Resumen.
La actividad porcícola es una de las más importantes en el Estado de Yucatán, por lo que
constantemente crea un alza en la demanda de la carne de cerdo, lo cual origina que se
establezcan más unidades de producción, desencadenando un crecimiento acelerado en la
población porcina, dando como resultado un problema de contaminación, provocado por la
descarga de aguas residuales.
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una
mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil
Los métodos cromatográficos acoplados a detectores UV han sido utilizados por la accesibilidad
de los equipos. Los fármacos, como es el caso de las sulfonamidas, tienen una estructura química
conformada, por anillos de carbono y dobles enlaces, que les permiten absorber la luz, lo que les
permite ser cuantificados por métodos espectrofotométricos.
Abstract.
Swine industry is one of the most important in the State of Yucatan, so it constantly creates an
increase in the demand for pork, which causes more production units to be established, triggering
an accelerated growth in the pig population, resulting in a pollution problem, caused by the
discharge of wastewater.
At present, the analysis of emerging pollutants in swine water has become important, due to the
environmental risk they represent. Among the emerging contaminants of interest are antibiotics
for veterinary use, which present persistence in the environment, affecting the soil and ground
water.
The ultraviolet-visible absorption detector coupled to HPLC is probably the most used in
environmental studies due to its wide versatility in the detection of most of the environmental
contaminants analyzed by liquid chromatography. Liquid chromatography (HPLC) is a technique
used to separate the components of a mixture. It consists of a non-polar stationary phase (column)
and a mobile phase. This technique is applied for semi-volatile substances.
The chromatographic methods coupled to UV detectors have been used for the accessibility of
the equipment. The drugs, as is the case of sulfonamides, have a chemical structure formed by
carbon rings and double bonds, which allow them to absorb light, which allows them to be
quantified by spectrophotometric methods.
The concentration of antibiotics present in the swine wastewater is a parameter that contributes
to the analysis of these emerging pollutants.
Establishing the conditions for the detection of these compounds, allows us to obtain reliable
results. In this work, we present the conditions for the detection of sulfamethoxazole, streptomycin,
oxytetracycline, enrofloxacin, neomycin, tylosin, penicillin, ractopamine and ivermectin, in High
Performance Liquid Chromatography (HPLC), to establish methods with appropriate resolution to
identify and quantify mixtures of antibiotics.
Dependiendo del objetivo de su producción, las granjas porcícolas se pueden dividir en:
Pie de cría: Los lechones nacidos en estas granjas se conservan durante la lactancia
hasta llegar a un peso aproximado de 20 Kg.
Engorda: Adquieren los lechones destetados y se dedican a engordarlos hasta que llegan
el peso en que son enviados al rastro
Ciclo completo: Tienen sus propios vientres y sementales; los lechones nacen en la granja
y ahí mismo son criados y engordados hasta su envío al rastro
Desde la década de los cincuenta, se generalizó la explotación del cerdo bajo un modelo de
producción intensivo, tanto en granjas semitecnificadas como tecnificadas, sin embargo; no se
tenía contemplado el problema de tratamiento de los desechos generados en gran volumen por
la cría y engorda de los cerdos en confinamiento. A finales de los ochenta, un estudió reportó que
existían escasos o nulos sistemas de tratamiento de las aguas, y no existía una adecuada
disposición final.
Los nutrientes presentes en los residuos no tratados de animales llegan al acuífero y aguas
superficiales, provocando la eutrofización de los cuerpos de agua. Esto representa la proliferación
de algas y menor capacidad de transportar oxígeno en el medio. Otro factor que degrada la
calidad del agua, es la presencia de agentes patógenos en los desechos animales. Los
microorganismos presentes en las aguas residuales porcinas tratadas inadecuadamente
contienen bacterias, protozoos, helmintos y virus. (Rowse 2011).
De forma particular, en Yucatán, la contaminación del manto freático se presenta fácilmente
debido al suelo permeable y a que las aguas subterráneas se encuentran a poca profundidad.
Esta característica conlleva que los desechos contaminen las aguas del subsuelo en un corto
periodo de tiempo, lo que causa graves daños en la salud, tomando en cuenta de durante un
tiempo, en ciertos lugares de la región los pozos artesanales fueron la única fuente de agua de
los pobladores.
En los últimos años se han desarrollado diversos trabajos de investigación, sobre la aplicación
de tecnologías que permitan ofrecer un adecuado tratamiento a los desechos sólidos y líquidos
presentes en el agua residual.
A finales del 2012 la Secretaría de Desarrollo Urbano y Medio Ambiente del Estado de Yucatán
da a conocer el proyecto de biodigestores para pequeñas y medianas granjas porcícolas, que
tienen una producción semitecnificada, el cual, consiste en la instalación de 50 biodigestores
anaerobios de cúpula flotante para mitigar la contaminación por residuos porcinos. En junio del
2016, para dar continuidad al proyecto, se realizó la inversión para la instalación de 100 unidades
adicionales a las 50 ya instaladas en las granjas porcinas en Yucatán, abarcando 42 de los 106
municipios del Estado.
La problemática ambiental de los antibióticos radica en que generan resistencia bacteriana (Goñi-
Urriza et al., 2000), con frecuencia se utilizan en cantidades mayores a las apropiadas (Holstrom
et al., 2003), tal es el caso de México, son parcialmente metabolizados, afectan la eficiencia de
los sistemas de tratamiento de aguas residuales (Alatrache et al., 2010), generalmente no son
removidos en los sistemas de tratamiento (Rizzo et al., 2009), además de que los medicamentos
caducos se disponen inapropiadamente.
Los residuos de antibióticos utilizados para la cría de animales ingresan al medio ambiente
mediante la dispersión del estiércol o mediante el almacenamiento de lodos (Martínez-Carballo
et al., 2007). Estudios recientes han detectado residuos de antibióticos en diferentes muestras de
agua, incluyendo aguas residuales municipales, agua de río, agua de lago e incluso aguas
subterráneas (Batt et al., 2006). Una vez excretados de los cuerpos de los animales, ya sea en
formas inalteradas o como metabolitos (Wiuff et al., 2002), los residuos de antibióticos muestran
comportamientos diferentes bajo diferentes condiciones ambientales (Managaki et al., 2007).
Los fármacos son sustancias químicas biológicamente activas que al ser descargadas pueden
interferir con sistemas biológicos específicos. La mayor parte de los fármacos usados para
propósitos veterinarios terminan en el estiércol. El estiércol es almacenado generalmente en
tanques por un determinado tiempo y posteriormente es aplicado a los campos. Una vez
esparcido el estiércol en los campos agrícolas la movilidad de los fármacos y sus metabolitos
permite que estos lleguen al agua subterránea afectando los organismos terrestres y/o acuáticos
La mayor parte de los fármacos usados para propósitos veterinarios terminan en el estiércol. El
estiércol es almacenado generalmente en tanques por un determinado tiempo y posteriormente
es aplicado a los campos. Una vez esparcido el estiércol en los campos agrícolas la movilidad de
los fármacos y sus metabolitos permite que estos lleguen al agua subterránea afectando los
organismos terrestres y/o acuáticos
La complejidad del agua residual porcina es que generalmente tiene una DQO superior a 15,000
mg L-1 y una concentración de sólidos por arriba de 10,000 mg L-1 lo que dificulta la detección
de antibióticos. Por lo que es un reto determinar el mejor método para su detección y
cuantificación en este tipo de aguas.
Generalmente todo el proceso analítico incluye cinco pasos: muestreo, preparación de muestras,
separación cromatográfica, detección y análisis de datos. Es importante considerar las
condiciones de almacenamiento de la muestra, que pudieran causar errores en el análisis;
algunos factores a considerar son la temperatura, la irradiación UV, la actividad microbiológica o
alguna reacción química que se pudiera presentar. Algunas recomendaciones son mantener las
muestras en botellas ámbar, mantenerlas a 4 oC o en congelación y en un ambiente oscuro hasta
el análisis cromatográfico. Las muestras pueden ser acidificadas para inhibir el crecimiento
bacteriano. Otro factor importante es la filtración para eliminar las partículas presentes en el agua,
Se sabe que el análisis cromatográfico con detección por ultravioleta permite la determinación de
fluoroquinolonas, tetraciclinas y sulfonamidas (García et al.,2012)
Para la separación con cromatografía líquida, se suelen utilizar mezclas de agua, acetonitrilo y
metanol como fases móviles, debido a que ya se ha reportado una adecuada resolución, que
nos permite identificar a los diferentes compuestos en las mezclas de antibióticos.
Debido a que la tilosina, es uno de los antibióticos veterinarios más vendidos en el mundo, se han
reportado diferentes condiciones para su cuantificación e identificación en diferentes matrices
complejas, entre las cuáles se encuentras las aguas residuales porcícolas.
Se recolectaron muestras de 10 granjas porcícolas, tomadas del cárcamo de recepción del agua
residual proveniente del lavado de los corrales de los cerdos y de la salida del biodigestor
anaerobio instalado como sistema de tratamiento en la granja. Se tomó 1 L de muestra por granja,
la cual fue almacenada en vidrio ámbar y refrigerada a 4°C. Se realizaron dos muestreos a cada
una de las granjas seleccionadas.
Cada una de las muestras fueron filtradas a través de una malla de algodón estéril de 1 mm
(gasa) y filtros comerciales para cafeteras (85 µm), removiendo las partículas sólidas de mayor
tamaño que se encontraban en la muestra, después se utilizó papel filtro cualitativo comercial (25
µm), poro fino y finalmente papel filtro Whatman No.2 de 8 μm. Adicionalmente se realizó la
extracción en fase sólida de las muestras, utilizando cartuchos Octadecyl C18 de 6 mL (J.T.
Baker), acondicionando la columna con 5 volúmenes cada uno, de acetonitrilo, metanol y agua,
se dejó pasar 1 L de muestra, posteriormente lavando con agua tri-destilada Millipore hasta que
se clarifique, para finalmente agregar 2 volúmenes cada uno, de metanol y acetonitrilo como
solventes de elución.
Para el análisis por CLAE se utilizó un equipo Agilent 1100 con detector de longitud de onda
variable UV (Figura 2), empleando una columna HYPERSIL GOLD de 250 mm, 4.6 de diámetro
mm y 5 μm de poro, manteniendo la temperatura a 25 °C. Se inyectaron 5 μL utilizando el
automuestreador del equipo. La fase móvil fue una mezcla de acetonitrilo con agua pH 4, ajustada
con ácido acético glacial. Se analizaron 9 fármacos de manera individual obteniendo sus
condiciones, con base en lo anterior, se establecieron las proporciones de las fases, longitudes
de onda y velocidad de flujo para agruparlos en mezclas.
Fig. 2. Equipo Agilent 1100 para cromatografía líquida de alta eficiencia
3. Resultados
Para la detección de antibióticos de uso veterinario por cromatografía liquida acoplado a UV, se
establecieron las condiciones reportadas en la tabla 1.
Estas condiciones permiten la estabilidad de los compuestos presentes, y toma en cuenta las
propiedades físicas y químicas de cada uno de los compuestos, las cuáles a su vez, se relaciones
con las estructuras químicas de los antibióticos.
Flujo Temperatura
Fármacos λ (nm ) Fase móvil
(mL/min)
Mezcla 1
Estreptomicina
Oxitetraciclina
Mezcla 2
Neomicina
Tilosina
Mezcla 3
Ractopamina
Acetonitrilo 33.35%
Ivermectina 220 0.5 30°C
Metanol 33.35%
Agua 33.35%
El uso del método de Cromatografía de alta eficiencia acoplado a detectores UV, para la
separación y detección de sulfonamidas y fluoroquinolonas ha sido ampliamente investigado. Se
han realizado estudios de validación del método y se ha reportado como un método efectivo para
la detección de estos compuestos, además de que equipo que se requiere es accesible en cuanto
a costos.
El antibiótico tilosina, que pertenece al grupo de los macrólidos, ha sido detectado en aguas
residuales porcícolas, mediante Cromatografía de alta eficiencia, utilizando una fase móvil de
ácido fórmico 0.2% y acetonitrilo (50/50 v/v). (Tagiri-Endo, 2009). En la literatura se ha reportado
una longitud de onda de 290 nm para su detección. (Hu et al., 2008).
Se han realizado estudios de validación de métodos de HPLC con detector UV, para la detección
de ivermectina con triclabendazol y la fase móvil fue agua, acetonitrilo, metanol, ácido acético
(56/36/7.5/0.5, v/v/v/v), y una longitud de onda de 245 nm A 25 OC. (Shurbaji, 2010)
Los antibióticos pertenecientes al grupo de amino glúcidos, han sido analizado por Cromatografía
líquida de alta eficiencia, sin embargo se han reportado que se tiene una mejor detección y
cuantificación, utilizando la espectrometría de masas, en lugar del UV.
Los errores generados en la detección y cuantificación se puede deber a que los antibióticos no
se analizaron de manera aislada, utilizando la longitud de onda correspondiente a cada
compuesto.
El uso de solventes, de acetonitrilo, agua y metanol, y en algunos casos ácido fórmico, son
permiten una mejor resolución en los picos característicos de los compuestos, y se utilizan de
manera estandarizada. (Seifrtová et al.2009)
La absorción UV proporciona en general una sensibilidad adecuada pero, para la mayoría de los
análisis de fármacos, no permite obtener información estructural y está sujeta a múltiples
interferencias, lo que hace necesario una etapa previa de limpieza de muestra o bien, una
derivatización de los compuestos
Conclusiones.
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