Konformasi DNA dan Perbaikan dari Kerusakan DNA Polimer Alami oleh Antitumor

Azolato - Dijembatani Kompleks Dinuclear PtII

Abstract
Desain dari obat baru Pt antitumor saat ini juga difokuskan pada kompleks Pt baru yang
terbentuk pada DNA utama yang hampir tidak dapat dihapus oleh sistem perbaikan DNA. Upaya
semacam ini memiliki sudah dilakukan dengan merancang dan mensintesis antitumor baru
azolato-dijembatani kompleks dinuclear PtII, seperti [{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-pyrazolate)]2+
(AMPZ). Kompleks PtII baru ini memiliki efek toksik yang lebih tinggi dalam beberapa baris sel
tumor dari mononuklear cisplatin konvensional. Tujuan utama dalam penelitian ini adalah untuk
lebih menggambarkan perbedaan dalam interaksi AMPZ dan cisplatin dengan alam, DNA massa
molekul tinggi dengan menggunakan kombinasi teknik biokimia dan biofisika molekuler. Hasil
menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa sedikit distorsi konformasi yang diinduksi oleh
AMPZ dalam DNA yang sangat polimer dengan urutan nukleotida acak mewakili motif
struktural dikenali oleh system perbaikan DNA kurang efisien daripada distorsi yang disebabkan
oleh cisplatin. Dengan demikian, hasil adisi DNA dari azolato-dijembatani kompleks dinuclear
PtII dapat terjadi mekanisme perbaikan lebih mudah daripada cisplatin, yang dapat
mempotensiasi efek antitumor dari metallodrugs baru pada sel-sel kanker.

Introduction
Mekanisme kerja obat antikanker platinum yang digunakan dalam klinik, seperti cis-
[Pt(NH3)2Cl2] (cisplatin, Gambar 1) dan analog, melibatkan koordinasi untuk basa DNA purin,
respon seluler untuk kerusakan DNA terutama yang menyebabkan apoptosis sel atau nekrosis
[1,2]. Kemampuan sel kanker untuk mengenali induksi kerusakan dalam DNA dengan obat
antitumor platinum dan memulai perbaikan DNA merupakan mekanisme penting untuk terapi
ketahanan dan memiliki dampak negatif pada keberhasilan terapi. Inhibisi farmakologis dari
perbaikan DNA memiliki potensi untuk meningkatkan efisiensi kemoterapi antitumor. Ini
menyiratkan bahwa desain dari obat baru platinum antitumor harus difokuskan pada orang-orang
kompleks platinum baru yang terbentuk pada DNA utama yang hampir tidak dapat dihapus oleh
sistem perbaikan DNA [3–10].
Upaya semacam ini telah dilakukan dengan merancang dan mensintesis antitumor baru
azolato-dijembatani kompleks dinuclear PtII, seperti [{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-pz)]2+ (pz =
pyrazolate) (AMPZ) [4-8,10,11] (untuk strukturnya, lihat Gambar 1). Kompleks PtII baru ini
memiliki efek toksik yang lebih tinggi dalam beberapa baris sel tumor daripada cisplatin [4,6,7].
Bentuk kompleks ini dalam oligonukleotida pendek kopel besar 1,2-GG intrastrand cross-link
(CLs). μ-hidrokso bertindak sebagai suatu gugus pergi, dan jembatan kaku pyrazolate pada
AMPZ menjaga jarak antara dua atom Pt untuk dapat mengikat dua guanines tetangga [5,12].
Selain itu, juga telah dideduksi dari spektrum NMR kopel pendek yang mengandung 1,2-GG
intrastrand CL dari AMPZ bahwa hasil adisi koordinatif ini secara lokal melepaskan DNA dalam
batas yang sama seperti adisi dari cisplatin, tetapi ikatan DNA kurang terlihat [12]. Telah
diusulkan bahwa peningkatan sitotoksisitas dari azolato – dijembatani kompleks dinuclear PtII
dan kurangnya resistensi silang pada baris sel tahan cisplatin merupakan konsekuensi dari
perubahan struktural kecil yang diinduksi dalam DNA oleh kompleks baru ini. Dengan kata lain,
sedikit distorsi konformasi pada DNA mewakili motif struktural lemah pada protein perbaikan
DNA dan dengan cara ini terjadi mekanisme perbaikan. Dengan demikian, hasil adisi kompleks
dinuclear ini dapat bertahan pada DNA, yang dapat mempotensiasi efek antitumor dari
metallodrugs. Namun, sitotoksisitas dari kompleks baru dinuclear PtII didasarkan pada asumsi-
asumsi teoritis menunggu konfirmasi eksperimental lebih lanjut. Tujuan utama kami pada
penelitian ini adalah untuk lebih menggambarkan perbedaan dalam interaksi DNA antara
cisplatin dan azolato-dijembatani kompleks AMPZ dinuclear PtII. Penelitian sebelumnya
difokuskan pada pemahaman mekanisme molekuler efek antitumor yang mendasari metallodrugs
menggunakan model monomer guanine yang mengandung nukleotida atau kopel singkat
oligonukleotida sintetis. Dengan demikian, percobaan pada penelitian ini dilakukan secara alami,
massa molekul tinggi mamalia atau plasmid DNA. Kombinasi teknik biofisik dan biokimia yang
digunakan untuk membangun perbedaan mekanistik antara cisplatin dan dinuclear PtII senyawa
AMPZ.
 cis-Pt(NH3)2Cl2 [{cis-Pt(NH3)2}2(μ-OH)(μ-pz)]2+
Cisplatin AMPZ
Gambar 1. Struktur cisplatin dan azolato-dijembatani kompleks dinuclear PtII
Perhatian juga telah diberikan pada DNA koordinatif hasil adisi menghasilkan AMPZ, efeknya
pada konformasi dari biopolimer yang rusak. Selain itu, interaksi DNA hasil adisi dengan sistem
perbaikan DNA telah diperiksa. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk memberikan bukti
eksperimental yang mendukung hipotesis kerja peningkatan sifat farmakologi dari dinuclear
AMPZ yang merupakan konsekuensi dari distorsi konformasi kecil yang diinduksi dalam massa
molekul tinggi DNA oleh adisi dari metallodrug dan karena berkurangnya perbaikan dari hasil
adisi ini.

Materials and methods

Bahan kimia
Cisplatin dan transplatin (kemurnian ≥ 99.9% berdasarkan unsur dan analisis jejak ICP) dan
polietilen glikol (PEG) (massa molekul 6000) diperoleh dari Sigma (Praha, Republik Ceko).
Azolato-dijembatani kompleks dinuclear PtII AMPZ disintesis menurut prosedur yang diterbitkan
[4,5]. Chloridodiethylenetriamineplatinum(II) klorida ([PTCL(dien)]Cl) merupakan pemberian
dari Prof. G. Natile dari Universitas Bari. Persediaan larutan dari kompleks platinum [5×10-4M
pada NaClO4 (10 mM)] disimpan dalam tempat gelap pada suhu 4°C. Konsentrasi platinum
dalam persediaan larutan ditentukan oleh flameless atomic absorption spectroscopy (FAAS).
Calf timus (CT) DNA (42% G + C, rata-rata massa molekul 20000 kDa) disiapkan dan
dikarakterisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [13,14]. Plasmid, pUC19 [2686 pasangan
basa (bp)], pSP73KB (2455 bp) dan pBR322 (4361 bp), diisolasi sesuai dengan prosedur standar.
Endonuklease restriksi EcoRI, SspI, BamHI, HindIII, NdeI, dan PvuI, DNA ligase T4, fragmen
Klenow dari DNA polimerase I, dan polinukleotida kinase T4 yang dibeli dari New England
Biolabs (Beverly, MA). Riboprobe Gemini Sistem II untuk pemetaan transkripsi mengandung
SP6 dan T7 RNA polimerase dibeli dari Promega (Madison, WI). Akrilamida, bis (akrilamida),
etidium bromida (EtBr), NaCN, dithiothreitol, dan urea berasal dari Merck KgaA (Darmstadt,
Jerman). SDS adalah dari Serva (Heidelberg, Jerman). Proteinase K berasal dari Boehringer
(Mannheim, Jerman). Produk radioaktif berasal dari Amersham (Arlington Heights, IL, USA).
Ekstrak sel bebas (CFE) disiapkan dari perbaikan garis sel HeLa S3 seperti yang telah dilaporkan
sebelumnya [15].
Reaksi Platinasi
Jika tidak dinyatakan sebaliknya, CT atau plasmid DNA diinkubasi dengan kompleks
platinum pada NaClO4 (10 mM) selama 48 jam pada suhu 37°C dalam gelap. Pada akhir
inkubasi, sampel (500 µL) yang didialisis mendalam dengan NaCl (1 M, 1 L, 1 jam, 5 kali) dan
kemudian media yang diperlukan untuk analisis biokimia atau biofisik. Sebuah aliquot dari
sampel ini digunakan untuk menentukan nilai rb (jumlah molekul kompleks koordinatif platinum
terikat per residu nukleotida) oleh FAAS.
Uji inhibisi pembelahan enzim restriksi
DNA pSP73KB pertama kali dilinierisasi oleh PvuI endonuklease. Setelah reaksi
pembelahan ini enzim restriksi telah dihapus oleh fenol/ekstraksi kloroform. Fragmen linier yang
dimodifikasi oleh kompleks PtII untuk berbagai nilai rb. Proses berikutnya dilakukan setelah
presipitasi etanol dengan menginkubasi non-modifikasi atau proses platinasi utama dari DNA
pSP73KB dengan BamHI, EcoRI atau SspI. Besarnya enzim yang digunakan dalam proses
sekunder (dilakukan pada media yang direkomendasikan dan disediakan oleh produsen) yang
diperlukan untuk memotong 1 µg DNA linier dalam 1 jam pada 37°C. Dihasilkan fragmen DNA
yang menjadi sasaran elektroforesis agarose (1% gel) dalam larutan penyangga TAE [Tris-asetat
(0.04M) + EDTA (0.04M, pH 7.0)] pada 25°C dengan penurunan potensi 0,8 V/cm. Gel
diwarnai dengan EtBr dan sampel divisualisasikan dan difoto di bawah sinar ultraviolet.
Intensitas dari ikatan yang diukur dengan menggunakan Molecular dynamics phosphor imager
(sistem Storm 860 sistem dengan perangkat lunak ImageQuant). Yang terpenting, DNA
pSP73KB hanya berisi satu tempat pembelahan dari BamHI, EcoRI atau SspI diposisi 45, 24 dan
2014 (angka ini sesuai dengan penomoran nukleotida dalam urutan peta plasmid pSP73KB).
DNA transkripsi oleh RNA polimerase in vitro
Transkripsi (NdeI / HpaI) pembatasan fragmen DNA pSP73KB dengan DNA-dependent
RNA polimerase T7 dan transkrip analisis elektroforesis dilakukan sesuai dengan protocol yang
direkomendasikan oleh Promega (Promega Protokol dan Aplikasi, 43-46 (1989-1990) dan
sebelumnya dijelaskan secara rinci [16].
Uji Interstrand cross-link
AMPZ atau cisplatin pada konsentrasi yang berbeda-beda diinkubasi dengan 2 µg DNA
pUC19 setelah dilinierisasi oleh EcoRI. Sampel terplatina diendapkan dengan etanol dan
dianalisis untuk interstrand DNA CLs dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan dalam
artikel yang diterbitkan sebelumnya [16,17]. Rangkap linear pertama kali 3'- selesai dilabeli
dengan cara Klenow fragmen dari DNA polimerase I dan [α-32P] dATP. Sampel yang kehilangan
protein oleh fenol, dipicu oleh etanol dan pellet yang dilarutkan dalam 18 ml NaOH (30 mM)
dengan EDTA (1 mM), sukrosa (6.6%) dan bromofenol biru (0,04%). Jumlah CLs interstrand
dianalisis dengan elektroforesis dibawah kondisi denaturasi pada gel agarosa alkali (1%). Setelah
elektroforesis selesai, intensitas dari ikatan yang sesuai dengan untai tunggal DNA dan rangkap
silang interstrand yang dihitung dengan Molecular dynamics phosphor imager (Storm 860
system dengan Software ImageQuant). Frekuensi CLs interstrand, F (nomor dari CLS interstrand
per adisi), dihitung sebagai F = XL / 5372.rb (plasmid pUC19 terkandung 5.372 residu
nukleotida). XL adalah jumlah CLS interstrand per satu molekul duplex DNA linier yang
dihitung dengan asumsi distribusi Poisson dari CLs interstrand sebagai XL = – ln A, dimana A
adalah fraksi molekul berjalan sebagai ikatan yang sesuai dengan non-cross-linked DNA [17].
Karakterisasi DNA teradisi oleh tiourea
Penggabungan [14C] tiourea ke DNA dalam kondisi yang terkendali (8,7 × 10-4 M, 10 menit,
25°C [18]) digunakan untuk menghitung kuantitas monofungsional platinum-DNA teradisi
AMPZ dengan cara yang sama seperti dijelaskan dalam artikel kami baru-baru ini diterbitkan
[19] dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, pengukuran dilakukan dalam NaClO4 (10 mM)
pada 25°C. CT DNA (0,16 mg mL-1) diinkubasi dengan AMPZ (ri=0,1) (ri didefinisikan sebagai
rasio molar kompleks platinum bebas untuk nukleotida fosfat pada awal inkubasi dengan DNA)
selama 48 jam. Konversi monofungsional untuk bifunctional teradisi diblokir dalam sampel ini
dengan penambahan [14C] tiourea (konsentrasi akhir adalah 8,7 × 10-4 M, dan aktivitas spesifik
adalah 2,5 mCi-mmol-1) dan NaCl (konsentrasi akhir adalah 0,15 M) sehingga volume akhir dari
sampel ini adalah 1,0 mL. Kemudian sampel diinkubasi pada 25°C selama 10 menit dan
kemudian dilapiskan pada Filter Millipore (diameter pori-pori adalah 0,1 µm); tiourea tidak
bereaksi dan kompleks yang terbentuk antara AMPZ tak terikat dan tiourea yang dihapus dengan
mencuci filter dengan 15 mL dari 5% (v / v) asam trikloroasetat (TCA). Filter yang dikeringkan
di bawah lampu inframerah dan ditransfer dalam tabung kaca, diamna 5 mL toluena sintilator
ditambahkan. Nilai rb setelah penghapusan bebas (AMPZ tak terikat) ditentukan dengan FAAS
sebesar 0,052. Radioaktivitas diukur dengan liquid scintillation analyzer TriCarb 2800 TR
(Perkin-Elmer) (2 × 2 menit). Koordinasi bebas pada DNA teradisi dari AMPZ tidak terlibat
dalam mengikat DNA ditentukan sebagai jumlah (%) tiourea radioaktif terikat dengan DNA
terplatinasi; konsentrasi tiourea sesuai dengan 2-lipat konsentrasi AMPZ (memiliki dua ikatan
potensial DNA) terikat DNA dalam sampel ditentukan oleh FAAS (rb) diambil sebagai 100%.
Hal itu juga diverifikasi bahwa, pada 8,7 × 10-4 M tiourea, kejenuhan dari monofungsional
teradisi diperoleh tanpa pembalikan platinasi yang jelas [20,21].
Pelelehan DNA
Kurva pelelehan CT DNA (32 μg mL-1) dicatat dengan mengukur absorbansi pada 260 nm.
Kurva leleh yang tidak dimodifikasi atau DNA terplatinasi dicatat dalam medium yang
mengandung NaClO4 (0.01 atau 0.07 M) dengan Tris-HCl (1 mM, pH 7.4) / EDTA (0,1 mM).
Nilai Tm ditentukan sebagai suhu yang berhubungan dengan maksimum pada profil turunan
pertama dari kurva leleh. Nilai Tm dapat ditentukan sehingga dengan akurasi ±0,3°C.
Pengukuran fluoresensi
Pengukuran ini dilakukan dengan Shimadzu RF 40 spectrofluorophotometer menggunakan
sel kuarsa 1-cm. Pengukuran fluoresensi CT DNA dimodifikasi dengan kompleks platinum
dengan adanya EtBr dilakukan pada panjang gelombang eksitasi 546 nm, dan fluoresensi
dipancarkan dianalisis di 590 nm. Intensitas fluoresensi diukur pada 25°C di NaCl (0,4 M) untuk
menghindari ikatan sekunder dari EtBr ke DNA [22,23]. Konsentrasi 0,01 mg mL-1 untuk DNA
dan 0,04 mg mL-1 untuk EtBr, yang berhubungan dengan saturasi dari EtBr pada DNA [23].
Pengukuran fluoresensi terbium dilakukan dengan menambahkan TbCl3 untuk dimodifikasi
atau kontrol DNA (8 μg mL-1) pada konsentrasi akhir setara dua kali isi nukleotida monomer.
Intensitas fluoresensi diukur setelah kesetimbangan selama 60 menit pada 25°C dalam gelap.
Eksitasi dan panjang gelombang emisinya 290 nm dan 546 nm, masing-masing. Rincian lain dari
pengukuran ini dapat ditemukan dalam makalah yang diterbitkan sebelumnya [24-26].
Dispersi kristal cair dari DNA
Dispersi kristal cair DNA heliks ganda (plasmid pSP73KB dilinierisasi oleh NdeI)
dimodifikasi dengan kompleks platinum yang dibentuk dengan mencampur larutan DNA dan
PEG seperti yang dijelaskan sebelumnya [27,28]. Secara singkat, 1 mL DNA non-modifikasi
atau DNA termodifikasi oleh kompleks platina dilarutkan dalam NaClO4 (0,01 M) pada
konsentrasi 0,06 mg mL-1 dicampur dengan 3 mL PEG (200 mg mL-1) [juga dilarutkan dalam
NaClO4 (0.3M)] selama 1 jam. Spektra circular dichroism (CD) dispersi kristal cair dari DNA
plasmid dimodifikasi oleh kompleks platinum dicatat setelah 24 jam pada 25°C menggunakan
JASCO J-720 spectropolarimeter. Panjang jalan sel 1 cm. Spektra tercatat di kisaran 220-350 nm
dengan penambahan 0,5-nm dengan rata-rata waktu 1 s.
Sintesis perbaikan DNA oleh ekstrak bebas sel manusia
Sintesis perbaikan DNA diuji menggunakan plasmid pUC19 terplatinasi dan CFEs. Setiap
reaksi 50 µL mengandung 300 ng dari pBR322 tak termodifikasi dan 300 ng yang tak
termodifikasi atau terplatinasi pSP73KB, ATP (2 mM), KCl (30 mM), creatine phosphokinase
(otot kelinci) (0,05 mg mL-1), 20 mM setiap dGTP, dATP, dan dTTP, dCTP (8 mM), 74 kBq dari
[α-32P] dCTP dalam buffer terdiri dari HEPES-KOH (40 mM, pH 7,5) (HEPES = 2- [4- (2-
hidroksietil) piperazin-1-yl] asam ethanesulfonic), MgCl2 (5 mM), dithiothreitol (0,5 mM),
kreatin fosfat (22 mM), kalium glutamat (70 mM), bovine serum albumin (1,4 mg mL-1), dan 20
mg CFE dari sel HeLa S3. Reaksi diinkubasi selama 4 jam pada suhu 30°C dan diakhiri dengan
inkubasi selama 30 menit dengan EDTA (20 mM), SDS (0,6%), dan proteinase K (250 mg mL-
1
). Produk diekstraksi satu kali dengan fenol/kloroform (1:1) dan diendapkan dengan
menambahkan natrium asetat (3 M) dan 2,5 volume etanol. Setelah 30 menit inkubasi pada 20°C
dan sentrifugasi pada 12.000 xg selama 30 menit pada 4°C, pellet dicuci dengan 0,2 ml 70%
etanol dan dikeringkan dalam vakum centrifugasi. DNA dilinierisasi oleh SspI sebelum
elektroforesis pada gel agarosa 1%. Gel diwarnai dengan SybrGreen® menurut protokol
produsen untuk dokumentasi foto dan radioaktivitas yang berhubungan dengan ikatan yang
terhitung. Percobaan dilakukan rangkap empat.
Metode fisik lainnya
Spektrum serapan diukur dengan spektrofotometer Beckman DU 7400 dilengkapi dengan
thermoelectrically dikendalikan holder sel. Pengukuran FAAS dilakukan pada spektrometer
serapan atom Varian AA240Z Zeeman dilengkapi dengan tabung penyemprot grafit GTA 120.
Untuk analisis FAAS, sampel DNA (500 µL) didialisis pertama dengan NaCl (1 M, 1 L, 1 jam, 5
kali) untuk menghapus platinum takterikat. Gel divisualisasikan pada BAS 2500 FUJIFILM
bioimaging analyzer, dan radioaktivitas terkait dengan ikatan diukur dengan software AIDA
image analyzer (Raytest, Jerman).

Results
Platinasi DNA alami
Larutan dari double-heliks CT DNA (32 µg mL-1) diinkubasi dengan AMPZ pada ri dari
0,08 di NaClO4 (10 mM) pada 37°C. Pada berbagai interval waktu, sebuah aliquot dari reaksi
campuran dihapus, didialisis dengan 1 M NaCl dan diuji dengan FAAS untuk platinum terikat
DNA. Tidak ada perubahan pH campuran reaksi yang mengandung senyawa DNA dan PtII
diukur dalam waktu 48 jam setelah pencampuran DNA dengan kompleks PtII. Jumlah platinum
terikat DNA meningkat seiring waktu (Gambar. S1). Dalam reaksi ikatan ini, waktu mengikat
mencapai 50% (t50%) adalah ~ 30 jam. Nilai t50% untuk reaksi mononuklear cisplatin
konvensional dengan DNA dalam kondisi yang sebanding adalah 2 jam [29]. Dalam penelitian
lebih lanjut, CT DNA diinkubasi dengan AMPZ pada ri = 0,02, dan pada tingkat yang sama
mengikat diamati ketika ri sebesar 0,08.
Untuk penelitian lebih lanjut, sampel DNA alami (CT atau DNA plasmid) dimodifikasi oleh
kompleks platinum yang dianalisis dengan teknik biokimia atau biofisik disusun dengan
menginkubasi DNA dengan AMPZ dalam NaClO4 (10 mM) pada 37°C selama 48 jam kecuali
dinyatakan (lihat juga bagian eksperimental). Nilai-nilai rb diverifikasi oleh FAAS setelah
dialisis lengkap dari sampel (500 µL) terhadap NaCl (1 M, 1 L, 1 jam, 5 kali). Jika itu perlu
untuk mentransfer DNA terplatinasi ke media yang berbeda dari NaClO4 (10 mM) diperlukan
analisis DNA tertentu, sampel diendapkan dalam etanol, dilarutkan di media ini dan nilai rb
dalam aliquot dari sampel ini diperiksa dengan FAAS. Dengan cara ini, analisis yang dijelaskan
pada paper ini dilakukan dengan tidak adanya kompleks platinum tak terikat (bebas).