tambahkan natrium asetat pada masing-masing larutan hingga pH 3,5 ± 1,0.
3. Tambahkan 5 mL hidroksilamonium klorida 10% atau 4 mL hidrokuinon dan 4
cm3 larutan 1,10 fenantrolina. Tambahkan air suling sampai tanda, campur baik-
baik dan biarkan selama 1 jam agar reduksi besi menjadi lengkap.
Metode addisi standar :
1. Hitung dan rencanakan pembuatan 5 deret standar dari larutan besi (II) dengan
konsentrasi 1 hingga 50 ppm dalam labu takar 50 mL.
2. Tambahkan sampel sebanyak 2 mL pada masing-masing larutan.
3. Tambahkan natrium asetat pada masing-masing larutan hingga pH 3,5 ± 1,0.
4. Tambahkan 5 mL hidroksilamonium klorida 10% atau 4 mL hidrokuinon dan 4
cm3 larutan 1,10 fenantrolina. Tambahkan air suling sampai tanda, campur baik-
baik dan biarkan selama 1 jam agar reduksi besi menjadi lengkap.

Praktikum Spektrometer UV-Vis 9 Kartini Megasari

 UV-1240

PHOTOMETRIC
fungsi : untuk mengukur absorban atau % transmittan pada panjang gelombang
tertentu
Prosedur :
1) Tekan [1] PHOTOMETRIC pada keypad
2) Tekan [GO TO WL]  masukkan numeric panjang gelombang yang
diinginkan  [ENTER]
3) Tekan [F1] untuk mengubah mode pengukuran dari ABS ke %T dan
sebaliknya
4) Masukkan kuvet yang berisi larutan blangko ke dalam kompartemen sampel
5) Tekan [AUTOZERO] untuk mengenolkan sinyal
6) Ganti kuvet yang berisi larutan blangko dengan kuvet yang berisi sampel yang
akan dianalisa
7) Tekan [START] untuk membaca nilai absorban (ABS) atau transmittannya
(%T)
8) Ulangi langkah 6 – 7 untuk sampel berikutnya

SPECTRUM
fungsi : scanning sampel pada range panjang gelombang tertentu untuk mengukur
besarnya panjang gelombang dimana absorban ,% transmittan atau E maksimal dari
sampel
Prosedur :
1) Tekan [2] SPECTRUM pada keypad
2) Ganti parameter sesuai kebutuhan :
1. Meas Mode : untuk memilih mode pengukuran (ABS, %T, atau E)
Tekan [1]  [ENTER]
2.  Range : Tekan [2]  [ENTER]  atur range panjang gelombang
tertinggi  [ENTER]  atur panjang gelombang terendah
[ENTER]
3. Rec Range : untuk mengatur skala sumbu y (ABS, %T, atau E) yang
akan ditampilkan. Tekan [3]  [ENTER]  atur range terendah 
[ENTER]  atur range tertinggi  [ENTER]
4. Scan Speed : Tekan [4]  [ENTER]  [1] / [2] / [3] / [4] / [5] 
[ENTER]
5. No. Of Scan : untuk mengatur banyaknya pengukuran yang akan
dilakukan. Tekan [5]  [ENTER]  [1] / [2] / [3], dst  [ENTER]
6. Display Mode : untuk mengatur macam tampilan pada layar. Tekan [6]
 [ENTER]  Sequential / Overlay
3) Masukkan kuvet yang berisi larutan blangko ke dalam kompartemen sampel
4) Tekan [F1] untuk melakukan koreksi baseline  tunggu hingga selesai
5) Ganti kuvet dengan kuvet yang berisi larutan sampel  [START]
6) Untuk mencetak spektrum tekan [PRINT]
7) Untuk melihat puncak spektrum hasil analisa tekan [F2] PEAK
8) Untuk mengubah ke tabel lembah tekan [F3] VALLEY

Praktikum Spektrometer UV-Vis 10 Kartini Megasari

QUANTITATIVE
fungsi : digunakan untuk analisa kuantitatif sampel dengan cara :
a) membandingkan sampel terhadap satu konsentrasi standar (single point
calibration curve method)
b) membandingkan sampel dengan kurva standar yang dibuat dengan lebih dari
satu konsentrasi standar ( multi point calibration method)
c) membandingkan standar dengan suatu kurva yang telah diketahui nilai K dan
B-nya terlebih dahulu (K-Faktor Method)
Prosedur :
1) Tekan [3]  [ENTER]
2) Ubah parameter analisa :
1. MEAS : Tekan [1] [1] 1  / [2] 2  / [3] 3   masukkan numeric
panjang gelombang  [ENTER]
2. METHOD : Tekan [2]  pilih metode yang diinginkan
a. K-Faktor ( C = K*ABS + B )
Tekan [1]  isi nilai K  [ENTER]  isi nilai B 
[ENTER]  masukkan kuvet berisi larutan blangko 
[AUTOZERO]  lanjut ke prosedur 3)
b. Single Point (C = K*ABS, K diperoleh dari satu konsentrasi
standar)
Tekan [2]  isi konsentrasi standar  [ENTER]  bila nilai
absorbansi standar sudah diketahui tekan [1] (Key In) 
masukkan nilai absorbansi  [ENTER];
bila nilai absorbansi belum diketahui tekan [2] (Measure)
masukkan kuvet berisi larutan blangko  [AUTOZERO]
 masukkan kuvet berisi larutan standar  [START] 
lanjut ke prosedur 3)

c. Multi Point
Tekan [3]  isi jumlah konsentrasi standar yang akan
digunakan  [ENTER]  [1] (order)  [ENTER]  pilih
melewati nol (zero intercept) atau tidak  [START]  isi
konsentrasi standar yang digunakan  isi nilai absorban
dengan menekan [1] bila nilainya sudah diketahui atau [2]
bila belum diketahui  lanjut ke prosedur 3)

3. No of Meas : Tekan [3]  isi banyaknya pengulangan yang akan

dilakukan  [ENTER]
4. Unit : Tekan [4]  pilih unit pengukuran yang diinginkan dengan
menekan numeriknya  [ENTER]
5. Data Print : Tekan [5]  YES (bila hasil langsung diprint) / NO (bila
hasil tidak diprint)
Langkah 3) – 4) hanya untuk multipoint method, untuk K-faktor dan single point
langsung langsung ke 5)

3) masukkan kuvet berisi larutan blangko ke kompartemen sampel 

[AUTOZERO]

Praktikum Spektrometer UV-Vis 11 Kartini Megasari

 4) masukkan kuvet yang berisi larutan standar  [START]  masukkan semua
nilai konsentrasi standard ke dalam table  [START]  ulangi untuk standar-
standar berikutnya sampai selesai
Tekan [F1] (CalCurve) untuk menampilkan kurva kalibrasi
Tekan [F2] (StdChg) untuk mengubah data
Tekan [F3] (SmplMeas) untuk kembali ke tabel pengukuran
Tekan [F4] (StdPrint) untuk mengeprint data
5) masukkan kuvet yang berisi larutan sampel  [START]  ulangi untuk
sampel-sampel berikutnya
Tekan [F1] (SmplNo) untuk memasukkan no sampel
Tekan [F2] (DataFile) untuk menyimpan data ke dalam memori
Tekan [F3] (DataDisp) untuk memunculkan kembali data
Tekan [F4] (Equation) untuk memunculkan persamaan dari kurva kalibrasi

Memanggil Parameter Analisa

Pada menu utama tekan [F1] (PARAMS)  muncul daftar parameter yang tersimpan
 [F2] (Set) pilih no file  [ENTER]

Menghapus Parameter Analisa

Pada menu utama tekan [F1] (PARAMS)  muncul parameter list  [F4] (DELETE)
 pilih no file  [ENTER]

Menyimpan Parameter
1. Pada masing-masing Parameter Configuration Screen (PHOTOMETRIC,
SPECTRUM, QUANTITATIVE) Tekan [F4](SAVPARAM)  [F2] (SAVE)
 masukkan no file ke tempat penyimpanan  [ENTER]
2. Buat nama file penyimpanan dengan menggerakkan kursor [<] atau [>]
hingga abjad yang diinginkan  [ENTER]  setelah selesai tekan [F1]
(END)

Menyimpan dan Memanggil Data

1. Pada PHOTOMETRIC dan QUANTITATIVE tekan [F3] (SMPLMEAS) 
muncul Measurement Screen  [F2] (DATAFILE)
2. Untuk memanggil data tekan [F1] (LOAD)  pilih no file  [ENTER]
3. Untuk menyimpan data tekan [F2] (SAVE)  masukkan no file ke tempat
penyimpanan  [ENTER]  buat nama file  [ENTER]

Menyimpan Data Spectrum

Pada Spectrum Measurement Screen tekan [F4] (SaveCurv)  [F2]  [F2] (Save) 
tekan no file tempat penyimpanan  [ENTER]  beri nama file  [ENTER] [F1]
(END)

Memanggil Data Spektrum

Pada Spectrum Parameter Screen tekan [F4] (FileCurv)  [F1](LOAD)  tekan no
file  [ENTER]  untuk menampilkan kurva tersebut pada layar monitor tekan
[ENTER] sekali lagi

Perawatan :

Praktikum Spektrometer UV-Vis 12 Kartini Megasari

  Setiap 1 bulan sekali lakukan pengecekan baseline flatness dan Wavelength
Accuracy (prosedurnya ada pada buku instruction manual Uvmini-1240
halaman 1-6 s/d 1-10)

Praktikum Spektrometer UV-Vis 13 Kartini Megasari